CN113528408B - 一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR‑nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用。本发明首先利用生物信息学方法确定需要保留的必需基因及可以删除的非必需基因，选择一段长度为10Kb的非必须基因作为目标敲除大片段。然后在目标基因序列的编码链和模板链上各设计一个spacer序列，两个由spacer序列转录并加工出的crRNA搭配经过改造后的nCas3单链核酸内切酶共同作用，完成对目标DNA序列双链的破坏。最后将人工CRISPR簇和供体DNA序列组装到载体上，通过电穿孔转化到运动发酵单胞菌细胞内完成编辑。

Description

一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用。

背景技术

近年来，利用微生物进行代谢工程、系统生物学及合成生物学等方面的研究取得了良好的进展，为理性化设计、构建微生物细胞工厂，利用生物体活细胞或酶对可再生生物质，如纤维素等进行物质转化，生产生物能源，实现生物冶炼的工业化提供了重要的理论基础。生物能源再生化是解决人类目前面临的资源、能源短缺及环境污染严重等问题的有效手段之一。

CRISPR-Cas是一种广泛存在于大多数细菌和古菌中的原核适应性免疫系统，用于防止病毒或质粒等外源性遗传物质的入侵。该系统由RNA引导，CRISPR序列内储存的遗传信息会转录出具有特异性RNA，与Cas核酸酶结合后会在外源入侵遗传物质的位点特异性结合，产生双链断裂并刺激宿主的修复机制，包括同源重组修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)。这种细菌保有的免疫修复机制目前已经被开发用来作为生命科学领域常用的一种基因编辑工具。

高效、易于操作的基因组编辑工具的匮乏，严重阻碍了对具有良好微生物细胞工厂特性的运动发酵单胞菌的细胞学性质研究，以及对其生物能源生产优势等方面的有效利用。本发明将开发运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统构建基因组编辑平台，打破外源CRISPR-Cas基因组编辑工具无法在该类菌株中应用的限制，为在该菌株及类似细胞中开展基础研究与应用研究提供一套强大的工具，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明的目的在于利用运动发酵单胞菌其自身基因组编码的I-F型CRISPR-Cas系统作为基础加以改造，对其自身基因组上的大片段进行了敲除。为在该菌株及类似细胞中开展基础研究与应用研究提供一套强大的工具，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。

本发明首先利用生物信息学方法确定需要保留的必需基因及可以删除的非必需基因，选择一段长度为10Kb的非必须基因作为目标敲除大片段。然后在目标基因序列的编码链和模板链上各设计一个spacer序列，两个由spacer序列转录并加工出的crRNA搭配经过改造后的nCas3单链核酸内切酶共同作用，完成对目标DNA序列双链的破坏。最后将人工CRISPR簇和供体DNA序列组装到载体上，通过电穿孔转化到运动发酵单胞菌细胞内完成编辑。

本发明是这样实现的，一种基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统，包括序列如SEQ ID NO.16所示的人工CRISPR簇、编辑质粒载体和含nCas3单链核酸内切酶的工程菌；

所述nCas3单链核酸内切酶为在野生型Cas3蛋白的解旋酶功能域上引发突变，使野生型Cas3蛋白丧失解旋酶活性，只具备单链核酸酶活性的nCas3蛋白。

进一步地，所述野生型Cas3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述nCas3单链核酸内切酶为K458A、或D608A、或R887A；

所述K458A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第458位的“K”替换为“A”；

所述D608A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第608位的“D”替换为“A”；

所述R887A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第887位的“R”替换为“A”。

进一步地，所述含nCas3单链核酸内切酶的工程菌为运动发酵单胞菌。

进一步地，所述工程菌以运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4为基础，将编码Cas3蛋白的ZMO0681基因内的676,661号的腺嘌呤核苷酸原位替换为胞嘧啶核苷酸。

进一步地，所述编辑质粒载体pEZ15a载体。

进一步地，所述含nCas3单链核酸内切酶的工程菌的制备方法，包括以下步骤：

S1：将质粒pL2R用Bsa I核酸内切酶酶切后，与原间隔序列S(D608)连接，将连接产物用EcoR I和Xba I核酸内切酶酶切后，与核苷酸替换后的cas3基因序列连接组装，得到单碱基编辑质粒；

S2：将单碱基编辑质粒转化到制备成感受态细胞的DRM1菌株。

进一步地，所述原间隔序列S(D608)由引物退火过程得到，将SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示的引物各1μL混合到反应缓冲液中，经PCR仪95℃反应5分钟后再降至室温反应10分钟得到。

进一步地，所述核苷酸替换后的cas3基因序列由ZM4基因组在SEQ ID NO.8-SEQID NO.11所示的引物克隆得到。

进一步地，所述原间隔序列S(D608)的序列如SEQ ID NO.16所示。

进一步地，所述核苷酸替换后的cas3基因序列如SEQ ID NO.17所示。

本发明还提供了如上述的一种基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统在基因编辑中的应用。

进一步地，所述基因编辑包括基因敲除、定点突变、插入中的任一种。

进一步地，所述基因敲除包括基因组大片段删除。

本发明还提供了基因组大片段删除的方法，包括以下步骤：

S1：将人工CRISPR簇和编辑质粒载体连接，构建编辑质粒；

S2：根据待删除的目标片段序列设计并制备原间隔序列，

S3：将目标片段的原间隔序列与编辑质粒连接后，转化至含nCas3单链核酸内切酶的工程菌中培养。

本发明还提供了一种运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4(Seo et al.2005)基因组改造后的菌株DRM2。该菌株是在原本ZM4菌株的基础上，将编码Cas3蛋白的ZMO0681基因内的676,661号的腺嘌呤核苷酸原位替换为胞嘧啶核苷酸得到的；

或将编码Cas3蛋白的ZMO0681基因内的676,209号的腺嘌呤核苷酸原位替换为鸟嘌呤核苷酸且将676,209号的腺嘌呤核苷酸原位替换为胞嘧啶核苷酸；

或将编码Cas3蛋白的ZMO0681基因内的677,497号的胞嘧啶核苷酸原位替换为鸟嘌呤核苷酸且将677,498号的鸟嘌呤核苷酸原位替换为胞嘧啶核苷酸。

C-1T和C3T两个碱基的改变属于密码子简并性的覆盖范围内，不影响蛋白质的翻译。只是为了原位替换时的操作，与工程菌性质无关。

本发明还提供了改造后的DRM2菌株的应用，利用改造后该菌株内源的I-F型CRISPR-Cas系统进行基因组大片段敲除时，相较于原始菌株而言，可以在基因的靶向位点处使DNA发生单链断裂，并可以显著得提高编辑质粒的转化效率以及编辑效率。

为了达到以上目的，本发明采取了以下措施：

通过比对ZM4菌株与其他同样携带内源I型CRISPR-Cas系统的菌株，内源CRISPR相关蛋白的编码基因序列差异，找到了其Cas3蛋白的功能结构划分。并且通过探究I-F型CRISPR-Cas系统的工作原理，设计并替换了ZM4菌株内Cas3蛋白解旋酶结构域中的一个氨基酸。将原本ZM4菌株上编码Cas3蛋白的ZMO0681基因内的676,661号的腺嘌呤核苷酸原位替换为胞嘧啶核苷酸，使Cas3蛋白丧失解旋酶活性，转变为只携带单链DNA核酸内切酶活性的nCas3蛋白。从而得到改造后菌株DRM2。

DRM2菌株与野生型Zymomonas mobilis ZM4菌株的生长条件及生长曲线相同。

DRM2菌株在完成针对基因组上大片段基因敲除实验过程中，相较于野生型ZM4菌株，可以在基因的靶向位点处使DNA发生单链断裂，并可以显著地提高编辑质粒的转化效率以及编辑效率。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

1、一般情况下，在Ⅰ型CRISPR-Cas系统基因编辑过程中，Cas3蛋白对靶向的目的片段造成损伤的时候，首先是发挥其单链核酸酶活性，在目标区域的DNA单链上切出一个缺口。然后随着Cas3蛋白沿着目的DNA往下游移动的同时，发挥其解旋酶活性，使得缺口附近的氢键断裂，DNA双螺旋解开。于是另一条单链暴露出来，再次与Cas3蛋白接触、断裂，最终形成目的DNA片段的双链断裂。

