ES2214936A1 - Gen codificante de una b-agarasa y su utilizacion para producir enzimas de biodegradacion de agares. - Google Patents
Gen codificante de una b-agarasa y su utilizacion para producir enzimas de biodegradacion de agares.Info
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Abstract
Gen codificante de una {be}-agarasa y su utilización para producir enzimas de biodegradación de agares. La invención se relaciona con la nueva cepa de Cytophaga drobachiensis depositada en la Colección DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares)) el 8 de Mayo de 1998 bajo el número DSM 12170, con el gen agaB codificante de una {be}-agarasa y que tiene la SEC ID N° 1, cuyo gen codifica para una {be}-agarasa de Cytophaga drobachiensis DSM 12170, y con la proteína AgaB del tipo {be}-agarasa de C drobachiensis DSM 12170, que tiene la SEC ID N° 2. Aplicación: biodegradación de agares.
Description
Gen codificante de
\beta-agarasa y su utilización para producir
enzimas de biodegradación de agares.
La presente invención se relaciona con un nuevo
gen codificante de \beta-agarasa y con su uso para
la producción de enzimas de biodegradación de agares.
Se relaciona igualmente con la cepa de
Cytophaga drobachiensis, a partir de la cual se aisló este
gen.
Los galactanos sulfatados de Rhodophyceae,
tales como agares y carrageninas, representan los polisacáridos
mayores de las Rhodophyceae y son ampliamente utilizados
como agentes gelificantes o espesantes en diversas ramas de
actividad, especialmente en el sector agroalimentario. Anualmente,
se extraen aproximadamente 6.000 toneladas de agares y 22.000
toneladas de carrageninas de algas rojas marinas con este fin. Los
agares son producidos industrialmente a partir de algas rojas de
los géneros Gelidium y Gracilaria. Las carrageninas
son ampliamente extraídas de los géneros Chondrus,
Gigartina y Euchema.
Loa agarocoloides son complejos de polisacáridos
consistentes principalmente en agares y agaroides. Cada
agarocoloide tiene un contenido diferente de cada uno de los
anteriores compuestos, por lo que su fuerza gelificante es
diferente. El gel de agar consiste en una matriz de cadenas
poliméricas de doble hélice que se mantienen juntas por medio de
enlaces de hidrógeno.
Existen dos tipos de enzima capaces de degradar
los agares: las \alpha-agarasas y las
\beta-agarasas. Las
\beta-agarasas actúan sobre la unión
\beta-1,4 y las \alpha-agarasas
actúan sobre la unión \alpha-1,3.
Se han aislado ya microorganismos que producen
enzimas capaces de hidrolizar los agares. Esta capacidad para
digerir el agar ha sido atribuida a los géneros Pseudomonas
(MORRICE y col., Eur. J. Biochem. 137, 149-154
(1983)), Streptomyces (HODGSON y CHATER, J. Gen. Microbiol.
124, 339-348, (1981)), Cytophaga (VAN DER
MEULEN y HARDER, J. Microbiol. 41, 431-447 (1975)) y
Vibrio (SUGANO y col., Appl. Environ. Microbiol. 59,
1549-1554 (1993)). Se han aislado ya varios genes
de \beta-agarasa. Así, BELAS y col. aislaron el
gen de una agarasa de Pseudomonas atlantica (Appl. Environ.
Microbiol. 54, 30-37 (1988)). BUTTNER y col.
aislaron una agarasa de Streptomyces coelicolor y
secuenciaron el gen correspondiente (Mol. Gen. Genet. 209,
101-109 (1987)). SUGANO y col. clonaron y
secuenciaron dos genes de agarasa diferentes de Vibrio sp.
JT0107, a los que llamaron agaA (Appl. Environ. Microbiol.
59, 3750-3756 (1993)) y agaB (Biochimica et
Biophysica Acta 1218, 105-108 (1994)).
La Solicitante ha aislado ahora, a partir del
alga roja Delesseria sanguínea, una cepa bacteriana que
tiene actividad agarasa.
Esta cepa fue depositada en la Colección DSMZ
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)
(Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares) el 8 de
Mayo de 1998 bajo el número DSM 12170. Forma el primer objeto de
la presente invención.
