KR20070107789A

KR20070107789A - 엔테로박테리아세애 과에서 자발적으로 복제할 수 있는신규 플라스미드

Info

Publication number: KR20070107789A
Application number: KR1020077021975A
Authority: KR
Inventors: 요시히코 하라; 히로시 이즈이; 히로미 노구치
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2007-11-07
Also published as: EP1853621B1; CN101128479B; EP1853621A1; KR101089054B1; WO2006090912A1; DE602006016562D1; JP4734959B2; CN101128479A; JP2006230311A

Abstract

본 발명은 판토에아(Pantoea) 세균, 에르위니아(Erwinia) 세균 및 엔테로박터(Enterobacter) 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 미생물로부터 분리되고, Rep 단백질 또는 이의 동족체를 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 엔테로박테리아세애 세균에서 자발적으로 복제할 수 있는 유전자를 함유하는 플라스미드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 당해 플라스미드를 함유하는 엔테로박테리아세애 미생물에 관한 것이다.

판토에아 세균, 에르위니아 세균, 엔테로박터 세균, Rep 단백질

Description

엔테로박테리아세애 과에서 자발적으로 복제할 수 있는 신규 플라스미드{Novel plasmid autonomously replicable in Enterobacteriaceae family}

본 발명은 엔테로박테리아세애 과에 속하는 미생물에서 자발적으로 복제할 수 있는 신규 플라스미드, 및 당해 플라스미드를 사용하는 방법 및 당해 플라스미드를 함유하는 미생물에 관한 것이다.

현재, 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)를 포함하여 엔테로박테리아세애 과에 속하는 미생물들을 DNA 재조합 기술에 의해 개량하고 있다. DNA 재조합 기술을 사용한 미생물들의 개량을 위해, 다양한 속의 미생물로부터 유래된 플라스미드 및 광범위 숙주 스펙트럼 벡터가 흔히 사용된다. 그러나, 일반적으로 미생물 기원의 성질이 유사한 플라스미드가 사용된다.

엔테로박테리아세애 과에 속하는 미생물로부터 유래된 플라스미드는 에스케리치아 콜리로부터 유래하는 pBR322, RSF1010(Gene, vol. 75, (2) pp.271-288, 1989), 및 pUC(Gene, Oct. 1982, 19(3):259-68), 살모넬라(Salmonella) 세균으로부터 유래하는 pHCM2(Plasmid, May 2002, 47(3):159-71), 예르시니아(Yersinia) 세균 으로부터 유래하는 pCD1(Infect. Immun., Mar. 1986, 51(3):788-94) 및 pMT1(J. Bacteriol., Jul. 2000, 182 (14):3924-8)등과 같은 소형 플라스미드를 포함한다. pS가 판토에아(Pantoea) 세균 유래인 것으로 공지되어 있지만(WO98/59054), 미생물로 전달될때 호기적 조건하에서 미생물의 증식을 개선시킬 수 있는 플라스미드는 공지되어 있지 않다.

본 발명의 목적은 엔테로박테리아세애 과에 속하는 미생물의 개량에 적합한 신규 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명자는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) AJ13601(FERM BP-7207)이 신규 플라스미드를 함유하고 있음을 밝혔고 당해 플라플라스미드를 성공적으로 동정하였다. 이에 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 판토에아 세균, 에르위니아(Erwinia) 세균 및 엔테로박터(Enterobacter) 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 미생물로부터 유래하고, 서열번호 2의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 Rep 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 상기 정의된 바와 같은 유전자를 포함하고 엔테로박테리아세애 세균에서 자발적으로 복제할 수 있는 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 상기된 바와 같고 마커 유전자를 추가로 포함하는 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 상기된 바와 같고 판토에아 아나나티스 FERM BP-7207, BP-6614 및 BP-6615로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 판토에아 세균으로부터 유래하며 약 320kb인 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 상기된 바와 같고, pEA320이며 도 1, 2, 3, 4 및 5에 나타낸 것들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제한 효소 맵을 갖는 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 판토에아 세균, 에르위니아 세균 및 엔테로박터 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 미생물로부터 분리되고 서열번호 2의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 Rep 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 엔테로박테리아세애 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 플라스미드가 판토에아 아나나티스 FERM BP-7207, BP-6614 및 BP-6615로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 판토에아 세균으로부터 유래하고 약 320kb인, 상기된 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 플라스미드가 pEA320이고, 도 1, 2, 3, 4 및 5에 나타낸 것들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제한 효소 맵을 갖는, 상기된 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 플라스미드가 마커 유전자를 추가로 포함하고 엔테로박테리아세애 미생물에서 자발적으로 복제할 수 있는, 상기된 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 에스케리치아 세균, 판토에아 세균, 엔테로박터 세균, 에르위니아 세균, 클렙시엘라(Klebsiella) 세균, 세라티아(serratia) 세균, 살모넬라(Salmonella) 세균 및 모르가넬라(Morganella) 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기된 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 유용한 물질을 생산할 수 있는 상기된 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 상기된 바와 같은 미생물을 배지에서 배양하고 미생물 배지로부터 유용한 물질을 수거함을 포함하는, 유용한 물질의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 유용한 물질이 L-아미노산인 상기된 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 엔테로박테리아세애 미생물을 상기된 바와 같은 플라스미드로 형질전환시킴을 포함하는 산 내성이 개선된 미생물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 플라스미드를 함유하지 않는 균주와 비교하여, 산 내성이 개선된 미생물이 pH 3 내지 5에서 개선된 증식을 보여주는, 상기된 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 NotI에 대한 플라스미드 pEA320의 제한 효소 맵을 도시한다.

도 2는 Sse8387I에 대한 플라스미드 pEA320의 제한 효소 맵을 도시한다.

도 3은 SwaI에 대한 플라스미드 pEA320의 제한 효소 맵을 도시한다.

도 4는 PmeI에 대한 플라스미드 pEA320의 제한 효소 맵을 도시한다.

도 5는 AscI에 대한 플라스미드 pEA320의 제한 효소 맵을 도시한다.

도 6은 중성 및 산성 조건하에서 플라스미드 pEA320 형질전환된 이. 콜리의 증식을 나타내는 그래프를 도시한다.

도 7은 산성 조건하에서 플라스미드 pEA320 형질전환된 이. 콜리의 증식을 나타내는 그래프를 도시한다.

본 발명을 수행하기 위한 최선의 양태

이후부터, 본 발명은 상세히 설명될 것이다.

<1> 본 발명의 유전자 및 플라스미드

본 발명의 유전자는 판토에아 세균, 에르위니아 세균 또는 엔테로박터 세균으로부터 유래하거나 분리된 유전자이다. 이러한 유전자(rep 유전자)는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 Rep 단백질을 암호화한다. 본 발명의 플라스미드는 본 발명의 유전자를 포함한다.