本发明提供的nCas3单链核酸内切酶，通过破坏掉Ⅰ型系统中Cas3蛋白的解旋酶活性区域，使其成为只具备单链核酸酶活性的nCas3蛋白，达到在基因编辑过程中只在靶向位点切割其中一条DNA单链而不会对DNA分子内另一条单链造成损伤的目的。以此降低Cas3蛋白在基因编辑过程中对细胞的毒性，从而提高转化效率，获得更多的转化子，进而筛选得到更多编辑后的目的菌株。

2、CRISPR-Cas系统的编辑效率与目标基因的分子量大小及其功能都有密切关系。一般来说，由于基因组损伤后修复的难易程度不同，更长基因在被编辑时，编辑质粒的转化效率相应更低，能够得到的转化子越少，其最终编辑的成功率也越低。目前，有关运动发酵单胞菌ZM4内源I-F型CRISPR-Cas系统的报道指出，该系统在敲除、替换单个基因时，可以达到近乎100％的效率。然而，在面对较大片段基因(约为基因组的5‰)时，其效率则仅能达到50％。

本申请中，通过比对ZM4与其他同样带有内源I型CRISPR-Cas系统的菌株，内源CRISPR相关蛋白的编码基因序列差异，找到了其Cas3蛋白的功能结构划分。并且通过探究I-F型CRISPR-Cas系统的工作原理，设计并替换了ZM4菌株内Cas3蛋白解旋酶结构域中的一个氨基酸，使其丧失解旋酶活性，转变为只携带单链DNA核酸内切酶活性的nCas3蛋白。

改造后的这一工程菌株命名为DRM2菌株，并重新设计将其引用到敲除基因组大片段的实验当中。最终发现其在针对基因组大片段(约为基因组的5‰)编辑时，编辑质粒的转化效率得到了显著提升(相比对照提升超过100倍)，其最终的编辑效率也提高到接近100％。

3、常规的遗传学方法直接利用宿主体内DNA重组修复系统，也能对基因进行突变，但通常只能单个单个地完成，耗时较长，效率太低，显然无法满足诸如构建复杂的代谢通路等研究的要求。而且，对于每一个目标基因的突变，均需要引入特定的选择标记，会存在可用选择标记有限、引入抗生素标记而产生生物安全隐患等等一些问题。此外，为了提高细胞体内DNA重组效率，可利用序列特异性核酸酶对目的基因进行定点剪切，促进基因组与供体DNA的重组，定点引入突变，实现基因组的精准编辑。例如，锌指核酸酶(Zinc fingernucleases，ZFNs)和转录激活样效应物核酸酶(Transcription activator-like effectornucleases，TALENs)被成功用于对基因组进行定点剪切。但是，对每一个靶标位点的剪切，均需要对上述蛋白进行一次改造，实验步骤较为复杂。

自2013年以来，基于CRISPR-Cas9与CRISPR-Cpf1系统的基因组编辑技术被广泛应用于包括人体细胞在内的各类生物(细胞)中，相比于ZFN和TALEN技术，CRISPR技术具有一个明显的优势：对不同目的DNA的靶定不需要进行蛋白改造，只需要简单改变单个介导RNA(gRNA)序列，易于操作。然而，截止目前为止，尚无相关应用在运动发酵单胞菌中实现，是由于外源表达Cas9或Cpf1蛋白产生了细胞毒性。Cas9和Cpf1均为具有多个结构域的大核酸蛋白(大于1000氨基酸)，随着研究的深入，越来越多的结果显示，异源表达这些核酸酶会对宿主产生不同程度的细胞毒性。

本发明以运动发酵单胞菌为模式菌株，运用其內源CRISPR-Cas系统进行基因组编辑。开发宿主內源CRISPR-Cas基因组编辑工具，(1)可有效避免外源Cas核酸蛋白对宿主产生的细胞毒性；(2)宿主自身CRISPR-Cas系统具有完整的功能，能加工成熟的crRNA用于介导Cas效应复合体对目标DNA序列的剪切，因此，将不同的介导序列克隆到同一个CRISPR簇中，即能实现对多个靶位点的同时编辑。而相对于传统遗传学操作方法，CRISPR-Cas系统能对预编辑的目标序列进行持续剪切，具有很强的正选压力，不需要额外使用选择标记，避免了传统操作方法中常遇到的可用选择标记有限、引入抗生素标记产生生物安全隐患等等。

附图说明

图1是实施例1中SDS-PAGE电泳结果；

图2是实施例2中环状DNA切割效果图；

图3是ZM4菌株基因组上的Cas3蛋白基因结构；

图4是实施例3中的菌落PCR产物Cas3蛋白结构片段分析结果；

图5是实施例3中的菌落PCR产物电泳结果；

图6是实施例3中的PCR产物测序结果；

图7是实施例4中的工程菌株转化效率结果；

图8是实施例4中的工程菌株编辑效率结果；

图9是实施例5中人工CRISPR簇的结构；

图10是实施例6中的编辑效率结果；

图11是实施例6中的产物测序分析结果；

图12是实施例7中的编辑效率结果；

图13是实施例7中的产物测序分析结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用，具体如下实施例所示。

实施例1蛋白质及其编码基因的制备与功能。

nCas3单链核酸内切酶是指在野生型Cas3蛋白的解旋酶功能域上引入突变后，使其丧失解旋酶活性，从而转变为只具备单链核酸酶活性的nCas3蛋白，该单链核酸内切酶活性能以内切1,4-磷酸二脂键的方式作用于靶标DNA双链中的一条单链。

本发明本实施例中涉及的野生型(wide type)Cas3蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本实施例中具体共给出了三种不同序列的nCas3单链核酸内切酶，分别命名为K458A(用丙氨酸取代野生型Cas3蛋白第458位的赖氨酸，氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第458位的“K”替换为“A”；核苷酸序列与SEQ ID NO.2相比，区别仅在于将第1372-1373位的“aa”替换为“gc”)、D608A(用丙氨酸取代野生型Cas3蛋白第608位的天冬氨酸，氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第608位的“D”替换为“A”；核苷酸序列与SEQ ID NO.2相比，区别仅在于将第1823位的“a”替换为“c”)和R887A(用丙氨酸取代野生型Cas3蛋白第887位的精氨酸，氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第887位的“R”替换为“A”；核苷酸序列与SEQ ID NO.2相比，区别仅在于将第2659-2660位的“cg”替换为“gc”)。

1、模板DNA的制备可以分别通过以下两种方式进行：

(1)运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4总DNA的提取：采用运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mM Tris缓冲液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mM EDTA(pH8.0)，混匀后37℃放置20min；之后加入2毫升质量分数为10％的SDS，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次；取最后一次的上清溶液，加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗；沉淀溶于0.5毫升TE缓冲液(pH8.0，10mM Tris，1mM EDTA)，加入10mg/mL RNase 3μL，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次；上清溶液加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，真空干燥，用去离子水溶解。

(2)人工合成三种nCas3单链核酸内切酶的核苷酸序列的DNA片段。该合成过程在金斯瑞生物科技有限公司完成。

2、利用引物进行PCR扩增

根据目标核苷酸序列设计引物对如下：

正向引物：5’-CTTTAAGAAGGAGATATACCATATGAATGTTCTATTCGTTTCGC-3’，如SEQ IDNO.3所示；

反向引物：5’-GATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACTATGATATCTGGAAAATC-3’，如SEQ IDNO.4所示；

以运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4的总DNA或人工合成的nCas3单链核酸内切酶的核苷酸序列作为模板，用设计的引物对进行PCR扩增。

PCR反应体系：5μL 10×缓冲液；4μL dNTP；0.5μL ExTaq DNA聚合酶；1μL正向引物；1μL反向引物；0.5μL模板；38μL水。

PCR反应条件：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火1min30s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化。将纯化的PCR产物进行测序，结果表明PCR产物的序列符合预期，将突变序列命名为ncas3片段。

3、重组表达载体的构建

(1)将上述正确的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化回收。

(2)将质粒pET28a(Cat.N0 69864-3,Novogen)用Nco I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

