KR20070060206A - 증가된 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제유전자의 발현량을 갖는 5'-이노신산 생산성이 우수한코리네박테리움 속 미생물 및 그를 이용하여 5'-이노신산을생산하는 방법 - Google Patents

증가된 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제유전자의 발현량을 갖는 5'-이노신산 생산성이 우수한코리네박테리움 속 미생물 및 그를 이용하여 5'-이노신산을생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 5'-이노신산을 생산하는 코리넥박테리움 속 미생물로서, 모균주의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자의 발현량에 비하여 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자의 발현량이 증가된 미생물 및 그를 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법을 제공한다.
5'-이노신산, 코리네박테리움 암모니아게네스

Description

증가된 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 유전자의 발현량을 갖는 5'-이노신산 생산성이 우수한 코리네박테리움 속 미생물 및 그를 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법{A microorganism of Corynebacterium genus comprising an enhanced expression of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene producing 5'-inosinic acid in high productivity and a method of producing 5'-inosinic acid using the same}
도 1은 프로테옴 분석에 의하여 코리네박테리움 암모니아게네스 야생주 (ATCC 6872)와 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제의 발현 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 코리네박테리움 암모니아게네스 야생주 (ATCC 6872) 유래의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 유전자를 클로닝하는 과정을 나타내는 도면이다.
본 발명은 세포 성장이 우수하고 5'-이노신산 생산성이 우수한 코리네박테리움 속 미생물 및 그를 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
5'-이노신산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 갖는다. 또한, 5'-이노신산은 식품, 의약품, 및 각종 의료적 용도로 다양한 분야에서 이용되고 있다. 특히, 5'-이노신산은 글루타민산 나트륨과 함께 사용되는 경우 맛의 상승효과가 우수하여, 핵산계 조미료로서 사용되고 있다.
종래 5'-이노신산의 생산방법으로서, 직접발효법이 알려져 있었다. 예를 들면, 한국특허출원 공개 제10-2003-0042972호에는 발린, 루신 및 이소루신의 유사체, 및 테트라히드로폴레이트의 유사체에 대한 내성을 갖고, 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (수탁번호 KCCM-10330) 균주 및 그를 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (수탁번호 KCCM-10330) 균주는 모균주로 사용된 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP009 (수탁번호 KCCM-10226) 균주에 비하여 5'-이노신산의 생산성은 우수하나, 세포 성장 속도가 느리다는 단점이 있었다.
따라서, 상기한 종래 기술에 의하더라도 여전히 생산성이 개선된 5'-이노신산 생산 균주를 개발할 필요성이 요구되고 있었다.
이에 본 발명자들은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (수탁번호 KCCM-10330) 균주의 5'-이노신산의 생산성을 개량하고자 노력하던 중, 코리네박테리움 암모니아게네스의 야생주 (수탁번호 ATCC6872)와 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (수탁번호 KCCM-10330) 균주의 프로테옴 분석을 통하여 상기 야생주에서 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제가 과발현되고 있다는 것을 발 견하고, 상기 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제를 코딩하는 유전자를 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (수탁번호 KCCM-10330) 균주에 형질도입함으로써 본 발명을 완성하기에 아르렀다.
본 발명의 목적은 5'-이노신산의 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 5'-이노신산을 생산하는 코리넥박테리움 속 미생물로서, 모균주의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자의 발현량에 비하여 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자의 발현량이 증가된 미생물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 미생물에 있어서 상기 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자는 세포 외부로부터 추가적으로 도입된 것이거나, 내재적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자가 증폭된 것인 미생물이다.
