CN115175993B - 柠檬酸合酶活性减弱的新型修饰多肽及使用其生产l-氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及柠檬酸合酶活性减弱的修饰多肽、包括所述修饰多肽的生产亮氨酸的微生物、以及使用所述微生物生产L‑氨基酸的方法。
Description
技术领域
本公开涉及柠檬酸合酶活性减弱的新型修饰多肽、包括所述修饰多肽的微生物以及使用所述微生物生产L-氨基酸的方法。
背景技术
棒状杆菌(Corynebacterium)属微生物，具体是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，是广泛用于生产L-氨基酸和其它有用物质的革兰氏阳性微生物。对于L-氨基酸和其它有用物质的生产，正在进行各种研究以开发高效生产的微生物和发酵过程技术。例如，主要使用目标物质特异性方法，例如增加编码参与L-赖氨酸生物合成的酶的基因的表达或去除生物合成不必要的基因(US 8048650 B2)。
同时，在L-氨基酸中，L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸和L-甘氨酸是天冬氨酸衍生的氨基酸，而草酰乙酸(即，天冬氨酸的前体)的生物合成水平可以影响这些L-氨基酸的生物合成水平。
柠檬酸合酶(CS)是通过催化微生物过程中产生的乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合而产生柠檬酸的酶，并且其也是决定进入TCA途径的碳流(carbon-flow)的重要酶。
先前在文献中报道了由于缺失编码柠檬酸合酶的gltA基因而导致L-赖氨酸生产菌株的表型改变(Ooyen et al.,Biotechnol.Bioeng.,109(8):2070-2081,2012)。然而，这些缺失gltA基因的菌株的缺点在于，不仅其生长受到抑制，而且糖消耗速率显著降低，从而导致每单位时间赖氨酸产量低。因此，仍然需要能够考虑到L-氨基酸生产能力和菌株生长这两方面的有效提高的研究。
发明内容
技术问题
本发明人确认了当使用柠檬酸合酶活性减弱到一定水平的新型修饰多肽时，所产生的L-氨基酸的量增加，从而完成本公开。
解决方案
本公开的一个目的是提供具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽，其中对应于从由SEQID NO:1的氨基酸序列组成的多肽的N-末端起第312位的氨基酸被另一种氨基酸取代。
本公开的另一个目的是提供编码所述修饰多肽的多核苷酸。
本公开的又另一个目的是提供包括所述多核苷酸的载体。
本公开的又另一个目的是提供生产L-氨基酸的微生物，其包括所述修饰多肽、编码所述修饰多肽的多核苷酸、或包含所述多核苷酸的载体。
本公开的又另一个目的是提供生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养微生物，所述微生物包括所述修饰多肽、编码所述修饰多肽的多核苷酸、或包含所述多核苷酸的载体。
有利效果
当培养柠檬酸合酶对底物的活性被修饰的生产L-氨基酸的棒状杆菌属微生物时，与具有现有未修饰多肽的微生物相比，能够高产率生产L-氨基酸。
具体实施方式
以下详细描述了本公开。同时，本文公开的各个描述和实施方式也可分别适用于其它描述和实施方式。即，本公开中所公开的各种要素的所有组合均落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受以下具体描述的限制。
本公开的一个方面可以提供具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽，其中对应于从由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽的N-末端起第312位的氨基酸被另一种氨基酸取代。
在本公开中，SEQ ID NO:1的氨基酸序列可指代具有柠檬酸合酶活性的氨基酸序列，并且具体地可以指代具有由gltA基因编码的柠檬酸合酶活性的蛋白质序列。SEQ IDNO:1的氨基酸序列可从已知数据库NCBI的GenBank获得。例如，SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以衍生自谷氨酸棒状杆菌，但不限于此，并且可以不限制地包括与包括上述氨基酸序列的蛋白质具有相同活性的蛋白质的任意氨基酸序列。此外，本公开的具有柠檬酸合酶活性的蛋白质可以是包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，并且其中可以包括由于在该SEQID NO的氨基酸序列的上游或下游添加无意义序列而可能发生的突变、天然发生的突变、或沉默突变，并且对于本领域技术人员而言显而易见的是，与包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质具有相同或相应活性的任意蛋白质都可以落入本公开的具有柠檬酸合酶活性的蛋白质之内。在具体实例中，本公开的具有柠檬酸合酶活性的蛋白质可以是包括SEQ IDNO:1的氨基酸序列的蛋白质或是由与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％或更高同源性或同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。此外，显然，具有氨基酸序列——其中部分氨基酸序列缺失、修饰、取代、或添加——的任意蛋白质也可以落入本公开所靶向修饰的蛋白质的范围内，只要该蛋白质具有这样的同源性或同一性并且表现出与上述蛋白质的效果对应的效果即可。