(3)将步骤(1)的回收产物和步骤(2)中的酶切产物进行连接，连接产物电击转化大肠杆菌DH5α后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用上述的正向引物和反向引物进行菌落PCR，筛选到含有ncas3基因的重组菌，提取重组菌的质粒，进行测序验证。结果表明，在pET28a的Nco I和Xho I酶切位点之间插入了ncas3基因片段，插入方向正确，将重组质粒命名为pET28a-ncas3。

4、工程菌的制备

将质粒pET28a-ncas3电击转化大肠杆菌BL21(DE3)(Cat.N0 CD801,全式金公司)后，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，得到含有质粒pET28a-ncas3的工程菌，记作BL21/pET28a-ncas3。

用pET28a代替pET28a-ncas3，转化大肠杆菌BL21(DE3)，步骤同上，得到含有pET28a的空载重组菌，作为对照菌。将转入pET28a的菌株记作BL21/pET28a。

5、nCas3单链核酸内切酶的制备与纯化

将上述步骤4中制备得到的阳性重组菌BL21/pET28a-nCas3培养于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3h；OD600＝0.7时，加入IPTG至其在LB培养基中的终浓度0.8mM，转至18℃继续培养16h。在3800rpm、15min条件下离心收集菌体，悬浮于PBS溶液(20mM Tris-HCl，pH7.4，0.5M NaCl)中，于冰浴中超声破碎(60w，10min；超声1s，停止2s)，之后12000rpm离心10min除去细胞碎片，取上清液；将上清液过His60 Ni Superflow resin纯化柱，用5mL超纯水冲洗，再用10mL溶液A(50mM NaH2PO4-Na2HPO4，pH7.0，25m M咪唑)漂洗，最后用5mL溶液B(50mM NaH2PO4-Na2HPO4，pH7.0，500mM咪唑)洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用脱盐柱GE HiTrap Desalting进行脱盐处理，用溶液C(50mM Tris-HCl，pH 7.0)进行洗脱，得到的洗脱液再过阴离子交换柱GE HiTrap Q FF，先用溶液D(20mM Tris-HCl，pH7.9)洗脱杂蛋白，再用溶液E(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH7.9)洗脱目的蛋白，得到nCas3单链核酸内切酶纯酶液。

将步骤4中制备的对照菌采用相同的步骤进行培养和纯化，得到的溶液作为对照酶液。

SDS-PAGE电泳显示纯化的nCas3蛋白的分子量约为130kDa，符合理论推断的130.0kDa。结果如图1所示，图1中，泳道M表示蛋白分子量标准(180、130、95、72、55kDa)；泳道wt表示由野生型(wide type)Cas3蛋白充当的阳性对照；泳道K458A、D608A、R887A表示在野生型Cas3蛋白的解旋酶功能域上引入突变后，使其丧失解旋酶活性，从而转变为只具备单链核酸酶活性的nCas3蛋白；泳道ck表示由上述步骤4中的BL21/pET28a空载体表达纯化后得到的蛋白液，作为阴性对照。

实施例2以环状DNA为底物验证蛋白功能

选取pL2R质粒(Zheng et al,2019)作为反应底物，质粒总长度为3283bp。反应体系包含150ng pL2R环状质粒；2mM MgCl2；0.5mM ATP；250nM Cascade蛋白；250nM上述纯化得到的Cas3或nCas3蛋白变体之一；一个携带靶向pL2R质粒上5’-CCC-3’PAM序列的32nt的crRNA。上述crRNA由金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如SEQ ID NO.5所示。在30℃条件下分别反应15、30、60分钟后，将反应产物跑琼脂糖凝胶电泳。

结果如图2所示，图2中最左侧泳道表示核酸分子量标准(5.0、3.0、2.0kb)；最右侧Reaction time轴表示反应持续时间(15、30、60min)；右侧OC、L、SC表示反应过后环状DNA分子的状态，[OC(open circle开环)；L(linear线性)；SC(negatively supercoiled超螺旋)]；DNA alone泳道表示反应体系中不加入Cas3蛋白或nCas3蛋白时环状质粒的状态，随着反应时间增加，质粒保持超螺旋状态不变，表示质粒DNA结构未受到破坏；wt泳道表示反应体系中加入野生型(wide type)Cas3蛋白时环状质粒的状态，随着反应时间增加，质粒逐渐由超螺旋转变为半开环再转变为线性最终直至消失，表示质粒DNA在野生型Cas3蛋白作用下先后发生了双链断裂，并逐渐被降解；K458A、D608A、R887A泳道表示反应体系中加入在野生型Cas3蛋白的解旋酶功能域上引入突变后，使其丧失解旋酶活性，从而转变为只具备单链核酸酶活性的nCas3蛋白，随着反应时间增加，质粒逐渐由超螺旋状态转变为开环状态并且直至反应到最终时间仍保持开环状态并未向线性或降解发展，表示质粒DNA在改造后的单链核酸酶nCas3蛋白作用下，只完成了DNA分子中单链的断裂，结果符合实验预期。

实施例3包含nCas3单链核酸内切酶的工程菌的制备

本实施例中以D608A为例，制备包含nCas3单链核酸内切酶的工程菌。

1、设计并构建单碱基编辑质粒

(1)根据实验需求，决定利用ZM4菌株中内源的I-F型CRISPR-Cas编辑系统，对基因组上的目的位点进行编辑。

如图3所示，通过对ZM4菌株基因组上的Cas3蛋白编码基因的仔细分析，发现cas3基因序列内存在5’-TCC-3’的PAM序列，因此将其下游的32-nt序列设计为一个原间隔序列。为了避免CRISPR-Cas系统破环转入的供体质粒，并且完成对ZMO0681基因内的676,661号的腺嘌呤核苷酸到胞嘧啶核苷酸的原位替换，供体DNA上总共引入了三种核苷酸变化。为了清晰说明，将原间隔序列的位置编号设定为：紧邻PAM序列的下游位置称为1，随后位置称为2、3等，直至32；而PAM序列中间的位置被称为-1、-2、-3，其中-1是最接近间隔序列的位置。于是三种核苷酸变化在供体DNA上的位置即为C-1T、C3T和T25G。其中C-1T的和C3T分别破坏掉了原间隔序列中的PAM序列和Seed sequence序列，用于保护供体质粒，使编辑后的细胞得以存活。并且这两个位点的核苷酸替换并未造成对应氨基酸的变化，因此不会破坏原本的蛋白质序列。而T25G的突变则是为了将ZMO0681基因内的676,661号的腺嘌呤核苷酸原位替换为胞嘧啶核苷酸，使位点对应的天冬氨酸(D)的密码子GAT被替换为丙氨酸(A)的密码子GCT。并且，为了使编辑后能够方便地筛选到阳性的转化子，C3T在破坏掉Seed sequence的同时，引入了新的酶切位点Dra I(TTTAAA)，使得后续可以通过对如图4所示的菌落PCR产物处理后的带型情况，快速筛选到具有预期编辑的菌株。

(2)按照(1)中的设计，如图3所示构建单碱基编辑质粒pNS-cas3。以质粒pL2R为基础，在上面分别引入原间隔序列S(D608)和含有三个指定核苷酸替换后的cas3。

其中原间隔序列S由引物退火过程得到，将各1μL引物S(D608)-F和引物S(D608)-R混合到反应缓冲液中(10μL体系：1μL引物S(D608)-F，1μL引物S(D608)-R，1μL缓冲液，7μL水)，经PCR仪95℃反应5分钟后再降至室温反应10分钟，得到原间隔序列S(D608)，如SEQ IDNO.16所示。