본 발명에 있어서, 모균주는 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물이면 어느 것이나 포함된다. 바람직하게는, 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 종의 미생물이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 미생물에 있어서 상기 모균주가 상기 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP009 (KCCM-10226), 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHK25 (KCCM-10520) 및 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주인 미생물이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 미생물에 있어서 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (수탁번호 KCCM-10330)에 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자가 추가적으로 도입된 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (수탁번호 KCCM-10330)의 변이 미생물이다. 본 구체예에서 유전자가 도입되는 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (수탁번호 KCCM-10330) 는, 발린, 루신 및 이소루신의 유사체, 및 테트라히드로폴레이트의 유사체에 대한 내성을 갖고, 종래의 알려진 미생물보다 5'-이노신산을 고농도 및 고수율로 생산할 수 있는 세포이다. 상기 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (수탁번호 KCCM-10330) 균주는 한국특허 공개 제10-2003-0042972호에 개시되어 있으며, 기술의 편의를 위하여 그 전체 내용은 본 명세서에 원용에 의하여 포함되어진다. 바람직하게는, 상기 변이 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) CJGAP101 (수탁번호 KCCM-10690P)이다.
본 발명의 미생물에 있어서, 모균주에 비하여 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자의 발현량이 증가됨으로써, 모균주의 성장이 느린 단점을 보완함으로써, 5'-이노신산의 생산성을 높이는 것으로 여겨지나, 본 발명이 특정한 이론에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 균주에 있어서, "글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성"이란 글리세르알데히드-3-포스페이트를 1,3-비스포스페스포글리세레이트 (1,3-BPG)로 가역적으로 전환시키는 활성을 가진 효소를 의미한다. 이러한 활성을 갖는 효소이면, 그 기원과 관계 없이 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes)로부터 유래된 것이다.
본 발명의 균주는 외래의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자를 코리네박테리움 속 미생물 (예를 들면, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (수탁번호 KCCM-10330))에 도입함으로써 제조될 수 있다. 외래 유전자를 모균주에 도입하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자 또는 유전자를 포함하는 벡터 예를 들면, 본 명세서의 실시예에 기술된 p117-gapA를 형질전환, 트란스펙션 및 전기천공법과 같은 유전자 도입 방법을 사용하여 모균주에 도입시킴으로써 제작될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자의 발현량이 증가된"이란, 모균주의 내재적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자의 발현량보다 증가된 유전자 수준을 갖는다는 것을 의도한 것이다. 따라서, 모균주 또는 모균주와 다른 미생물의 상기 유전자를 증폭하고 얻어진 증폭된 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 상기 모균주에 도입시켜 얻어지는 코리네박테리움 속 미생물 (예를 들면, 코리네박테리움 암모니아게네스) 균주 뿐만 아니라, 모균주의 내재적 상기 유전자를 유전자 증폭 기법에 의하여 증폭함으로써, 상기 유전자의 세포 내 발현량이 내재적 발현량 보다 증가된 상기 모균주도 본 발명의 균주에 포함되는 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 5'-이노신산을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 코리네박테리움 속 미생물의 배양에 사용되는 배지이면 어느 것이나 사용될 수 있다. 또한, 배양 방법도 당업계에 알려진 임의의 배양 방법, 예를 들면, 회분식, 연속식 및 유가식 배양 방법 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양물에 생산된 5'-이노신산은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 추가적으로 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 5'-이노신산을 생산하는 코리넥박테리움 속 미생물에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 상기한 바와 같은 본 발명에 따른 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 미생물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 벡터란 유전자를 숙주 세포에 운반하는 운반체로서, "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"가 포함될 수 있다. 상기 벡터는 세포의 중심 대사의 일부분이 아닌 유전자를 종종 가지고 있으며, 보통 2중가닥 원형 DNA 단편이 염색체 외 요소를 말한다. 본 명세서에서 "플라 스미드", "벡터" 및 "카세트"는 상호 교환가능하게 사용된다. 상기 요소는 많은 뉴클레오티드 서열이 연결되거나 재조합되어진 독특한 구조체 (unique construction)로서 프로모터 및 적합한 3′비번역 서열과 함께 선택된 유전자 산물을 코딩하는 DNA를 세포에 도입시킬 수 있는, 임의의 원천으로부터 유래된 독립적으로 복제하는 서열, 게놈 삽입 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형 또는 원형, 단일 또는 2중가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 바람직하게는, 상기 벡터는 도 2에 나타낸 바와 같은 p117-gapA 벡터이다.
