WO2022210308A1

WO2022210308A1 - 環状リポペプチド産生微生物株、及び環状リポペプチドの製造方法

Info

Publication number: WO2022210308A1
Application number: PCT/JP2022/014183
Authority: WO
Inventors: 里奈青木; 新吾小林; 直明田岡
Original assignee: 株式会社カネカ
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2022-03-24
Publication date: 2022-10-06
Also published as: JPWO2022210308A1; EP4317461A1; CN117203327A; US20240018562A1

Abstract

本発明は、微生物培養によるサーファクチン等の環状リポペプチドの生産性を向上させることを課題とする。　本発明によれば、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．８）をコードする遺伝子又はコリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．１）をコードする遺伝子の少なくとも１つの遺伝子が欠損した環状リポペプチド産生微生物株、ならびに当該微生物株を培養することを含む、環状リポペプチドの製造方法が提供される。

Description

環状リポペプチド産生微生物株、及び環状リポペプチドの製造方法

　本発明は環状リポペプチド産生微生物株、及び該微生物株を用いる環状リポペプチドの製造方法に関する。

　サーファクチンやイツリンに代表される環状リポペプチドは、微生物由来の両親媒性物質であり、例えばサーファクチンは安全性と生分解性の高いバイオサーファクタントとして、医薬品、化粧品、食品などに広く利用されている。また、上記環状リポペプチドは、いわゆる界面活性作用だけでなく、広範囲の細菌又は真菌に対して優れた抗細菌作用又は抗真菌作用を示すため、抗菌剤、防カビ剤、感染症治療剤、植物病害防除剤等として、医療、食品製造、農業、環境衛生など多岐の分野において活用が期待されている。

　サーファクチンやイツリンなどの環状リポペプチドはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物によって産生されることから、環状リポペプチドの工業的生産は、バチルス属微生物を培養することによって行われている(特許文献１等）。このような微生物による有用物質の工業的生産においてその生産性の向上は重要な課題である。

　これまでバチルス属微生物の培養によるサーファクチンの生産性を向上させるために種々の方法が検討されているが、その多くは、培地への特殊な成分の添加や、培養条件の厳密な制御によるものであり、生産性や経済性において満足できるものではなかった。

　また、サーファクチンの生産能の高いバチルス・サブチリスの突然変異株についても幾つか報告されている。例えば、特許文献２には、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ２１３３２をＮＭＧで突然変異誘発処理して得られたサーファクチンを高濃度で生産できるバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ５５０３３株が開示されている。また、非特許文献１には、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ２１３３２の紫外線照射による突然変異株が親株の３倍以上のサーファクチン生産性を有し、その突然変異は遺伝子地図上のａｒｇＣ４とｈｉｓＡ１の間に位置することが報告されている。しかしながら、これらはその変異に関与する特定の標的遺伝子を改変した微生物菌株ではなく、工業的生産のために安定的にかつ大量に供給できるものでない。

特許第３６３５６３８号公報特許第３０３０７８９号公報

Appl. Microbiol. Biotech., 31: 486-489 (1989)

　従って、本発明は、サーファクチン等の環状リポペプチドの生産性に優れ、かつ環状リポペプチドの工業的生産に安定的にかつ大量に供給できる微生物株を提供し、微生物培養による環状リポペプチドの生産性を向上させることを課題とする。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、細胞内の浸透圧調節物質であるグリシンベタインの生合成経路に関与する遺伝子である、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．８）をコードする遺伝子（ｇｂｓＡ遺伝子）又はコリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．１）をコードする遺伝子（ｇｂｓＢ遺伝子）の少なくとも１つの遺伝子が欠損した微生物株において、サーファクチンの生産性が顕著に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

　具体的には、本発明は以下の発明を包含する。
［１］以下の（１）又は（２）の少なくとも１つの遺伝子が欠損した環状リポペプチド産生微生物株。
（１）ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．８）をコードする遺伝子
（２）コリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．１）をコードする遺伝子
［２］前記微生物株が、細菌を宿主とする組換え微生物株である、［１］に記載の微生物株。
［３］前記細菌が、グラム陽性細菌である、［２］に記載の微生物株。
［４］前記グラム陽性細菌が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌である、［３］に記載の微生物株。
［５］前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌が、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、［４］に記載の微生物株。
［６］前記環状リポペプチドが、サーファクチン系環状リポペプチド、イツリン系環状リポペプチド、及びフェンジシン系環状リポペプチドから選ばれる１種又は２種以上の環状リポペプチドである、［１］～［５］のいずれかに記載の微生物株。
［７］前記環状リポペプチドが、サーファクチンである、［１］～［６］のいずれかに記載の微生物株。
［８］［１］～［７］のいずれかに記載の微生物株を培地中で培養することを含む環状リポペプチドの製造方法。
［９］前記培地が、豆類の粉砕物又はその抽出物を含む、［８］に記載の環状リポペプチドの製造方法。
［１０］前記豆類が大豆である、［９］に記載の環状リポペプチドの製造方法。
　本願は、２０２１年３月２９日に出願された日本国特許出願２０２１－５６１１５号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。