본 발명의 유전자는 pEA320 플라스미드를 분석하여 동정하였다. pEA320은 약 320kb이고 이후에 기술되는 바와 같은 판토에아 아나나티스 AJ13601(FERM BP- 7207), 판토에아 아나나티스 AJ 13355(FERM BP-6614), 판토에아 아나나티스 AJ 13356(FERM BP-6615)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세균으로부터 유래하거나 분리된다. 판토에아 세균, 에르위니아 세균 및 엔테로박터 세균은 γ-프로테오박테리아로서 분류된 미생물이고 이들은 분류학적으로 서로 매우 유사하다[문헌참조: J. Gen. Appl. Microbiol., Dec. 1997, 43(6), 355-361; International Journal of Systematic Bacteriology, 1993, pp.162-173; and International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, pp.1061-1067]. 최근해에, 엔테로박터 속에 속하는 몇몇 미생물은 16s rRNA 등의 뉴클레오타이드 서열 분석을 기준으로 판토에아 애글로메란스(Pantoea agglomerans), 판토에아 아나나티스, 판토에아 스튜워티(Pantoea stewartii)등으로서 재분류되었고 에르위니아 속에 속하는 몇몇 미생물은 판토에아 아나나스 또는 판토에아 스튜워티로 재분류되었다(문헌참조: International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, pp.1061-1067).

추가로, 이들은 공통적으로 하기의 물리적 성질을 나타낸다[문헌참조: 미국 특허 제6,331,419호 및 제6,197,559호]:

(1) 그람 염색: 음성

(2) 산소에 대한 반응: 조건적 혐기성

(3) 옥시다제: 양성

(4) 보게스-프로스카우어 반응: 양성

(5) 메틸 레드 시험: 음성

(6) 우레아제: 음성

(7) 인돌 생산: 양성

(8) TSI 배양 배지에서 황화수소 생산: 약간 활성

(9) β-갈락토시다제: 양성

(10) 당 동화작용

아라비노스: 양성

슈크로스: 양성

락토스: 양성

크실로스: 양성

소르비톨: 양성

이노시톨: 양성

트레할로스: 양성

말토스: 양성

멜리비오스: 양성

아도니톨: 음성

라피노스: 양성

살리신: 음성

멜리비오스: 양성

(11) 시트르산 동화작용: 양성

(12) 아르기닌 데하이드라타제: 음성

(13) 오르니틴 데카복실라제: 음성

(14) 증식 pH: pH 4.5 내지 7에서 양호한 증식

따라서, 본 발명의 유전자는 판토에아 세균, 에르위니아 세균 및 엔테로박터 세균에 고유한 거대 플라스미드, 특히, 당해 세균의 야생형 균주로부터 수득한 거대 플라스미드로부터 수득할 수 있다. 당해 거대 플라스미드를 함유하는 판토에아 세균의 전형적인 균주는 판토에아 아나나티스, 판토에아 스튜워티 및 판토에아 애글로메란스를 포함한다. 추가로, 당해 에르위니아 세균의 전형적인 균주는 에르위니아 아나나스(Erwinia ananas) 및 에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola)를 포함한다. 추가로, 당해 엔테로박터 세균의 전형적인 균주는 엔테로박터 애글로메란스 및 엔테로박터 아에로게네스를 포함한다.

추가로, 엔테로박터 애글로메란스의 몇몇 균주는 최근에 16S rRNA 등의 뉴클레오타이드 서열 분석을 기초로 판토에아 애글로메란스, 판토에아 아나나티스, 판토에아 스튜워티등으로서 재분류되었다. 본 발명에서, 당해 유전자 및 플라스미드는 미생물이 엔테로박테리아세애로서 분류되는 한, 엔테로박터, 판토에아 및 에르위니아중 하나로부터 유래하거나 분리될 수 있다. 판토에아 아나나티스 균주가 유전자 조작 기술에 의해 개량되는 경우, 판토에아 아나나티스 AJ13355 균주(FERM BP-6614), AJ13356(FERM BP-6615), AJ13601 균주(FERM BP-7207) 및 이의 변이체가 사용될 수 있다. 이들 균주는 분리되었을때 엔테로박터 애글로메란스로서 동정되었고 엔테로박터 애글로메란스로서 기탁되었다. 그러나, 이들은 최근에 16S rRNA 등의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 판토에아 아나나티스로서 재분류되었다.

특히, 본 발명의 유전자는 판토에아 아나나티스 AJ13601(FERM BP-7207) 균 주(EP1078989A)로부터 수득할 수 있다. 판토에아 아나나티스 AJ13601 균주는 기탁기관[the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (현재, the International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, address: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan)]에 1999년 8월 18일자로 기탁되어 기탁번호 FERM P-17516을 부여받았다. 기탁물은 부다페스트 조약하에 2000년 7월 6일자로 국제 기탁 기관으로 이관되어 기탁번호 FERM BP-7207을 부여받았다.

추가로,, 본 발명의 유전자는 또한 에르위니아 아나나스 및 에르위니아 헤르비콜라로부터 수득할 수 있다. 에르위니아 아나나스의 예는 에르위니아 아나나스 ATCC 33244 및 에르위니아 헤르비콜라 IAM1595를 포함한다. ATCC 33244 균주는 할당된 등록 번호를 사용하여 기탁기관[the American Type Culture Collection (Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)](www.atcc.org/ 참조)으로부터 입수할 수 있다. 각각의 균주에 대한 등록 번호는 기탁기관[the American Type Culture Collection]의 카탈로그에 등재되어 있다. IAM1595는 기관[the IAM Culture Collection, Laboratory of Bioresources, Institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo]에서 보관하고 있고 등록번호로 주문될 수 있다. 각각의 균주에 대한 등록 번호들은 IAM 카탈로그(IAM Catalogue of Strain, Third Edition, 2004)에 등재 되어 있다.

추가로, 본 발명의 유전자는 또한 엔테로박터 애글로메란스 및 엔테로박터 아에로게네스로부터 수득할 수 있다. 엔테로박터 애글로메란스의 예는 ATCC 12287이고 엔테로박터 아에로게네스의 예는 ATCC 13048이다.

상기 언급된 판토에아 아나나티스는 pEA320으로 지정되고 동정된 약 320kb의 플라스미드를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 플라스미드는 판토에아 아나나티스의 세포에서 이본쇄 사이클릭 DNA로서 존재한다. pEA320에 함유된 rep 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 나타내고 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸다.

전형적인 제한 효소로 분해되는 경우, pEA320으로부터 수득된 단편의 수 및 크기는 표 1에 나타낸다. 추가로, pEA320의 제한 효소 맵은 도 1 내지 5에 나타낸다. rep 단백질을 암호화하는 유전자는 pEA320의 효소 맵상에서 110606번과 109728번 사이에 위치한다.