如本文所用，术语“柠檬酸合酶(CS)”指代通过催化微生物糖酵解期间产生的乙酰辅酶A与草酰乙酸的缩合而产生柠檬酸的酶，并且其是决定进入TCA途径的碳流的重要酶。具体地，柠檬酸合酶作为用于合成柠檬酸的酶在TCA循环的第一步中起到调节速率的作用。另外，柠檬酸合酶催化来自乙酰辅酶A的二碳乙酸残基与4-碳草酰乙酸酯分子的缩合反应以形成6-碳乙酸酯。在本公开中，柠檬酸合酶可与“用于合成柠檬酸的酶”、“CS”、“gltA蛋白质”或“gltA”互换使用。
如本文所用，术语“变体”指代具有至少一个通过保守取代和/或修饰而与所叙述的序列不同，使得蛋白质的功能或性质得以维持的氨基酸序列的多肽。修饰多肽不同于通过取代、缺失、或添加几个氨基酸而鉴定的序列。此类变体总体上可通过修饰上述多肽序列中的一个并通过评价修饰多肽的性质来鉴定。也就是说，变体的能力可相对于天然蛋白质增强、不变、或减弱。此类变体总体上可通过修饰上述多肽序列中的一个并通过评价修饰多肽的反应性来鉴定。此外，一些变体可包括其中一个或多个部分如N-末端前导序列或跨膜结构域被去除的那些变体。其它变体可包括其中一部分从成熟蛋白质的N-和/或C-末端去除的那些变体。
如本文所用，术语“保守取代”指代氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代。例如，变体可具有至少一个保守取代，同时维持至少一种生物活性。这种氨基酸取代可总体上基于残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性、和/或两亲性的相似性来进行。例如，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；以及疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸和色氨酸。总体上，保守取代对所生产的多肽的活性影响很小或没有影响。
另外，变体还可以包括对多肽的性质和二级结构具有最小影响的氨基酸的缺失或添加。例如，多肽可与蛋白质N-末端的信号(或前导)序列缀合，该信号(或前导)序列参与共翻译地或翻译后地蛋白质转移。此外，多肽还可与另一个序列或连接体缀合以鉴定、纯化、或合成该多肽。
如本文所用，“具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽”指代与野生型相比，通过取代具有柠檬酸合酶活性的多肽的部分氨基酸序列而柠檬酸合酶活性减弱的多肽。在本公开中，其可以指代可通过修饰具有柠檬酸合酶活性的多肽的氨基酸序列中的至少一个氨基酸而有效建立碳流平衡的修饰多肽，因此其活性与野生型相比是减弱的。
具体地，在具有柠檬酸合酶活性的各种蛋白质中，修饰多肽可以是对应于SEQ IDNO:1的氨基酸序列中第312位的氨基酸被另一种氨基酸取代的修饰多肽。“另一种氨基酸”可以指代取代前的不同氨基酸，并且其可以是不包括取代前的氨基酸的任意氨基酸。
更具体地，在具有柠檬酸合酶活性的各种蛋白质中，修饰多肽可以是对应于SEQID NO:1的氨基酸序列中第312位的甲硫氨酸被另一种氨基酸取代的修饰多肽。甲硫氨酸可以被选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸的任一种或多种氨基酸取代，更具体地，其可以是被异亮氨酸取代的修饰序列，但不限于此。
另外，取代的氨基酸残基中不仅可以包括天然氨基酸，还可以包括非天然氨基酸。非天然氨基酸可以是例如D-氨基酸、同型氨基酸、β-同型氨基酸、N-甲基氨基酸、α-甲基氨基酸、不常见的氨基酸(例如，瓜氨酸、萘基丙氨酸等)，但不限于此。同时，在本公开中，当描述为“具体的氨基酸被取代”时，显然，除取代前的氨基酸之外的氨基酸已被取代，尽管并未说明另一种氨基酸已被取代。
如本文所用，“对应于”指代在蛋白质或肽中所叙述的位置处的氨基酸残基，或与该蛋白质或肽中所叙述的残基相似、相同或同源的氨基酸残基。如本文所用，“对应区域”总体上指代相关蛋白质或参考蛋白质中的相似位置。
在本公开中，可以采用本文所用多肽中氨基酸残基位置的具体编号。例如，可以通过将本公开的多肽序列与待比较的目标多肽进行比对，将本公开的多肽的氨基酸残基位置重新编号为对应位置。