　本発明によれば、野生株や公知の変異株と比較して、環状リポペプチドの生産性に優れた微生物株が提供される。この微生物株を利用することによって、産業上有用な環状リポペプチドの生産性を向上させることができる。

＜宿主微生物＞
　本発明の１以上の実施形態に係る、（１）ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．８）をコードする遺伝子（遺伝子名：ｇｂｓＡ）又は（２）コリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．１）をコードする遺伝子（遺伝子名：ｇｂｓＢ）の少なくとも１つの遺伝子が欠損した微生物株の、宿主（親株）となる微生物は、好ましくは細菌であり、より好ましくはグラム陽性細菌であり、更に好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、チューメバチルス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する細菌であり、更により好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌であり、特に好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｉａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｗｅｚｅｙｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇｅｎｏｍｏｓｐｅｃｉｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓであり、最も好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓである。なお、これらの宿主（親株）となる微生物は、野生型でも変異を施したものでもよい。

　本発明の１以上の実施形態に係る微生物株は、宿主においてベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．８）又はコリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．１）の少なくとも１つの遺伝子を欠損させた形質転換体（組み換え微生物）である。

＜べタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．８）＞
　多くの細菌、植物、動物において、細胞内の浸透圧を調節するベタインは、いくつかの経路で合成されることが知られており、そのうちの一つが、(i)コリンからベタインアルデヒドへの変換と、(ii)ベタインアルデヒドからベタインへの変換の２段階で合成される経路である。ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．８）は、この２段階目の反応を触媒する酵素であり、ＮＡＤ^＋を補酵素としてグリシンベタインアルデヒドをグリシンベタインに変換する。

　ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの例として、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。

　ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼはまた、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する他のポリペプチドであってもよい。ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性に対して、１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。

　従って、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの具体例としては、
（１Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）であって、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；
（１Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（１Ｄ）（１Ａ）～（１Ｃ）のいずれかのポリペプチドの、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する断片が挙げられる。

　前記（１Ｂ）において「複数個」とは、例えば、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～７個、２～５個、２～４個又は２～３個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換をいう。性質の類似するアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）等に分類することができる。以下、本明細書では「保存的アミノ酸置換」という用語はこの意味で用いる。

　前記（１Ｃ）において「配列同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号２に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。配列同一性は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質の検索システムを用いて算出することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，　１９９３，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０：　５８７３－５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，　１９９０，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５：　４０３－４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，　１９８８，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８５：　２４４４－２４４８）。以下、本明細書ではアミノ酸配列の「配列同一性」は、同様の意味で用いる。

　前記（１Ｄ）において断片としては、アミノ酸数が好ましくは２００以上、より好ましくは３００以上、更に好ましくは４００以上のポリペプチドであることができる。

　「べタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．８）をコードする遺伝子」とは、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を指し、遺伝子名はｇｂｓＡと称する。ｇｂｓＡ遺伝子はベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼを欠損させる前の野生型の微生物の染色体上のゲノムＤＮＡに含まれる。

　バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一例を配列番号１に示す。べタインアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列は、宿主に合わせてコドン最適化したものであってもよい。微生物株のゲノムＤＮＡでは、配列番号１の塩基配列がそのまま存在するとは限らず、配列番号１の塩基配列がエキソン配列であり、途中に１以上のイントロン配列が介在していてもよい。

　よって、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列の具体例としては、
（１Ｅ）配列番号１に示す塩基配列；
（１Ｆ）配列番号１に示す塩基配列において、１～複数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列（特に好ましくは、配列番号１に示す塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方において合計で１～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加した塩基配列）であって、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（１Ｇ）配列番号１に示す塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（１Ｈ）（１Ｅ）～（１Ｇ）のいずれかの塩基配列の、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする部分塩基配列；
（１Ｉ）（１Ｅ）～（１Ｈ）のいずれかの塩基配列において、サイレント変異（コードするアミノ酸残基を変化しない塩基置換）が導入された塩基配列；
（１Ｊ）（１Ａ）～（１Ｄ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は、
（１Ｋ）（１Ｅ）～（１Ｊ）のいずれかの塩基配列をエキソン配列とし、途中に１以上のイントロン配列が介在している塩基配列が挙げられる。

　前記（１Ｇ）において「配列同一性」とは、二つの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１に示す塩基配列の全塩基数に対する同一塩基の割合（％）をいう。配列同一性は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによる塩基配列の検索システムを用いて算出することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，　１９９３，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０：　５８７３－５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，　１９９０，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５：　４０３－４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，　１９８８，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８５：　２４４４－２４４８）。以下、本明細書では塩基配列の「配列同一性」は、同様の意味で用いる。

