CN108949719B

CN108949719B - 一种编码易错dna聚合酶及其制备方法

Info

Publication number: CN108949719B
Application number: CN201810831279.6A
Authority: CN
Inventors: 刘承芸; 杨秀清
Original assignee: Shanxi University; Shanxi Medical University
Current assignee: Shanxi University; Shanxi Medical University
Priority date: 2018-07-26
Filing date: 2018-07-26
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2038-07-26
Also published as: CN108949719A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法。本发明易错DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：(1)提取红球菌基因组DNA，测序，比对，得到易错DNA聚合酶基因序列SEQ ID NO：1；(2)克隆SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，得到核苷酸片段；(3)将核苷酸片段和质粒pET32a进行连接，构建重组质粒；(4)将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21中，获得表达菌株；(5)利用LB液体培养基培养表达菌株，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导16‑20h，裂解菌体，纯化，获得重组易错DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提高了易错DNA聚合酶表达和纯化效率，以获得稳定、高活力的易错DNA聚合酶，提高易错效果。

Description

一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法。

背景技术

PCR是一种DNA片段体外复制技术，但常有一定的碱基错配发生，一般错配率为10^-6～10^-5。碱基错配虽然降低了DNA序列复制的保真性，但对获得新DNA序列提供了一种可利用的突破口。易错PCR是通过改变PCR条件，提高扩增产物的碱基错配率，从而获得与原来不同的DNA 序列或基因。易错PCR作为一种简便、有效地获得DNA序列变异的技术，主要是针对特定的基因，这在遗传和基因改良研究中具有巨大的应用前景。易错PCR技术是采用多种方法提高 DNA聚合酶的碱基错配率，并稳定非互补碱基对。改变PCR反应条件的方法主要有4种，一是使用低保真度Taq酶、并加大Taq酶用量；二是调整反应体系中4种dNTP的浓度，使之非1∶1∶1∶1的平衡浓度关系；三是在反应体系中加入一定量的Mn²⁺；四是增加反应体系中的Mg²⁺浓度。此外，降低起始模板浓度、增加每个循环的延伸时间、提高反应体系pH值、增加循环次数等也都可以明显提高诱变率。几种方法可单独使用，但更多的时候是综合使用，以求最简单、快捷的得到更多的突变子。

以上的易错PCR研究全部采用改变PCR反应条件，来提高DNA聚合酶错误率的方法进行，但易错PCR产量和变异水平偏低。较低的模板浓度以及引物与模板结合严格性的降低，使得目标片段的产量偏低由于碱基变异偏好、转换高于颠换，造成变异谱较窄，筛库得到有益基因的概率降低。三是对模板的要求较高，最好是只含目的基因的DNA片段。另外，应用易错 PCR时一般都要针对具体基因进行诱变条件的优化，需要优化的条件有多个，包括Mn²⁺浓度、 Mg²⁺浓度、4种dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板浓度、延伸时间、循环次数等，这些条件综合起来优化还比较费力。为了解决这些问题，有人尝试通过修饰DNA聚合酶来提高常规 PCR错配率的研究。Benjamin和Connolly于2004年报道了一个PfuDNA聚合酶的变种在易错PCR反应中表现出极好的性能。Pfu DNA聚合酶有两个螺旋构成了聚合酶的指状子域，这一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对。当两个螺旋之间的关键氨基酸发生变异，与缺失 3'-5'核酸外切酶活性同时发生时，一个高保真野生型聚合酶就变为了一个低保真聚合酶。这个PfuDNA聚合酶变种能够在标准PCR反应条件下用于诱变基因，并得到高频率、几乎没有任何倾向的变异。

发明内容

为了解决易错PCR时操作的繁琐及条件的优化，本发明提供一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法。该方法可以得到高纯度易错DNA聚合酶。

本发明是为实现上述技术目的而采取的技术方案为：

一种编码易错DNA聚合酶，所述编码易错DNA聚合酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明易错DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取红球菌基因组DNA，测序，比对，得到易错DNA聚合酶基因序列SEQ ID NO：1；