본 발명의 유전자에 의해 암호화된 Rep 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이의 동족체를 갖는 것으로서 정의된다. 당해 Rep 단백질의 아미노산 서열(서열번호 2)과 공지된 엔테로박테리아세애 세균의 플라스미드의 Rep 단백질의 아미노산 서열을 비교하여 상동성을 측정하였다. 따라서, 본 발명의 유전자는 암호화된 Rep 단백질들의 상동성을 비교함에 의해 공지된 엔테로박테리아세애 세균의 유전자와는 구별될 수 있다. 본 발명의 유전자는 서열번호 2의 총 아미노산 서열을 기준으로 80% 이상의 상동성, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 Rep 단백질을 암호화하는 동족체를 포함하고 당해 단백질 또는 동족체는 플라스미드의 복제에 관여한다. 본원에서 계산된 바와 같은 상동성은 유전자 분석 소프트웨어 진틱스(Genetyx)(Genetyx, Inc로부터 구입될 수 있는)를 사용하여 분석되고 계산되었으며 정확하게 일치하는 아미노산 잔기의 비율을 나타낸다. 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열의 상동성(동일성)은 예를 들어, 카를린(Karlin) 및 알슐(Altschul)에 의한 알고리듬 BLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) 또는 FASTA(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))를 사용하여 측정할 수 있다. BLASTN 및 BLASTX로 호칭되는 프로그램이 당해 알고리듬 BLAST를 기초로 개발되었다[www.ncbi.nlm.nih.gov].

추가로, 판토에아, 에르위니아 및 엔테로박터 세균의 종 또는 균주에 따라 rep 유전자의 뉴클레오타이드 서열에는 차이가 존재할 수 있다. 따라서, Rep 단백질은, Rep 단백질 기능이 변형에 의해 변화되지 않는 한, 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가는 예를 들어, 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개일 수 있다. 상기 언급된 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가는 보존성이고 플라스미드의 정상적인 복제에 영향을 주지 않을 것이다. 전형적인 보존성 아미노산 변화는 보존성 치환이다. 보존성인 것으로 사료되는 치환은 Ala의 Ser 또는 Thr로의 치환, Arg의 Gln, His 또는 Lys로의 치환, Asn의 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp의 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환, Cys의 Ser 또는 Ala로의 치환, Gln의 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환, Glu의 Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly의 Pro로의 치환, His의 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환, Ile의 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Leu의 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Lys의 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환, Met의 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환, Phe의 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환, Ser의 Thr 또는 Ala로의 치환, Thr의 Ser 또는 Ala로의 치환, Trp의 Phe 또는 Tyr로의 치환, Tyr의 His, Phe 또는 Trp로의 치환 및 Val의 Met, Ile 또는 Leu로의 치환을 포함한다.

추가로, Rep 단백질을 암호화하는 유전자는 또한 플라스미드 복제 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 엄중 조건하에 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 하이브리드화할 수 있는 DNA일 수 있다. "엄중 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되지만 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 포함한다. 엄중 조건의 예는 예를 들어, 80% 이상의 상동성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화하지만 80% 미만의 상동성을 나타내는 DNA는 서로 하이브리드화하지 않는 조건들을 포함한다. 특정 예는 전형적인 서던 하이브리드화 세척 조건인 1 x SSC, 0.1% SDS 및 60℃, 바람직하게는 0.1 x SSC, 0.1% SDS 및 60℃, 보다 바람직하게는 0.1 x SSC, 0.1% SDS 및 68℃의 염 농도 및 온도에서 1회, 바람직하게는 2회 또는 3회 세척하는 것을 포함한다. 적합한 길이의 프로브는 하이브리드화 조건에 따라 선택되지만 일반적으로 100bp 내지 1kbp이다.

판토에아, 에르위니아 및 엔테로박터 세균에 고유적인 본 발명의 플라스미드는 판토에아 및 에스케리치아 세균과 같은 엔테로박테리아세애 미생물에서 자발적으로 복제할 수 있다. 따라서, 목적하는 유전자가 플라스미드 또는 자발적 복제 능력을 유지하고 있는 변형체의 임의의 위치에 삽입되고 숙주 미생물이 당해 재조합 플라스미드로 형질전환되는 경우, 숙주 미생물에서 목적하는 유전자의 발현이 가능하다.

본 발명의 플라스미드로 형질전환된 엔테로박테리아세애 미생물의 예는 에스케리치아, 판토에아, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 세라티아, 살모넬라 또는 모르가넬라 세균을 포함한다. 구체적으로, NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이타베이스에 기재된 분류법에 따른 엔테로박테리아세애 세균이 사용될 수 있다.

구체적으로, 문헌[참조: Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029, Table 1]에 언급된 에스케리치아 세균이 사용될 수 있다. 이들 중에서, 예를 들어, 에스케리치아 콜리가 사용될 수 있다. 에스케리치아 콜리의 예는 특히, 에스케리치아 콜리 W3110(ATCC 27325), 에스케리치아 콜리 MG1655(ATCC 47076)등 및 프로토타입의 야생형 균주인 K12 균주로부터 유래하는 균주를 포함한다.

엔테로박터 세균의 예는 엔테로박터 애글로메란스, 엔테로박터 아에로게네스등을 포함한다. 구체적으로, 유럽 특허원 제952221 A호에 예시된 균주가 사용될 수 있다. 상기된 바와 같이, 엔테로박터 애글로메란스의 몇몇 균주는 최근에 16S rRNA 등의 뉴클레오타이드 서열 분석을 기초로 판토에아 애글로메란스, 판토에아 아나나티스, 판토에아 스튜워티등으로서 재분류되었다.

판토에아 세균의 전형적인 균주는 판토에아 아나나티스, 판토에아 스튜워티, 판토에아 애글로메란스 및 판토에아 시트레아를 포함한다. 구체적으로, 유럽 특허원 제955368 A호에 예시된 균주가 사용될 수 있다.

에르위니아 세균의 전형적인 균주는 에르위니아 아나나스 및 에르위니아 헤르비콜라를 포함하고 클렙시엘라 세균의 전형적인 균주는 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola)를 포함한다. 구체적으로, 유럽 특허원 제955368 A호에 예시된 균주가 사용될 수 있다.

세라티아 세균의 전형적인 균주는 세라티아 리쿠에파시엔스를 포함하고, 살모넬라 세균의 전형적인 균주는 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)을 포함하고 모르가넬라(Morganella)의 전형적인 균주는 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii)를 포함한다. 구체적으로, 세라티아 세균에 속하는 세균으로서, 유럽 특허원 제95221 A호에 예시된 균주가 사용될 수 있다.

본 발명의 플라스미드는 본 발명의 유전자가 플라스미드내에 함유되는 한 판토에아, 에르위니아 및 엔테로박터 세균에 고유한 거대 플라스미드의 일부 및 거대 플라스미드 자체 또는 이의 일부 및 또 다른 DNA 서열을 포함한다. 거대 플라스미드의 일부만이 사용되는 경우, 플라스미드의 자발적 복제에 필수적인 영역이 포함되어야만 한다. 플라스미드의 자발적 복제에 필수적인 영역(복제 조절 영역) 일부 또는 전체 영역, 예를 들어, 복제 오리진 및 복제에 필요한 유전자를 포함하는 영역 이외의 일부 또는 전체 영역이 제거되어 당해 제거에 의해 보다 작아진다 해도 당해 플라스미드는 숙주 미생물에서 자발적으로 복제할 수 있다. 따라서, 벡터로서 사용하기가 바람직하다. 추가로, 약제 내성 유전자와 같은 마커 유전자가 본 발명의 플라스미드로 혼입되는 경우, 형질전환체에서 마커 유전자의 표현형을 사용하여 형질전환체를 검출하기가 용이해진다. 숙주에 사용될 수 있는 당해 마커 유전자의 예는 클로람페니콜 내성 유전자, 가나마이신 내성 유전자, 스트렙토마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 에리트로마이신 내성 유전자, 앰피실린 내성 유전자, 스펙티노마이신 내성 유전자등을 포함한다.