　前記（１Ｆ）において「複数個」とは、例えば、２～６０個、２～４５個、２～３０個、２～２１個、２～１５個、２～６個又は２～３個をいう。

＜コリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．１）＞
　コリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．１）は、前述のグリシンベタイン合成経路のうち、１段階目の反応を触媒する酵素であり、ＮＡＤ^＋を補酵素としてコリンをグリシンベタインアルデヒドに変換する。

　コリンデヒドロゲナーゼの例として、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のコリンデヒドロゲナーゼの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３及び配列番号４に示す。

　コリンデヒドロゲナーゼはまた、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるコリンデヒドロゲナーゼに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、コリンデヒドロゲナーゼ活性を有する他のポリペプチドであってもよい。コリンデヒドロゲナーゼ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるコリンデヒドロゲナーゼの活性に対して、１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。

　よって、コリンデヒドロゲナーゼの具体例としては、
（２Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２Ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号４に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）であって、コリンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；
（２Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、コリンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２Ｄ）（２Ａ）～（２Ｃ）のいずれかのポリペプチドの、コリンデヒドロゲナーゼ活性を有する断片が挙げられる。

　前記（２Ｂ）において「複数個」とは、例えば、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～７個、２～５個、２～４個又は２～３個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。

　前記（２Ｃ）において「配列同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号４に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。

　前記（２Ｄ）において断片としては、アミノ酸数が好ましくは２００以上、より好ましくは３００以上、更に好ましくは４００以上のポリペプチドであることができる。

　「コリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子」とは、コリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を指し、遺伝子名はｇｂｓＢと称する。ｇｂｓＢ遺伝子はコリンデヒドロゲナーゼを欠損させる前の野生型の微生物の染色体上のゲノムＤＮＡに含まれる。

　バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する、コリンデヒドロゲナーゼの配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一例を配列番号３に示す。コリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列は、宿主に合わせてコドン最適化したものであってもよい。微生物株のゲノムＤＮＡでは、配列番号３の塩基配列がそのまま存在するとは限らず、配列番号３の塩基配列がエキソン配列であり、途中に１以上のイントロン配列が介在していてもよい。

　よって、コリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列の具体例としては、
（２Ｅ）配列番号３に示す塩基配列；
（２Ｆ）配列番号３に示す塩基配列において、１～複数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列（特に好ましくは、配列番号３に示す塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方において合計で１～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加した塩基配列）であって、コリンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（２Ｇ）配列番号３に示す塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、コリンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（２Ｈ）（２Ｅ）～（２Ｇ）のいずれかの塩基配列の、コリンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする部分塩基配列；
（２Ｉ）（２Ｅ）～（２Ｈ）のいずれかの塩基配列において、サイレント変異（コードするアミノ酸残基を変化しない塩基置換）が導入された塩基配列；
（２Ｊ）（２Ａ）～（２Ｄ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は、
（２Ｋ）（２Ｅ）～（２Ｊ）のいずれかの塩基配列をエキソン配列とし、途中に１以上のイントロン配列が介在している塩基配列が挙げられる。

　前記（２Ｆ）において「複数個」とは、例えば、２～６０個、２～４５個、２～３０個、２～２１個、２～１５個、２～６個又は２～３個をいう。

＜本発明の微生物株＞
　本発明の１以上の実施形態に係る微生物株は、（１）ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．８）をコードする遺伝子(ｇｂｓＡ遺伝子）又は（２）コリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．１）をコードする遺伝子(ｇｂｓＢ遺伝子）の少なくとも１つの遺伝子が欠損した微生物株である。遺伝子の欠損は、ｇｂｓＡ遺伝子又はｇｂｓＢ遺伝子のいずれか１つの遺伝子であってもよく、両方の遺伝子であってもよい。

　本発明において、欠損の対象となる前記ｇｂｓＡ遺伝子及びｇｂｓＢ遺伝子（これらの遺伝子を「欠損対象遺伝子」と称する場合がある）の「欠損」とは、前記欠損対象遺伝子がコードするタンパク質の活性が宿主株と比較して低下していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。本発明の１以上の実施形態に係る微生物株は、前記欠損対象遺伝子の機能が失われている状態、又は、当該機能が減少している状態にある微生物株であり、具体的には、前記欠損対象遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質の発現量が低下している状態若しくは当該発現量がほぼゼロである状態にある微生物株、前記欠損対象遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質が、ｍＲＮＡ又はタンパク質として正常に機能しない状態にある微生物株、又は前記欠損対象遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質が生成されず、ｍＲＮＡ又はタンパク質として完全に機能しない状態にある微生物株が挙げられる。

　前記欠損対象遺伝子の欠損は、例えば、宿主株の遺伝子を人為的に改変することにより達成できる。そのような改変は、例えば、突然変異処理、遺伝子組換え技術、遺伝子発現抑制法等により達成できる。

　突然変異処理としては、紫外線照射、放射線（γ線など）照射、又は、Ｎ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤による処理が挙げられる。