(2)克隆SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，得到核苷酸片段；

(3)将步骤(2)所得的核苷酸片段和质粒pET32a进行连接，构建重组质粒；

(4)将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21中，获得表达菌株；

(5)利用LB液体培养基培养表达菌株，37℃培养4.5h后，加入终浓度为0.5mM的IPTG 诱导16-20h，裂解菌体，纯化，获得重组易错DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明步骤(1)中所述的提取红球菌基因组DNA的方法为：采用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒提取红球菌R04总DNA；所述的比对方法为：经华大基因测序，注释，通过blast比对得到易错DNA聚合酶序列，该序列全场为3252bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码1123个核苷酸，以ATG为起始密码子，TGA为终止密码子。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明步骤(4)中所述的表达菌株得具体获得方法为：通过PCR进行易错DNA聚合酶基因的扩增，扩增引物为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4， PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切割含有目的条带的胶块，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，回收产物和pET32a质粒进行EcoRI和NotI双酶切，之后电泳，回收，将目的片段易错DNA聚合酶基因和pET32a进行连接，16℃过夜，构建好的重组质粒为pET32a-error Taq，将质粒转化入感受态E.coli BL 21中，获得表达菌株。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明步骤(5)中所述裂解菌体是采用溶菌酶裂解。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明在步骤(5)中，所述纯化是热变性和镍柱亲和层析。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述溶菌酶裂解时采用的溶菌酶浓度为0.2-0.44mg/mL。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述层析柱为镍柱亲和层析。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述热变性为裂解菌体采用溶菌酶裂解后，上清液80℃加热30分钟；离心，所得上清液进行镍柱亲和层析。

本发明是在已构建的重组易错DNA聚合酶基因表达载体的基础上，进行表达体系的优化，提高易错DNA聚合酶表达和纯化效率，以获得稳定、高活力的易错DNA聚合酶，提高易错效果。本发明通过测序、基因克隆，从红球菌中克隆到一个易错DNA聚合酶基因，通过制备重组易错DNA聚合酶的方法，重组菌株诱导表达制备出高活力易错DNA聚合酶，酶活力达到2IU/μl，通过易错PCR，证实其易错效果要优于目前所使用的方法。

附图说明

图1为本发明纯化的易错DNA聚合酶蛋白电泳图；

图2为本发明制备的易错DNA聚合酶进行易错PCR；

图3为本发明PCR扩增模板gene1的DNA片段。

具体实施方式

实施例1：基因全长编码区的测序，克隆：

采用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒提取红球菌R04总DNA，经华大基因测序，通过 blast比对得到易错DNA聚合酶序列，该序列全场为3252bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2 所示，编码1123个核苷酸，以ATG为起始密码子，TGA为终止密码子。

通过PCR进行易错DNA聚合酶基因的扩增，扩增引物为SEQ ID NO： 3:GCGAATTCATGCAGTCGATCGTGCAGTT,SEQ ID NO：4AGCGGCCGCGCGAAAGTCGCGTGAT，PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切割含有目的条带的胶块，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，回收产物和pET32a质粒进行EcoRI和NotI双酶切，之后电泳，回收。将目的片段易错DNA聚合酶基因和pET32a进行连接，16℃过夜，构建好的重组质粒为pET32a-error Taq.将质粒转化入感受态E.coli BL 21中，获得表达菌株。

实施例2：重组易错DNA聚合酶菌株的培养及诱导

将表达菌株接种于4mL LB液体培养基中(Amp100g/mL)37℃培养16-20h，之后取1.25mL 培养液接种于250mL摇瓶中，37℃培养4.5h。之后加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导，继续培养16-20h。

实施例3：易错DNA聚合酶的提取

4℃，12000rpm离心10min收集菌体，重悬于50mL 20mM pH 8.0磷酸缓冲液中，离心，收集沉淀，重悬于20mL 20mM pH 8.0磷酸缓冲液，向其中加入8mg的溶菌酶，使终浓度达到 0.4mg/mL。置于37℃下30min后，10000rpm离心20min，收集上清液，即为易错DNA聚合酶提取液。

