KR100352146B1 - 아퀴펙스 파이로필러스 유래의 내열성 파이로포스파타아제유전자 및 그의 아미노산 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아퀴펙스 파이로필러스 (Aquifex pyrophilus) 유래의 내열성 파이로포스파타아제(pyrophosphatase)에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 아퀴펙스 파이로필러스로부터 유래하는 내열성 파이로포스파타아제('AaePpase'라 함)를 코딩하는 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열, 그리고 상기 내열성 파이로포스파타아제를 정제하는 방법에 관한 것이다.

상기 클로닝된 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정한 결과,ApyPpase 유전자는 종지코돈을 포함하여 총 534 bp이며, 177개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하는 것으로 확인되었다.

본 발명의ApyPpase는 DNA 씨퀀싱(sequencing)의 효율 증진과 PCR(폴리머라아제 연쇄 반응, polymerase chain reaction)에 의한 DNA 증폭 효율을 높이기 위해 내열성 DNA 중합효소와 함께 각종 유전공학연구 및 유전병 진단 등에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

아퀴펙스 파이로필러스 유래의 내열성 파이로포스파타아제 유전자 및 그의 아미노산 서열{A Gene Coding for Thermostable Pyrophosphatase from Aquifex pyrophilus and Amino Acid Sequence Deduced Therefrom}

본 발명은 아퀴펙스 파이로필러스 (Aquifex pyrophilus) 유래의 내열성 파이로포스파타아제(pyrophosphatase)에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 아퀴펙스 파이로필러스의 내열성 파이로포스파타아제를 코딩하는 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열, 그리고 상기 내열성 파이로포스파타아제의 정제 방법에 관한 것이다.

파이로포스파타아제 (Inorganic pyrophosphatase, 이하, 'Ppase'라 함)는 파이로포스페이트가 포스페이트로 가수분해되는 반응을 촉매하는 효소이다 (Lahti, R.,Microbiol. Rev. 47: 169-179 (1983)). Ppase는 박테리아, 효모, 식물 등에 폭넓게 분포하고 있는 효소로써 활성을 나타내기 위해서는 Mg2+등을 비롯한 2가 양이온이 필요하다. Ppase는 대장균을 비롯한 효모나 기타 다른 종에서 활발히 연구되고 있는 효소의 한 종류로써 세포의 에너지대사와 관련하여 매우 중요한 역할을 하는 효소이다.

Ppase의 활성부위(active site) 구조나 촉매 기작은 여러 종에서 매우 잘 보존되어 있고, 촉매는 인산화된 효소(phosphorylated enzyme)의 생성 없이 진행되며 높은 활성을 갖기 위해서는 2가 양이온이 반드시 필요하다.

이러한 Ppase는 분자생물학 연구에 있어 염기서열을 결정하는 DNA 씨퀀싱이나, PCR에 의한 DNA 증폭시에 DNA 중합효소와 함께 사용함으로써 DNA 중합반응에 의해 생성되는 파이로포스페이트를 쉽게 제거시킴으로써 반응 효율을 높일 수 있기 때문에 산업적으로 유용하다. 실제로 DNA 씨퀀싱에 DNA 중합효소와 Ppase를 함께 사용하여 파이로포스포롤리시스(pyrophosphorolysis)에 의한 종지 피크(termination peak)의 탈락을 방지하여 씨퀀싱 효율을 높인 결과가 보고되어 있다[참조: Tabor, S. and Richardson, C. C.,J. Biol. Chem., 265: 8322-8328 (1990)].

그러나, 종래의 Ppase들은 대부분 중온균 유래의 효소이므로 고온에서 반응시키는 DNA 씨퀀싱이나 PCR에서 쉽게 활성을 잃어버린다. 따라서 고온에서 안정한 내열성 Ppase가 필요하게 되었다. 현재까지 보고된 내열성 Ppase에 대한 연구로는주로 70-75℃에서 생육하는 써머스(Thermus) 속에서, 특히 써머필러스 (Thermus thermophilus) HB8 등에서 상세히 보고되었다(Satoh, T., et al.,J. Biochem. 124: 79-88 (1988)).

그러나, 중온균들로부터 생성되는 Ppase의 연구에 비하여, 내열성 유래의 Ppase에 관한 연구는 미미할 정도이다. 또 아퀴펙스 에우리쿠스(Aquifex aerolicus)의 전체 게놈 씨퀀싱이 완료됨[참조: Deckert, G., et al.,Nature, 392: 353-358(1998) 또는 GenBank accession numbers AE000745]에 따라AaePpase의 유전자가 추정되었지만, 아직 그 효소적 특성이 보고되지 않은 상태이다. 따라서 써머스 속보다 더 높은 85-90℃의 고온에서 생육하는 아퀴펙스 파이로필러스로부터 새로운 내열성 Ppase를 개발하여야 할 필요성이 대두되고 있다.