本公开提供的具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽与在通过取代上述柠檬酸合酶中具体位置的氨基酸的修饰前的多肽相比，可以具有提高的L-氨基酸生产能力。
修饰多肽可以与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80％或更高且小于100％的序列同源性，但不限于此。具体地，本公开的修饰多肽可以与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。此外，显然，除第312位的氨基酸序列外，具有氨基酸序列——其中该氨基酸序列的部分缺失、修饰、取代、或添加——的任意蛋白质也落入本公开的范围内，只要该蛋白质具有这样的同源性并表现出与上述蛋白质的效果对应的效果即可。
另外，在本公开中，尽管描述为“具有具体SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但显然，部分氨基酸序列具有缺失、修饰、取代、或添加的任何蛋白质也都可用于本公开中，只要与由相应SEQID NO的氨基酸序列组成的多肽具有基本上相同或等同的活性即可。例如，在蛋白质或多肽具有与所述修饰多肽相同或等同的活性的情况下，除了在第312位的修饰——其带来一定的活性——之外，不排除还有其中可因相应SEQ ID NO的氨基酸序列的上游或下游的无意义序列添加而导致的突变、天然发生的突变、或沉默突变，并且显然，具有这种序列添加或突变的蛋白质或多肽也属于本公开的范围。
对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第312位的氨基酸被另一种氨基酸取代的修饰多肽可以包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列。更具体地，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第312位的甲硫氨酸被异亮氨酸取代的修饰多肽可以由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。另外，修饰多肽可以包括与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有80％或更高且小于100％的同源性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，本公开的修饰多肽可以包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性的多肽。此外，显然，除第312位的氨基酸序列外，具有氨基酸序列——其中该氨基酸序列的部分缺失、修饰、取代、或添加——的任意蛋白质也可用于本公开中，只要该蛋白质具有这样的同源性并包括表现出与上述蛋白质的效果对应的效果即可。
在出于本公开的目的包括柠檬酸合酶活性减弱的修饰多肽的微生物的情况下，其特征在于与对照相比L-氨基酸的产率提高，同时具有相似的糖消耗速率。因此，其可以理解为生产的L-氨基酸的量可通过控制柠檬酸合酶的活性达到进入TCA途径的碳流与用作L-氨基酸生物合成前体的草酰乙酸的供应量之间的适当平衡来增加。
如本文所用，术语“同源性”指代两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分数。其也可以指代与给定氨基酸序列或核苷酸序列的对应程度，并且可以表示为百分比。在本说明书中，具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列的活性相同或相似的活性的同源序列可以用“％同源性”表示。可以通过本领域已知的技术确定从一个部分到另一个部分的序列之间的同源性。例如，可以利用用于计算诸如评分、同一性和相似性的参数的标准软件，具体是BLAST 2.0，或通过在所定义的严格条件下通过DNA杂交实验比较序列来确认同源性。所定义的适当的杂交条件在本领域的相应技术内，并且可以通过本领域技术人员公知的方法确定(例如，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。
本公开的另一方面可以提供编码具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽的多核苷酸，其中对应于从由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽的N-末端起第312位的氨基酸被另一种氨基酸取代。
SEQ ID NO:1的氨基酸序列、柠檬酸合酶和修饰多肽如上所述。
如本文所用，术语“多核苷酸”——通过共价键连接成长链的核苷酸单体组成的核苷酸的多聚物——是具有至少一定长度的DNA或RNA链，并且更具体地可以指代编码变体的多核苷酸片段。