　遺伝子組換え技術としては、公知の技術（例えば、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１６５（１９９８）　３３５－３４０、ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，　Ｄｅｃ．　１９９５，　ｐ７１７１－７１７７、Ｃｕｒｒ　Ｇｅｎｅｔ　１９８６；　１０（８）：５７３－５７８、ＷＯ　９８／１４６００等）を利用することができる。

　遺伝子発現抑制法としては、欠損対象遺伝子のｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡｉ誘導性核酸（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ等）、欠損対象遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を抑制する核酸（アンチセンス核酸、ｍｉＲＮＡ、リボザイム核酸等）、欠損対象遺伝子の転写を抑制する核酸（デコイ核酸等）を用いる方法等が挙げられる。前記「ＲＮＡｉ誘導性核酸」とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉を誘導し得る２本鎖構造のＲＮＡ分子をいう。ＲＮＡ干渉とは、ｍＲＮＡと同一の塩基配列（又はその部分配列）を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する効果をいう。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、ｓｉＲＮＡ、その一部にステムループ構造を有するｓｈＲＮＡ　（ｓｍａｌｌ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）等が挙げられるが、転写活性抑制の強さからｓｉＲＮＡが好ましい。ｓｉＲＮＡは、具体的には、配列番号１又は３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである。ｓｉＲＮＡの長さは、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り特に限定はされないが、通常１８～２５個程度である。欠損対象遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖の一方又は双方の５’末端又は３’末端において１～５個程度の付加的塩基を有していてもよい。

　他の遺伝子発現抑制法として、欠損対象遺伝子のプロモーター領域や転写開始領域などに対して、エンドヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質をｇＲＮＡ（又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）を用いてリクルートすることによって、転写を抑制するＣＲＩＳＰＲｉ（ＣＲＩＳＰＲ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）技術を用いることもできる。ｇＲＮＡ及びｃｒＲＮＡの設計方法は、周知であり、ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの５’末端の約２０ｍｅｒを標的配列に生理的条件下でハイブリダイズ可能なように設計すればよい。

　前記欠損対象遺伝子の欠損は、より好ましくは、微生物株のゲノムＤＮＡにおける前記欠損対象遺伝子の欠損である。前記欠損対象遺伝子の欠損としては、発現調節配列の一部又は全部の欠損であってもよいし、前記各タンパク質のアミノ酸配列のコード領域の一部又は全部の欠損であってもよい。ここで「欠損」とは、欠失又は損傷を意味し、好ましくは欠失である。

　宿主株のゲノムＤＮＡにおいて、前記欠損対象遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。前記欠損対象遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列のコード領域の一部又は全部を欠失させる場合、タンパク質の活性の低下が達成できる限り、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域のコード領域を欠失させてもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。好ましい実施形態では、ゲノムＤＮＡにおいて、前記欠損対象遺伝子のうちアミノ酸配列のコード領域及び／又は発現調節配列の少なくとも一部、例えば、コード領域及び／又は発現調節配列の全体の塩基数に対して好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更により好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％の塩基数からなる領域、が欠失した微生物株である。特に好ましくは、ゲノムＤＮＡにおいて、前記欠損対象遺伝子のうち開始コドンから終止コドンまでの領域が欠損した微生物株である。

　また、タンパク質の活性が低下するような、前記欠損対象遺伝子の欠損の他の例としては、ゲノムＤＮＡ上の前記欠損対象遺伝子のアミノ酸配列コード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１～２塩基を付加又は欠失するフレームシフト変異を導入すること等の、前記欠損対象遺伝子の損傷が例示できる。

　また、タンパク質の活性が低下するような、前記欠損対象遺伝子の欠損は、例えば、ゲノムＤＮＡ上の前記欠損対象遺伝子の発現調節配列又はアミノ酸配列コード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の機能を低下又は消失させるものであれば特に制限されず、例えば、マーカー遺伝子や目的物質（環状リポペプチド）の生産に有用な遺伝子、それらの遺伝子の発現調節配列などであってもよい。

　ゲノムＤＮＡ上の前記欠損対象遺伝子を上記のように欠損させることは、例えば、前記欠損対象遺伝子を、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した不活性遺伝子を作製し、該不活性遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主株を形質転換して、不活性遺伝子とゲノムＤＮＡ上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子を不活性遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。また、前記組換えＤＮＡは、制限酵素で切断する等により直鎖状にしておくと、ゲノムＤＮＡに組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率よく取得することができる。不活性遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。

　また、例えば、任意の配列を含む線状ＤＮＡであって、当該任意の配列の両端にゲノムＤＮＡ上の置換対象部位（典型的には、前記欠損対象遺伝子の一部又は全部）の上流及び下流の配列を備える線状ＤＮＡ、或いは、ゲノムＤＮＡ上の前記置換対象部位の上流及び下流の配列を直結した線状ＤＮＡで微生物を形質転換して、宿主株のゲノムＤＮＡの置換対象部位の上流及び下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで置換対象部位を前記線状ＤＮＡの配列に置換することができる。前記任意の配列には、例えば、マーカー遺伝子配列を含んでもよい。マーカー遺伝子は、その後、必要により除去してもよい。マーカー遺伝子を除去する場合には、マーカー遺伝子を効率的に除去できるよう、相同組換え用の配列をマーカー遺伝子の両端に付加しておいてもよい。