S(D608)-F：GAAAGAATCTTTGCGGGGCGGGCGACAAATCGCACC；SEQ ID NO.6；

S(D608)-R：GAACGGTGCGATTTGTCGCCCGCCCCGCAAAGATTC；SEQ ID NO.7。

核苷酸替换后的cas3基因序列(如SEQ ID NO.17所示)则是由ZM4基因组在引物cas3-F、D608A-R、D608A-F、cas3-R(序列中带有下划线的部分分别为EcoR I和Xba I酶切位点)克隆得到。具体过程为：用cas3-F和D608A-R扩增出上半段UP(D608A)，用D608A-F和cas3-R扩增出下半段DOWN(D608A)，最后用cas3-F和cas3-R做overlap PCR将UP(D608A)和DOWN(D608A)连接为cas3(D608A)。

cas3-F：AGGTCACCAGCTCACCGTCTGAATTCATGAATGTTCTATTCGTTTC；SEQ ID NO.8；

D608A-R：CTTTTAAATCATAATCATCCAATTCAGCTAAAACGAGATCAGCCCCC；SEQ ID NO.9；

D608A-F：GCTGAATTGGATGATTATGATTTAAAAGATTTACCCGCCTTAACTCG；SEQ ID NO.10；

cas3-R：CTCGAGAGATCTGATATCACTCTAGATTAACTATGATATCTGGAAA；SEQ ID NO.11。

将质粒pL2R用Bsa I核酸内切酶在37℃的条件下酶切4小时后，用琼脂糖凝胶电泳纯化回收。将回收产物与S(D608)通过T4 DNA酶连技术组装连接。再将连接产物用EcoR I和Xba I核酸内切酶在37℃的条件下酶切4小时后，用琼脂糖凝胶电泳纯化回收。最后将回收产物与核苷酸替换后的cas3基因序列连接组装，得到单碱基编辑质粒pNS-cas3。

2、利用编辑质粒构建工程菌株DRM2

(1)将上述构建完成的单碱基编辑质粒pNS-cas3通过热激转化的方式，转化到制备成感受态细胞的DRM1菌株(Zheng et al,2019)中。转化步骤如下：将质粒与感受态细胞冰上混合后，放入42℃水浴热激35s，然后加入1ml LB液体培养基，37℃培养1小时后离心收菌，涂带有壮观霉素抗性的平板。

(2)将培养基上通过抗生素筛选过后的转化子收集，利用引物cas3-Chk-F和cas3-Chk-R进行菌落PCR。

cas3-Chk-F：GATCACGGAAATTATTTGGCTTATGGCCTTGGTGCTACTGCGAC；SEQ ID NO.12；

cas3-Chk-R：

GAAGACATCCAAGGCGGCGGCATTACCGACAACATCTATATCAAAATTTTC；SEQ ID NO.13。

(3)在步骤(2)得到的PCR产物中，加入Dra I限制性核酸内切酶(NEB公司提供)，酶切2小时后跑琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图5所示，其中最左侧泳道M表示核酸分子量标准(2.0、1.0、0.75kb)；最右侧标记为胶图中核酸条带分子量；ck表示用DRM1菌株基因组为模板，扩增后酶切得到的产物作为对照组；1、2、3、4泳道则为在平板上挑取得到的四个转化子。

(4)将图5实验后得到的实际结果与图4预期得到的带型进行比较，发现泳道1、2、3对应的酶切后的带型都与预期编辑后应该产生的带型相符；而泳道4对应的带型则与对照组相同。表示泳道1、2、3对应的转化子内的基因组上完成了预期设计的核苷酸替换。

(5)挑取其中的一株经过传代培养后，将其对应的PCR产物送到测序公司检测(由金斯瑞生物科技有限公司完成)，测序结果如图6所示，峰图单一且与预期序列相符。DRM2工程菌株构建成功。

实施例4工程菌在大片段基因组敲除中的应用

1、通过对ZM4菌株基因组的分析，选取ZM4基因组上的1,858,251-1,868,309号基因，即ZMO1815-ZMO1822基因作为敲除目标，敲除片段序列共计10058个核苷酸。针对目标片段的基因组序列设计并构建了3个靶向目标区域内不同位点敲除质粒，即pKO-1、pKO-2和pKO-3(三个编辑质粒上都携带有一个人工CRISPR簇，和一段作为同源臂的Donor序列。CRISPR簇中包含有针对于目标片段设计的间隔序列。三个质粒的区别只是在于间隔序列的不同，从而靶向目标区域内的不同位点。三个质粒的Donor序列完全相同，都是在基因组上目标区域上下游各截取300bp序列组合而成)。其中每个敲除质粒上都携带有两个分别针对靶向序列DNA编码链和模板链的间隔序列。

2、将上述步骤中构建好的编辑质粒pKO-1、pKO-2和pKO-3通过电穿孔转化的方式，转入到DRM2菌株中。电穿孔转化步骤如下：将质粒与DRM2菌株感受态与冰上充分混合后，加入到直径为0.1cm的电转杯中。在电转仪中1.6kv条件下电转，加入RMG液体培养基复苏6小时后收菌涂带有RMG抗性平板。

3、将上述步骤中电穿孔转化后平板放入30℃培养箱中培养48小时后，取出平板清点平板上转化子数量。由此计算可得每个编辑质粒转入DRM2菌株时的转化效率，并与将它们转入DRM1菌株时的转化效率相比较。

转化效率结果如图7所示，图表表示将编辑质粒分别转化到DRM1和DRM2菌株的转化效率、与将空白载体(pEZ15a)转化到菌株中的转化效率的相对比值。其中wt表示将空白载体分别转化到DRM1和DRM2菌株中的转化效率，设为1.0。实验重复三次，误差线表示均值的标准误差。如图7结果所示，三个编辑质粒转化到DRM2菌株中的转化效率相对于它们转化到DRM1菌株中的转化效率都由显著提升，提升幅度在100倍左右。

4、收集上述平板上的转化子，利用引物10k-Chk-F和10k-Chk-R进行菌落PCR。通过菌落PCR结果，可以判断目标片段是否成功被编辑质粒敲除。

10k-Chk-F：GACAAGAGCGGAATCCGCGT；SEQ ID NO.14

10k-Chk-R：GAGGTAATAACCCCGCGACC；SEQ ID NO.15。

统计编辑效率，结果如图8所示，三个编辑质粒转化到DRM2菌株后，其针对目标位点的基因编辑效率，相对于它们转化到DRM1菌株后的编辑效率均有显著提升，甚至最高达到了100％。证明DRM2菌株在用于针对大片段基因组敲除时，可以有效提高编辑质粒得转化效率，得到更多转化子得同时，进而大幅提高编辑效率。

K458A、R887A和D608A虽然是三个不同的突变位点，但是达成的目的都是沉默掉了野生型菌株中Cas3蛋白的解旋酶功能域，从而使其转变为具备单链切割活性的核酸内切酶。技术效果(提高编辑质粒的转化效率、成功对大片段基因组进行敲除)的根本原理，正是利用改造后Cas3蛋白的单链切割特点，区别于传统的直接将DNA双链切断，而是只留下一个切口。减少对待编辑菌株基因组的损伤，从而提高转换效率，使得对本来较难实现的大片段的敲除成为可能。因此，在D608A采用基因组原位替换构建的工程菌可以提高编辑质粒的转化效率、成功对大片段基因组进行敲除，可以推断采用相同原理针对K458A和R887A构建的工程菌株比如也可以达到相同的技术效果。

实施例5CRISPR-nCas3系统用于基因组大片段删除方法的设计

1、如图9所示，设计基于CRISPR-nCas3系统的基因组大片段删除工具。其中，编辑质粒pKO上构建了一个人工CRISPR簇，包括一个启动子P_leader、一个终止子Term、三个回文重复序列R和之间夹杂的两个间隔序列S1、S2。两个spacer序列转录并加工为具有R-loop结构的的crRNA，并分别与Cascade结合并靶向基因组上目标序列的模板链与编码链。招募改造过后的单链核酸内切酶nCas3，在特异性结合位点切割DNA单链，形成两个缺口。最后，两条链上的缺口共同造成了目标序列区域内DNA双链的断裂。

2、构建基于CRISPR-nCas3系统的编辑质粒

(1)通过生物公司人工合成一段适用于运动发酵单胞菌内源I-F型CRISPR-Cas系统的，含有一个启动子、一个终止子、三个回文重复序列和两个间隔序列的人工CRISPR簇(序列如SEQ ID NO.18所示，序列中起始和最后六位分别为Xma I和BamH I酶切位点，由金斯瑞生物科技有限公司合成)。