이하 본 발명의 일 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJGAP101 (KCCM-10690P) 균주의 제작 과정을 예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 코리네박테리움 암모니아게네스 CJGAP101 (KCCM-10690P) 균주는 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제를 코딩하는 유전자를 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)에 형질전환하여 얻어진 재조합 균주이다. 먼저, 숙주로 사용된 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)와 야생주 (ATCC 6872)의 생체 내 단백질들의 분포와 상태를 총괄적으로 측정하여 코리네박테리움 암모니아게네스 야생주 (ATCC 6872)에서 과발현되는 단백질들을 선별하였다. 선별된 단백질들 중 하나가 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제로 동정되었다. 도 1은 프로테옴 분석에 의하여 코리네박테리움 암모니아게네스 야생주 (ATCC 6872)와 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제의 발현 분석 결과를 나타내는 도면이다.
이렇게 선별된 과발현 단백질의 유전정보를 염색체 서열정보를 바탕으로 분 석하여 단백질 유전자를 PCR로 증폭하였다. 이렇게 증폭된 염색체 DNA를 제한효소 BamHI과 EcoRV을 이용하여 절단하였다. 이렇게 얻은 염색체 DNA 단편을 전기영동한 후 회수하여 사용하였다. 이렇게 제작된, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 유전자를 BamHI과 EcoRV로 절단된 대장균과 코리네형 세균에서 발현 가능한 셔틀벡터인 pECCG117 (KFCC-10673/KFCC-10674)에 삽입하고, T4 리가제를 이용하여 결찰반응을 수행하였으며, 얻어진 벡터를 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)에 형질전환하였다. 도 2는 코리네박테리움 암모니아게네스 야생주 (ATCC 6872) 유래의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 유전자를 클로닝하는 과정을 나타내는 도면이다.
얻어진 균주를 카나마이신이 포함된 CM 한천 배지 (펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모 추출물 1%, 아데닌 100 mg/ml, 구아닌 100 mg/ml, 한천 2% (pH 7.2))에 도말하여 성장하는 균주를 선별하였다. 선별된 균주를 코리네박테리움 암모니아게네스 CJGAP101로 명명하였으며, 이를 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 서울 서대문구 홍제 1동 소재의 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2005년 11월 2일자로 수탁번호 KCCM-10690P호로 기탁하였다.
본 발명의 균주의 배양에 사용될 수 있는 영양 배지, 최소 배지, 종 배지, 플라스크 발효 배지, 발효조 종 배지 및 발효조 본 배지는, 표 1에서 나타낸 바와 같은 조성으로 이루어진 배지일 수 있다. 그러나, 배지 조성은 표 1에 나타낸 배지에 제한되지는 않으며, 코리네박테리움 암모니아게네스의 배양에 적합한 모든 배양 배지를 사용할 수 있다.