　微生物株において前記欠損対象遺伝子が欠損していることの確認は、前記欠損対象遺伝子がコードするタンパク質の活性の低下により確認することができる。前記タンパク質の活性が低下したことの確認は、前記タンパク質の活性を測定することによって行うことができる。

　前記欠損対象遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を宿主株と比較することによって行うことができる。ｍＲＮＡの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ等が挙げられる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ（ＵＳＡ），　２００１））。ｍＲＮＡの量は、宿主株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、又は０％に低下しているのが好ましい。

　前記欠損対象遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ（ＵＳＡ），　２００１））。本発明の１以上の実施形態に係る微生物株では、前記欠損対象遺伝子がコードするタンパク質の量は、宿主株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、又は０％に低下しているのが好ましい。

＜本発明に係る環状リポペプチドの製造方法＞
　本発明の更なる１以上の実施形態は、前記の本発明の１以上の実施形態に係る微生物株を培養することを含む、環状リポペプチドの製造方法に関する。

　本発明において環状リポペプチドとしては、例えば、サーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）系環状リポペプチド、イツリン（ｉｔｕｒｉｎ)系環状リポペプチド、又はフェンジシン（ｆｅｎｇｙｃｉｎ）系環状リポペプチドが挙げられる。

　サーファクチン系環状リポペプチドは、Ｃ１１～Ｃ１７の鎖長を有するβ－ヒドロキシ脂肪酸と結合した７個のアミノ酸で構成される環状リポペプチドで、例えば、サーファクチン、エスペリン、リケニシン、プミラシジン等が包含される。

　イツリン系環状リポペプチドは、Ｃ１２～Ｃ１８の鎖長を有するβ－アミノ脂肪酸と結合した７個のアミノ酸で構成される環状リポペプチドで、例えば、イツリンＡ、イツリンＡ１、イツリンＣ、バシロマイシンＤ、バシロマイシンＦ、バシロマイシンＬ、バシロマイシンＬＣ（バシロペプチン）、マイコサブチリン等が包含される。

　フェンジシン系環状リポペプチドは、Ｃ１４～Ｃ２１の鎖長を有するβ－ヒドロキシ脂肪酸と結合した１０個のアミノ酸で構成される環状リポペプチドで、例えば、フェンジシンＡ、フェンジシンＢ、プリパスタチンＡ、プリパスタチンＢ等が包含される。

　本発明の方法による目的の環状リポペプチドの生産は、上記微生物株を資化可能な炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、当該目的の環状リポペプチドを精製することにより行えばよい。

　培養に使用される培地の組成及び培養条件については、使用する微生物株の種類等に従って、当業者が適宜選択することができる。例えば、培地は、本発明に用いられる微生物株の資化できる炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン等であって、当該微生物株の増殖、及び、目的物質の生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。

　炭素源としては、例えば、グルコース、マルトース、フラクトース、スクロース、加水分解デンプン、糖蜜のような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類、植物油、動物油、脂肪酸のような脂質等が挙げられる。これら炭素源は、単独で、あるいは組み合わせて使用することができ、グルコース又はマルトースが好ましい。

　窒素源としては、例えば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アンモニア、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、グルタミン酸ナトリウム、尿素、各種アミノ酸、アミン等の窒素化合物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆加水分解物、豆類の粉砕物又はその抽出物のような天然窒素源などが挙げられる。これら窒素源は、単独で、あるいは組み合わせて使用することができ、豆類の粉砕物又はその抽出物とその他の窒素源を組み合わせて使用することが好ましい。また、豆類としては大豆、小豆、えんどう豆、そら豆、ひよこ豆、ひら豆、インゲン豆などが使用でき、大豆が好ましい。

　無機塩としては、例えば、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、モリブデンイオン、リン酸イオン、硫酸イオン、塩化物イオン、硝酸イオン等のカチオン又はアニオンが挙げられる。

　ビタミンとしては、例えば、ビオチンやチアミンなどが挙げられる。さらに必要に応じて本発明の１以上の実施形態に係る微生物株が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性の微生物株であれば要求アミノ酸）を添加することができる。

　培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。発泡がある場合には通常使用される一般的な消泡剤を添加することができる。培養温度は２０～５０℃、好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２３～３８℃である。培養時のｐＨは５～９、好ましくは６～８である。培養時間は、３時間～５日間、好ましくは５時間～３日間である。