(2)将pEZ15a载体用Xma I和BamH I两种限制性核酸内切酶(NEB公司提供)在37℃水浴中酶切反应4小时后，用琼脂糖凝胶电泳纯化回收。将步骤(1)中公司合成的人工CRISPR簇基因片段也按照同样的步骤酶切回收处理。将载体的回收产物与基因片段的回收产物通过T4酶连的方法，组合到一起，构成含有两个spacer的编辑质粒pL3R。

实施例6 10k基因组大片段的删除

1、通过生物信息学分析在ZM4菌株的基因组上找到了一段非必须基因ZMO1815-ZMO1822(10,021bp)可作为大片段敲除的目标序列。

2、从目标基因序列ZMO1815-ZMO1822的模板链和编码链上，各截取一段5’-CCC-3’下游紧邻的32bp序列作为两个spacer序列。两个序列不能位于基因组的同一条链上。

3、利用引物退火的方法得到两个原间隔序列10k-S1和10k-S2。步骤如下：分别将引物S1-10k-F、S1-10k-R(10μL体系：1μL引物S1-10k-F，1μL引物S1-10k-R，1μL缓冲液，7μL水)和引物S2-10k-F、S2-10k-R(10μL体系：1μL引物S2-10k-F，1μL引物S2-10k-R，1μL缓冲液，7μL水)混合到反应缓冲液中，经PCR仪95℃反应5分钟后再降至室温反应10分钟，得到原间隔序列10k-S1和10k-S2。

S1-10k-F：GAAAGACCTTATGCCTATGTCGATACAACCACGAAT；SEQ ID NO.19

S1-10k-R：GAACATTCGTGGTTGTATCGACATAGGCATAAGGTC；SEQ ID NO.20

S2-10k-F：GAAAGCTGATCCGCGTCCAAATAGGGCGGCTGATGG；SEQ ID NO.21

S2-10k-R：GAACCCATCAGCCGCCCTATTTGGACGCGGATCAGC；SEQ ID NO.22

4、将上述构建的编辑质粒pL3R用Bsa I限制性核酸内切酶在37℃的条件下酶切4小时后，用琼脂糖凝胶电泳纯化回收。将回收产物与10k-S1通过T4 DNA酶连技术组装连接。再将连接产物用Bsmb I限制性核酸内切酶在55℃的条件下酶切4小时后，用琼脂糖凝胶电泳纯化回收。将回收产物与10k-S2通过T4 DNA酶连技术组装连接，最终得到针对10k片段ZMO1815-ZMO1822的编辑质粒pKO-10k。

5、将上述步骤中构建好的编辑质粒pKO-10k通过电穿孔转化的方式，转入到DRM2菌株中。电穿孔转化步骤如下：将质粒与DRM2菌株感受态与冰上充分混合后，加入到直径为0.1cm的电转杯中。在电转仪中1.6kv条件下电转，加入RMG液体培养基复苏6小时后收菌涂带有RMG抗性平板。

6、将上述步骤中电穿孔转化后平板放入30℃培养箱中培养48小时后，取出平板并收集上述平板上的转化子，利用引物10k-Chk-F和10k-Chk-R进行菌落PCR。通过菌落PCR结果，可以判断目标片段是否成功被编辑质粒敲除。

10k-Chk-F：GACAAGAGCGGAATCCGCGT；SEQ ID NO.23

10k-Chk-R：GAGGTAATAACCCCGCGACC；SEQ ID NO.24

统计编辑效率，结果如图10所示，成功的敲除了10Kb的基因组大片段，充分的说明了该发明是一种高效的基因编辑方法。利用上述PCR产物进行测序分析，结果如图11所示，通过测序结果与野生型菌株基因组序列进行比对，发现编辑方式完全按照实验设计的方案，进一步说明了该发明是一种精确的基因编辑方法。

实施例7ZMO0252基因组大片段的删除

1、为进一步验证这一方法的普扁适用性，通过生物信息学分析又在ZM4菌株的基因组上找到了一段非必须基因ZMO0252(8,955bp)可作为大片段敲除的目标序列。

2、重复实施列6中的相应步骤，分别将引物S1-0252-F、S1-0252-R(10μL体系：1μL引物S1-0252-F，1μL引物S1-0252-R，1μL缓冲液，7μL水)和引物S2-0252-F、S2-0252-R(10μL体系：1μL引物S2-0252-F，1μL引物S2-0252-R，1μL缓冲液，7μL水)混合到反应缓冲液中，经PCR仪95℃反应5分钟后再降至室温反应10分钟，得到原间隔序列0252-S1和0252-S2。

S1-0252-F：GAAAGTCTGCACAGTGTTACCGGCATCACTGGTGAT；SEQ ID NO.25

S1-0252-R：GAACATCACCAGTGATGCCGGTAACACTGTGCAGAC；SEQ ID NO.26

S2-0252-F：GAAAAGATTATCAATCCGCAAGAAGGTATGTGGAAC；SEQ ID NO.27

S2-0252-R：GAACGTTCCACATACCTTCTTGCGGATTGATAATCT；SEQ ID NO.28

3、用同样的方法将0252-S1和0252-S2序列先后依次组装到pL3R质粒上，然后通过电穿孔转化的方式，转入到DRM2菌株中。

4、30℃培养箱中培养48小时后，取出平板并收集上述平板上的转化子，利用引物0252-Chk-F和0252-Chk-R进行菌落PCR。通过菌落PCR结果，可以判断目标片段是否成功被编辑质粒敲除。

0252-Chk-F：TGAATGGCGCCTCTGAACTT；SEQ ID NO.29

0252-Chk-R：TAGACCATCTGGGAAGCCGA。SEQ ID NO.30

统计编辑效率，结果如图12所示，成功地敲除了ZMO0252基因组大片段，充分的说明了该发明是一种高效的基因编辑方法。利用上述PCR产物进行测序分析，结果如图13所示，通过测序结果与野生型菌株基因组序列进行比对，发现编辑方式完全按照实验设计的方案，进一步说明了该发明是一种精确的基因编辑方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1146

<212> PRT

<213> 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)

<400> 1

Met Asn Val Leu Phe Val Ser Gln Cys Asp Asn Asn Ala Leu Lys Glu

1 5 10 15

Thr Arg Arg Ile Leu Asp Gln Phe Ala Glu Arg Lys Gly Ser Arg Ser

20 25 30

Trp Gln Thr Pro Ile Thr Gln Ile Gly Leu Ala Thr Val Gln Lys Leu

35 40 45

Leu Arg Lys Thr Ala Arg Arg Asn Thr Ser Val Ala Cys His Trp Leu

50 55 60

His Gly Gly Gly Gln Cys Asp Leu Leu Trp Ile Val Gly Asp Ala Ser

65 70 75 80

Arg Phe Asn Asn Glu Gly Ala Val Pro Thr Asn Ser Thr Thr Arg Asn

85 90 95

Ile Leu Arg Gln Gln Asp Glu Asn Asp Trp Ile Thr Ala Glu Asp Ile

100 105 110

Gln Met Leu Ala Gln Met Ala Ala Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ala

115 120 125

Ser Lys Ala Phe Gln Arg Arg Leu Gln Ser Arg Glu Lys Ser Arg Asn

130 135 140

Leu Tyr Arg His Glu Trp Val Ser Leu Arg Leu Phe Gln Ala Phe Val

145 150 155 160

Gly Glu Asp Thr Asp Glu Val Trp Leu Thr Arg Leu Leu Glu Gly Asn

165 170 175

Tyr Ser Ile Lys Asp Trp Val Ala Lys Lys Arg Tyr Lys Lys Asp Gly

180 185 190

Val Asp Ala Leu Asn Gly Glu Asp Cys Tyr Pro Phe Lys Ser Leu Pro

195 200 205

Pro Leu Ala Ala Ala Ile Gly Trp Leu Ile Val Ser His His Arg Ile

210 215 220

Pro Leu Leu Pro Val Tyr Ile Glu Lys Lys Asp Arg Arg Glu Gln Ala

225 230 235 240

Tyr Leu Gly Lys Lys Pro Gln Ser Val Arg Leu Gly Ile Leu Thr Asp

245 250 255

Pro Leu Asn Lys Ile Thr Ser Leu Trp Asn Glu Ile Thr Asp Asn Gln

260 265 270

Ala Ser Pro Ala Gln Ile Lys Ala Tyr Trp Asp Ile Asp Lys Lys Glu

275 280 285

Lys Phe Pro Val Leu Leu Pro Glu Trp Gln Lys Gln Ala Ser Arg Ile

290 295 300

Ala Lys Arg Leu Leu Ala Leu Ala Lys Lys Lys Asp Ile Gly Lys Asn

305 310 315 320

Gly Leu Asp Asn Pro Tyr Leu Met His Leu Ala Arg Leu Ser Leu Met

325 330 335

Leu Ala Asp His Tyr Tyr Ser Ser Leu Pro Pro Glu Ser Lys Asp Arg

340 345 350

Met Ala Ala Thr Lys Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Asp Asp Phe Leu Tyr