实施例4：蛋白纯化及检测

将易错DNA聚合酶提取液置于80℃水浴中，加热30min，10000rpm离心20min，收集上清液，即为易错DNA聚合酶热变性纯化后的酶液。

将热变性后的错DNA聚合酶酶液上样于平衡后的镍柱层析柱上，收集穿透重复上样；用 10倍柱床体积的结合缓冲液(20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH 7.5，500mMNaCl，5mM咪唑)平衡镍柱以除去未结合的蛋白质。以含有100mM，200mM，300mM和500mM的洗脱缓冲液(20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH 7.5，500mMNaCl，5mM咪唑)洗脱镍柱，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液。

将收集到的洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析(图1)，同时以市售的Taq DNA聚合酶做对照进行PCR扩增反应。合并电泳行为一致且有DNA多聚酶活性的部分，置于透析袋中1000ml的pH7.5的Tris-HCl缓冲液透析，4℃，20h，期间换两次透析液，收集透析袋中的液体，即为本申请专利的易错PCR聚合酶。

实施例5：易错DNA聚合酶功能的PCR扩增

PCR扩增模板为名为gene1(序列见图3gene1)的DNA片段，扩增引物：Fg： 5’---ATTGAACTACCCGCTG---3’,Rg:5’---CGACTCGAGTGGACAG---3’，PCR扩增条件：94℃ 变性5min后按照如下参数循环30次：94℃变性45s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，最后再于72℃延伸10min，PCR扩增所使用的DNA多聚酶为本次申请专利产品易错DNA聚合酶。重复两次扩增，琼脂糖凝胶电泳PCR产物(图2)，送上海生工生物工程有限公司测序，两次 PCR反应所得序列gene1-m1和gene1-m2和模板序列gene1进行序列比对，如图3所示，结果表明经本申请专利易错DNA聚合酶扩增后，gene1-m1的突变率达到3.1％，gene1-m2的突变率达到7.5％，表明该易错DNA聚合酶具有较好的PCR扩增易错功能。

易错DNA聚合酶氨基酸序列：

易错PCR DNA聚合酶DNA序列：

图1是本发明易错PCR DNA聚合酶亲和纯化电泳检测图，图中Mr：蛋白质分子量标准，从上到下分子量依次为：116KD，68KD，45KD，35KD，25KD，18KD，14KD；1：纯化后易错PCRDNA聚合酶

图2是本发明经易错PCR DNA聚合酶扩增后的DNA片段琼脂糖凝胶电泳检测图，图中Mr：DNA分子量标准，100bpLadder；1,2；两次扩增的PCR产物，

本发明制备的易错DNA聚合酶进行PCR：

图3：易错PCR产物测序序列：Gene1-易错PCR扩增的模板序列；gene1-m1和gene1-m2 分别为两次经易错PCR聚合酶扩增后的序列。

序列表

<110> 山西医科大学

山西大学

<120> 一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1123

<212> PRT

<213> 红球菌R04(Rhodococcus sp.R04)

<400> 1

Met Gln Ser Ile Val Gln Phe Ser Ser Pro Thr Pro Gly Val Ser Arg

1 5 10 15

Arg Glu Leu Arg Val Phe Glu Arg Leu Val Arg Thr His Val Arg Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Arg Gly Gly Ala Gly Val Gly Trp Gly Asn Gly Pro Pro

35 40 45

Thr Trp Ser Glu Met Glu Arg Val Leu Ser Gly Arg Pro Gly Thr Ser

50 55 60

Arg Arg Asp Ala Glu His Pro Gly Asp Gly Ser Asp Ser Pro Ala Trp

65 70 75 80

Ser Arg Thr Arg Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Val Arg His Pro Glu Gly

85 90 95

Pro Val Val Pro Tyr Ala Glu Leu His Ala His Ser Ala Phe Ser Phe

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ser Thr Pro Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ala Ala Arg