표 1. 본 발명에서 사용된 배지 조성
배지 종류 배지 조성
영양 배지 펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모추출물 1%, 한천 2% (pH 7.2)
최소 배지 포도당 2%, 황산나트륨 0.3%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.3%, 염화칼슘 10mg/l, 황산철 10mg/l, 황산아연 1mg/l, 염화망간 3.6mg/l, L-시스테인 20mg/l, 칼슘판토테네이트 10mg/l, 티아민염산염 5mg/l, 바이오틴 30μg/l, 아데닌 20mg/l, 구아닌 20mg/l, (pH 7.3)
종 배지 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모액기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌 100mg/l (pH 7.2)
플라스크 발효 배지 글루타민산나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/l, 황산망간 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산구리 5mg/l, L-시스테인 23mg/l, 알라닌 24mg/l, 니코틴산 8mg/l, 바이오틴 45ug/l, 티아민염산염 5mg/l, 아데닌 30mg/l, 인산(85%) 1.9%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 8%가 되게 첨가하여 사용 (pH 7.2)
발효조 종 배지 포도당 5.4%, 펩톤 1%, 효모추출물 2%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 황산철 80mg/l, 황산아연 40mg/l, 황산망간 40mg/l, L-시스테인 80mg/l, 칼슘판토테네이트 60mg/l, 티아민염산염 20mg/l, 바이오틴 240μg/l, 아데닌 1200mg/l, 구아닌 1200mg/l (pH 7.2)
발효조 본 배지 염화칼슘 120mg/l, 황산구리 8mg/l, 황산마그네슘 1.5%, 황산철 24mg/l, 황산아연 24mg/l, 황산망간 mg/l, L-시스테인 26.4mg/l, 글루타민산 나트륨 0.12%, 티아민염산염 6mg/l, 바이오틴 40μg/l, 니코틴산 50mg/l, 알라닌 145mg/l, 아데닌 200mg/l, 인산(85%) 4.3%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 32%가 되게 첨가하여 사용 (pH 7.2)
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 프로테옴 분석을 통한 과발현 단백질로서 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제의 선정
본 실시예에서는, 프로테오믹스 기법을 이용하여 코리네형 세균의 유전자 발현을 분석하였다. 코리네박테리움 암모니아게네스 야생주 (ATCC 6872)와 CJHB100 (KCCM-10330)를 원당 가수분해물 (포도당 50% + 과당 50% 혼합물)을 탄소원으로 한 배지 중에서 배양하면서 대수기, 초기 정체기 및 정체기 단계별로 세포 추출물을 얻고, 이를 다음과 같은 조건으로 이차원 전기영동을 실시하여 단백질을 분리하였다.
먼저, 각각의 시료를 총 부피가 350 ㎕가 되도록 6M 우레아, 2M 티오우레아, 4% CHAPS, 0.4% DTT로 희석한 후, 7 ㎕의 IPG 버퍼, 3 ㎕의 1% 브로모페놀 블루 (BPB)를 가한 후 이들을 Immobiline pH gradient DrystripTM으로 재수화 트레이 위에서 시료를 얹고 시료의 증기화와 우레아의 결정화를 방지하기 위하여 2 ml의 커버 용액 (covering fluid)을 가하고, 대략 24시간 정도 실온에서 탈수시켰다. 이렇게 탈수가 완료된 겔을 0-100 V에서 1시간, 300 V에서 1시간, 600V에서 1시간, 그리고 대략 43-97 kVhr가 되도록 8000V의 시간을 조정하면서 (pH 4-7: 43.4 kVhr, pH 4.5-5.5, pH 5.5-6.7: 97 kVhr), 등전 포커싱 (isoelectric focusing)을 실시하였다. 다음으로, 각각의 스트립을 20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6M 우레아, 2% SDS, 20% 글리세롤, 2.5 % 아크릴아미드 및 5 mM TBP에서 15분간 평형에 이르도록 하였다. 스트립의 평형이 완료된 후, 각각의 스트립을 2차원 겔 위에 얹고 0.5% 저 융점 아가로즈와 0.001% BPB가 들어있는 SDS로 봉합했으며, 약 19시간 동안 100 V로 전기영동을 실시하였다.
전기영동 후 겔을 45% 메탄올, 5% 아세트산으로 고정시키고, 증류수로 1시간 동안 아세트산을 씻어냈다. 0.02% 소듐 티오설페이트로 2분간 감작화 (sensitization)시키고 증류수를 이용하여 1분씩 2번 세척하고, 겔을 0.1% 실버 나이트레이트와 20분간 반응시킨 다음 다시 증류수로 세척하였다. 이후 2% (w/v) 소듐 카르보네이트, 0.04% (v/v) 포름알데히드로 현상하여 원하는 세기의 단백질 스팟이 나타나면 1% 아세트산으로 반응을 정지시킨 후, 마지막으로 겔을 증류수로 세척하고, 밀봉된 플라스틱 백 속에 저장 후 4℃에서 보관하였다. 쿠마시 염색의 경우에는 겔을 꺼낸 후 30% 메탄올과 10% 아세트산으로 1시간 동안 고정하고 증류수로 간단히 씻은 후, 콜로이드성 쿠마시 브릴리어트 G250으로 24시간 동안 염색하였으며, 10% 메탄올과 7% 아세트산으로 4시간 동안 탈염색하였다.
