JP2020533947A - 新規な5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ及びこれを用いた5’−イノシン酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の他の一つの目的は、前記変異型5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記変異型5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ及び前記ベクターを含む5’−イノシン酸を生産する微生物を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階;及び前記微生物または培地で5’−イノシン酸を回収する段階を含む5’−イノシン酸の製造方法を提供することにある。
前記目的を達成するための本発明の一つの態様は、配列番号2のアミノ酸配列内に1つ以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを提供することにある。具体的には、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列内に1つ以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを提供し、前記アミノ酸置換は、N末端から377番目のアミノ酸がトレオニンに置換及び499番目のアミノ酸がイソロイシンに置換された群から選択される少なくともいずれか1つを含む。本発明のもう一つの態様は、配列番号2のアミノ酸配列で377番目のアミノ酸がトレオニンに置換、499番目のアミノ酸がイソロイシンに置換、またはそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を有する、5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異型5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを提供することにある。具体的には、前記変異型5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号2のアミノ酸配列内に1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、377番目のアミノ酸がトレオニンに置換及び499番目のアミノ酸がイソロイシンに置換された群から選択される少なくともいずれか1つからなるものであってもよい。
用語相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられる。
保存された(conserved)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性を有するか(homologous)または同一(identical)の配列は、一般的に、配列全体または全長の少なくとも約50%、60%、70%、80%または90%の中間または高い厳しい条件(stringent conditions)でハイブリッドしてもよい。ハイブリッドするポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
本明細書において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体(monomer)が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドのポリマー(polymer)であって、一定の長さ以上のDNAまたはRNA鎖で、より具体的には、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本発明の変異型5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、本発明の5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれてもよい。本発明で5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、guaB遺伝子であり、具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であってもよいが、これに制限されない。
ハイブリッド化は、たとえハイブリッド化の厳密度に応じて塩基間のミスマッチ(mismatch)が可能であっても、2つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語「相補的」は、互いに混成化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、DNAに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含みうる。
ポリヌクレオチドをハイブリッド化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は該当技術分野でよく知られている(非特許文献8参照)。
本発明で変異型5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドも、先に説明した通りである。
また、前記で用語、「作動可能に連結された」ものとは、本発明の目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
本発明で、前記5’−イノシン酸を生産する微生物は、5’−イノシン酸を生産する微生物、5’−イノシン酸生産能を有する微生物と混用して使用してもよい。
本明細書において、用語、「5’−イノシン酸を生産する微生物」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化されるなどの原因により特定メカニズムが弱化されたり強化された微生物であって、目的とする5’−イノシン酸の生産のために、遺伝的変異が起きたり活性を強化させた微生物であってもよい。本発明の目的上、前記5’−イノシン酸を生産する微生物は、前記変異型5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを含み、目的とする5’−イノシン酸の生産能が増加したことを特徴とし、具体的には、コリネバクテリウム属微生物であってもよい。具体的には、本発明で5’−イノシン酸を生産する微生物または5’−イノシン酸生産能を有する微生物は、5’−イノシン酸生合成経路内の遺伝子の一部が強化または弱化されたり、5’−イノシン酸分解経路内の遺伝子の一部が強化または弱化された微生物であってもよい。例えば、前記微生物は、ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ(phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase)をコードするpurFの発現が強化されたり、アデニロコハク酸シンテターゼ(adenylosuccinate synthetase)をコードするpurAの発現が弱化された微生物であってもよいが、これに制限されない。