이에, 본 발명자들은 다른 써머스 속 균주보다 더 고온에서 생육하는 초고온균인 아퀴펙스속 균주에서 기존의 Ppase와는 다른 새로운 내열성 Ppase를 코딩하는 유전자를 분리하고자 연구 노력한 결과, 아퀴펙스 파이로필러스 (Aquifex pyrophilus)로부터 내열성 Ppase 유전자를 분리한 데 이어, 상기 유전자의 염기서열과 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하여 종래의 Ppase와는 상이한 염기서열을 가지는 새로운 효소임을 확인하고, 또 대장균에서 상기 유전자를 발현시킨 후, 열처리 등의 방법으로 정제하여 특성을 조사한 결과 내열성을 갖는ApyPpase임을 다시 한 번 확인하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 아퀴펙스 파이로필러스 (Aquifex pyrophilus)로부터 유래하는 새로운 내열성 Ppase를 코딩하는 유전자 서열과 그 서열로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 유전자를 이용하여 유전공학 기술에 의한 대량생산이 가능하게 하여 보다 저렴한 가격으로 상기 효소의 다양한 활용을 가능하게 하는데 있다.

도 1의 (A)는 아퀴펙스 파이로필러스 염색체 DNA를EcoR1,HindIII,PstI,SacI,XhoI 의 제한효소를 절단하여 전기 영동한 결과이다. (B)는 아퀴펙스 에우리쿠스의 파이로포스파타아제(이하,'AaePpase'라 함) 유전자를 프로브로 사용하여EcoR1,HindIII,PstI,SacI,XhoI의 제한효소를 처리하여 아가로스 젤 전기영동한 아퀴펙스 파이로필러스 염색체 DNA를 하이브리다이제이션을 한 결과이다.

도 2는 아퀴펙스 파이로필러스의 파이로포스타아제(이하 'ApyPpase'라 함)의 유전자를 포함하고 있는 3.5 kbHindIII DNA 절편 및 2.0 kbSacI 절편이 삽입된 클론의 제한효소 지도를 나타낸다.

도 3은ApyPpase를 코딩하는ApyPpase 유전자의 리딩프레임의 염기서열(서열 1)을 나타낸다.

도 4는 상기 도 3의 염기서열로부터 유추되는ApyPpase의 아미노산 서열(서열 2)이다.

도 5는ApyPpase의 아미노산 서열을 다른 종의 Ppase의 아미노산 서열과 비교하여 나타낸 것이다.ApyPpase는 Apy(서열 3),AaePpase는 Aae(서열 4), 써머스 써머필러스 Ppase는 Tth(서열 5), 대장균의 Ppase는 Eco(서열 6)로 각각 나타내었으며, 박스부분은 아미노산 서열보존 부위이다.

도 6은ApyPpase 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 대장균에서ApyPpase 생산을 위한 재조합 플라스미드 pAPYP를 구축한 그림이다.

도 7은ApyPpase를 정제단계별로 SDS-PAGE 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

도 8은 정제된ApyPpase의 온도에 따른 상대적인 활성을 나타내는 그래프이다.

도 9는 정제된ApyPpase의 pH에 따른 상대적인 활성을 나타내는 그래프이다.

본 발명자들은 이미 전체 염기서열이 결정된 아퀴펙스 에어리쿠스 (Aquifex aolicus)로부터AaePpase유전자를 코딩하고 있는 부위의 5'말단과 3'말단의 프라이머를 제작하고, PCR을 이용해AaePpase유전자를 증폭시킨후,ApyPpase 유전자를 찾기 위한 프로브로 사용하였다. 먼저 아퀴펙스 파이로필러스 (Aquifex pyrophilus) (참조: Stteter, K. O., et al.,System Appl. Microbiol., 4: 535-551 (1983))의 제노믹 DNA를 여러가지 제한효소를 처리하여 전기영동한 후, 상기의 프로브로 하이브리다이제이션(hybridization)을 수행한 결과, 약HindIII의 3.5kb와SacI의 약 2.0kb절편에서ApyPpase 유전자일 가능성을 보인 시그널이 나타났다. 상기의HindIII의 3.5kb와SacI의 약 2.0kb 절편을 각각 클로닝하여, 전체ApyPpase 유전자를 클로닝하고, 염기서열을 결정한 다음, 피씨진(PCGENE) 및 NCBI-블라스트 서치(NCBI-blast search)로 분석하여,ApyPpase를 코딩하는 총 531bp (종지코돈 포함 534bp)의 염기서열을 포함하는ApyPpase 유전자의 리딩 프레임(reading frame)을 결정하였고, 상기의 염기서열로부터 유추되는 아미노산 서열은 177개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하는 것으로 확인되었다.