전기 영동으로 분리된 단백질 스팟들로부터 펩티드를 추출하는 방법은 Shevchenko 등의 방법 (Shevchenko et al. Anal. Chem., 68(5), 850-8, 1996)을 변형하여 사용하였다. 단백질 스팟을 겔로부터 제거한 후, 120 ㎕의 30 mM 포타슘 페리시아나이드와 100mM 소듐 티오설페이트 1:1 혼합액에서 탈 염색한 후, 증류수로 15분씩 3번 세척 후 다시 120 ㎕의 50% 아세토니트릴/25 mM 암모늄 비카르보네이트, pH 7.8로 10분간 세척하였다. 50 ㎕의 100% 아세토니트릴과 하얀색이 될 때까지 약 5분간 반응하고, 진공 건조기 Speed Vac를 이용하여 건조시켰다.
질량 분석을 위한 단백질 스팟들을 겔로부터 얻은 후, 25 mM 암모늄 비카르보네이트, pH 7.8, 50% 아세토니트릴 용액으로 세척하고 색이 없어질 때까지 37℃에서 반응시켰다. 여기에 50 ㎕의 100% 아세토니트릴을 넣고 겔이 하얀 색으로 변할 때까지 약 5분간 반응하고 Speed Vac을 이용하여 건조시킨 후, 각 겔 마다 0.02μg/㎕ 트립신 10 ㎕를 가해 얼음 속에서 45분간 반응한 후, 다시 50 mM 암모늄 비카 르보네이트 버퍼, pH 7.8을 가해 37℃에서 12-14 시간 반응시켰다. 그 후 펩티드의 추출을 원활하게 하기 위하여 10 ㎕ 0.5% TFA, 50% 아세토니트릴 속에서 10분간 3회 초음파 처리 방법으로 펩티드를 추출하였다.
추출된 펩티드를 NSI MS/MS를 이용하여 다음과 같은 조건에서 분석하였다. HPLC 시스템은 Agilient 1100 시리즈를 사용하였으며, 나노 스프레이 이온화 소스가 장착된 Finnigan LCQ DECA 이온-트랩 질량 분석기 (ThermoQuest, San Jose, CA)와 연결하여 사용하였다. LC 상의 분리를 위하여 C18 마이크로프로브 역상 칼럼을 사용하였고, 용매 A는 0.1% 포름산, 용매 B는 90% (v/v) 아세토니트릴, 0.1% 수성 포름산으로 구성된 선형 구배 시스템 (유속 1㎕/min)을 사용해서, 다음과 같은 NSI 기준으로 측정하였다. 분무 전압, 1.8 kV; 모세관 온도, 200℃; 모세관 전압, 34 V; 튜브 렌즈 오프세트, 40 V; 전자, 증폭기는 -60V로 사용하였다. 모든 측정결과는 3회 측정 후 세트로이드 모드 (centroid mode)에서 수집되었으며 400-2000 Da의 완전한 MS 스캔을 얻은 후, 역치 값을 1 x 105 카운트로 고정하여 가장 강력한 이온들을 고해상 줌 스캔으로 분리하고 다시 충돌-유도된 해리 (collision-induced dissociation) (CID) MS/MS를 실시하였다. 해석되지 않은 CID 스펙트럼들의 서열을 Thermo Finnigan 사의 제품인 TurboQuestTM 소프트웨어를 사용하여 확인하였다. SEQUEST 검색 결과는 교차 상관 (cross correlation)과 △Cn (델타 표준화된 상관)으로 확인하였다. 이러한 방법으로 분석된 펩티드의 아미노산 서열의 확인 및 동정은 Applied Biosystems사의 Q-star Pulsar LC MS/MS를 이용한 드 노보 서열 분석 (de novo sequencing)을, Applied Biosystems사에서 제공한 소프트웨어를 사용하여 실시하였다.