La investigación taxonómica de esta cepa,
llevada a cabo mediante técnicas bien conocidas para los expertos
en este campo, muestra que pertenece al genero Cytophaga
(bacterias del grupo CFB o
"Cytophaga/Flexibacter/Bacteroides"). En efecto, esta
cepa se desarrolla por propagación y tiene colonias amarillas
incrustadas en el agar, el cual entonces se licúa. La bacteria es
una bacteria Gram-negativa y tiene la forma de un
bacilo no móvil de 0,3-0,4 x 3,0-8,0
\mum x \mum. Cuando una gota de cultivo de la cepa es inoculada
en el centro de una placa de agar, la colonia se desarrolla con
crecimiento concéntrico del margen y esta movilidad no resulta
inhibida por el éter dietílico, que es un inhibidor del aparato
flagelar. La cepa es aerobia y tiene un metabolismo oxidativo.
Produce flexirrubina, que es un pigmento raramente encontrado en
aislados de Cytophaga marinas, pero que está presente en
Cytophaga no marinas. Es capaz de asimilar diversas fuentes
de carbono y de degradar varios tipos de macromoléculas, tales como
agar, carragenina, almidón y gelatina.
El demandante realizó un estudio en profundidad
para averiguar a qué especie pertenecía esta cepa. Determinó así el
porcentaje de la composición de guanina y citosina del ADN de la
cepa de la invención y vio que los valores eran de entre un 43 y un
49%. También secuenció su ADN 16S por el método bien conocido para
los expertos en la técnica para averiguar la posición taxonómica de
una cepa (FOX y col., Int. J. Syst. Bacteriol. 22,
44-57 (1977)). El resultado de la secuenciación
muestra que la cepa de la invención es muy similar a Cytophaga
uliginosa. (Existe una similitud de secuencia del 99% entre el
ADN 16S de C. uliginosa y el de la cepa de la invención). Sin
embargo, la hibridación ADN/ADN entre las dos cepas (45%) muestra
que son especies diferentes.
Más aún, la cepa de la invención tiene
características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas similares
a la cepa Pseudomonas drobachiensis nov. Comb. Aislada por
HUMM (Duke Univ. Mar. Stn. Bull. 3, 43-75 (1946)).
Se la llamó, por lo tanto, Cytophaga drobachiensis.
La Solicitante aisló también un gen con actividad
\beta-agarasa de Cytophaga drobachiensis
DMS 12170.
Así, la presente invención se relaciona también
con un nuevo gen agaB codificante de una
\beta-agarasa, que tiene la secuencia de ADN SEC
ID N° 1.
Este gen codifica para dos diferentes
\beta-agarasas producidas por C.
drobachiensis DSM 12170, a saber, las
\beta-agarasas denominadas proteínas AgaA y
AgaB.
La presente invención se relaciona también con
las secuencias de ácidos nucleicos, a saber, las secuencias de ADN
genómico y las secuencias de ADN o ARNm, que comprenden o
consisten en una concatenación de nucleótidos codificantes de la
proteína AgaB o de cualquiera de sus fragmentos peptídicos según se
define a continuación.
La invención se relaciona, por lo tanto, con:
- Todas las secuencias de ácidos nucleicos
codificantes de la proteína AgaB en su totalidad o de uno o más de
sus fragmentos peptídicos. Estas secuencias están preferiblemente
representadas por:
a) la secuencia de ADN SEC ID N° 1 codificante de
la proteína AgaB y sus fragmentos codificantes de los fragmentos
peptídicos de dicha proteína;
b) las secuencias de ADN que se hibridan en
condiciones de estrictez específicas con la secuencia anterior o con
uno de sus fragmentos;
c) las secuencias de ADN que, debido a la
degeneración del código genético, derivan de una de las secuencias
a) y b) anteriores y codifican para la proteína AgaB o los
fragmentos de dicha proteína, y
d) las secuencias de ARNm correspondientes.
Los ácidos nucleicos según la invención pueden
ser preparados por síntesis química o ingeniería genética usando
las técnicas bien conocidas para los expertos en este campo y
descritas, por ejemplo, en SAMBROOK y col. ("Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", publicado por Cold Spring Harbor Press,
N.Y., 1989).
Por ejemplo, las secuencias de ADN según la
invención pueden ser sintetizadas empleando los genes de
Cytophaga drobachiensis por el método de la PCR (Polymerase
Chain Reaction), según describen, por ejemplo, GOBLET y col.,
(Nucleic Acid Research 17, 2144 (1989)), usando como cebadores
oligonucleótidos sintéticos definidos a partir de la secuencia de
ADN SEC ID N° 1 ó SEC ID N° 3.