본 발명자들은 결정된ApyPpase 유전자의 염기서열로부터 5'-말단 및 3'-말단 염기서열에 각각 상보적인 프라이머를 합성하여 PCR 방법으로ApyPpase 유전자를 증폭시켜, 발현벡터 pJR에 클로닝하여ApyPpase 생산을 위한 재조합 플라스미드 pAPYP를 구축하였다. 이 플라스미드를 대장균에 형질전환시킨 후, 대장균에서 가장 많이ApyPpase가 발현되는 콜로니를 선별하였다. 대장균에서 발현된ApyPpase를 열처리와 DEAE-세파셀(sephacel)을 이용하여 정제한 후, 여러 가지 특성을 조사하였다.ApyPpase의 SDS-PAGE에서 결정한 분자량은 약 24,500 달톤이었다. 최적온도는 70℃였고, pH는 6.8에서 8.8에 이르기까지 넓은 범위에서 활성을 지녔지만, 그 중 pH 8.4에서 가장 높은 활성을 보였다. 최적 활성을 위해서는 마그네슘이나 코발트, 아연 등의 2가 양이온을 반드시 필요로 하며 이들의 최적 농도는 1mM정도이다.

한편, 상기의ApyPpase 유전자는AaePpase 유전자와 비교해볼때 G+C 함량이 약간 높았으며,ApyPpase 유전자는 다른 종의 Ppase의 아미노산 서열과 비교 분석한 결과,ApyPpase가 다른 종들로부터 유래한 Ppase들과는 상이한 아미노산 서열을 지니고 있는 새로운 Ppase임이 확인되었다.

(실시예)

본 발명을 이하의 실시예를 들어 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예1: 아퀴펙스 파이로필로스 균주의 배양

아퀴펙스 파이로필로스 균주 (DSM 6858)를 Stteter SME 배지[참조: Stteter, K. O., et al.,System Appl. Microbiol., 4: 535-551 (1983)] 조성을 약간 변형하여 키웠다. SME (NaCl 30g, MgSO4 7H2O 7g, MgCl2 6H2O 5.5g, KCl 0.65g, Na2S2O3 2.0g, NaBr 0.1g, NaHCO3 2.0g, NH4Cl 0.15g, K2HPO4 0.15g, CaCl2 2H2O 0.5g, Trace element 용액 10.0㎖) 배지를 준비하고 5N 황산으로 pH를 6.5-6.8로 조절하였다. 120㎖의 혈청 버틀(serum bottle, Wheaton Co., USA)에 20㎖의 배지를 넣고 이 균주의 기질인 H2: CO2 : O2 (300kPa; 각 혼합물 80: 20: 0.5 by % volume) 가스로 배지를 포함한 혈청 버틀의 내부 가스를 충분히 교환하여 고무 병마개로 막은 후, 알루미늄 링으로 고무 병마개를 고정하여 121℃에서 15분간 멸균하였다.

멸균된 배지에 주사기를 이용하여 아퀴펙스 파이로필로스 균주를 1%접종하고, 여기에 다시 상기의 H2: CO2 : O2 가스를 300 kPa되도록 충진시킨 후, 85℃에서 12시간 정도 배양하였다.

실시예2: 아퀴펙스 파이로필로스 제노믹 DNA 분리

제노믹 DNA 분리는 마르무어(Marmur) 방법을 다음과 같이 약간 변형하여 수행하였다[참조: Marmur, J.,J. Mol. Biol., 3: 208-218 (1961)]. 200㎖의 진탕배양한 균체를 원심분리로 회수하고 SETB (20% 자당 / 50mM Tris-HCl (pH 7.6) / 50mM EDTA) 완충액 4㎖로 현탁시켜 5회 동결과 해동으로 세포막을 약화시킨 후, 최종 10㎎/㎖로 라이소자임과 100㎍/㎖의 RNase A를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 여기에 3㎖의 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1)을 첨가하여 37℃에서 하룻밤 천천히 진탕하고 TE포화 페놀 및 클로로포름/아밀 알코올로 DNA를 추출하여 1/10배의 3M 소듐 아세테이트(pH 5.2)와 2배의 에탄올을 가하여 DNA를 추출하였다. 추출한 제노믹 DNA를 70% 에탄올로 3회 세척하여 진공건조시킨 후 TE [10mM Tris-HCl (pH7.6) / 1mM EDTA] 완충액으로 녹이고 100㎍/㎖로 프로테나아제 K를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응 후 페놀로 추출하고 에탄올 침전을 행하여 TE 완충액에 녹인 후, O.D 260nm에서 흡광도를 측정하여 정량하여 사용하였다.

실시예3 : 서던 블롯 하이브리다이제이션

아퀴펙스 파이로필러스의 제노믹 유전자로부터ApyPpase 유전자를 선별하기 위한 서던블롯의 프로브로 사용하고자, 이미 전체 염기서열이 결정된 아퀴펙스 에어리쿠스(Aquifex aolicus) 제노믹 DNA를 로버트 후버(Robert Huber)(참조: Deckert, G., et al.,Nature, 392: 353-358 (1998))로부터 입수하였다. 상기의 제노믹 DNA와AaePpase유전자를 코딩하고 있는 부위의 5'말단과 3'말단의 프라이머를 합성하여 PCR 방법으로AaePpase 유전자를 증폭하였다[참조: GenBank accession numbers AE000745].