115 120 125

Leu Gly Leu Glu Ala Leu Ala Val Thr Asp His Asp Gly Leu Tyr Gly

130 135 140

Ala Val Arg Phe Ala Glu Ala Ala Arg Glu Leu Gly Ile Arg Thr Val

145 150 155 160

Phe Gly Ala Glu Leu Gly Leu Asp Asp Ala His Leu Leu Val Leu Ala

165 170 175

Arg Gly Gln Glu Gly Tyr Arg Arg Leu Ser Arg Gln Ile Ala Asp Ala

180 185 190

His Leu Ala Gly Gly Glu Lys Asn Asn Pro Arg Tyr Asp Tyr Asp Ala

195 200 205

Leu Thr Asp Ala Ala Gly Gly His Trp Gln Ile Leu Thr Gly Cys Arg

210 215 220

Arg Gly His Leu Arg Gln Ala Leu Thr Thr Gly Gly Ile Pro Ala Ala

225 230 235 240

Glu Ala Ala Leu Leu Asp Leu Val Asp Arg Phe Gly Ala Asp Arg Val

245 250 255

Thr Val Glu Leu Thr Arg His Gly Tyr Pro Asp Asp His Glu Arg Asn

260 265 270

Ala Ala Leu Phe Glu Leu Ala Ala Arg His Gly Ile Pro Cys Ile Ala

275 280 285

Ser Thr Ala Ala His Phe Ala His Pro His Arg Arg Arg Leu Ala Met

290 295 300

Ala Val Ala Ala Ile Ser Asp Arg Gln Ser Leu Asp Asp Ala Val Gly

305 310 315 320

Arg Ile Pro Pro Thr Gly Gly Gly His Leu Arg Ser Gly Glu Glu Met

325 330 335

Thr Arg Leu Phe Glu Ala Phe Pro Gly Val Val His His Ala Ala Glu

340 345 350

Leu Gly Arg Glu Cys Ala Phe Asp Leu Arg Leu Val Ala Pro Lys Leu

355 360 365

Pro Pro Phe Asp Val Pro Asp Gly His Thr Glu Phe Thr Trp Leu Arg

370 375 380

Glu Leu Thr Tyr Asp Gly Ala Arg Arg Arg Tyr Gly Pro Val Glu Arg

385 390 395 400

Arg Pro Asp Ala Tyr Arg Gln Ile Glu His Glu Leu Asp Val Val Gly

405 410 415

Arg Leu Gly Phe Pro Gly Tyr Phe Leu Val Val His Asp Ile Val Asp

420 425 430

Phe Cys Lys Arg Ser Asp Ile Leu Cys Gln Gly Arg Gly Ser Ala Ala

435 440 445

Asn Ser Ala Val Cys Tyr Ala Ile Gly Ile Thr Asn Val Asp Pro Val

450 455 460

Gly Asn Lys Leu Leu Phe Glu Arg Phe Leu Ser Pro Glu Arg Asp Gly

465 470 475 480

Pro Pro Asp Ile Asp Leu Asp Ile Glu Ser Asp Arg Arg Glu Glu Ala

485 490 495

Ile Gln Tyr Val Tyr Arg Lys Tyr Gly Arg Ile Asn Ala Ala Gln Val

500 505 510

Ala Asn Val Ile Thr Tyr Arg Gly Arg Ser Ala Val Arg Asp Met Ala

515 520 525

Arg Ala Leu Gly Tyr Ser Gln Gly Gln Gln Asp Ala Trp Ser Lys Leu

530 535 540

Ile Gly Arg Trp Gly Gly Val Arg Val Glu Thr Asp Glu Arg Ile Pro

545 550 555 560

Glu Thr Val Leu Asp Leu Ala Glu Gln Ile Glu Gly Leu Pro Arg His

565 570 575

Leu Gly Ile His Ser Gly Gly Met Val Ile Cys Asp Arg Pro Val Ala

580 585 590

Asp Val Cys Pro Val Glu Trp Ala Arg Met Glu Gly Arg Thr Val Leu

595 600 605

Gln Trp Asp Lys Asp Asp Cys Ala Ala Ala Gly Leu Val Lys Phe Asp

610 615 620

Leu Leu Gly Leu Gly Met Leu Ser Ala Leu His Tyr Met Ile Asp Leu