El fragmento de ácido nucleico amplificado de
esta forma puede ser entonces clonado en un vector de expresión por
las técnicas descritas en MANIATIS y col. (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, New York (1982)).
La invención se relaciona además con las células
procarióticas y las células eucarióticas transformadas con ayuda de
un vector de expresión que contiene una secuencia de ácido nucleico
según la invención. Este vector de expresión, que puede estar, por
ejemplo, en forma de un plásmido, debe contener, además de la
secuencia de ácido nucleico de la invención, los medios necesarios
para su expresión, tales como, en particular, un promotor, un
finalizador de la transcripción, un origen de replicación y,
preferiblemente, un marcador de selección. La transformación de
células procarióticas y células eucarióticas es una técnica bien
conocida para los expertos en este campo, quienes podrán fácilmente
determinar, en función del microorganismo que haya de ser
transformado, los medios necesarios para la expresión de la
secuencia de ADN según la invención.
Los microorganismos procarióticos preferidos
para los fines de la invención son Escherichia coli y
Bacillus subtilis.
Las células de Aspergillus niger,
Trichoderma viridae o Pichia pastoris pueden ser
citadas en particular como ejemplos de células eucarióticas que
resultan adecuados para los fines de la invención.
La presente invención se relaciona igualmente
con la nueva proteína AgaB de C. drobachiensis, que comprende
la SEC ID N° 2.
La nueva proteína AgaB está compuesta por 353
aminoácidos. Tras la eliminación del péptido señal, esta proteína
tiene un peso molecular calculado de 40.680 kDa.
La presente invención se relaciona además con
los fragmentos peptídicos de la proteína AgaB que resultan de la
adición supresión y/o substitución de uno o más aminoácidos, cuyos
fragmentos peptídicos tienen conservada la actividad
\beta-agarasa.
Las proteínas y fragmentos peptídicos según la
invención pueden ser obtenidos por técnicas de ingeniería genética,
que comprenden las siguientes etapas:
- cultivo de células procarióticas o células
eucarióticas transformadas por un vector de expresión que posee una
secuencia de ácido nucleico según la invención y
- recuperación de la proteína o fragmento
peptídico producido por dichas células.
\newpage
Estas técnicas son bien conocidas para los
expertos en este campo y se pueden obtener más detalles haciendo
referencia al siguiente trabajo: Recombinant DNA Technology I,
editores: Ales Prokop, Raskesh K. Bajpai; Annals of the New York
Academy of Sciences, volumen 646, 1991.
Los fragmentos peptídicos pueden ser también
preparados por síntesis química convencional de péptidos, bien
conocida para los expertos en la técnica.
La invención será ahora descrita con detalle con
la ayuda de la siguiente sección experimental.
Las técnicas descritas en estos Ejemplos, que
son bien conocidas para los expertos en este campo, están
ampliamente explicadas con detalle en el trabajo de SAMBROOK y col.
(antes citado) o en el trabajo de MANIATIS y col. (antes
citado).
Se entenderá con mayor claridad la siguiente
descripción con ayuda de las Figuras 1 a 6, en las cuales:
- La Figura 1 muestra el mapa físico del clón
genómico de Cytophaga drobachiensis que tienen actividad
agarasa.
- La Figura 2 da las secuencias de nucleótidos y
de aminoácidos deducidas del gen agarasa B que se originan a partir
de C. drobachiensis.
- La Figura 3 de acuerdo con la solicitud
principal muestra la alineación de la proteína AgaA (línea superior)
y de la proteína AgaB (línea inferior) de acuerdo con la presente
solicitud divisional originadas a partir de la cepa de C.
drobachiensis según la invención.
- La Figura 4 muestra el análisis de grupos
hidrofóbicos ("HCA") de los genes de agarasa y de otros genes
de glicósido hidrolasas.
- Las Figuras 5A a 5B muestran los perfiles de
elución de los productos resultantes de la hidrólisis de
neoagarododecaosa por la agarasa originada a partir de la cepa de
C. drobachiensis según la invención.
Se aisló la cepa DSM 12170 de frondas vivas del
alga roja Delesseria sanguinea, siendo efectuado el
aislamiento en una placa de Petri en medio de Zobell (ZOBELL, J.
Mar. Res. 4, 41-75 (1941)) que contenía un 2% de
\iota-carragenina.
Se cultivó la cepa a 25°C en medio de Zobell
(ZOBELL, J. Mar. Res. 4, 41-75 (1941)).