상기의 증폭된AaePpase 유전자의 방사선 동위원소의 라벨링은 뵈링거 만하임(Boehringer mannheim)의 랜덤 프라임드 DNA 라벨링 키트(random primed DNA labelling kit)를 이용하여 수행하였다. 상기의 증폭된AaePpase 유전자 0.25 g을 100℃에서 5분 간 끓인 후 얼음에서 급냉시켜 3㎕의 dATP, dGTP, dTTP 혼합물을 3㎕, 반응 혼합물을 2㎕, 50μCi [α32P］dCTP를 6㎕첨가하여 최종 볼륨이 20㎕가 되게 하고, 여기에 1 ㎕ 클레나우 효소(Klenow enzyme)를 넣어 37℃에서 16시간반응시켜 표지하고 세파덱스 G-25 미니컬럼(Sephadex G-25 mini-column)으로 미반응의 [α32P］dCTP를 제거한 후, 프로브로 이용하였다. 상기에서와 같이 분리한 아퀴펙스 파이로필러스(Aquifex pyrophilus)의 제노믹 DNA를EcoR1,HindIII,PstI,SacI,XhoI 제한효소로 각각 처리하고 0.7% 아가로오스 젤에 전기영동하여 분리한 다음 UV 램프 하에서 사진을 찍었다 (참조: 도 1 (A)). 도 1에서 레인 E는EcoR1, 레인 H는HindIII, 레인 P는PstI, 레인 S는SacI, 레인 X는XhoI으로 절단한 것을 각각 나타낸다.

다음, 상기 젤을 0.5N NaOH/0.1N NaCl 수용액으로 60분간 변성시켜 증류수로 30분간 세척한 후, 페이퍼 타올 사이에 넣고 압축하여 수분을 가능한 제거하여, 약 1mm 두께가 된 젤을 와트만 3MM 페이퍼에 옮기고 60℃에서 30분간 진공건조시켜 멤브레인(membrane) 상태로 만든다[참조: 권석태 등, 분자생물학노트-유전공학실험서, 한국과학기술연구원 유전공학연구소 발행, 도서출판 한림원 인쇄 (1991)]. 이 아가로스 젤 멤브레인을 증류수로 세척한 후, 프리하이브리다이제이션(prehybridization) 용액 (6X SSC, 5X Denhardt's 용액, 50mM 인산 나트륨 완충액 (pH6.5), 고주파처리된 연어 고환 DNA (Sigma, typeIII Na salt) 100㎍/㎖) 내에 담구어 65℃로 1시간 프리하이브리다이제이션 반응시킨 후, 이 아가로스 젤 멤브레인을 프로브를 첨가한 하이브리다이제이션 용액 (프리하이브리다이제이션 용액과 동일함)에 넣어 45℃에서 16시간 하이브리다이제이션을 수행하였다.

하이브리다이제이션하지 않은 프로브를 세척하기 위해 실온에서 2X SSC 용액으로 10분씩 2회, 1X, 0.5X, 0.1X SSC 용액으로 각각 10분씩 수행하였다. 이것을 공기 중에 건조시킨 후 오토레디오그래피를 수행하였다. 필름을 현상한 결과, 도 1 (B)와 같이HindIII로 절단한 경우에는 약 3.5kb,SacI으로 절단한 경우에는 약 2.0kb에서 각각 하이브리다이제이션된 양성 시그널이 나타났다.

실시예4: Apy Ppase 유전자의 클로닝

상기HindIII와SacI으로 절단한 아퀴펙스 파이로필로스 제노믹 DNA를 저융점 아가로오스젤에 제한효소로 절단한 DNA와 DNA 마커를 같이 전기영동하고, 전개된 젤 상에서 원하는 크기 DNA에 해당하는 부분, 즉,HindIII 3.5kb,SacI 2.0kb 절편들을 각각 회수하여, 이렇게 얻은 젤 조각을 65℃로 가열하여 완전히 녹이고 동량의 TE 완충액을 가한 후 다시 5분간 가열한다. 이 DNA/아가로오스가 녹은 용액에 동량의 페놀로 2회, 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1) 혼합용액으로 1회 처리하고, 1/10배 5M 아세트산 칼륨, 2배의 에탄올을 가하여 -70℃에서 30분간 방치한 후, 원심분리에 의해 DNA 단편을 회수하였다. 저융점 아가로스 젤로부터 회수한 목적의 DNA 단편을 p블루스크립트 SK+의 동일한 제한효소 부위에 각각 삽입하여 샘브루크의 방법에 준하여 T4 DNA 리가아제를 사용하여 16℃에서 하룻밤 라이게이션(ligation) 하였다(참조: Sambrook, J., et al., inMolecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). 또, 라이게이션된 플라스미드의 대장균내 형질 전환은 일렉트로포레이터를 이용하였고, 상기의 조작된 p블루스크립트 SK+ 플라스미드로 대장균을 형질전환시켜 각각 약 1000개 이상의 콜로니를 얻었으며, 상기 실시예 1의 서던블롯에 사용한 것과 동일한 프로브를 사용하여 콜로니 하이브리다이제이션(hybridization)을 다음과 같이 수행하였다.