항생제 내성 유전자에 대하여, 단지 상기된 거대 플라스미드의 복제에 필요한 영역만을 분리하고 항생제 내성 유전자에 연결시키거나 항생제 내성 유전자를 당해 복제에 관여하지 않는 거대 플라스미드 부분으로 전달할 수 있다. 당해 플라스미드로 항생제 내성 유전자를 도입하기 위한 방법으로서, 문헌[참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기재된 방법등이 사용될 수 있다. 당해 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 소위 "레드-구동 통합"으로 호칭되는 다센코(Datsenko) 및 와너(Wanner)에 의해 개발된 일본쇄 DNA를 사용하는 방법[문헌참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, pp.6640-6645] 및 일본 공개 공보 제2-109985호 에 기재된 바와 같이 항생제 내성 유전자를 트랜스포존에 도입하고 트랜스포존을 전달하는 방법이 사용될 수 있다.

거대 플라스미드의 예인 pEA320이 도 1 내지 5에 나타낸 제한 효소 맵을 특징으로 하지만 자발적 복제 능력이 영향받지 않는 한 본 발명의 플라스미드는 이들 제한 효소 맵을 가질 필요가 없고 임의의 제한 효소 절단 부위가 결실될 수 있다. 추가로, pEA320에 존재하지 않는 제한 효소 절단 부위는 본 발명의 플라스미드로 도입될 수 있다.

상기된 바와 같은 당해 플라스미드는 통상적으로 공지된 클로닝 벡터 및 발현 벡터의 등의 제조에서와 동일한 방식으로 제조될 수 있다. 변형된 플라스미드를 제조하기 위해, 거대 플라스미드의 뉴클레오타이드 서열을 측정하는 것이 바람직하다. 뉴클레오타이드 서열은 디데옥시 방법과 같은 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다.

목적하는 유전자를 본 발명의 플라스미드 또는 이의 유도체에 삽입하기 위해, 이것을 플라스미드의 제한 효소 부위 또는 이의 유도체로 삽입하는 것이 편리하다.

선택된 제한 효소 부위는 플라스미드에서 유일해야만 하고 상응하는 제한 효소에 의해 절단되어야만 한다. 목적하는 유전자를 삽입하기 위해, 목적하는 유전자의 공급원으로서 작용하는 플라스미드 및 게놈 DNA가 당해 제한 효소에 의해 부분적으로 또는 완전히 분해되어, 예를 들어, 동일한 제한 효소에 적합한 상응하는 점성 말단이 생성되고 이들은 적당한 조건하에서 연결될 수 있다. 또한, 이들은 평활 말단으로 연결될 수 있다.

DNA의 분해 및 연결, 형질전환등 및 당업자에게 널리 공지된 일반적인 방법들을 사용하여 플라스미드 DNA를 제조할 수 있다. 당해 방법들은 문헌[참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]등에 기재되어 있다. 거대 플라스미드를 추출하기 위해, 문헌[참조: J. Bacteriol, Mar. 1981, Vol. 145, No. 3, pp.1365-1373]에 기재된 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 플라스미드는 또한 본 발명의 플라스미드를 함유하는 미생물로부터 접합 전달에 의해 또 다른 미생물로 전달될 수 있다.

플라스미드의 접합 전달은 일반적으로 엔테로박테리아세애 미생물의 형질전환에 적용되는 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, oriT, tra 유전자 및 mob 유전자를 갖거나 이들을 함유하도록 변형된 플라스미드를 함유하는 공여체 미생물이 제조된다. 이어서 플라스미드는 수용체 미생물에 전달된다. 추가로, 플라스미드가 oriT를 갖지만 tra 및/또는 mob 유전자를 함유하지 않는 경우, 이것은 당해 유전자들을 함유하는 헬퍼 플라스미드의 사용을 통해, 공여체 미생물로부터 수용체 미생물로 전달될 수 있다. 즉, tra 유전자 및/또는 mob 유전자를 갖는 헬퍼 플라스미드는 공여체 미생물이 별도로 함유할 수 있고 당해 미생물은 oriT 플라스미드로 형질전환된다[문헌참조: J. Bacteriol., Aug. 1995; 177 (15):4350-5]. oriT는 전달 오리진이다. Mob 단백질은 oriT에서 닉 생성 뉴클레아제이다. Tra 단백질은 oriT에서 닉을 사용함에 의해 DNA를 또 다른 세포로 접합적으로 전달하는 단백질이다.

이후부터, 본 발명의 플라스미드를 사용한 엔테로박테리아세애 미생물의 형질전환 방법이 예시된다. 판토에아, 에르위니아 또는 엔테로박터 세균에 고유한 본 발명의 플라스미드는 전형적으로 극히 거대하고(예를 들어, pEA320은 약 320kb의 크기를 갖는다), 따라서 이를 또 다른 미생물로 전달하기 위해 접합 전달 방법을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 천연적으로 본 발명의 플라스미드를 함유하는 판토에아, 에르위니아 또는 엔테로박터 세균은 본원에서 소위 공여체 균주로 호칭되고 본 발명의 플라스미드로 형질전환되는 엔테로박테리아세애 세균은 편의상 수용체 균주로 호칭된다.

접합 전달은 바람직하게 본 발명의 플라스미드 및 접합 전달을 촉진시킬 수 있는 헬퍼 플라스미드를 사용하여 수행될 수 있다. 변형이 필요하거나 필요하지 않더라도 이렇게 함에 의해, 본 발명의 플라스미드의 변형이 최소화될 수 있다. 헬퍼 플라스미드는 바람직하게 mob 유전자 및 tra 유전자를 함유하고 당해 유전자 둘다는 접합 전달을 위해 필요하다. 구체적으로, pRK2013[제조원(CLONTECH and Biomedal)으로부터 시판됨) 또는 이의 유도체가 헬퍼 플라스미드[문헌참조: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76:1648-1652, 1979, the sequence can be obtained from NCCB Plasmids database]로서 바람직하다. 추가로, 본 발명의 플라스미드는 바람직하게 수용체 균주에 본래 존재하지 않는 마커 유전자를 함유하여 수용체 균주로 전달되는 경우 우성적 선별을 가능하게 한다. 마커 유전자는 상기된 바와 같다.