El protocolo empleado para extraer el ADN de la
cepa Cytophaga drobachiensis DSM 12170 deriva del de Marmur
(MARMUR, J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961)) y se
describe con detalle a continuación.
Tras el cultivo, las bacterias fueron
centrifugadas a 3.000 g durante 15 min y luego lavadas en agua de
mar estéril. Las células fueron sometidas a una centrifugación final
idéntica a la anterior y tratadas inmediatamente o congeladas a
-20°C.
Se recogieron 5 a 10 g de células, dependiendo de
la concentración celular (peso húmedo después de la
centrifugación) en 25 ml de tampón Sph (Tris-HCl 50
mM, pH 8; 25% sacarosa) y luego en 5 ml de tampón TES
(Tris-HCl 50 mM, pH 8; ácido
etilendiaminatetraacético 5 mM; cloruro de sodio 50 mM) y se
añadieron 50 mg de lisozima. Aparecieron esferoplastos tras
incubación durante 15 min a temperatura ambiente.
Se protegió inmediatamente el ADN añadiendo
ácido etilendiaminatetraacético 100 mM (concentración final) y se
continuó la incubación en hielo durante otros 10 min.
Se completó la lisis añadiendo un 2% de
dodecilsulfato de sodio (concentración final) y 25 ml de solución
de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8; ácido
etilendiaminatetraacético 100 mM; cloruro de sodio 100 mM).
Las proteínas fueron totalmente desnaturalizadas
por incubación durante 1 hora a 50°C en presencia de 40 mg de
proteinasa K. Cuando se completó esta incubación, se añadió
perclorato de sodio 1 M (concentración final) para romper los
enlaces ADN/proteína.
La solución fue desproteinizada agitándola en
presencia de 0,5 volúmenes de fenol saturado durante 5 min. Se
llevó la agitación a mano y tuvo que ser lo suficientemente vigorosa
como para formar una emulsión (sin la cual no podría producirse
ninguna extracción), pero no tan vigorosa como para romper el ADN.
Se continuó la desproteinización durante otros 5 min después de
añadir 0,5 volúmenes de cloroformo/alcohol isoamílico (24/1). Las
proteínas fueron concentradas en la interfase entre la fase acuosa
y la fase orgánica por centrifugación a 10.000 g durante 15 min a
temperatura ambiente.
La fase acuosa que contenía los ácidos nucleicos
fue transferida a un tubo limpio usando una pipeta cuya punta había
sido agrandada para no romper el ADN. Se continuó la
desproteinización y se extrajeron las trazas de fenol de la fase
acuosa agitando la solución durante 5 min en presencia de 1 volumen
de cloroformo/alcohol isoamílico (24/1).
Después de centrifugar a 10.000 g durante 5 min
a temperatura ambiente, se retiró la fase acuosa con las mismas
precauciones que antes y se precipitaron los ácidos nucleicos
vertiendo con delicadeza en 0,6 volúmenes de isopropanol (para
formar dos fases). Se recuperó el ADN de alto peso molecular con
una varilla de vidrio, se lavó en etanol al 70%, se deshidrató en
etanol absoluto y se secó al aire.
Después de secar, se disolvió el ADN en 20 ml de
tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8; ácido
etilendiaminatetraacético 1 mM). Esto llevó aproximadamente 12
horas y pudo ser facilitado mediante calentamiento a 50°C. Cuando
la solución obtenida fue opalescente -un signo de contaminación
substancial con proteínas-, estas últimas fueron eficientemente
eliminadas pasando una fracción del ADN sobre un gradiente de
cloruro de cesio en presencia de bromuro de etidio. Después de este
pase sobre el gradiente y de la eliminación del bromuro de etidio,
se cuantificó el ADN resultante. Pudo ser conservado a 4°C o
congelado a -20°C.
La composición de ADN, expresada como porcentaje
molar de guanina + citosina (% mol de G + C), fue determinada por
el método espectroscópico de ULITZUR (Biochem. Biophys. Acta 272,
1-11 (1972)) y por el método de gradiente de
cloruro de cesio en presencia de
2'-[4-hidroxifenil]-5-[4-metilpiperazin-l-il]-2,5'-bi-1H-benz-imidazol
(Hoechst 33258/Sigma) (KARLOVSKY y DE COCK, Anal. Biochem. 194,
192-197 (1991)). En el primer caso, es de un 44
\pm 1% (media de 2 manipulaciones) y, en el segundo caso, es del
48,8%. Este porcentaje molar de G + C fue calculado usando el ADN
de E. coli como patrón de referencia.