콜로니 하이브리다이제이션은 더글라스 하나한의 방법(참조: Hanahan, D. and Meselson, M., Gene 10: 63-67 (1980))에 따라 앰피실린(100 ug/ml)이 첨가된 LB 플레이트(plate)에 니트로셀룰로오스 필터를 깔고 그 위에 형질전환체 (transformant)인 콜로니를 형성시켜 콜로니가 약 1mm 크기로 생육하였을 때 이것을 주형으로 사용하여 또 다른 니트로셀룰로오스 필터 위에 레플리카(replica)를 찍어 앰피실린(100 ug/ml)이 첨가된 새로운 LB 플레트에서 생육시킨다. 이렇게 레플리카를 찍어 니트로세룰로오스 필터 위에서 생육된 콜로니들을 0.5N NaOH로 5분간 변성시킨 후, 1M Tris-HCl (pH7.6)/1.5M NaCl로 중화시켜서 80℃에서 2시간 베이킹한 다음, 위의 아가로스젤 멤브레인 하이브리다이제이션에서 기술한 것과 동일한 방법으로 프리하이브리다이제이션 및 하이브리다이제이션을 수행하였다. 또, 상기와 동일한 방법으로 멤브레인을 세척하여 공기 중에 건조시킨 후 오토레디오그래피를 수행하여 프로브와 하이브리다이제이션을 하는 콜로니를 선별한 결과HindIII 절편이 삽입된 콜로니에서 14개,SacI 절편이 삽입된 콜로니에서 20개의 양성 클론(positive clone)을 각각 얻을 수 있었다.

상기의 양성 클론들을 재확인하기 위해 샘브루크의 방법에 준하여 다음과 같이 플라스미드를 분리하였다. 양성 클론을 함유하고 있는 각각 10개씩의 균주들을 항생제 앰피실린(100 ug/ml)이 첨가된 LB 배지 3㎖에 접종하여 하룻밤 배양하고 원심분리하여 균체를 회수한 후, 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 10mM EDTA, 4㎎/㎖ 라이소자임 용액 100㎕에 현탁시켜 상온에서 5분간 방치하였다. 0.2N NaOH/1%SDS 용액 200㎕을 가하여 얼음에서 5분간 방치한 후 5M 아세트산 칼륨 용액 150㎕을 가하고 얼음에서 5분간 처리하였다. 이를 원심분리(4℃, 12000 rpm, 5분)하여 상층액만을 모으고, 동량의 페놀을 1-2회, 클로로포름/이소아밀 알코올 (24:1) 혼합 용액으로 1회 처리하고, 2배의 에탄올을 가하여 잘 섞어준 후 상온에서 5분간 방치하였다. 이를 원심분리하여 침전물을 얻고 70% 에탄올로 씻어준 다음 완전히 건조하여 0.5㎍/㎖의 DNase 없는(free) RNase를 포함한 TE 완충액에 DNA 침전물을 녹이고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이렇게 하여 얻어진 DNA를 전기영동하여 양을 확인한 후 실험에 들어갔다. 먼저 3.5 kbHindIII 단편이 삽입되었다고 예상한 플라스미드들을 제한효소HindIII로 절단한 후, 아가로스 젤에 전기영동하여 확인한 결과, 예상한 약 3.5 kbHindIII 절편이 나타났으며, 또 상기 실시예1의 서던블롯에 사용한 것과 동일한 프로브를 사용하여 아가로스 젤 하이브리다이제이션을 실시한 결과, 3.5 kbHindIII 절편에 하이브리다이즈한다는 것을 확인하였다. 따라서 3.5 kbHindIII 절편이 삽입된 플라스미드를 pAPHP라고 명명하였다. 그리고, 2.0 kbSacI 단편이 삽입되었다고 예상한 플라스미드들을 제한효소SacI 으로 절단한 후, 아가로스 젤에 전기영동하여 확인한 결과 예상한 약 2.0 kbSacI 절편이 나타났으며, 또 상기 실시예1의 서던블롯에 사용한 것과 동일한 프로브를 사용하여 아가로스 젤 하이브리다이제이션을 실시한 결과, 2.0 kbSacI 절편에 하이브리다이즈한다는 것을 확인하였다. 따라서 2.0 kbSacI 절편이 삽입된 플라스미드를 pAPSP라고 명명하였다. 상기의 pAPHP와 pAPSP 플라스미드를 제조한 다음,ApaI,BamHI,HindIII, SacI, PstI 등의 제한효소를 이용하여 절단하고 유전자 사이즈 마커와 함께 전기영동하여 각 크기를 비교함으로써 제한효소지도를 작성하였다. 그 결과, 도 2와 같은 제한효소 지도를 얻었다.