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特に制限されないが、塩基性化合物(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア)または酸性化合物(例えば、リン酸または硫酸)を用いて適正pH(例えば、pH5〜9、具体的には、pH6〜8、最も具体的には、pH6.8)を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は20〜45℃、具体的には、25〜40℃を維持してもよく、約10〜160時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産された5’−イノシン酸は、培地中に分泌されるか細胞内に残留しうる。
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行ってもよい。したがって、前記回収された5’−イノシン酸は、精製された形態または5’−イノシン酸を含有した微生物発酵液であってもよい(非特許文献9)。
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、IMPを生産できないか、IMPを生産しても非常に極微量を生産することができる。したがって、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872を基にIMP生産株を製作した。より具体的には、プリン生合成酵素の一番目であるホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードするPurFの活性を強化させて、5’−イノシン酸の分解経路にあるアデニロコハク酸シンテターゼをコードするPurAの活性を弱化させたIMP生産菌株を製造した。
purFの開始コドンが変更された菌株を製作するために、まずpurFが含まれた挿入用ベクターを製作した。挿入用ベクターにpurF遺伝子をクローニングするために、具体的に、PCRは、コリネバクテリウム・スタティオニスATCC6872の染色体を鋳型として、配列番号9と10、配列番号11と12のプライマーを用いて行い、94℃で30秒の変性(denaturation)、55℃で30秒のアニーリング(annealing)、及び72℃で2分の伸長(extension)過程を30回繰り返した。前記PCR反応で獲得した2つのDNA切片を鋳型として、配列番号9と12のプライマーを用いて、94℃で30秒の変性(denaturation)、55℃で30秒のアニーリング(annealing)、及び72℃で2分の伸長伸長(extension)過程を30回繰り返す条件でPCRを行い、DNA断片を獲得した。得られたDNA断片を制限酵素XbaIで切断した後、同じ制限酵素で切断された(pDZ(特許文献1及び2))ベクターにクローニングした。前記方法で製作したベクターをpDZ−purF−g1aと命名した。
purAの開始コドンが変更された菌株を製作するために、まずpurAが含まれた挿入用ベクターを製作した。挿入用ベクターにpurA遺伝子をクローニングするために、具体的に、PCRは、コリネバクテリウム・スタティオニスATCC6872の染色体を鋳型として、配列番号13と14、配列番号15と16のプライマーを用いて行い、前記PCR産物は、実施例1−1と同様にクローニングを進めて、製作したベクターをpDZ−purA−a1tと命名した。
最終的に選別された、野生型コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872を基にする前記IMP生産菌株をCJI2331と命名した。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、ATCC6872及びCJI2331をそれぞれ接種して30℃の温度で24時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注し、121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLC(SHIMAZDU LC20A)を用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表3の通りである。下記のような結果は、purF強化及びpurA弱化させた菌株がIMPの生産能を有することを示唆する。
−発酵培地:グルタミン酸ナトリウム0.1%、塩化アンモニウム1%、硫酸マグネシウム1.2%、塩化カルシウム0.01%、硫酸鉄20mg/l、硫酸マンガン20mg/l、硫酸亜鉛20mg/l、硫酸銅5mg/l、L−システイン23mg/l、アラニン24mg/l、ニコチン酸8mg/l、ビオチン45μg/l、チアミン塩酸5mg/l、アデニン30mg/l、リン酸(85%)1.9%、ぶどう糖2.55%、果糖1.45%になるように添加して用いた。
IMP生産能を向上させる5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ変異を発掘するために、これをコードする遺伝子であるguaBの変異ライブラリを製作した。
guaB変異ライブラリを製作するために、まずguaBを含む組換えベクターを製作した。PCRは、コリネバクテリウム・スタティオニスATCC6872の染色体を鋳型として、配列番号17及び配列番号18のプライマーを用いて行い、前記増幅産物をTOPO Cloning Kit(Invitrogen)を用いて大腸菌ベクターpCR2.1にクローニングしてPCR−guaBを得た。
前記実施例2−1で製作したベクターを基にguaB変異ライブラリを製作した。ライブラリは、error−prone PCR kit(clontech DiversifyTMPCR Random Mutagenesis Kit)を用いて製作した。変異が発生しうる条件で、配列番号19及び配列番号20をプライマーとしてPCR反応を行った。具体的には、1000bp当たり0〜3つの変異が発生する条件で、94℃で30秒予熱した後、94℃で30秒、68℃で1分30秒の過程を25回繰り返して行った。このとき得られたPCR産物をメガプライマー(500〜125ng)とし、95℃で50秒、60℃で50秒、68℃で12分の過程を25回繰り返した。その後、DpnI処理して大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/l)を含むLB固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニー20種を選別した後、プラスミドを獲得してポリヌクレオチド配列を分析した結果、2変異/kbの頻度で互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約20,000個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってプラスミドを抽出し、これをpTOPO−guaB−libraryと命名した。