355 360 365

Ala Asn Thr Asp Ser Gln Gly Glu Arg Lys Gln Gly Leu Ser Glu His

370 375 380

Leu Leu Gly Val Ala Arg Asp Ala Gly Ile Ile Ala His Ala Leu Pro

385 390 395 400

Asn Phe Ser Glu Tyr Leu Pro Arg Leu Ala Lys His Lys Gly Leu Lys

405 410 415

Lys Arg Ser Gln Asn Pro Arg Phe Ser Trp Gln Asp Lys Ala Ala Asp

420 425 430

Met Ala Thr Ala Leu Arg Glu Lys Thr Glu Arg Gln Gly Ala Phe Cys

435 440 445

Val Cys Met Ala Ser Thr Gly Thr Gly Lys Thr Leu Ala Ser Ala Arg

450 455 460

Ile Ile Asn Ala Met Ala Asn Pro Glu Lys Gly Met Arg Leu Thr Tyr

465 470 475 480

Ala Leu Gly Leu Arg Ala Leu Thr Leu Gln Thr Gly Lys Ser Tyr Gln

485 490 495

Lys Asp Leu His Leu Asn Asp Asn Asp Leu Ala Ile Leu Val Gly Gly

500 505 510

Ser Ala Ser Lys Thr Leu Phe Asp Tyr Tyr Ser Asp Lys Ala Glu Glu

515 520 525

Ser Gly Ser Ala Ser Ser Leu Asp Leu Leu Glu Glu Asp Ser Tyr Ile

530 535 540

Ser Tyr Glu Gly Cys Glu Ala Ser His Pro Leu Leu Ser Arg Leu Gly

545 550 555 560

His Asp Pro Arg Ile Arg Ser Leu Leu Ser Ala Pro Val Leu Val Cys

565 570 575

Thr Val Asp His Leu Val Pro Ala Thr Glu Ser Leu Arg Gly Gly Arg

580 585 590

Gln Ile Ala Pro Met Leu Arg Leu Met Gly Ala Asp Leu Val Leu Asp

595 600 605

Glu Leu Asp Asp Tyr Asp Leu Lys Asp Leu Pro Ala Leu Thr Arg Leu

610 615 620

Val Tyr Trp Ala Gly Leu Leu Gly Ser Arg Val Leu Leu Ser Ser Ala

625 630 635 640

Thr Leu Pro Pro Ser Leu Val Ser Gly Met Tyr Gln Ala Tyr Leu Ala

645 650 655

Gly Arg Lys Cys Tyr Gln Leu Asn His Asp Pro Ser Leu Ser Leu Ala

660 665 670

Ala Gln Asp Ile Pro Cys Leu Trp Ile Asp Glu Phe Gly Thr Thr His

675 680 685

Ala Asp Cys Ala Asp Ala Asn Gln Phe Glu Gln Ala His Asp Asp Phe

690 695 700

Val Lys Arg Arg Lys Gln Lys Leu Leu Lys Ser Asp Ala Ile Cys Lys

705 710 715 720

Gly Glu Ile Val Pro Leu Asp Glu Val Val Gly Thr Pro Asp Asp Lys

725 730 735

Val Leu Tyr Lys Asn Phe Ala Ser Ile Leu Arg Lys Thr Ala Leu Asp

740 745 750

Leu His Glu Gly Phe Ala Glu Lys Asp Pro Ile Thr Gly Arg Lys Val

755 760 765

Ser Phe Gly Leu Ile Arg Met Ala Asn Ile Glu Pro Leu Phe His Val

770 775 780

Ala Lys Asp Phe Phe Ala Leu Gly Gly Arg Arg Asp Thr His Ile His

785 790 795 800

Leu Cys Val Tyr His Ala Arg Phe Pro Leu Ile Gln Arg Ser Ala Ile

805 810 815

Glu Asn Met Leu Asp Arg Val Leu Asn Arg Arg Glu Ala Asp Phe Val

820 825 830

Tyr His His Ala Asp Ile Arg Glu Ile Leu Asp Asn Asn Pro Glu Gln

835 840 845

Asp His Ala Phe Ile Ile Leu Ala Ser Pro Val Cys Glu Val Gly Arg

850 855 860

Asp Trp Asp Leu Asp Trp Ala Ile Thr Glu Pro Ser Ser Met Arg Ala

865 870 875 880

Leu Ile Gln Leu Ala Gly Arg Val Gln Arg His Arg Arg Lys Ser Ala

885 890 895

Glu Lys Pro Asn Ile Ala Ile Leu Asn Thr Ala Leu Arg Tyr Phe Lys

900 905 910

Asn Pro Ala Gly Ala Val Phe Trp His Pro Gly Phe Glu Lys Pro Lys

915 920 925

Thr Pro Tyr Gly Asp Asn Arg Phe Tyr Leu Glu Asn His Trp Leu Ser

930 935 940

Lys Ile Leu Arg Pro Glu Glu Tyr Lys Ile Ile Thr Ala Leu Pro Arg

945 950 955 960

Ile Ala Pro Gln Pro Lys Glu Glu Arg His Ser Gln Glu Arg Met Ser

965 970 975

Asp Leu Glu Gln Ala Arg Ile Cys Glu Ser Met Leu Pro Glu Lys Asn

980 985 990

Leu Gly Glu Val Val Gly Gly Ser Ser Arg Ser Pro Lys Lys Leu Glu

995 1000 1005

Pro Lys Glu Glu Met Ala Ala Leu Cys Trp Gln Tyr Pro Gln Ala Ser

1010 1015 1020

Leu Thr Gly Val Leu Pro Gln Trp Gln Pro Phe Arg Glu Lys Thr Leu

1025 1030 1035 1040

Arg Glu Glu Thr Leu Leu Phe Leu Pro Asp Glu Asp Gly Glu Lys Leu

1045 1050 1055

Glu Leu Tyr Gln Glu Tyr Lys Asn Pro Glu Asn Ser His Asn Pro Tyr

1060 1065 1070

Ile Leu Val Glu Arg Glu Lys Lys His Pro Val Glu Ile Asp Tyr Gly

1075 1080 1085

Ser Asp Ile Thr Ala Trp Gln Ala Asp Ser Leu Glu Asn Leu Leu Glu

1090 1095 1100

Glu Gln Ser Glu Asn Leu Gly Ile Ser Leu Tyr Lys Cys Ala Glu Tyr

1105 1110 1115 1120

Met Thr Lys Val Asn Val Leu Glu Ser Ile Ser Gly Tyr Asn Tyr Asn

1125 1130 1135

Asp Ile Leu Gly Phe Ser Arg Tyr His Ser

1140 1145

<210> 2

<211> 3441

<212> DNA

<213> 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)