실시예5: Apy Ppase 유전자 염기서열의 결정 및 아미노산 서열 비교

서던블롯을 하여 양성신호가 나타난 플라스미드 pAPHP (3.5 kbHindIII 절편)와 pAPSP (2.5 kbSacI절편)를 T3 프라이머와 T7 프라이머를 사용하여 생거의 디데옥시 사슬 종결법(Sanger's dideoxy chain termination method)으로 각 클론의 염기서열을 결정하고, 이를 컴퓨터 프로그램인 피씨진(PCGENE)으로 분석한 다음, 인터넷 프로그램인 NCBI-블라스트 써치(blast search)의 서열 분석결과,HindIII 절편과SacI 절편사이에ApyPpase 유전자가 코딩되어 있음을 알 수 있었다.ApyPpase 유전자는 총 543bp(종지코돈포함)의 염기서열을 포함하였고 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하였다 (참조: 도 3 및 4).

상기의ApyPpase 유전자의 G+C 함량은 49.8 %이며,AaePpase 유전자의 G+C함량 46.2 %와 비교해 볼 때 G+C 함량이 비교적 높았으며, 이러한 차이는 주로 코돈 이용법에서 제 3번째 코돈에서 차이가 많이 보였다.ApyPpase 유전자는 총 177개의 아미노산으로 구성된 단백질로 보이며, 다른 종의 Ppase의 아미노산 서열과 비교 분석한 결과,ApyPpase가 다른 종들로부터 유래한 Ppase들과는 상이한 아미노산 서열을 지니고 있는 새로운 Ppase임이 확인되었다. 아미노산 서열 비교 결과ApyPpase는AaePpase와는 약 88%의 높은 상동성을 보였고 같은 고온균에 속하는 써머스 써머필러스 HB8의 Ppase와는 43.8%, 대장균의 Ppase와는 52.8%의 상동성을각각 나타내었다 (참조: 도 5). 도 5에서ApyPpase는 Apy,AaePpase는 Aae, 써머스 써머필러스 Ppase는 Tth, 대장균의 Ppase는 Eco로 각각 나타내었으며, 박스부분은 아미노산 서열 보존 부위이다.

실시예6: Apy Ppase 유전자의 발현벡터의 구축

결정된ApyPpase 유전자의 염기서열로부터 5'-말단 및 3'-말단 염기서열에 각각 상보적인 프라이머 P1과 P2를 각각 합성하여, 아퀴펙스 파이로필러스의 제노믹 DNA로부터 PCR방법으로ApyPpase 유전자를 증폭시켰다. 프라이머 P1은ApyPpase유전자의 개시코돈(ATG)을 포함한 31개 염기로 구성되어 있으며, PCR에 의해 증폭된 DNA가 5'-말단에EcoRI부위를 갖도록 설계하였다 (5'NNNNGAATTCATGGGATACAAGGACTTACCC3'). 프라이머 P2는ApyPpase 유전자의 3'-말단의 종지코돈(TAA)과 상보적인 TTA를 포함하는 34개 염기서열로 구성되어 있으며, PCR에 의해 증폭된 DNA가 3'말단에SalI부위를 갖도록 설계하였다(5'NNNNGTCGACTTACTTTCCACCTTTTTTGTAGTT3').

아퀴팩스 파이로필러스 제노믹 DNA를 주형 DNA로 하고 프라이머 P1과 P2 를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR의 반응화합물(50㎕)은 1㎍의 아퀴팩스 파이로필러스 제노믹 DNA, 1μM의 각각의 프라이머 P1과 P2, 200μM dNTPs, 50mM KCl, 20mM Tris-HCl (pH8.3), 1mM MgCl2이다. 이 반응 화합물 위에 미네랄 오일을 한 방울 적하시킨 후, 100℃에서 5분간 주형 DNA를 변성시켰다. 여기에 Taq DNA 폴리머라아제 2.5 단위를 첨가한 후에 94℃에서 5분, 45℃에서 1분, 72℃에서 1분, 이 순서를 반복하여 30회 PCR 로봇을 이용하여 수행한 후, 마지막회(31회)에는 72℃로 5분 동안 폴리머라이제이션 반응을 길게 하였다. 반응이 끝난 후, 상층부의 오일을 제거하고, 동량의 페놀 및 클로로포름으로 처리한 후 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상층액의 2배의 에탄올을 가하여 잘 섞어준 후 -70 ℃에 30분간 반응 후 이를 원심분리하여 침전물을 얻고 70% 에탄올로 씻어준 다음 완전히 건조하여 TE 완충액에 DNA 침전물을 녹이고, 위의 PCR 생성물을EcoRI과SalI 제한효소로 절단 한후 발현벡터 pJR (참조: Kwon, S.-T., et al.,Mol. cells7: 264-271 (1997))의 동일한 부위에 삽입하여ApyPpase 생산을 위한 재조합 플라스미드 pAPYP를 구축하였다(참조: 도 6). 이를E. coliDH5α에 트랜스포메이션하였다. 형질전환체들로부터 플라스미드를 분리하여EcoRI과SalI 효소처리를 하여ApyPpase 유전자가 정확히 삽입되어 정확하게 구축된 플라스미드 pAPYP를 함유하고 있는 재조합된 균주를 선별하였다.