625 630 635 640

Val Asp Glu His Glu Gly Ile Arg Val Asp Leu Ala His Leu Asp Leu

645 650 655

Ser Glu Pro Gly Val Tyr Glu Met Leu Cys Arg Ala Asp Ser Val Gly

660 665 670

Val Phe Gln Val Glu Ser Arg Ala Gln Met Ala Thr Leu Pro Arg Leu

675 680 685

Lys Pro Arg Cys Phe Tyr Asp Leu Val Ile Glu Val Ala Ile Ile Arg

690 695 700

Pro Gly Pro Ile Gln Gly Gly Ser Val His Pro Tyr Ile Arg Arg Arg

705 710 715 720

Asn Gly Leu Glu Pro Val Thr Tyr Asp His Pro Cys Leu Glu Lys Ala

725 730 735

Leu Glu Arg Thr Leu Gly Val Pro Leu Phe Gln Glu Gln Leu Met Gln

740 745 750

Met Ala Val Asp Ala Ala Gly Phe Thr Ala Ala Glu Ala Asp Arg Leu

755 760 765

Arg Arg Ala Met Gly Ser Lys Arg Ser Thr Glu Lys Met Glu Arg Leu

770 775 780

Arg Gly Arg Leu Tyr Gln Gly Met Arg Asp Leu His Gly Ile Thr Gly

785 790 795 800

Asp Val Ala Asp Arg Ile Tyr Glu Lys Leu Tyr Ala Phe Ala Asn Phe

805 810 815

Gly Phe Pro Glu Ser His Ser Gln Ser Phe Ala Ser Leu Val Phe Tyr

820 825 830

Ser Ala Trp Phe Lys Leu His His Pro Ala Ala Phe Cys Ala Gly Leu

835 840 845

Leu Arg Ala Gln Pro Met Gly Phe Tyr Ser Pro Gln Ser Leu Val Ala

850 855 860

Asp Ala Arg Arg His Gly Val Val Val His Gly Pro Asp Ile Gly Ala

865 870 875 880

Ser Leu Ala His Ala Thr Leu Glu Asn Glu Gly Arg Glu Val Arg Leu

885 890 895

Gly Leu Ala Thr Val Arg His Ile Gly Asp Asp Leu Ala Glu Arg Ile

900 905 910

Val Thr Glu Arg Ser Ala His Gly Pro Tyr Thr Ser Pro Ala Asp Leu

915 920 925

Ala Ala Arg Val Gly Leu Thr Thr Thr Gln Val Glu Ala Leu Ala Thr

930 935 940

Ala Gly Thr Phe Ser Ser Phe Gly Val Thr Arg Arg Glu Ala Leu Trp

945 950 955 960

Gly Ala Ala Pro Ala Ala Ala Gln Arg Pro Gly Arg Phe Pro Gly Ile

965 970 975

Gly Thr Val Pro Thr Pro Ala Leu Pro Gly Met Ser Ala Leu Glu Leu

980 985 990

Ala Ala Ala Asp Val Trp Ala Thr Gly Ile Ser Pro Asp Ser Tyr Pro

995 1000 1005

Thr Gln Phe Leu Arg Glu Arg Leu Asp Glu Leu Gly Val Ile Pro Ala

1010 1015 1020

Ala Glu Leu Trp Gln Val Pro Asp Gly Thr Arg Ile Leu Val Gly Gly

1025 1030 1035 1040

Ala Val Thr His Arg Gln Arg Pro Ala Thr Ala Ala Gly Val Thr Phe

1045 1050 1055

Leu Asn Leu Glu Asp Glu Thr Gly Met Val Asn Val Val Cys Ser Val

1060 1065 1070

Gly Leu Trp Ala Arg Tyr Arg Thr Val Ala His Thr Ala Pro Ala Leu

1075 1080 1085

Leu Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn Ala Glu Gly Val Val Thr Leu Leu

1090 1095 1100

Ala Asp His Leu Glu Ala Met Asp Leu Arg Met Pro Ser Arg Ser Arg

1105 1110 1115 1120

Asp Phe Arg

<210> 2

<211> 3372

<212> DNA

<213> 红球菌R04(Rhodococcus sp.R04)