<400> 2

atgaatgttc tattcgtttc gcaatgcgac aacaatgctc tgaaagaaac tcggcgaatc 60

cttgatcagt ttgctgaacg gaagggaagt cgaagctggc aaacgcctat cacgcaaata 120

ggcttggcta ctgttcaaaa attattgaga aaaacagcaa ggcgaaatac ttctgttgcc 180

tgtcattggt tacatggggg tgggcagtgt gatttacttt ggatagttgg ggacgccagc 240

cgttttaata atgaaggcgc tgtcccgacc aatagcacta cccgaaatat tttacgccaa 300

caggatgaaa atgattggat aactgctgaa gatattcaga tgttggcgca aatggctgct 360

ttgttgcatg atttaggaaa ggccagcaaa gcttttcaaa ggcgtctgcg gtcaagagaa 420

aaatctcgca atttataccg tcatgaatgg gtttctttac ggttatttca ggctttcgtc 480

gggggggata cggatgaggt ctggctaacc cgtctgttag aaggcaacta ttcaataaaa 540

gactgggtgg cgaaaaaacg gtataaaaaa gatggagtcg atgccttgaa tggtgaagac 600

tgttatcctt ttaaatcttt accgcctttg gcggcggcga ttgggtggtt aatcgtttct 660

catcatcgta ttccgttgct gcctgtttat attgataaaa aagaccgtag ggaacaggcc 720

tatttgggta aaaaaaccca atcggtaaga cttgggattc tcaaagatcc attagataag 780

ataacctctt tatggaatga aataaccgaa aatggggctt cctcatctaa ggtaaaagac 840

tattgggata ttgacaaaaa agaaaaattt ccggttttgt taccggaatg gcaaaaacag 900

gcttccagaa tagcgaagcg tttattggct ttgaacaaga agaaagacat ccaaaaaaac 960

gggcttgata atccttatct tatgcatttg gcacgtttga gtctgatgtt ggcggatcac 1020

tattattcga gtcttcctcc ggaatcaaaa gaccggatat ccgctgccaa agaattatct 1080

tctagcggag atgattttct ttatgccaac acagacagtc aaggtgagcg gaaacaaggc 1140

ttgagtgagc atctattggg tgtggcaaga gatgccggaa ttatcgccca tgctttgccg 1200

aatttttccg aatatttgcc ccgtttagcc aaacataaag gattaaagaa gagaagccag 1260

aacccccgtt tttcgtggca ggataaggct gctgatatgg cgatagccct gcgcgaaaaa 1320

accgaaaggc aaggagcttt ctgtgtctgt atggcctcta cgggaacagg aaaaactctt 1380

gctagtgctc gtattatcaa tgccatggcc aaccctgaaa aagggatgcg tctgacctat 1440

gcgttgggat tgagaacact cactttgcaa accggaaaat cttatcaaaa agatttacat 1500

ctgaatgaca atgatctggc tattttagtt ggaggaagtg ccagtaaaac cctatttgac 1560

tattattcag ataaggctga agaatccggt tcagcttcct ctttggatct attggaagaa 1620

gatagctata tttcatatga aggctgtgaa gccagccatc ctttattgag ccgtttgggg 1680

catgatccta gaatacgaag ccttttatcc gcaccagttc tggtttgtac cgttgatcat 1740

ctggttcctg cgaccgaatc tttgcggggc gggcgacaaa tcgcacccat gctgcgtttg 1800

atgggggctg atctcgtttt agatgaattg gatgattatg atttgaagga tttacccgcc 1860

ttaactcgat tggtctattg ggcaggtctg ttgggtagtc gtgttttatt gtcttcagcc 1920

acattaccgc cttccttggt ttcgggtatg tatcaggctt atcttgccgg tcggaaatgc 1980

tatcaattaa atcatgaccc tagtctatct ctggcagcgc aggatatccc ttgtttgtgg 2040

atagacgaat ttggaactac tcatgctgat tgtgctgatg ccaatcagtt tgagcaggcg 2100

catgatgatt ttgtaaagcg gcgtaagcag aagcttttga aaagtgaagc tatctgtaaa 2160

ggcgaaatcg tgcctttgga tgaggtggtt ggaacgccag acgataaggc attatataaa 2220

aattttgctt caatattacg caagactgcc ttggatttgc atgaaggctt tgctgaaaaa 2280

gacccgatta caggaagaaa agttagtttc ggtctgatca gaatggctaa tattgaaccg 2340

ctatttcatg tcgcaaaaga tttttttgcc ttaggtggtc gccgtgatac gcatatccat 2400

ttatgtgtct accatgcgcg tttccctcta atccagcgtt cagctatcga aaatatgctg 2460

gatagggtgc tgaatcgccg cgaggctgac tttgtctatt atcatgcgga tatccgagag 2520

attttggata acaatccaga acaggatcac gcctttatta tattagcatc gcctgtttgc 2580

gaggtagggc gtgattggga tttggattgg gcgattaccg agccttcttc tatgcgcgcg 2640

ctcatccaat tggcagggcg tgtccagcga catagaagaa aagctgctca gaaaccgaat 2700

atcgctattt tgaatactgc tttgcgttat tttaaaaatc ctgctggggc tgtcttctgg 2760

catccgggat tcgaaaaacc taaaacacca tatggcgata atcgattcta tcttgaaaac 2820

cattggttaa gcgaaatttt aagaccagaa gaatataaaa ttattacagc tttgcctcga 2880

atagcgccct tacccaaaga agagcggcat agccaagaaa gaatgtctga tctggaacaa 2940

gcgcgtattt gtgaatctat gttgccagag aaaaaccttg gagaagttgt gggggggagt 3000

agccgttctc ccaaaaaagt ggaaccaaaa gaggaaatgg cagctctttg ttggcaatat 3060

ccgcaggcta gtctgacggg tgttttgccc caatggcagc catttagaga aaaaacctta 3120

agagaagaga cccttctatt tttacctgac gaagatggcg atgggttaga actttatcag 3180

gaaaataaga atcccgaaaa tagtcataat ccgtatattc ttgttgaacg ggaaaaaaaa 3240

catcaggtcg aaattgatta tggttcagat ataaccgcat ggcaggctga taatcttgaa 3300

aatttattag aaaagcagtc tgaaaatctt ggtatttctc tgtataagtg tgctgaatat 3360

atgacaaaag taaatgtttt agaaaataca tctggatata attataatga tattcttgga 3420

ttttccagat atcatagtta a 3441

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctttaagaag gagatatacc atatgaatgt tctattcgtt tcgc 44

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatctcagtg gtggtggtgg tggtgactat gatatctgga aaatc 45

<210> 5

<211> 60

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cuuagaaacc uggcggcucc cucgugcgcu cuccuguucc guucacugcc gcacaggcag 60

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaagaatct ttgcggggcg ggcgacaaat cgcacc 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaacggtgcg atttgtcgcc cgccccgcaa agattc 36

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggtcaccag ctcaccgtct gaattcatga atgttctatt cgtttc 46

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttttaaatc ataatcatcc aattcagcta aaacgagatc agccccc 47

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctgaattgg atgattatga tttaaaagat ttacccgcct taactcg 47

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcgagagat ctgatatcac tctagattaa ctatgatatc tggaaa 46

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gatcacggaa attatttggc ttatggcctt ggtgctactg cgac 44

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaagacatcc aaggcggcgg cattaccgac aacatctata tcaaaatttt c 51

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacaagagcg gaatccgcgt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaggtaataa ccccgcgacc 20

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)

<400> 16

ttcaaatcat aatcatccaa ttcatctaaa ac 32

<210> 17

<211> 3441

<212> DNA

<213> 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)