이상의 방법으로 선별된 과발현 단백질의 유전정보를 염색체 서열정보 (NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 바탕으로 분석하여 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제를 선별하였다. 도 1은 프로테옴 분석에 의하여 코리네박테리움 암모니아게네스 야생주 (ATCC 6872)와 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제의 발현 분석 결과를 나타내는 도면이다. 도 1에서 A와 B는 각각 코리네박테리움 암모니아게네스 야생주 (ATCC 6872)와 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제의 발현 결과를 나타내는 것이다.
실시예 2: 글리세르알데히드 -3- 포스페이트 디히드로게나제 유전자 서열을 함유하는 재조합 벡터 p117 - gapA 제작
Eikmann 등 (Gene, 102, 93-98, 1991)의 방법에 따라, 1 일간 배양한 코리네박테리움 암모니아게네스 야생주 (ATCC 6872) 25 ㎖로부터 염색체 DNA 500 ㎍을 분리하였다. 분리된 염색체를 주형으로 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR을 통하여 과발현 단백질인 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 유전자를 증폭하였다. PCR은 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃ 에서 30 초간의 반응 사이클을 30 회 반복하였다.
증폭된 유전자를 BamHI과 EcoRV로 절단하여 대장균과 코리네형 세균에서 발현 가능한 셔틀벡터인 pECCG117 (KFCC-10673/KFCC-10674)의 BamHI과 EcoRV 위치에 도 입한 후, T4 리가제 10 유니트를 이용하여 16 ℃에서 16 시간 동안 결찰반응을 수행하였다. 이렇게 얻은 재조합 벡터 (p117-gapA)를 van der Rest 등의 방법 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999)으로 형질전환이 가능하게 만든 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)에 도입시켰다. 형질전환된 균주를 카나마이신 10 ㎍/㎖이 포함된 CM 배지 (펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모 추출물 1%, 아데닌 100mg/ml, 구아닌 100mg/ml, 한천 2% (pH 7.2))에 도말하여 32 ℃에서 3 일간 배양하면서 성장하는 균주를 선별하고, 선별된 코리네박테리움 암모니아게네스 CJGAP101 (KCCM-10690P)로 명명하였다.
실시예 3: 삼각플라스크 발효실험
실시예 2에서 얻어진 코리네박테리움 암모니아게네스 CJGAP101 (KCCM-10690P)를 배양하고, 세포 성장 및 5'-이노신산의 생산량을 측정하였다.
표 1에 나타낸 바와 같은 종 배지 3ml를 지름 18mm 시험관에 분주하고 통상의 방법에 따라 가압살균한 후 코리네박테리움 암모니아게네스 CJGAP101 (KCCM-10690P) 균주를 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하고, 얻어진 배양액을 종 배양액으로 사용하였다.
표 1에 나타낸 바와 같은 발효 배지 27ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균한 다음, 상기한 얻어진 종 배양액 3ml를 접종한 다음 5일 동안 배양하였다. 배양하는 동안 플라스크의 회전수는 분당 200회, 온도는 32℃, pH는 pH 7.2로 조절하였다. 배양 중 지정된 시간에 세포 성장 및 5'-이노신산의 양을 각각 스펙트로포토미터의 흡광도와 고성능 액체 크로마토그래피 (High performance liquid chromatography)로 측정하였으며, 그 결과는 표 2와 같다.
표 2.