실시예7: Apy Ppase의 활성 측정

상기 실시예 4에서 선별된ApyPpase유전자가 재조합된 균주들의ApyPpase 활성 측정은 하이노넨과 라티의 방법 (참조: Heinonen, J. K. and Lahti, R. J.,Anal. Biochem. 113: 313-317))을 약간 변형하여 다음과 같이 실시하였다.ApyPpase유전자가 재조합된 균주를 앰피실린 (100 ug/ml)이 첨가된LB 배지 3ml에 접종하여 A600에서 0.6-0.8까지 키운 후 IPTG 유도에 의해 발현시키고 6시간 동안 배양하였다. 그리고 모든 균주의 세포의 양을 일정하게 하기 위해 A600에서 1로 맞춰준 후, 그에 해당하는 볼륨의 세포를 회수하여 활성측정을 하였다.

회수된 세포를 고주파음 분해(sonication) 완충액 (10mM Tris-HCl pH8.0/1mM MgCl2) 1㎖에 현탁한 후 고주파음 분해기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 원심분리(15,000rpm, 15분)하여 상층을 회수하고, 대장균 유래의 Ppase를 포함한 단백질을 제거하기 위해 85℃에서 20분간 열처리를 하였다. 열처리한 샘플을 원심분리(15,000rpm, 15분)하여 회수된 상층을 조효소액으로 이용하였다. 상기의 조효소액을 100㎕를 취하고 20㎕의 50mM 파이로인산 나트륨 용액을 첨가하여 80℃에서 10분간 반응시킨 후, 효소반응을 멈추기 위하여 0.1M 시트르산 100 ㎕를 첨가하였다. 여기에 발색반응에 의한 포스페이트 함량을 측정하기 위해 AAM 용액 (1 볼륨의 몰리브덴산 암모늄 용액, 1 볼륨의 5N 황산용액, 2 볼륨의 아세톤)을 1ml 첨가하여 충분히 혼합한 후, 1M 시트르 산 100㎕를 첨가하고 420nm에서 흡광도를 측정하여 그 중 활성이 높은 균주를 선별하여 본 실험에 들어갔다.

실시예8: Apy Ppase유전자의 발현 및 간단한 효소정제 방법

상기 실시예 5에서 선별된 재조합균주(E. coliDH5α/pAPYP)를 항생제 앰피실린 (100 ug/ml)이 첨가된 LB 배지 3ml에 접종하여 37℃로 12시간 정도 배양한 후, 다시 앰피실린 (100 ug/ml)이 첨가된 LB 배지의 10ml에 1%되게 접종을 하여 5시간 정도 전배양한 후, 1ℓ의 앰피실린(100 ug/ml)이 첨가된 LB 배지에 1% 접종하여 본배양에 들어갔다. 본배양 중, 세포농도가 A600에서 0.8까지 배양한 후, 최종 농도 0.5mM의 IPTG를 첨가하여 7 시간 배양하여ApyPpase 유전자의 발현을 유도하였다. 1ℓ를 키운 균체를 원심분리(6000rpm, 10분, 4℃)하여 세포를 회수한 후, 1mM PMSF를 포함한 용액 A(10mM Tris-HCl, pH7.4/ 1mM MgCl2)로 세포를 현탁시켜 고주파음 분해로 세포를 파쇄하고 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 이 파쇄과정을 3회 정도 반복하여 상층액을 회수하였다. 이 상층액의 핵산을 제거하기위해 황산 스트렙토마이신을 상층액 볼륨의 1%정도 농도로 처리하여 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 15,000rpm에서 약 30분간 원심분리하였다. 그 상층액을 회수하여 85℃에서 30분간 열처리한 후, 또 다시 원심분리하여E. coli유래의 단백질을 제거하였다.

상층액을 용액 A로 완전히 투석한 후, 용액 A로 평형화시킨 DEAE-세파셀 컬럼에 로딩한 후. 충분히 용액 A로 결합하지 않은 단백질들을 씻어주었다. 그 다음, NaCl 용액을 이용하여 0-1M 농도까지 점차적으로 변화하도록(gradient) 결합된ApyPpase을 분리, 정제하였다. 상기 실시예5의ApyPpase 활성측정 방법으로 용출된 분획들을 확인하여 24시간정도 투석시킨 후, SDS-PAGE 전기영동(참조: Laemmli, U. K.,Nature227: 680-685 (1970))하였으며 그 결과를 도 7에 나타냈다. 도 7에서 레인1은 단백질 분자량 마커들이고, 레인2는E.coliDH5α이고, 레인 3은 대장균에서ApyPpase 유전자를 발현시키지 않은 샘플을 고주파음 분해로 파쇄시킨 시료, 레인 4는 대장균에서ApyPpase 유전자를 발현시킨 샘플을 고주파음 분해로 파쇄시킨 시료 , 레인 5는 레인 4의 시료를 80℃에서 20분간 열처리하여 대장균 유래의 단백질을 원심분리에 의해 제거한 시료, 레인 6은 레인4의 샘플을 DEAE-세파셀 컬럼 크로마토그래피로 정제한 시료들을 각각 나타낸다. 도 7의 SDS-PAGE 전기영동에서 분자량은 약 24,500 달톤의 써브유니트를 갖는 것으로 나타났다.