　本発明の好ましい一実施態様として、バチルス属細菌を用いて環状リポペプチドの生産を行う場合、培養に使用される培地の組成及び培養条件としては、特許第３６３５６３８号公報に記載の条件が挙げられる。具体的には、培養には大豆粉又はその抽出物を含む培地を用いることが好ましい。大豆粉又はその抽出物とは、大豆若しくは脱脂大豆を顆粒状に粉砕した粗粒大豆粉、粉末状に粉砕した粉砕大豆粉、それらの抽出物（例えば熱水抽出物）、加水分解物（例えば酸加水分解物、酵素加水分解物）等を言う。大豆粉又はその抽出物の濃度に特に制限はないが、培地中の大豆粉又はその抽出物の濃度に比例して環状リポペプチド生産量は増加するため、ある程度の生産量を得るためには０．５ｗ／ｗ％以上が望ましい。しかし、一方で大豆粉又はその抽出物が高濃度になると滅菌が不十分になるおそれがあるので、２０ｗ／ｗ％濃度を超えないことが望ましい。よって高い生産量を得るための大豆粉又はその抽出物濃度は０．５～２０ｗ／ｗ％であり、好ましくは２～１５ｗ／ｗ％、より好ましくは４～１２ｗ／ｗ％である。

　また、上記培地には、大豆粉又はその抽出物の他に、通常使用する資化可能な炭素源、窒素源及び無機塩等を含有させることができる。さらに必要であればアミノ酸及び／又はビタミン等を添加することができる。

　炭素源としては、グルコース、マルトース、スクロース、加水分解デンプン、糖蜜、馬鈴薯エキス、モルト、ピート、植物油、コーンスティープリカー、フルクトース、シロップ、液糖（ｌｉｑｕｉｄ　ｓｕｇａｒ）、転化糖（ｉｎｖｅｒｔ　ｓｕｇａｒ）、アルコール、有機酸、有機酸塩、アルカン又は他の一般的な炭素源が利用できる。これらの炭素源は単独で、又は組み合わせて使用することができ、なかでもグルコース又はマルトースが好ましい。上記の炭素源は通常０．０１～５０ｗ／ｗ％、好ましくは１～４０ｗ／ｗ％程度の濃度で用いることができる。

　窒素源としては、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム又は重炭酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アンモニア、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、グルタミン酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン水解物、フェザーミール、酵母エキス等の無機又は有機の窒素源が利用できる。これらの窒素源は単独で、又は組み合わせて使用することができ、環状リポペプチドの生産性の点から酵母エキスが好ましい。上記の窒素源は通常０．０１～３０ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～１０ｗ／ｗ％程度の濃度で用いるのがよい。

　さらに、無機塩として、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、モリブデンイオン、リン酸イオン、硫酸イオン、塩化物イオン、又は硝酸イオン等のカチオン又はアニオンを添加することが好ましい。無機塩の添加濃度は培養条件により異なるが、通常、リン酸塩として０．０１～５ｗ／ｗ％、マグネシウム塩として１０ｐｐｍ～２ｗ／ｗ％、他の塩は０．１ｐｐｍ～１０００ｐｐｍ程度である。

　また、アミノ酸としては、Ｌ－グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－システイン、シスチン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－プロリン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－リシン、Ｄ－バリン、Ｄ－イソロイシン等が挙げられ、これらを１種又は２種以上添加することができる。特に本発明においては、Ｌ－アルギニン及び／又はＬ－トリプトファンを添加することが好ましい。アミノ酸の添加濃度は、通常、０．００１～５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０１～１ｗ／ｗ％程度である。

　ビタミンとしてはビオチン、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ピリドキサール、ピリドキシン、ｍｙｏ－イノシトール、コリン、葉酸、コバラミン、シアノコバラミン等が挙げられ、これらを１種又は２種以上添加することができる。ビタミンの添加濃度は、通常、０．１～１００ｐｐｍであり、好ましくは１～５０ｐｐｍである。

　培養では、試験管、フラスコ、発酵槽等の容器に上記の培地を添加し、強く通気しながら、培養を行う。試験管、フラスコ等の容器を用いた培養の場合は強く振とうすることにより通気を行い、培地の初発のｐＨを６．５～８．０に調整する。発酵槽等の容器により高濃度の生産を行う場合は無菌空気を通気し、撹拌しながら培養を行い、発泡があって培養が困難な場合は通常使用される一般的な消泡剤を添加することができる。

　培地のｐＨは６～９、好ましくは６．５～８．０、より好ましくは６．９～７．５に維持する。ｐＨの調節はたとえば、アンモニア、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム又は炭酸カリウム水溶液等の塩基性水溶液の添加によって行うが、それらの中でも水酸化ナトリウム又はアンモニア水を使用することが好ましい。水酸化ナトリウムであれば２０ｗ／ｗ％濃度程度、またアンモニア水であれば８～２５ｗ／ｗ％程度がよい。培養温度は２５～４２℃、好ましくは２８～４０℃、より好ましくは３０～３７℃である。

　上記のようにして本発明の微生物株を培養した後、培養物中に蓄積した環状リポペプチドは、通常の精製方法によって採取することができる。例えば、培養終了後、遠心分離などで菌体や固形物を除いたあと、イオン交換、濃縮、結晶分別などによって採取することができる。

　以下に実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

　以下で説明する遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　１９８９）の記載を参照して実施することができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、前記酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。