균주명 3일 후 세포 농도 (OD600) 3일 후 세포 농도 5'-이노신산 생산성(g/l/hr) 5일 후 세포 농도 (OD600) 5일 후 세포 농도 5'-이노신산 생산성(g/l/hr)
CJHB100 (KCCM-10330) 28.7 0.098 51.2 0.126
CJGAP101 (KCCM-10690P) 31.7 0.118 52.3 0.128
표 2에 나타낸 바와 같이, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJGAP101 (KCCM-10690P)는 모균주인 CJHB100 (KCCM-10330)에 비하여, 배양 3일 경과 후에는 세포성장 및 5'-이노신산의 생산성이 우수하였으며 배양 최종 시점인 5일 후에는 거의 동일하였다. 이는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJGAP101 (KCCM-10690P) 균주가 동일한 조건하에서 균체의 성장속도가 우수하고, 그에 따라 단위 시간당의 5'-이노신산의 생산성이 더 우수하다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 1리터 발효조에서의 실험
실시예 2에서 얻어진 코리네박테리움 암모니아게네스 CJGAP101 (KCCM-10690P)를 1리터 발효조에서 배양하고, 세포 성장 및 5'-이노신산의 생산량을 측정하였다.
표 1에 나타낸 바와 같은 종 배지 50ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 통상의 방법에 따라 가압살균한 다음, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJGAP101 (KCCM-10690P) 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하고, 얻어진 배양액을 사용하였다.
또한, 표 1에 나타낸 바와 같은 발효조 본 배지 1000ml를 1L-발효조에 넣고 온도 120℃에서 15분간 가압살균하여, 상기한 발효조 종 배양액 50ml를 접종한 다음, 3일 동안 배양하였다. 배양하는 동안 임펠러 회전수는 분당 900회, 온도 30℃, pH 7.2로 조절하였다. 배양 후 세포 성장 및 5'-이노신산의 양을 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
표 3. 1리터 발효조 발효 결과
균주명 세포 농도 (OD600) 발효 시간 (hr) 5'-이노신산 생산성(g/l/hr)
CJHB100 (KCCM-10330) 48.4 57 0.223
CJGAP101 (KCCM-10690P) 51.5 51 0.251
표 3에 나타낸 바와 같이, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 유전자를 과발현하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJGAP101 (KCCM-10690P) 균주가 모균주인 CJHB100 (KCCM-10330)에 비하여 세포 성장이 우수하고, 단축된 발효 시간에 높은 5'-이노신산 생산성을 발휘하였다.
본 발명의 균주에 따르면, 모균주에 비하여 증가된 발현량의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 유전자를 갖는 코리네박테리움 속 미생물은, 5'-이노신산의 생산성은 높으면서도 세포 성장 속도가 빨라 5'-이노신산을 효율적으로 생산하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 발효시간을 단축함으로써 5'-이노신산을 효율적으로 생산할 수 있다.
<110> CJ Corporation <120> A microorganism of Corynebacterium genus comprising an enhanced expression of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene producing 5'-inosinic acid in high productivity and a method of producing 5'-inosinic acid using the same <130> PN065310 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene <400> 1 tcgaaattgc gtgaattt 18 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene <400> 2 cgcggatcca gcaaatcatc cagggactta 30

Claims (8)

  1. 5'-이노신산을 생산하는 코리넥박테리움 속 미생물로서, 모균주의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자의 발현량에 비하여 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자의 발현량이 증가된 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자는 세포 외부로부터 추가적으로 도입된 것이거나, 내재적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자가 증폭된 것인 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 모균주는 코리네박테리움 암모니아게네스 종인 미생물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 모균주는 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP009 (KCCM-10226), 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHK25 (KCCM-10520) 및 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 (KCCM-10330)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주인 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) CJGAP101 (수탁번호 KCCM-10690P)인 변이 미생물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 5'-이노신산을 생산하는 방법.
  7. 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 5'-이노신산을 생산하는 코리넥박테리움 속 미생물에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 제조하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 벡터는 도 2에 나타낸 바와 같은 p117-gapA인 방법.
KR1020050119248A 2005-12-08 2005-12-08 증가된 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제유전자의 발현량을 갖는 5'-이노신산 생산성이 우수한코리네박테리움 속 미생물 및 그를 이용하여 5'-이노신산을생산하는 방법 KR20070060206A (ko)

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