본 발명의 플라스미드가 마커 유전자를 갖지 않는 경우, 상동성 재조합과 같은 통상적인 방법에 의해 삽입될 수 있다. 이후부터, 항생제 내성 유전자를 본 발명의 플라스미드로 삽입시키는 것이 예시될 수 있다. 삽입 위치는 플라스미드의 복제 및 안정성에 영향을 주지 않는 한 임의의 부위에 위치할 수 있지만, 구체적으로 아세토인/부탄디올 생합성 유전자들, 즉, bud 오페론에 인접한 영역이 사용될 수 있다. 먼저, 돌연변이된 bud 유전자는 널리 공지된 중첩 신장 PCR 방법을 사용하여 증폭되고 클로닝될 수 있다. 당해 방법은 주형으로서 공여체 균주 기원의 염색체 DNA를 사용하고 돌연변이를 갖고 목적하는 영역에 상보적인 프라이머를 사용한다[문헌참조: Urban, A., Neukirchen, S. and Jaeger, K.E., A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-step overlap extension PCR, Nucleic Acids Res., 25, 2227-8, 1997]. 클로닝된 돌연변이형 bud 오페론은 pUT399(pUT-△bud)에 혼입하고 λ-pir를 갖는 S17-1λpir 균주[제조원(Biomedal)으로부터 시판됨, R. Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY, NOVEMBER 1983, 784-791 (1983)]를 당해 플라스미드로 형질전환시킨다. pUT399는 R6K 복제 오리진, 클로람페니콜 내성 유전자 및 접합 전달에 필요한 mob 영역을 갖는다. pUT399 플라스미드는 pir 유전자를 갖지않는 균주에서는 복제할 수 없다. 접합 전달은 수득한 균주와 공여체 균주간에 수행되어 공여체 균주의 pEA320으로 혼입된 플라스미드(pUT-△bud)를 갖는 균주를 생성시킨다.

이후부터, 상기 언급된 헬퍼 플라스미드와 항생제 내성 유전자를 사용한 접합 전달이 예시될 것이다. Tn5::Tet 유전자를 함유하는 pRK-Tet 플라스미드는 플라스미드 pRK2013의 Tn5내에 테트라사이클린 내성 유전자를 삽입시킴에 의해 수득되었다. 플라스미드 pRK2013은 접합 전달에 요구되는 tra 유전자를 갖는다. 당해 방법은 에피센터의 트랜스포소믹스^TM &EZ::TN^TM을 사용하여 성취하였다. pRK-Tet의 공여체 균주로의 접합 전달을 수행한다. pRK-Tet는 pRK-Tet로 형질전환된 이. 콜리 균주로부터 공여체 균주로 전달된다. 이어서, pRK-Tet를 함유하는 당해 공여체 균주 및 엔테로박테리아세애 세균(수용체 균주)가 접합되고 클로람페니콜 내성을 기초로 선별을 수행하여 본 발명의 플라스미드를 갖는 수용체 균주를 수득한다.

<2> 본 발명의 플라스미드를 사용하는 방법

(2-1) 벡터로서의 사용

목적하는 유전자가 본 발명의 플라스미드의 임의의 위치에 삽입되고 숙주 미생물이 통상적인 방식으로 수득된 재조합 플라스미드로 형질전환되는 경우, 목적하는 유전자가 숙주 미생물에서 발현할 수 있다. 추가로, 또 다른 숙주에서 복제를 위해 요구되는 영역을 삽입하여 셔틀 벡터를 제조할 수 있다.

숙주 미생물은 이것이 엔테로박테리아세애 세균 과에 속하고 유용한 물질을 생산할 수 있는 한, 임의의 미생물일 수 있다. 유용한 물질은 미생물에 의해 생산될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 이의 예는 예를 들어, 단백질, 아미노산, 핵산, 비타민, 사카라이드, 유기산, 지질등을 포함한다. 추가로, 목적하는 유전자는 바람직하게 상기 언급된 유용한 물질과 관련되어 있고 예를 들어, 단백질과 같은 유용한 물질을 암호화하는 유전자, 아미노산, 핵산, 비타민, 사카라이드, 유기산, 지질등의 생합성 시스템에 관여하는 유전자를 포함한다.

L-아미노산의 예는 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, L-글라이신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-타이로신 및 L-발린을 포함하고 따라서 숙주 미생물의 예는 에스케리치아 콜리 및 판토에아 아나나티스와 같은 L-아미노산 생산 엔테로박테리아세애 세균을 포함한다[유럽 특허원 제1078989 A호, 미국 특허 제6,331,419호].

예를 들어, L-글루탐산 생산 세균은 하기의 미생물을 포함한다:

판토에아 아나나티스 AJ13601(FERM BP-7207)

클렙시엘라 플란티콜라 AJ13410(FERM BP-6617)

판토에아 아나나티스 AJ13355(FERM BP-6614)

에르위니아 헤르비콜라 IAM1595/RSFCPG(미국 특허 제6,197,559호 참조)

클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399/RSFCPG(미국 특허 제6,197,559호 참조)

세라티아 리쿠에파시엔스 ATCC14460/RSFCPG(미국 특허 제6,331,419호 참조)

에스케리치아 콜리 AJ12628(일본 특허 공개공보 제H05-244970호)

에스케리치아 콜리 AJ12624(일본 특허 공개공보 제H05-244970호)

판토에아 아나나티스 AJ13601 균주는 국제 특허 유기체 기탁기관[National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan) (former National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry]에 1999년 8월 18일자로 기탁되었고 기탁번호 FERM P-17516을 부여받았다. 이어서, 기탁물은 2000년 7월 6일자로 부다페스트 조약하에 국제 기탁물로 이관되었고 기탁번호 FERM BP-7207을 부여받았다. 판토에아 아나나티스 AJ13355 및 AJ13356 균주는 국제 유기체 기탁 기관[National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan) (former National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry]에 1998년 2월 19일자로 기탁되었고 각각 기탁번호 FERM P-16644 및 FERM P-16645를 부여받았다. 이어서, 기탁물은 1999년 1월 11일자로 부다페스트 조약하에 국제 기탁물로 이관되었고 각각 기탁번호 FERM BP-6614 및 FERM BP-6615를 부여받았다.

유기산의 예는 D-글루콘산, 2-케토-D-글루콘산, 2,5-디케토-D-글루콘산 및 숙신산을 포함하고 숙주 미생물의 예는 판토에아, 에르위니아, 엔테로박터(국제 공개 공보 제WO98/59504, WO02/12468등) 및 에스케리치아 세균(WO99/06532등)(미국 특허 제6,448,061호)을 포함한다. 추가로, 비타민 또는 비타민 전구체의 예는 카로티노이드, 판토텐산 및 아스코르브산을 포함하고 이의 숙주 미생물의 예는 판토에아 및 에스케리치아 세균을 포함한다(국제 공개 공보 제WO02/072855).

추가로, 벡터로서 본 발명의 플라스미드를 사용하기 위해, 다중-클로닝 제한 절단 부위가 도입되어 목적하는 유전자의 삽입을 촉진시킬 수 있거나 목적하는 유전자의 업스트림 부위의 강력한 프로모터 및 목적하는 유전자의 다운스트림 부위의 강력한 터미네이터가 도입될 수 있다. 추가로, 본 발명의 플라스미드는 또한 단백질의 친화성 정제를 위해 적당한 부위에서 태그를 함유하는 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서 사용될 수 있다.