（製造例１）ＢＬ００２株の作製
　環状リポペプチド生産株の宿主となるＢＬ００２株を作製した。具体的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株（以下、「１６８株」と記載することがある）に環状リポペプチド生産能を付与するために、４－ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードするｌｐａ－１４（Ｊ．　Ｆｅｒｍｅｎｔ．　Ｂｉｏｅｎｇ．，　７６　：６，　４４５－４５０（１９９３））を染色体上に導入した菌株を作製した。

　まず、ｌｐａ－１４を１６８株の染色体上に導入するためのＤＮＡ断片を作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、染色体上のｓｆｐ遺伝子座位に導入するための相同組換え用の足場と、ｌｐａ－１４とクロラムフェニコール耐性カセットを有するＤＮＡ断片（配列番号５：ｓｆｐＵＤ－ｌｐａ１４－ｃａｔ）を得た。

　次に、配列番号５に記載のＤＮＡ断片を用い、１６８株を親株として、ＣＩ／ＣＩＩ法（微生物遺伝学実験法、遺伝学実験講座３、共立出版）で形質転換した。形質転換後、得られた菌株をクロラムフェニコール７．５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートに塗布して３７℃で培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体から、ＰＣＲ及びＤＮＡシーケンサーによる解析により、１６８株の染色体上のｓｆｐ遺伝子座位にｌｐａ－１４とクロラムフェニコール耐性カセットが挿入された菌株１株を単離した。この菌株をＢＬ００２株と命名した。

（製造例２）ＢＬ００２　ｇｂｓＡ：：ｓｐｅｃ株の作製
　まず、ｇｂｓＡ遺伝子座位にスペクチノマイシン耐性カセットを挿入するためのＤＮＡ断片を作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｇｂｓＡ遺伝子の上流配列、下流配列とスペクチノマイシン耐性カセットを有するＤＮＡ断片（配列番号６：ｇｂｓＡＵＤ－ｓｐｅｃ）を得た。

　次に、製造例１で作製したＢＬ００２株を親株とし、配列番号６に示すＤＮＡ断片を用いて、製造例１と同様の方法で形質転換を行った。ただし、形質転換後の菌株はクロラムフェニコール５μｇ／ｍＬ、スペクチノマイシン二塩酸塩五水和物１５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートに塗布した。形質転換体から、ＰＣＲ及びＤＮＡシーケンサーによる解析により、染色体上のｇｂｓＡ遺伝子の開始コドンから終止コドンと、ｇｂｓＡ下流のｇｂｓＢとの間の遺伝子間領域を欠失し、スペクチノマイシン耐性カセットが挿入された菌株１株を単離した。この菌株をＢＬ００２　ｇｂｓＡ：：ｓｐｅｃ株と命名した。

（製造例３）ＢＬ００２ΔｇｂｓＡ株の作製
　まず、ＢＬ００２　ｇｂｓＡ：：ｓｐｅｃ株からスペクチノマイシン耐性カセットを脱落させるためのＤＮＡ断片を作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｇｂｓＡ遺伝子の上流配列、下流配列を有するＤＮＡ断片（配列番号７：ｇｂｓＡＵＤ）を得た。

　次に、製造例２で作製したＢＬ００２　ｇｂｓＡ：：ｓｐｅｃ株を親株とし、配列番号７に示すＤＮＡ断片を用いて、製造例１と同様の方法で形質転換を行った。ただし、形質転換後の菌株はクロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートに塗布した。さらに、取得したコロニーを、クロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール５μｇ／ｍＬ、スペクチノマイシン二塩酸塩五水和物１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートにそれぞれレプリカし、スペクチノマイシン感受性を示す形質転換体を選抜した。形質転換体から、ＰＣＲ及びＤＮＡシーケンサーによる解析により、染色体上のｇｂｓＡ遺伝子の開始コドンから終止コドンと、ｇｂｓＡ下流のｇｂｓＢとの間の遺伝子間領域を欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＢＬ００２ΔｇｂｓＡ株と命名した。

（製造例４）ＢＬ００２ΔｇｂｓＢ株の作製
　まず、ｇｂｓＢ遺伝子を破壊するためのＤＮＡ断片を作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｇｂｓＢ遺伝子の上流配列、下流配列とスペクチノマイシン耐性カセットを有するＤＮＡ断片（配列番号８：ｇｂｓＢＵＤ－ｓｐｅｃ）を得た。

　次に、製造例１で作製したＢＬ００２株を親株とし、配列番号８に示すＤＮＡ断片を用いて、製造例２と同様の方法で、染色体上のｇｂｓＢ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、スペクチノマイシン耐性カセットが挿入された菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＢＬ００２ΔｇｂｓＢ株と命名した。