<400> 2

atgcagtcga tcgtgcagtt ctcgtcgccg actcccggcg tgtcgcgacg agaactgcgc 60

gtgttcgaac gtctcgttcg aacacatgtg cgatactgga tcggtcgagg aggtgccgga 120

gtgggatggg gaaacggtcc gccgacctgg tcggagatgg aacgtgtgct ctcgggacga 180

cccggcactt cccgccgcga tgccgaacat cccggcgacg ggagcgacag cccggcgtgg 240

tcgcgcaccc gcaccgagta cgaggcgcgg gtccgacatc cggaaggacc ggtcgtgccc 300

tacgccgaac tgcacgccca ctccgcgttc agcttcctcg acggtgcctc cacgccggag 360

gaactcgccg aggaggcggc acgactcgga ctcgaggccc tcgcggtgac cgaccacgac 420

ggactgtacg gagcggtgcg attcgccgaa gccgcacgcg aactcggcat ccgcaccgtc 480

ttcggagccg agctgggcct cgacgatgcg cacctgctcg tcctcgcccg cggtcaggag 540

ggctatcgac gcctgtcgcg gcagatcgcc gacgcccacc tcgcaggagg ggagaagaac 600

aacccgaggt acgactacga cgcgctcacc gacgccgccg gtgggcactg gcagatcctc 660

accggttgtc gccgggggca cctgcgacag gcgctcacca cgggcgggat ccccgccgcc 720

gaagcagcat tgctcgatct cgtcgaccgg ttcggtgccg accgcgtgac cgtcgaactc 780

acccgtcacg gatatcccga cgaccacgaa cgcaacgcag ccctcttcga acttgccgcg 840

cgacatggca ttccgtgcat cgcgagcacg gcggcgcact tcgcgcatcc ccatcggcga 900

cgtctggcga tggccgtggc ggcgatctcc gaccggcaga gcctcgacga cgccgtcggc 960

cggatccccc cgaccggagg cgggcacctg cggtcggggg aggagatgac gcggctgttc 1020

gaggcctttc cgggtgtcgt gcaccatgcc gccgaactcg gtcgtgaatg cgccttcgat 1080

ctgcgtctcg tcgccccgaa actgccgccc ttcgatgttc ccgacgggca caccgagttc 1140

acctggctgc gcgaactcac ctacgacggg gcgcgtcgcc gctacggtcc ggtcgagcgc 1200

cgccccgacg cctatcggca gatcgaacac gaactcgacg tcgtcggccg gctgggattc 1260

ccgggatact tcctcgtcgt ccacgacatc gtcgacttct gcaagcggag cgacatcctc 1320

tgccagggac gaggatcggc cgccaactcg gcggtctgct acgcgatcgg catcaccaac 1380

gtcgaccccg tcggcaacaa gctgctgttc gaacgcttcc tgtcgcccga acgcgacggc 1440

ccacccgaca tcgacctcga catcgaatcc gaccggcgcg aggaggcgat ccagtacgtc 1500

taccgcaagt acggccgcat caatgcggcg caggtcgcga acgtcatcac ctaccgcggt 1560

cgttccgccg tccgcgacat ggcccgtgct ctcggatact cgcagggaca gcaggacgcg 1620

tggagcaagc tgatcggccg gtggggtggg gtgcgggtag agaccgacga acggatcccg 1680

gagacggttc tcgatctcgc cgaacagatc gaaggtctcc cacggcatct cggcatccac 1740

tcgggcggca tggtgatctg cgaccggccc gtcgccgacg tgtgccccgt cgaatgggcg 1800

cgaatggaag gacgcaccgt tctgcagtgg gacaaggacg actgtgctgc agcgggtctc 1860

gtgaagttcg atctgctcgg cctcggcatg ctctccgcgc tgcactacat gatcgacctc 1920

gtcgacgaac acgaaggcat ccgagtcgat ctcgcgcacc tcgacctctc cgagccgggg 1980

gtctacgaga tgttgtgccg cgccgactcg gtgggtgtct tccaggtgga gtcgcgggcg 2040

cagatggcca ctctgccgcg gttgaagccg cgctgcttct acgatctggt catcgaggtg 2100

gccatcatcc ggcccggccc gatccagggc ggttcggtgc acccctacat ccggcggcgc 2160

aacggtctcg aacccgtcac ctacgaccat ccgtgcctcg agaaggccct cgaacgcacc 2220

ctcggcgttc cgctcttcca ggaacagctc atgcagatgg ccgtcgacgc cgcgggattc 2280

accgcggcgg aggccgaccg gttgcgtcgc gccatgggat cgaaacggtc gacggagaag 2340

atggagcgtc tgcggggacg cctctatcag ggcatgcggg acctgcacgg catcacgggg 2400