유용한 물질은 본 발명의 플라스미드를 사용하여, 유용한 물질을 생산할 수 있는 엔테로박테리아세애 미생물을 형질전환시키고 배지 또는 미생물에서 유용한 물질을 생산할 수 있도록 하는 조건하에서 당해 미생물을 배양하고 배지 또는 미생물로부터 유용한 물질을 수거함에 의해 수득될 수 있다.

미생물의 발효에 의해 유용한 물질의 생산에 통상적으로 사용되는 배지가 사용될 수 있다. 즉, 경우에 따라 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 기타 유기 성분을 함유하는 통상적인 배지가 사용될 수 있다. 탄소원으로서, 글루코스, 슈크로스, 락토스, 갈락토스, 프럭토스 및 전분의 가수분해물과 같은 사카라이드, 글리세롤 및 소르비톨과 같은 알콜 및 푸마르산, 시트르산 및 숙신산과 같은 유기산이 사용될 수 있다. 질소원으로서, 황산암모늄, 염화암모늄 및 인산암모늄과 같은 무기 암모늄 염, 대두 가수분해물과 같은 유기 질소, 암모니아 기체 및 수성 암모니아가 사용될 수 있다. 유기 미량 영양물로서, 비타민 B₁ 및 L-라이신 또는 효모 추출물등과 같은 적당한 양의 요구되는 물질을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다, 이들외에, 인산칼륨, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온등이 요구되는 바와 같이 소량으로 첨가된다. 추가로, 본 발명에 사용되는 배지는 요구되는 바와 같이 탄소원, 질소원, 무기이온 및 기타 미량의 유기 성분을 함유하는 한 천연 또는 합성 배지일 수 있다.

배양은 호기적 조건하에서 1 내지 7일동안 수행한다. 배양 온도는 보통 24 내지 37℃이고 배양 동안의 pH는 보통 5 내지 9이다. pH 조절을 위해, 무기 또는 유기의 산성 또는 암모니아 가스와 같은 알칼린 물질이 사용될 수 있다. 유용한 물질이 미생물로부터 생산되고 분비되는 경우, 세포와 같은 침전물은 배양 완료 후 배양물로부터 제거됨에 이어서 유용한 물질은 이온 교환, 침전 및 기타 방법과 같은 공지된 방법을 조합하여 분리되거나 정제될 수 있다. 추가로, 유용한 물질이 미생물내에 축적되는 경우, 예를 들어, 세포는 초음파등에 의해 분쇄할 수 있고 유용한 물질은 이온 교환 수지 방법등에 의해, 원심분리 후 상등액으로부터 수거될 수 있다.

추가로, 본 발명의 플라스미드 또는 이의 유도체는 또한 벡터로서 사용하여 엔테로박테리아세애 미생물의 목적하는 유전자를 파괴할 수 있다. 예를 들어, 당해 돌연변이는 플라스미드가 저온 배양에서 복제할 수 있지만 고온에서는 복제할 수 없고 상동성 재조합이 돌연변이 유전자의 DNA 단편과 엔테로박테리아세애 미생물의 염색체상에서 존재하여 상동성 서열을 갖는 유전자 사이에서 유도되도록 서열번호 2의 아미노산 서열로 도입될 수 있다. 이러한 조작으로 당해 DNA 단편이 염색체로 혼입된 엔테로박테리아세애 미생물을 수득한다. 본 발명의 플라스미드가 온도 민감성이 되도록 하기 위해, DNA를 하이드록실아민으로 처리하여 저온에서는 자발적으로 복제할 수 있도록 하지만 고온에서는 복제할 수 없도록 하는 돌연변이를 갖는 플라스미드를 수득한다[문헌참조: 미국 특허 제6,303,383호].

(2-2) 산 내성의 부여

판토에아, 에르위니아 또는 엔테로박터 세균에 고유한 본 발명의 플라스미드는 미생물의 산 내성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 플라스미드는 또한 벡터로서의 상기된 용도 이외에 미생물의 산 내성 증가 효과를 파괴하지 않도록 변형되는 이상, 미생물의 산 내성을 증가시키는데 적합하다.

본 발명에서, "산 내성 증가"는 본 발명의 플라스미드를 함유하는 미생물이 호기적 조건하에서 배양되는 경우, 본 발명의 플라스미드를 함유하지 않는 모 균주와 비교하여 증식율이 개선되거나 증식을 위한 최적의 pH가 저하된 것을 의미한다. 모균주의 예는 야생형 균주, 예를 들어, 에스케리치아 콜리 MG1655 균주등을 포함한다. 이 경우에, 배지의 pH는 6 이하, 바람직하게는 5.5 이하, 보다 바람직하게는 4.9이하이다. 본 발명의 플라스미드에 의한 형질전환에도 증식이 가능하다면 pH의 하한치는 제한되지 않지만 예를 들어, pH는 3이상이다.

당해 증식과 모균주의 증식을 비교하는 방법의 예는, 모균주와 본 발명의 균주가 배양된 배양 배지의 흡광도를 580 내지 660nm에서 측정하고 흡광도를 비교하는 단계를 포함한다.

추가로, 본 발명의 플라스미드를 사용하여 상기된 바와 같은 산 내성을 부여하는 경우, 이는 벡터로서 동시에 사용될 수 있다. 즉, 목적하는 유전자를 함유하는 본 발명의 플라스미드를 함유하는 균주가 사용되는 경우, 호기적 조건하에서 균주의 증식은 개선되고 유용한 물질의 생산성이 또한 개선될 수 있다.

이후부터 본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 참조로 추가로 설명될 것이다.

실시예 1

pEA320은 매우 거대(약 320kb)하고 따라서 사이클릭 DNA로서 분리하고 균주의 형질전환에 사용하기가 어렵다. 추가로, 당해 플라스미드상에는 우성 선별을 가능하게 하는 약제 내성 유전자 또는 마커가 존재하지 않기때문에, 우성 선별을 가능하게 하는 마커 유전자를 도입할 필요가 있다. 따라서, pUT399는 상동성 재조합을 유발하도록 작제되었고 결과로서, 당해 균주는 클로람페니콜을 사용하여 선별될 수 있다[문헌참조: 미국 특허원 제20040180404호].

pUT399는 하기와 같이 작제하였다. 주형으로서 pUT-소형Tn5-Cm(Biomedal로부터 구입 가능)을 사용하고 프라이머로서 P7(서열번호 9) 및 P8(서열번호 10)을 사용하는 PCR을 수행하여 R6K의 복제 오리진 및 RP4의 mob 유전자를 증폭시킨다. 추가로, pHSG399(TaKaRa)가 주형으로서 사용되고 P9(서열번호 11) 및 P10(서열번호 12)이 프라이머로서 사용되는 경우, 클로람페니콜 내성 유전자 및 다중 클로닝 부위를 함유하는 영역이 증폭된다. 이들을 각각 제한 효소 BglII로 처리하고 이어서 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시킨다.

pUT399는 R6K의 복제 오리진 및 접합 전달을 위해 요구되는 mob 영역을 함유한다. 추가로, pUT399는 pir 유전자가 결핍된 균주에서는 복제할 수 없다. 따라서, pUT399상의 pEA320에 존재하는 서열을 함유하는 플라스미드를 작제하고 접합에 의해 이를 사용하여 피. 아나나티스를 형질전환시키고 클로람페니콜을 사용한 선별을 수행함에 의해, 상동성 영역에서 재조합이 유발되고 따라서 pUT399가 pEA320으로 도입된 플라스미드를 함유하는 피. 아나나티스 균주가 수득될 수 있다.