（製造例５）ＢＬ００２ΔｇｂｓＡＢ株の作製
　まず、ｇｂｓＡ遺伝子とｇｂｓＢ遺伝子を破壊するためのＤＮＡ断片を作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｇｂｓＡ遺伝子の上流配列、ｇｂｓＢ遺伝子の下流配列とスペクチノマイシン耐性カセットを有するＤＮＡ断片（配列番号９：ｇｂｓＡＵ－ｓｐｅｃ－ｇｂｓＢＤ）を得た。

　次に、製造例１で作製したＢＬ００２株を親株とし、配列番号９に示すＤＮＡ断片を用いて、製造例２と同様の方法で、染色体上のｇｂｓＡ遺伝子の開始コドンからｇｂｓＢ遺伝子の終止コドンまでを欠失し、スペクチノマイシン耐性カセットが挿入された菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＢＬ００２ΔｇｂｓＡＢ株と命名した。

（実施例１）ＢＬ００２ΔｇｂｓＡ株によるサーファクチン生産
　製造例３で取得したＢＬ００２ΔｇｂｓＡ株を以下の条件で培養し、サーファクチンを生産した。

　まず、ＢＬ００２ΔｇｂｓＡ株を３ｍＬ　ＬＢ培地（５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む）に植菌し、３７℃、３００ｒｐｍで１６時間振盪培養した。この培養液を、生産培地（４０ｇ／Ｌ大豆粉、５ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物、０．１８ｇ／Ｌ塩化カルシウム二水和物、０．０２５ｇ／Ｌ硫酸鉄七水和物、０．０２２ｇ／Ｌ塩化マンガン四水和物、３０ｇ／Ｌ　マルトース一水和物）２．５ｍＬに、ＯＤ６００＝０．１となるように植菌し、３５℃、３００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。得られた培養液を用い、培養液中のサーファクチン濃度を、下記条件によるＨＰＬＣ法にて分析した。

（ＨＰＬＣ条件）
　サンプル量：２０μｌ
　カラム：ＯＤＳ－２、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス社製
　カラム温度：４０℃
　溶離液：８０ｖ／ｖ％アセトニトリル、３．８ｍＭ　トリフルオロ酢酸
　流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
　検出器：ＵＶ検出器
　波長：２０５ｎｍ

　定量はサーファクチンの標準サンプル（シグマ－アルドリッチ社製）を用いて検量線を作成して測定した。

（実施例２）ＢＬ００２ΔｇｂｓＢ株によるサーファクチン生産
　製造例４で取得したＢＬ００２ΔｇｂｓＢ株を実施例１と同様の条件で培養し、サーファクチンを生産した。ただし、前培養のＬＢ培地は５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシン二塩酸塩五水和物を含むものを使用した。得られた培養液を用い、培養液中のサーファクチン濃度を、実施例１と同様に分析した。

（実施例３）ＢＬ００２ΔｇｂｓＡＢ株によるサーファクチン生産
　製造例５で取得したＢＬ００２ΔｇｂｓＡＢ株を実施例２と同様の条件で培養し、サーファクチンを生産した。培養液中のサーファクチン濃度を、実施例１と同様に分析した。

（比較例１）ＢＬ００２株によるサーファクチン生産
製造例１で取得したＢＬ００２株を実施例１と同様の条件で培養し、サーファクチンを生産した。培養液中のサーファクチン濃度を、実施例１と同様に分析した。

　実施例１～３、比較例１のサーファクチン濃度の分析結果を下記表１に示す。

　表１の実施例１～３と比較例１の結果を比べると、ｇｂｓＡ遺伝子又はｇｂｓＢ遺伝子のいずれか、あるいは両方の欠損により、サーファクチン生産量が大きく増加することが示された。以上の結果より、微生物培養による環状リポペプチド生産において、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子又はコリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の欠損がその生産性向上に有効であることが分かった。

　本発明は、環状リポペプチドの製造分野において利用できる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。

Claims

　以下の（１）又は（２）の少なくとも１つの遺伝子が欠損した環状リポペプチド産生微生物株。
（１）ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．８）をコードする遺伝子
（２）コリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．１）をコードする遺伝子
　前記微生物株が、細菌を宿主とする組換え微生物株である、請求項１に記載の微生物株。
　前記細菌が、グラム陽性細菌である、請求項２に記載の微生物株。
　前記グラム陽性細菌が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌である、請求項３に記載の微生物株。
　前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌が、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項４に記載の微生物株。
　前記環状リポペプチドが、サーファクチン系環状リポペプチド、イツリン系環状リポペプチド、及びフェンジシン系環状リポペプチドから選ばれる１種又は２種以上の環状リポペプチドである、請求項１～５のいずれか１項に記載の微生物株。
　前記環状リポペプチドが、サーファクチンである、請求項１～６のいずれか１項に記載の微生物株。
　請求項１～７のいずれか１項に記載の微生物株を培地中で培養することを含む環状リポペプチドの製造方法。
　前記培地が、豆類の粉砕物又はその抽出物を含む、請求項８に記載の環状リポペプチドの製造方法。
　前記豆類が大豆である、請求項９に記載の環状リポペプチドの製造方法。