Se amplificó el ADN 16S por PCR usando el ADN
genómico de la cepa de C. drobachiensis como plantilla y
Taq polimerasa (Promega) como enzima. La mezcla de reacción
típica de PCR, con un volumen de 50 \mul, tenía la siguiente
composición: 100 ng de plantilla, 10 ng de cada uno de los dos
oligonucleótidos específicos del ADN 16S del reino de las Bacteria,
200 mM de cada uno de los dNTP (siendo dNTP desoxirribonucleósido
trifosfato), 1,5 mM de MgCl_{2}, tampón Taq y 2,5 U de
enzima. Las diferentes etapas de PCR eran las siguientes:
\bullet 6 min a 95°C (una vez),
\bullet 1,5 min a 95°C; 1,5 min a 54°C; 2,5 min
a 72°C (25 veces),
\bullet 8,5 min a 72°C (etapa de
polimerización).
El producto obtenido por PCR fue o bien clonado
primeramente y luego secuenciado, o bien secuenciado directamente
por PCR usando Thermosequenase (Amersham) como enzima, con
diferentes oligonucleótidos específicos para el ADN 16S, marcados
en el extremo 5' con rojo Texas. Las diferentes etapas de PCR eran
las siguientes:
\bullet 5 min a 97°C (una vez),
\bullet 1 min a 97°C; 1 min a 54°C; 1 min a
61°C (25 veces).
Esta secuenciación, que revela la posición
taxonómica de la capa, mostró que la cepa según la invención era
filogenéticamente muy próxima a Cytophaga uliginosa.
Se indujo la actividad agarasa de la cepa en
medio de Zobell suplementado con 2,5 mg/l de agar. Se considera que
una cepa exhibe actividad agarasa cuando digiere el agar sobre el
cual se desarrolla.
Se cultivaron las cepas con actividad agarasa en
el medio anterior a 20°C. Se centrifugó el cultivo a 1.000 g
durante 20 min. Se recuperó el sobrenadante del cultivo y se
concentró a 50 ml por ultrafiltración tangencial (umbral de corte:
10 kDa), precipitando a continuación de esta operación con sulfato
de amonio. Se resuspendió el residuo proteico en 9 ml de tampón MES
(siendo MES ácido
2-[N-morfolino]etanosulfónico). Se añadieron
entonces 2 ml de Sepharose CL6B para llevar a cabo la
cromatografía por afinidad. Se recuperaron dos fracciones, una de
las cuales se había unido a la columna de Sepharose.
Se investigó la actividad agarasa estudiando los
azúcares reductores según la técnica de KIDBY D.K. & DAVIDSON
D.J. (Arenal. Biochem., vol. 55, 321-325 (1973)) en
el sobrenadante antes de la cromatografía de afinidad (que es muy
evidentemente positiva) y en las dos fracciones obtenidas tras la
cromatografía. Se detectó actividad agarasa en cada fracción.
Se construyó una librería de ADN genómico de la
cepa C. drobachiensis. Se fraccionaron fragmentos de 4 a 10
kb originados por digestión parcial del ADN cromosómico por
NdeII en un gradiente de sacarosa. Estos fragmentos fueron
insertados en el sitio BamHI del plásmido pAT153 (TWIGG y
SHERRATT, Nature 283, 216 (1980)).
Los clones recombinantes (aproximadamente 6.000)
de la cepa E. coli DH5\alpha (SAMBROOK y col., antes
citado) fueron independientemente inoculados en placas de
microtitulación en medio LBA (medio de Luria-Bertani
(MANIATIS y col., antes citado) suplementado con ampicilina a una
concentración de 50 \mug/ml). Después de incubar durante la noche
a 37°C, estos clones fueron plaqueados a 22°C en medio Zd (5 mg/l
de bactotriptona, 1 mg/1 de extracto de levadura, 10 mg/l de NaCl,
pH 7,2) suplementado con 50 \mug/ml de ampicilina para observar
la producción de agarosa (agujero en la gelosa cuando hay
producción de agarasa).
En dos meses de cultivo a 22°C, 2 colonias
independientes, denominadas pAC3 y pAC4, hicieron un agujero en el
substrato.