gacgtcgccg accgcatcta cgagaagctc tacgccttcg cgaatttcgg tttccccgaa 2460

agtcattcgc agagcttcgc ctcgctggtg ttctattcgg cgtggttcaa actgcaccat 2520

cccgcagcgt tctgcgcggg tctgctgcgt gctcagccga tgggtttcta ctcgccgcaa 2580

tcgctggtcg ccgatgcccg ccgtcacggt gtggtcgtcc acggccccga catcggggcg 2640

agcctcgcgc acgccaccct cgagaacgaa gggcgagagg tccggctcgg cctggcgacg 2700

gtgcggcaca tcggcgacga cctcgccgaa cgcatcgtga ccgaacgcag tgcccacggc 2760

ccgtacacct cgcccgccga cctcgccgcc cgcgtcggtc tcaccaccac gcaggtcgag 2820

gcgctggcca ccgcaggaac tttctcctcg ttcggcgtca cccgccgcga agccctctgg 2880

ggtgcggccc cggccgcggc acaacgcccc gggcggttcc ccgggatcgg gacggtgccg 2940

actccggccc tgccggggat gagcgctctc gaactcgccg ccgccgacgt ctgggccacg 3000

ggaatctcgc ccgacagcta tccgacgcag tttctgcgcg agcggctcga cgaactcggg 3060

gtgatcccgg ccgcggagtt gtggcaggtc cccgacggga cgcgcatcct cgtcggcggg 3120

gccgtgacac accggcagcg acctgcaaca gccgccggtg tcaccttcct caacctcgag 3180

gacgagaccg gaatggtgaa cgtggtgtgc tcggtcggtc tgtgggcgcg ctaccggacc 3240

gtggcccaca cggctcccgc cctgctcgtc cgcggccggc tccagaacgc cgagggcgtg 3300

gtcacgctcc tcgccgacca tctcgaagcc atggatctgc gaatgccgag cagatcacgc 3360

gactttcgct aa 3372

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthesis)

<400> 3

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<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthesis)

<400> 4

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Claims

1.一种易错DNA聚合酶，其特征在于，所述易错DNA聚合酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取红球菌基因组DNA，测序，比对，获得易错DNA聚合酶基因序列SEQ ID NO：2；

(2)克隆SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，得到核苷酸片段；

(5)利用LB液体培养基培养表达菌株，37℃培养4.5h后，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导16-20h，裂解菌体，纯化，获得重组易错DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述步骤(1)中所述的提取红球菌基因组DNA的方法为：采用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒提取红球菌R04总DNA；所述的比对方法为：经华大基因测序，注释，通过blast比对得到易错DNA聚合酶序列，该序列全长为3252bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码1123个氨基酸，以ATG为起始密码子，TGA为终止密码子。

3.根据权利要求2所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的表达菌株的具体获得方法为：通过PCR进行易错DNA聚合酶基因的扩增，扩增引物为SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4，PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切割含有目的条带的胶块，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，回收产物和pET32a质粒进行EcoRI和NotI双酶切，电泳，回收，将目的片段易错DNA聚合酶基因和pET32a进行连接，16℃过夜，构建好的重组质粒命名为pET32a-error Taq，将重组质粒转化入感受态E.coli BL 21中，获得表达菌株。

4.根据权利要求2所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述裂解菌体是采用溶菌酶裂解。

5.根据权利要求2所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述纯化是由热变性沉淀和层析柱分离纯化两步组成。

6.根据权利要求4所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述溶菌酶裂解时采用的溶菌酶浓度为0.2-0.4mg/mL。

7.根据权利要求5所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述层析柱为镍柱亲和层析。

8.根据权利要求5所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述热变性为裂解菌体采用溶菌酶裂解后，上清液80℃加热30分钟；离心，所得上清液进行镍柱亲和层析。