특정 과정은 하기에 기재된 바와 같다. pEA320의 분리는 플라스미드의 매우 거대한 크기(320kb)때문에 통상적인 알칼리-SDS 방법으로는 어렵지만, 통상적인 방식에서 염색체 분리동안에 염색체와 함께 수거될 수 있다. 본 실험에서, budAB 오페론의 유전자는 pEA320상의 유전자로서 선택된다. budA의 약 370bp 다운스트림 및 budB 유전자의 약 500bp 업스트림을 제거하기 위해, 프라이머 P1(서열번호 3) 및 P2(서열번호 4), 또는 P3(서열번호 5) 및 P4(서열번호 6)을 합성하고 주형으로서 AJ13355 균주(FERM BP-6614)의 염색체를 사용하여 제1 PCR을 수행하였다. 이어서, 약 2.3kb의 단편은 주형으로 상기된 PCR 생성물을 사용하고 프라이머 P5(서열번호 7) 및 P6(서열번호 8)을 사용하여 중첩 신장 PCR에 의해 증폭시켰다. 이어서, 수득된 증폭된 단편을 pCR2.1(Invitrogen)에 혼입시키고 당해 플라스미드를 EcoRI로 처리하여 EcoRI 부위를 갖는 삽입 단편을 수득하였다. 최종적으로, 당해 단편을, EcoRI로 처리되고 S17-1λpir 균주(Biomedal에서 구입 가능, Simon., R., et al., BIO/TECHNOLOGY, NOVEMBER 1983, 784-791 (1983))를 형질전환시키는데 사용된 pUT399에 혼입하였다.

수득된 균주, S17-1λpir/pUT-△bud 균주 및 피. 아나나티스 NP106 균주를 접합시켜 NP106/pEA320-bud::Cm 균주를 수득하였고, 여기서, pUT-△bud는 상동성 재조합에 의해 pEA320상의 유전자 영역으로 혼입하였다. 피. 아나나티스 NP106 균주는 판토에아 아나나티스 AJ13601 균주(FERM BP-7207 균주)로부터 고유 플라스미드 RSFCPG 및 pSTVCB를 제거하여 수득한다. 당해 작제에서, 전장의 pUT399 뿐만 아니라 전장 budAB 유전자 및 붕괴된 유형의 budAB 유전자를 pEA320에 혼입하였다. 이어서, pRK-Tet 플라스미드를 갖는 이. 콜리 DH5α균주(TaKaRa Bio에 의해 생성됨)는 공여체 균주로서 사용하고 pRK-Tet 플라스미드는 접합에 의해 NP106/pEA320-bud::Cm 균주로 전달하였다. pRK-Tet 플라스미드는 Tn5::Tet 유전자를 접합 전달을 위해 요구되는 tra 유전자를 갖는 pRK2013(Biomedal)로 도입함에 의해 작제하였 다. 당해 작제는 에피센터의 트랜스포소믹스^TM&EZ::TN^TM을 사용함에 의해 수행하였다. 이어서, NP106/pEA320-bud::Cm, pRK-Tet 균주 및 MG1655 균주를 접합시키고 25mg/L의 클로람페니콜을 함유하는 M9 글루코스 한천 배지상에서 선별함에 의해, 전달된 pEA320을 함유하는 MG1655, pEA320-bud::Cm 균주를 수득하였다.

실시예 2

<호기적 조건하에서 pEA320을 함유하는 이. 콜리의 증식>

호기적 조건하에서 pEA320을 함유하는 이. 콜리 MG1655 균주의 증식을 조사하였다.

구체적으로, 야생형 균주 MG1655 및 pEA320-형질전환된 균주, MG1655/pEA320-bud::Cm을 L 배지(1L 정제수(pH 7.0)중의 10g의 박토트립톤, 5g의 효모 추출물, 5g의 NaCl 및 15g의 한천)중에서 별도로 전배양하고, 여기서, pEA320 형질전환된 균주 배양물에는 25mg/l의 클로람페니콜이 보충되었다. 이어서 당해 세포를 멸균수로 2회 세척하고 30g/l의 글루탐산 및 5g/l의 글루코스를 함유하고 수성 암모니아로 pH가 7.0 또는 4.5로 조정되고 밀도가 OD 660nm에서 0.05인 M9 최소 배지(1L의 정제수중에 2mM의 황산 마그네슘, 3g의 인산일칼륨, 0.5g의 염화나트륨, 1g의 염화암모늄 및 6g의 인산이나트륨)에 접종하였다. 배지의 OD는 시간 경과에 따라 측정하였다. 배양 및 OD 측정을 위해, ADVANTEC에 의해 생성된 TN1506을 사용하였다.

도 6에 보여지는 바와 같이, pH 7.0에서는 증식이 거의 차이가 없는 반면, pH 4.5에서의 증식은 현저하게 개선되었다. 즉, pEA320은 산 내성을 부여한다.

이어서, 보다 상세하게 당해 현상을 분석하기 위해, 소형 발효기를 사용한 pH 통제 조건하에서의 배양을 수행하였다. 야생형 균주 MG1655, pEA320-형질전환된 균주 및 MG1655/pEA320-bud::Cm을 각각 L 배지(정제수 1L(pH 7.0) 중 10g의 박토 트립톤, 5g의 효모 추출물, 5g의 NaCl 및 15g의 한천)중에 전배양하고, 이때, pEA320-형질전환된 균주 배양물에는 25mg/l의 클로람페니콜이 보충되었다. 각각에 대해 한 플레이트상의 세포들을 소형 발효기에 하기와 같이 충전된 하기에 나타낸 조성을 갖는 300ml의 배지에 접종하였다. 37℃ 및 pH 4.9 또는 4.7에서 1/1 vvm의 통기 및 34℃에서 5% 이상의 산소 농도에서 배양을 수행하고 당해 조건은 교반에 의해 통제되며 pH는 배양 동안에 암모니아 가스를 주입하여 4.9 및 4.7로 조정하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, pEA320을 함유하는 MG1655는 pH 4.7 및 4.9에서도 증식할 수 있고 MG1655는 이들 pH에서 증식할 수 없다. 따라서, pEA320에 의한 형질전환이 산 내성을 개선시킴을 확인시켜주었다.

본 발명에 따라, 엔테로박테리아세애 미생물을 개량하는데 유용한 신규 플라스미드가 제공된다. 본 발명의 플라스미드는 엔테로박테리아세애 미생물의 개량 및 유용한 물질을 생산하기 위해 사용될 수 있고 호기적 조건하에서 미생물의 증식을 개선시킬 수 있다.