<400> 17

atgaatgttc tattcgtttc gcaatgcgac aacaatgctc tgaaagaaac tcggcgaatc 60

cttgatcagt ttgctgaacg gaagggaagt cgaagctggc aaacgcctat cacgcaaata 120

ggcttggcta ctgttcaaaa attattgaga aaaacagcaa ggcgaaatac ttctgttgcc 180

tgtcattggt tacatggggg tgggcagtgt gatttacttt ggatagttgg ggacgccagc 240

cgttttaata atgaaggcgc tgtcccgacc aatagcacta cccgaaatat tttacgccaa 300

caggatgaaa atgattggat aactgctgaa gatattcaga tgttggcgca aatggctgct 360

ttgttgcatg atttaggaaa ggccagcaaa gcttttcaaa ggcgtctgcg gtcaagagaa 420

aaatctcgca atttataccg tcatgaatgg gtttctttac ggttatttca ggctttcgtc 480

gggggggata cggatgaggt ctggctaacc cgtctgttag aaggcaacta ttcaataaaa 540

gactgggtgg cgaaaaaacg gtataaaaaa gatggagtcg atgccttgaa tggtgaagac 600

tgttatcctt ttaaatcttt accgcctttg gcggcggcga ttgggtggtt aatcgtttct 660

catcatcgta ttccgttgct gcctgtttat attgataaaa aagaccgtag ggaacaggcc 720

tatttgggta aaaaaaccca atcggtaaga cttgggattc tcaaagatcc attagataag 780

ataacctctt tatggaatga aataaccgaa aatggggctt cctcatctaa ggtaaaagac 840

tattgggata ttgacaaaaa agaaaaattt ccggttttgt taccggaatg gcaaaaacag 900

gcttccagaa tagcgaagcg tttattggct ttgaacaaga agaaagacat ccaaaaaaac 960

gggcttgata atccttatct tatgcatttg gcacgtttga gtctgatgtt ggcggatcac 1020

tattattcga gtcttcctcc ggaatcaaaa gaccggatat ccgctgccaa agaattatct 1080

tctagcggag atgattttct ttatgccaac acagacagtc aaggtgagcg gaaacaaggc 1140

ttgagtgagc atctattggg tgtggcaaga gatgccggaa ttatcgccca tgctttgccg 1200

aatttttccg aatatttgcc ccgtttagcc aaacataaag gattaaagaa gagaagccag 1260

aacccccgtt tttcgtggca ggataaggct gctgatatgg cgatagccct gcgcgaaaaa 1320

accgaaaggc aaggagcttt ctgtgtctgt atggcctcta cgggaacagg aaaaactctt 1380

gctagtgctc gtattatcaa tgccatggcc aaccctgaaa aagggatgcg tctgacctat 1440

gcgttgggat tgagaacact cactttgcaa accggaaaat cttatcaaaa agatttacat 1500

ctgaatgaca atgatctggc tattttagtt ggaggaagtg ccagtaaaac cctatttgac 1560

tattattcag ataaggctga agaatccggt tcagcttcct ctttggatct attggaagaa 1620

gatagctata tttcatatga aggctgtgaa gccagccatc ctttattgag ccgtttgggg 1680

catgatccta gaatacgaag ccttttatcc gcaccagttc tggtttgtac cgttgatcat 1740

ctggttcctg cgaccgaatc tttgcggggc gggcgacaaa tcgcacccat gctgcgtttg 1800

atgggggctg atctcgtttt agctgaattg gatgattatg atttgaagga tttacccgcc 1860

ttaactcgat tggtctattg ggcaggtctg ttgggtagtc gtgttttatt gtcttcagcc 1920

acattaccgc cttccttggt ttcgggtatg tatcaggctt atcttgccgg tcggaaatgc 1980

tatcaattaa atcatgaccc tagtctatct ctggcagcgc aggatatccc ttgtttgtgg 2040

atagacgaat ttggaactac tcatgctgat tgtgctgatg ccaatcagtt tgagcaggcg 2100

catgatgatt ttgtaaagcg gcgtaagcag aagcttttga aaagtgaagc tatctgtaaa 2160

ggcgaaatcg tgcctttgga tgaggtggtt ggaacgccag acgataaggc attatataaa 2220

aattttgctt caatattacg caagactgcc ttggatttgc atgaaggctt tgctgaaaaa 2280

gacccgatta caggaagaaa agttagtttc ggtctgatca gaatggctaa tattgaaccg 2340

ctatttcatg tcgcaaaaga tttttttgcc ttaggtggtc gccgtgatac gcatatccat 2400

ttatgtgtct accatgcgcg tttccctcta atccagcgtt cagctatcga aaatatgctg 2460

gatagggtgc tgaatcgccg cgaggctgac tttgtctatt atcatgcgga tatccgagag 2520

attttggata acaatccaga acaggatcac gcctttatta tattagcatc gcctgtttgc 2580

gaggtagggc gtgattggga tttggattgg gcgattaccg agccttcttc tatgcgcgcg 2640

ctcatccaat tggcagggcg tgtccagcga catagaagaa aagctgctca gaaaccgaat 2700

atcgctattt tgaatactgc tttgcgttat tttaaaaatc ctgctggggc tgtcttctgg 2760

catccgggat tcgaaaaacc taaaacacca tatggcgata atcgattcta tcttgaaaac 2820

cattggttaa gcgaaatttt aagaccagaa gaatataaaa ttattacagc tttgcctcga 2880

atagcgccct tacccaaaga agagcggcat agccaagaaa gaatgtctga tctggaacaa 2940

gcgcgtattt gtgaatctat gttgccagag aaaaaccttg gagaagttgt gggggggagt 3000

agccgttctc ccaaaaaagt ggaaccaaaa gaggaaatgg cagctctttg ttggcaatat 3060

ccgcaggcta gtctgacggg tgttttgccc caatggcagc catttagaga aaaaacctta 3120

agagaagaga cccttctatt tttacctgac gaagatggcg atgggttaga actttatcag 3180

gaaaataaga atcccgaaaa tagtcataat ccgtatattc ttgttgaacg ggaaaaaaaa 3240

catcaggtcg aaattgatta tggttcagat ataaccgcat ggcaggctga taatcttgaa 3300

aatttattag aaaagcagtc tgaaaatctt ggtatttctc tgtataagtg tgctgaatat 3360

atgacaaaag taaatgtttt agaaaataca tctggatata attataatga tattcttgga 3420

ttttccagat atcatagtta a 3441

<210> 18

<211> 276

<212> DNA

<213> 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)

<400> 18

cccgggtttg accctttatt tgaccctctt tttttggcat gtaaaaaaat cctttaaaat 60

caataggtta aaaataggct ctatttttag ggttatttgg ctatttttgc ccgatattcc 120

tttcatttag ggggattttt aattatttac tctagttcac tgccgcacag gcagcttaga 180

aaggagacgg acgtctcagt tcactgccgc acaggcagct tagaaaggag accgaggtct 240

cagttcactg ccgcacaggc agcttagaaa ggatcc 276

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaaagacctt atgcctatgt cgatacaacc acgaat 36

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gaacattcgt ggttgtatcg acataggcat aaggtc 36

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaaagctgat ccgcgtccaa atagggcggc tgatgg 36

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gaacccatca gccgccctat ttggacgcgg atcagc 36

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gacaagagcg gaatccgcgt 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gaggtaataa ccccgcgacc 20

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gaaagtctgc acagtgttac cggcatcact ggtgat 36

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gaacatcacc agtgatgccg gtaacactgt gcagac 36

<210> 27

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gaaaagatta tcaatccgca agaaggtatg tggaac 36

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gaacgttcca cataccttct tgcggattga taatct 36

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgaatggcgc ctctgaactt 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tagaccatct gggaagccga 20

Claims (7)

1.一种基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统，其特征在于：包括序列如SEQ ID NO.16所示的人工CRISPR簇、编辑质粒载体和含nCas3单链核酸内切酶的工程菌；

所述nCas3单链核酸内切酶为在野生型Cas3蛋白的解旋酶功能域上引发突变，使野生型Cas3蛋白丧失解旋酶活性，只具备单链核酸酶活性的nCas3蛋白；所述野生型Cas3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述nCas3单链核酸内切酶为K458A、或D608A、或R887A；

所述K458A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第458位的“K”替换为“A”；

所述D608A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第608位的“D”替换为“A”；

所述R887A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第887位的“R”替换为“A”。

2.根据权利要求1所述的一种基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统，其特征在于：所述含nCas3单链核酸内切酶的工程菌为运动发酵单胞菌。

3.根据权利要求1所述的一种基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统，其特征在于：所述编辑质粒载体pEZ15a载体。

4.如权利要求1-3任一所述的一种基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统在基因编辑中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述基因编辑包括基因敲除、定点突变、插入中的任一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述基因敲除包括基因组大片段删除。

7.一种利用如权利要求1-3任一所述的基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统进行基因组大片段删除的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将人工CRISPR簇和编辑质粒载体连接，构建编辑质粒；

S2：根据待删除的目标片段序列设计并制备原间隔序列，

S3：将目标片段的原间隔序列与编辑质粒连接后，转化至含nCas3单链核酸内切酶的工程菌中培养。

Images