실시예9 : Apy Ppase의 특성조사

상기 실시예 8의 방법으로 정제된ApyPpase를 이용하여 효소특성 조사를 수행하였으며,ApyPpase 활성은 상기의 실시예5의 방법을 토대로 측정하였다. 정제된ApyPpase의 최적 온도를 측정하는데 있어 온도범위는 40℃에서 90℃에 이르기까지 10℃ 간격으로 조사를 하였다. 그 결과 70℃부터 90℃에 이르기까지는 다양하게 활성을 나타내었으나 그 중, 70 ℃가 가장 최적의 활성을 보였다 (참조: 도8).

ApyPpase의 최적 pH를 측정하기 위하여 pH 3.0-11.0 범위에서 0.4간격으로, 조효소액 100㎕에 각각의 pH별 완충액을 10mM 농도로 하여 섞은 후, 50mM 파이로인산 나트륨 용액 20㎕를 넣고 70℃에서 10분간 반응시켜 상기 실시예 5의ApyPpase의 활성측정 방법으로 효소활성을 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 이때 pH 3.0-6.0은 50mM 시트르산염 완충액(●)을, pH 6.8-9.0은 50mM Tris-HCl 완충액(○)을, pH 8.5 - pH11.0은 글리신-NaOH 완충액(▼)을 각각 이용하였다. 그 결과 Tris-HCl 완충액에서 높은 활성을 보였으며, pH 6.8에서 8.4에 이르는 넓은 범위에서 활성을 지녔으며 그 중 pH 8.4에서 최적 활성을 나타내었다.

ApyPpase의 활성에 2가 양이온 (MgCl2, CaCl2, ZnCl2, MnCl2, CuCl2)이 미치는 영향을 조사하기 위하여 다음과 같이 반응을 하였다. 정제된ApyPpase의 효소액 일정량과 10mM Tris-HCl 완충액 (pH8.4) 혼합액에 최종농도가 1mM이 되도록 2가 양이온을 첨가하여 실온에서 1시간 방치한 후, 각각의 시료에 50mM의 기질 20㎕을 첨가하여 70℃에서 10분간 반응시킨 후, 상기 실시예 5의ApyPpase의 활성측정 방법으로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1 에 나타내었다. 그 결과 CaCl2은 활성에 영향을 끼치지 못했으나 MgCl2, ZnCl2, CuCl2은 2가 양이온을 넣지 않고 효소반응을 진행한 대조예보다 약 2배의 활성을 나타내었다.

[표 1] 정제된ApyPpase의 2가 양이온들에 따른 상대적 활성

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 아퀴펙스 파이로필러스(Aquifex pyrophilus)로부터 유래하는 내열성 파이로포스파타아제(ApyPpase)유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공한다. 또 본 발명은 대장균에서ApyPpase 유전자의 발현 및 내열성ApyPpase의 간단한 정제 방법을 제공하며, 또 내열성ApyPpase의 대량생산을 실현시킬 수 있을 것이다. 본 발명의 내열성 파이로포스파타아제 (ApyPpase)는 DNA 씨퀀싱(sequencing)의 효율 증진과 PCR (polymerase chain reaction)에 의한 DNA 증폭 효율을 높이기 위해 내열성 DNA 중합효소와 함께 각종 유전공학연구 및 유전병 진단 등에 유용하게 활용될 수 있다.

Claims (3)

1. 서열 1의 염기서열을 가지는 아퀴펙스 파이로필러스(Aquifex pyrophilus)로부터 유래하는 파이로포스파타제(ApyPpase)를 코딩하는 유전자
2. 제 1 항의 유전자 서열로부터 유추되는 아퀴펙스 파이로필러스(Aquifex pyrophilus)로부터 유래하는 파이로포스파타제(ApyPpase)의 서열2의 아미노산 서열.
3. 제 1 항의 유전자 서열로부터 유추되는 아퀴펙스 파이로필러스(Aquifex pyrophilus)로부터 유래하는 파이로포스파타제(ApyPpase)의 유전자가 구축된 발현 벡터 pAPYP를 형성하고, 이를 대장균에서 발현시킨 후 회수함으로써, 내열성ApyPpase를 정제하는 방법.