En la Figura 1 se muestran los mapas de los
plásmidos correspondientes a estas colonias, donde:
- las líneas finas representan las regiones
pAT153, los segmentos en negrilla representan los insertos de C.
drobachiensis y los rectángulos blancos representan el gen de
agarasa;
- las diversas abreviaturas tienen los
significados siguientes:
| B/S: | sitio de clonación BamHI-Sau3A |
| B: | BamHI |
| Bg: | BglII |
| C: | ClaI |
| E: | EcoRI |
| H: | HindIII |
| K: | KnpI |
| Nc: | NcoI |
| Nd: | NdeI |
| Ps: | PstI |
| Pv: | PvuII |
El mapa de estos plásmidos muestra, por lo
tanto, la presencia de un fragmento común, lo que sugiere la
presencia de al menos un gen de agarasa en el genoma de C.
drobachiensis. Los plásmidos pAC3 y pAC4 comparten un fragmento
común ClaI-PstI de 5 kb (delimitado por las líneas
discontinuas en la Figura 1B).
El fragmento fue subclonado en el fagémido
pBluescript (Stratagène) y se denominó pACP5, tal como se indica en
la figura 1. Este subclón tiene un fenotipo agarasa +.
Se utilizó el plásmido pACP5 para determinar, en
ambas hebras, las secuencias nucleotídicas del gen estructural de
agarasas.
Esta secuenciación fue efectuada por una técnica
bien conocida para los expertos en este campo, a saber, el método
de Sanger (SANGER y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 74,
5463-5467 (1977)), que también se denomina el
método de didesoxinucleótidos.
Se secuenció el inserto pACP5 sobre 2.440 pb
entre los dos sitios EcoRI (delimitado por las dos letras E
en la Figura 1). Contiene un solo ORF completo de 1.059 pb,
denominado el gen agaB, y un ORF parcial. Este gen
agaB tiene la SEC ID N° 1.
En la Figura 2 se ilustra la secuencia de ácido
nucleico obtenida. Se encuentran dos hexámeros, TTGAgA y TATtcT,
compatibles con los promotores consenso "-35" y "-10" de
E. coli y separados en 17 nucleótidos, 43 nucleótidos aguas
arriba del codon putativo de inicio del gen agaB. En la
región 3' no traducida, se encuentra un bucle de finalización de la
transcripción aguas abajo del codon de parada TAA, seguido de
cuatro residuos de timidina. El segundo ORF parcial se encuentra
aguas abajo del gen agaB. Se encuentran también dos
hexámeros, TTGACc y TtaAtT, separados por 17 nucleótidos, 39
nucleótidos aguas arriba del codon de inicio putativo del segundo
ORF.
El coeficiente de Chargaff (% GC) del gen de
agarasa es de entre un 41 y un 45%, lo cual concuerda con el del
género Cytophaga encontrado por REICHENBACH y col.
(30-45%; Género Cytophaga, en el Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology, 2015-2050
(1989)).
El producto de la traducción del gen agaB
es una proteína de 353 aminoácidos con un peso molecular calculado
de 40,680 kDa y con la secuencia deducida de aminoácidos SEC ID N°
2. El análisis del perfil hidropático muestra un segmento
N-terminal hidrofóbico en un dominio de
aproximadamente 20 aminoácidos. Sin embargo, no existe ningún sitio
de escisión según la regla "(-3,-1)" de Von Heijne (VON
HEIJNE, Eur. J. Biochem. 133, 17-21. (1983); J.
Mol. Biol. 184, 99-105, (1985)). Este segmento
parece, por lo tanto, ser no escindible. Los resultados de la
investigación de péptidos señal obtenidos gracias al programa PSORT
(sistema de experto de Nakai PSORT) (NAKAI & KANEHISA,
Proteins, Structure, Function and Genetics 11,
95-110 (1991)) sugieren que la proteína posee una
secuencia señal N-terminal no escindible que actúa
como anclaje de transmembrana. También habría que observar que la
secuencia LVFCCALLLGCGD está en perfecto acuerdo con la signatura
del extremo N-terminal de las lipoproteínas
procarióticas (Prosite PS00013; BAIROCH y col., Nucl. Acids Res.
24, 189-196 (1995)). En este caso, sería posible un
sitio de escisión entre los residuos G17 y C18. Estos resultados
sugieren que AgaB podría ser una lipoproteína localizada en la
membrana interna de la célula.