본 발명은 예시된 이의 양태를 참조로 상세히 기재되었지만, 당업자에게는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양하게 변형되고 등가물이 사용될 수 있음은 자명할 것이다. 상기된 서류 각각은 전체 내용이 본원에 참조로서 인용되었다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Novel Plasmid Autonomously Replicable in Enterobacteriaceae Family <130> C460-C5055 <150> JP 2005-051163 <151> 2005-02-25 <160> 12 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 930 <212> DNA <213> Pantoea ananatis <220> <221> CDS <222> (1)..(927) <400> 1 atg gca gat aaa gat agt gaa aac aaa gcg tta cta gag cct ttt ctg 48 Met Ala Asp Lys Asp Ser Glu Asn Lys Ala Leu Leu Glu Pro Phe Leu 1 5 10 15 tct gtg acc aaa aac agt ggt gaa gtt att cag ctt cat ccc aac aaa 96 Ser Val Thr Lys Asn Ser Gly Glu Val Ile Gln Leu His Pro Asn Lys 20 25 30 aat aat acc gtt cag ccc gtg gcc tta atg cgt ctg gga ctc ttt gtt 144 Asn Asn Thr Val Gln Pro Val Ala Leu Met Arg Leu Gly Leu Phe Val 35 40 45 ccc acg ctt aaa tcc aca gcg cgg ggc att tct ggt gct atg gct tca 192 Pro Thr Leu Lys Ser Thr Ala Arg Gly Ile Ser Gly Ala Met Ala Ser 50 55 60 acc gat gcc acc aaa gag ctt aaa aac ctc tct ctg gtt aaa gcg gaa 240 Thr Asp Ala Thr Lys Glu Leu Lys Asn Leu Ser Leu Val Lys Ala Glu 65 70 75 80 ggt tat gaa aag att acc atc acc ggt gcc aga ctg gat atg gat aat 288 Gly Tyr Glu Lys Ile Thr Ile Thr Gly Ala Arg Leu Asp Met Asp Asn 85 90 95 gac ttt aag acc tgg gcc ggt att att cag tct ttt tcc cgt tac cct 336 Asp Phe Lys Thr Trp Ala Gly Ile Ile Gln Ser Phe Ser Arg Tyr Pro 100 105 110 aca cag ggt gat acg gta acc ctg cct ttt att gat ttc gtg aag atg 384 Thr Gln Gly Asp Thr Val Thr Leu Pro Phe Ile Asp Phe Val Lys Met 115 120 125 tgc ggt att ccc tcc gcc aac tcc tct gcc gca ttg cgt aag cga ctc 432 Cys Gly Ile Pro Ser Ala Asn Ser Ser Ala Ala Leu Arg Lys Arg Leu 130 135 140 gac gct tcg tta cgc cgt att gcg acg aac act ctc tct ttt gaa ggt 480 Asp Ala Ser Leu Arg Arg Ile Ala Thr Asn Thr Leu Ser Phe Glu Gly 145 150 155 160 aac ggt aag gcc tat cat acg cat ctg gta cag tca gct tat tac gat 528 Asn Gly Lys Ala Tyr His Thr His Leu Val Gln Ser Ala Tyr Tyr Asp 165 170 175 cgt gaa aaa gac att gtc cgc ata cag gct gat ccc aag ctc ttt gag 576 Arg Glu Lys Asp Ile Val Arg Ile Gln Ala Asp Pro Lys Leu Phe Glu 180 185 190 ctg 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Phe Glu 180 185 190 Leu Tyr Asn Phe Asp His Lys Val Leu Leu Gln Leu Arg Ala Ile Ser 195 200 205 Arg Leu Lys Arg Lys Glu Ser Ala Gln Ala Leu Tyr Thr Phe Leu Glu 210 215 220 Ser Leu Pro Thr Asn Pro Ala Pro Ile Ser Leu Ala Arg Leu Arg Met 225 230 235 240 Arg Leu Asn Leu Gly Ser Lys Ile Thr Thr Gln Asn His Val Val Arg 245 250 255 Arg Ala Met Glu Gln Leu Lys Glu Ile Gly Tyr Leu Asp Tyr Ser Glu 260 265 270 Val Lys Arg Gly Arg Ser Val Phe Phe Ile Ile His Ser Arg Thr Pro 275 280 285 Lys Leu Asp Gly Ile Ser Asn Leu Glu Gly Ile Asp Thr Leu Asp Asp 290 295 300 Ile Asp Phe Glu Asp 305 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 3 gcgcgcaaac aggcaactga caataagctc 30 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 4 cggctgatca acgatatcct gtgggtgcac aaaactggtt gtcggagg 48 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 5 ccacaggata tcgttgatca gcc 23 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> 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Claims

판토에아(Pantoea) 세균, 에르위니아(Erwinia) 세균 및 엔테로박터(Enterobacter) 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 미생물로부터 분리되고, 서열번호 2의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 Rep 단백질을 암호화하는 유전자.
엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 세균에서 자발적으로 복제할 수 있는, 제1항에 따른 유전자를 포함하는 플라스미드.
제2항에 있어서, 마커 유전자를 추가로 포함하는 플라스미드.
제2항에 있어서, 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) FERM BP-7207, BP-6614 및 BP-6615로 이루어진 그룹으로부터 선택된 판토에아 세균 기원이고 약 320kb인 플라스미드.
제2항에 있어서, pEA320이고 도 1, 2, 3, 4 및 5에 나타낸 것들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제한 효소 맵을 갖는 플라스미드.
판토에아 세균, 에르위니아 세균 및 엔테로박터 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 미생물로부터 분리되고, 서열번호 2의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 Rep 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 엔테로박테리아세애 미생물.
제6항에 있어서, 플라스미드가 판토에아 아나나티스 FERM BP-7207, BP-6614 및 BP-6615로 이루어진 그룹으로부터 선택된 판토에아 세균 기원이고 약 320kb인 미생물.
제6항에 있어서, 플라스미드가 pEA320이고 도 1, 2, 3, 4 및 5에 나타낸 것들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제한 효소 맵을 갖는 미생물.
제6항에 있어서, 플라스미드가 마커 유전자를 포함하고 엔테로박테리아세애 미생물에서 자발적으로 복제할 수 있는 미생물.
제6항에 있어서, 엔테로박테리아세애 미생물이 에스케리치아 세균, 판토에아 세균, 엔테로박터 세균, 에르위니아 세균, 클렙시엘라(Klebsiella) 세균, 세라티아(Serratia) 세균, 살모넬라(Salmonella) 세균 및 모르가넬라(Morganella) 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 미생물.
제6항에 있어서, 유용한 물질을 생산할 수 있는 미생물.
제11항에 따른 미생물을 배지에서 배양하고 당해 배지 또는 미생물로부터 유용한 물질을 수거함을 포함하는, 유용한 물질의 생산 방법.
제12항에 있어서, 유용한 물질이 L-아미노산인 방법.
제4항에 따른 플라스미드로 엔테로박테리아세애 미생물을 형질전환시킴을 포함하는, 산 내성이 개선된 미생물을 제조하는 방법.
제14항에 있어서, 산 내성이 개선된 미생물이 플라스미드를 함유하지 않는 균주와 비교하여 pH 3 내지 5에서 증식이 개선된 방법.