前記実施例2−2で製作されたpTOPO−guaB−libraryを実施例1で製作した菌株CJI2331に電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン25mg/lを含有した栄養培地に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株から10,000個のコロニーを確保し、各コロニーをCJI2331_pTOPO_guaB(mt)1からCJI2331_pTOPO_guaB(mt)10000までと命名した。
−栄養培地:ペプトン1%、肉汁1%、塩化ナトリウム0.25%、酵母エキス1%、寒天2%、pH7.2
確保された10,000個のコロニーをそれぞれ加圧殺菌した種培地200μlに接種した96ディープウェルプレートを、マイクロプレート振とう機(Microplate shaker(TAITEC))を用いて30℃の温度、1200rpmで24時間振とう培養し、種培養液として用いた。加圧殺菌した発酵培地290μlを96ディープウェルプレートに分注した後、種培養液20μlずつ接種し、前記条件と同様に72時間振とう培養した。
培養液から生産された5’−イノシン酸の生産量を分析するために、培養終了後の培養上澄み液3μlを蒸留水が197μlずつ分注された96ウェルUVプレートに移した。次に、マイクロプレートリーダー(Microplate reader)を用いて30秒間振とうし、25℃、波長270nmで分光光度計で吸光度を測定し、CJI2331菌株の吸光度と比較して10%以上増加した吸光度を示す50個の変異菌株コロニーを選別した。その他のコロニーは対照区に比べて類似または減少した吸光度を示した。
選別された50個の菌株は、前記と同様に吸光度を測定し、5’−イノシン酸の生産量を繰り返して行った。そして、CJI2331菌株に比べて5’−イノシン酸の生産能が著しく向上されたCJI2331_pTOPO_guaB(mt)133、CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209、 CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927菌株3種を選別した。
前記突然変異菌株の遺伝子変異を確認するために、配列番号21と22のプライマーを用いてCJI2331_pTOPO_guaB(mt)133、CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209、CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927菌株でPCRを行い、シーケンスを進め、guaB遺伝子を野生型菌株であるATCC6872及びCJI2331と比較した。
その結果、前記の菌株3種すべてが異なる位置でguaB遺伝子変異を含むことを確認した。
具体的には、配列番号2で表われるGuaBアミノ酸配列において、CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133菌株は、499番目のトレオニンがイソロイシンに置換された変異を、CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209菌株は、377番目のアラニンがトレオニンに置換された変異を、CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927菌株は、377番目のアラニンがトレオニンに置換されて499番目のトレオニンがイソロイシンに置換された変異を含んでいることを確認した。したがって、以下の実施例3及び4では、前記の変異がそれぞれコリネバクテリウム属微生物のIMP生成量に影響を与えるかを確認した。
ATCC6872由来のIMP生産菌株であるCJI2331に前記実施例2で確認した変異を導入してIMP生産能を確認した。
前記実施例2で確認した変異を導入するために、ターゲット変異を含んでいる逆方向のオリゴヌクレオチドを75マー(mer)の長さでそれぞれデザインした。
具体的には、配列番号23または24のオリゴヌクレオチド30μgをCJI2331菌株に電気パルス法(非特許文献10)で形質転換して、複合液体培地を1 ml添加し、30℃で30分間、160rpmで振とう培養した。以後、培養液を氷で10分間インキュベーション(incubation)し、4℃で10分間4000rpmで遠心分離した後、上澄み液を除去して菌体を確保した。その後、4℃の10%グリセロール溶液を1ml添加して混合した後、4℃で10分間4000rpmで遠心分離し、上澄み液を除去して菌体を洗浄した。同様に菌体をもう1回洗浄し、4℃の10%グリセロール溶液を0.1ml添加して次の形質転換のための菌株を準備した。その後、前記のような電気パルス法で配列番号23または24のオリゴヌクレオチドを用いて形質転換する過程を10回繰り返した後、複合平板培地に塗抹してコロニーを確保した(非特許文献11)。
前記確保したコロニーの遺伝子配列解析を行った結果、菌株に前記のターゲット変異が導入されたことを確認し、guaB遺伝子にコードされるタンパク質内A377T変異が導入された前記菌株をCJI2331_guaB_m1、T499I変異が導入された菌株をCJI2331_guaB_m2と命名した。
また、A377TとT499I変異の両方を含む変異菌株を製作するためにCJI2331_guaB_m1菌株に配列番号24のオリゴヌクレオチド30μgを形質転換して、前記と同様の方法でコロニーを確保した(非特許文献11)。確保したコロニーの遺伝子配列解析を行い、guaB遺伝子にコードされるタンパク質内A337T及びT499I変異の両方が導入された菌株を選別し、これをCJI2331_guaB_m1m2と命名した。
種培地2mlを、直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、ATCC6872及びCJI2331をそれぞれ接種し、30℃の温度で24時間振とう培養し、種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注し、121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLC(SHIMAZDU LC20A)を用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表7の通りである。下記結果から分かるように、対照群であるCJI2331菌株に比べて、guaB遺伝子にコードされるタンパク質内A377T変異またはT499I変異を有するCJI2331_guaB_m1またはCJI2331_guaB_m2菌株の場合、IMP濃度がそれぞれ0.42g/L(40%)、0.21g/L(20%)向上されたことを確認した。また、A377TとT499I変異の両方を含んでいるCJI2331_guaB_m1m2菌株の場合、IMP濃度が0.58g/L(50%)向上され、2つの変異を一緒に含んだときにIMP濃度の向上に最も効果があることを確認した。