El ORF que sigue al gen agaB codifica para
una proteína que tiene una homología significativa con la familia
de proteínas DnaJ (OHKI y col., J. Biol. Chem. 261,
1778-1781 (1986)) (Figura 2).
Las similitudes de secuencia entre las proteínas
AgaA de acuerdo con la solicitud principal y AgaB de acuerdo con la
presente solicitud divisional están ilustradas en la Figura 3. La
proteína AgaA tiene una identidad del 44,5% y una similitud del
65,7% con la proteína AgaB. Numerosos dominios son bastante
similares en cuanto a las secuencias primarias desde Ile110 hasta
Val287 (numeración de la secuencia de agarasa A). En particular, en
una de las unidades mejor conservadas, están presentes dos
residuos de ácido glutámico y están separados por 4 aminoácidos
(Glu147 y Glu152 en la secuencia de AgaA y Glu184 y Glu189 en la
secuencia de AgaB, en negrilla en la Figura 4). Esta organización es
característica del sitio catalítico de la familia 16 de las
glicósido hidrolasas (HENRISSAT, Biochem. J. 280,
309-316 (1991)).
No se vio similitud de secuencia con las agarasas
de la cepa Vibrio sp. JT0107 (SUGANO y col., Appl. Environ.
Microbiol. 59, 3750-3756 (1993); Biochim. Biophys.
Acta 1218, 105-108 (1994)).
No obstante, las agarasas (AgaA y AgaB) comparten
significativas identidades de secuencia con las
\beta-agarasas de Alteromonas atlantica
GenBank M73783 (BELAS y col., J. Bacteriol. 54,
30-37 (1988)) (53,5% y 48% con AgaA y AgaB,
respectivamente) y las de Streptomyces coelicolor (BUTTNER y
col., Mol. Gen. Genet. 209, 101-109 (1987)) (33%
con AgaA y AgaB).
Estas similitudes son también demostradas por
medio del método HCA (análisis de grupos hidrofóbicos)
(LEMESLE-VARLOOT y col., Biochimie 72,
555-574 (1990)). La Figura 5 ilustra la comparación
HCA entre las agarasas AgaA y AgaB, a saber, Agar A Cd y Agar B Cd,
respectivamente, en la Figura, y otras enzimas de la familia 16 de
las glicósido hidrolasas, a saber, la
\beta-agarasa de Alteromonas atlantica
(Agar Aa), la \beta-agarasa de Streptomyces
coecicolor (Agar Sc), la \kappa-carragenasa de
C. drobachiensis (Kap Cd), la laminarinasa de
Rhodothermus marinus (Lam Rm), la liquenasa de Bacillus
macerans (Lich Bm) y la xiloglucano endotransglicosilasa de
Arabidopsis thaliana (XET At).
Los dos residuos catalíticos Glu presentes en la
liquenasa de Bacillus macerans fueron tomados como puntos de
anclaje para la comparación HCA y las secuencias fueron segmentadas
tomando la conocida estructura tridimensional de esta liquenasa
como referencia.
En la Figura 5 se muestran trece segmentos de
diferente estructura (I-XIII), donde los segmentos
I, II, IX, X, XI y XIII parecen ser los mejor conservados. Puede
verse que el segmento VI es específico para las agarasas de esta
familia de glicósido hidrolasas y que el sitio catalítico se
localiza en el segmento de estructura III.
Se estudiaron las especificidades de substrato de
la agarasa de la invención analizando los productos resultantes de
la degradación de la neoagarododecaosa por la agarasa recombinante
AgaB.
\newpage
Se preparó la neoagarododecaosa como sigue: Se
hidrolizó agarosa con agarasa usando 0,32 U/mg de polímero. Se
precipitó la fracción resistente en isopropanol y se fraccionaron
los oligosacáridos solubles por cromatografía de exclusión
preparatoria en Bio-gel P2 (95 cm x 4,4 cm; 25°C;
eluyente: agua destilada). Se efectuó la detección con un aparato
para registrar el índice de refracción diferencial (ROCHAS &
HEYRAUD, Polymer Bull. 5, 81-86 (1981)). La
fracción oligomérica correspondiente a la neoagarododecaosa fue
concentrada en un evaporador rotatorio y liofilizada.
El clón recombinante de E. coli que
contenía el plásmido pAC4, fue cultivado durante 12 horas a 37°C
en 1 litro de medio LB (medio de Luria-Bertani). Las
células fueron centrifugadas a 2.000 g durante 20 minutos,
suspendidas en 30 ml de tampón MES y estalladas con ayuda de una
prensa de French a 20.000 psi. Tras centrifugar a 20.000 g durante
1 hora, los fragmentos celulares fueron desechados y el volumen de
sobrenadante reducido a 5 ml usando una célula de ultrafiltración
(Amicon, umbral de corte de 10 kDa).
Se añadieron 500 \mul de cada extracto obtenido
de esta manera a 1 ml de neoagarododecaosa en tampón MES
(50 mg/ml) y se incubaron las mezclas a 37°C durante 18 horas. Se determinó el grado de polimerización de los productos finales por cromatografía HPAE usando un detector electroquímico pulsado y una columna de intercambio aniónico (carbo-PAC PA100, Dionex) en las condiciones siguientes: velocidad de flujo: 1 ml/min; tampón A: NaOH 150 mM; tampón B: acetato de sodio 500 mM en NaOH 150 mM; gradiente:
(50 mg/ml) y se incubaron las mezclas a 37°C durante 18 horas. Se determinó el grado de polimerización de los productos finales por cromatografía HPAE usando un detector electroquímico pulsado y una columna de intercambio aniónico (carbo-PAC PA100, Dionex) en las condiciones siguientes: velocidad de flujo: 1 ml/min; tampón A: NaOH 150 mM; tampón B: acetato de sodio 500 mM en NaOH 150 mM; gradiente:
\bullet 0 a 5 min: 70% De A, 30% de B;
\bullet 5 a 16 min: 40% de A, 60% de B;
\bullet 16 a 20 min: 100% de B.
Los resultados obtenidos por cromatografía HPAE
(cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento) son
ilustrados en las Figuras 5A a 5B, en donde las diversas
abreviaturas tienen los siguientes significados:
| nC: | nanoculombio |
| DP1: | neoagarobiosa |
| DP2: | neoagarotetraosa |
| DP3: | neoagarohexaosa |
| DP4: | neoagarooctaosa |
| DP5: | neoagarodecaosa |
| DP6: | neoagarododecaosa |
| DP7: | neoagarotetradecaosa |
| DP8: | neoagarohexadecaosa. |
Los productos finales resultantes de la
hidrólisis de la neoagarododecaosa por la agarasa B son mostrados
en la Figura 5B. En comparación con la neoagarododecaosa sin enzima
(Figura 5A), el perfil de elución al cabo de 18 horas de digestión
muestra que la neoagarotetraosa (DP2) es el producto mayor y la
neoagarohexaosa (DP3) es el producto menor.
\vskip0.333000\baselineskip
<110> LABORATOIRES GOEMAR S.A. et al.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<120> Genes coding for
\beta-agarase and its use for producing agar
biodegradation enzymes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<150> FR98 07419
\vskip0.333000\baselineskip
<151>
1998-06-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 1440
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cytophaga drobachiensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (196)..(1254)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 353
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cytophaga drobachiensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 2
Claims (7)
1. Gen agaB codificante de una
\beta-agarasa, caracterizado por tener la
SEC ID N° 1.
2. Gen según la reivindicación 1,
caracterizado por codificar para una
\beta-agarasa de Cytophaga drobachiensis
depositada en la Colección DSMZ (Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares)) el 8 de Mayo de 1998 bajo
el número DSM 12170.
3. Proteína AgaB del tipo
\beta-agarasa de C. drobachiensis DSM
12170, caracterizada por tener la SEC ID N° 2.
4. Secuencia de ácido nucleico codificante de la
proteína según la reivindicación 3.
5. Secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 4, caracterizada por consistir en:
a) la secuencia de ADN SEC ID N° 3 codificante de
la proteína AgaB;
b) las secuencias de ADN que se hibridan en
condiciones específicas de estrictez con la secuencia anterior;
c) las secuencias de ADN que, debido a la
degeneración del código genético, derivan de una de las secuencias
a) y b) anteriores y codifican para la proteína AgaB; o
d) las secuencias de ARNm correspondientes.
6. Vector de expresión, caracterizado por
contener una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 4 y 5 y los medios necesarios para su
expresión.
7. Microorganismos o células hospedadoras
transformados por un vector de expresión según la reivindicación
6.
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| VAN DER MEULEN, H.J. et al. "Production and characterization of the agarase of cytophaga-flevensis". ANTONIE VAN LEEUWENHOEK, 1975, Vol. 41, Nº 4, páginas 431-447. Ver todo el documento. * |
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