実施例4−1:ATCC6872由来のIMP生産菌株の選別
ATCC6872由来のIMP生産株を製作するために、ATCC6872をリン酸塩緩衝液(pH7.0)、またはクエン酸緩衝液(pH5.5)に107〜108細胞/mlと懸濁させた。ここにUV処理して、室温または32℃で20〜40分間処理して突然変異を誘発させた。2回にかけて0.85%食塩水で洗浄し、1.7%寒天を含有した最小培地に耐性を付与しようとする物質を適正濃度に含有した培地に希釈して塗抹した後、コロニーを得た。それぞれのコロニーを、栄養培地で培養し、種培地で24時間培養した。発酵培地で3〜4日間培養した後、培養液に蓄積されたIMP生産量が最も優れたコロニーを選別した。高濃度IMP生産株を製作するために、アデニン要求性、グアニン漏出型、リゾチーム感受性、3,4−ジヒドロプロリン耐性、ストレプトマイシン耐性、アゼチジンカルボン酸耐性、チアプロリン耐性、アザセリン耐性、スルファグアニジン耐性、ノルバリン耐性、トリメトプリム耐性を付与するために、前記過程をそれぞれの物質に対して順次行い、前記物質に対する耐性が付与されてIMP生産能の優れたCJI2335を最終選別した。下記の表8にATCC6872に比べたCJI2335の耐性程度を比較して示した。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、ATCC6872及びCJI2335をそれぞれ接種し、30℃の温度で24時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注して121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLC(SHIMAZDU LC20A)を用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表9の通りである。
前記実施例3で選別された変異を菌株に導入するために挿入用ベクターを製作した。guaB変異導入用ベクターの製作過程は次の通りである。前記実施例2で選別されたCJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209菌株のguaB(A377T)遺伝子及びCJI2331_pTOPO_guaB(mt)133菌株のguaB(T499I)遺伝子を鋳型とし、配列番号25と配列番号26をプライマーとして用いてPCRを行った。PCRは、94℃で5分間変性後、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を20回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行った。その結果、得られた遺伝子断片をそれぞれXbaIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングし、pDZ−guaB(A377T)とpDZ−guaB(T499I)を製作した。
前記実施例4−1で選別されたCJI2335菌株のguaB遺伝子の塩基配列を確認するために、CJI2335のゲノミックDNAをPCRを介して増幅した。具体的には、まず、前記CJI2335の染色体DNAを鋳型として、配列番号21と22のプライマーを用いて、94℃で1分、58℃で30秒、72℃で2分間Taq DNAポリメラーゼで重合する条件を28回繰り返すPCR方法を通じて、約2.1kbのguaBを増幅した。また、これを同じプライマーで塩基配列を分析した結果、野生型ATCC6872菌株のguaB遺伝子と同じ配列と確認され、guaB遺伝子には変異がないことを確認した。
下記の表12に示すように、対照群であるCJI2335菌株に比べてguaB遺伝子にコードされるタンパク質内のA377T変異またはT499I変異を有しているCJI2335_guaB_m1またはCJI2335_guaB_m2菌株の場合、IMP濃度がそれぞれ2.2g/L(40%)、1.0g/L(18.5%)向上されたことを確認した。また、A377TとT499I変異の両方を含んでいるCJI2331_guaB_m1m2菌株の場合は、IMP濃度が2.7g/L(50%)向上され、2つの変異を一緒に含むときに、IMP濃度の向上に最も効果があることを確認した。
前記CJI2335は、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2018年6月22日付で寄託し、受託番号KCCM122778Pを与えられた。また。前記製作されたCJI2335_guaB_m1m2菌株は、CJI2347と呼ばれており、これをブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2018年6月22日付で寄託し、受託番号KCCM12279Pを与えられた。
Claims (7)
- 配列番号2のアミノ酸配列で、i)337番目のアミノ酸がトレオニンに置換、ii)499番目のアミノ酸がイソロイシンに置換、またはiii)337番目のアミノ酸がトレオニンに置換され、かつ499番目のアミノ酸がイソロイシンに置換された、変異型5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ。
- 請求項1に記載の変異型5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項1に記載の変異型5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼまたは請求項3に記載のベクターを含み、5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、 コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)である、請求項4に記載の5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 請求項4に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階;及び前記微生物または培地から5’−イノシン酸を回収する段階を含む5’−イノシン酸の製造方法。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)である、請求項6に記載の5’−イノシン酸の製造方法。
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