本公开的多核苷酸可以不限制地包括任意多核苷酸序列，其编码本公开的具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽。在本公开中，编码柠檬酸合酶的氨基酸序列的基因可以是gltA基因，并且该基因可以衍生自谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。另外，该基因可以是编码SEQID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列，并且更具体地，其可以是包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列的序列，但不限于此。
具体地，由于密码子简并性或考虑到待表达多肽的生物体中优选的密码子，本公开的多核苷酸可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内在编码区中经历各种修饰。具体地，可以不限制地包括编码修饰多肽的任意多核苷酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第312位的氨基酸被另一种氨基酸取代。例如，本公开的修饰多肽可以是编码SEQID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸序列，但不限于此。更具体地，本公开的修饰多肽可以是由SEQ ID NO:4的多核苷酸序列组成的修饰多肽，但不限于此。
另外，可以不限制地包括可由已知基因序列制备的探针，例如，在严格条件下可以与和全部或部分核苷酸序列互补的序列杂交以编码具有柠檬酸合酶活性的蛋白质的任意序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第312位的氨基酸被另一种氨基酸取代。术语“严格条件”指代允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这种条件在文献中被具体描述(例如，J.Sambrook et al.,同上)。例如，严格条件可以包括具有40％或更高，具体地90％或更高、更具体地95％或更高、再更具体地97％或更高、再又更具体地99％或更高的高同源性或同一性的基因彼此杂交，而同源性或同一性低于上述同源性或同一性的基因不彼此杂交的条件，或DNA杂交的常规洗涤条件(即在60℃,1×SSC,0.1％SDS，具体地60℃,0.1×SSC,0.1％SDS，以及更具体地68℃,0.1×SSC,0.1％SDS的相应盐浓度和温度下洗涤一次，具体地两次或三次)。
尽管碱基之间可能错配——取决于杂交的严格性，但杂交要求两个核酸含有互补序列。术语“互补”用于描述可以彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开可以包括与整个序列互补的分离的核酸片段以及与其基本上相似的核酸序列。
具体地，具有同源性或同一性的多核苷酸可以利用杂交条件来检测，包括在上述条件下，在55℃的Tm值下的杂交步骤。此外，Tm值可以为60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域普通技术人员根据目的适当地调节。
多核苷酸杂交的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且这些变量是本领域公知的(参见Sambrook et al.,同上,9.50-9.51,11.7-11.8)。
本公开的又一方面可以提供载体，其包括编码具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽的多核苷酸，其中对应于从由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽的N-末端起第312位的氨基酸被另一种氨基酸取代。
SEQ ID NO:1的氨基酸序列、柠檬酸合酶、修饰多肽和多核苷酸如上所述。
如本文所用，术语“载体”指代DNA产物，其含有编码目标多肽的多核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列与适当的调控序列可操作地连接以在适当的宿主中表达目标多肽。调控序列可以包括能够启动转录的启动子、用于调控这种转录的任何操纵子序列、编码适当mRNA核糖体结合位点的序列以及调控转录和翻译终止的序列。在载体被转化到适当的宿主细胞后，其可以独立于宿主基因组进行复制或发挥作用，并且可被整合到基因组本身中。
本公开中使用的载体没有特别限制，可以使用本领域已知的任何载体。常规使用的载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可以用作噬菌体载体或粘粒载体；基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些可以用作质粒载体。具体地，可以使用pCR2.1、pDC、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。
可在本公开中使用的载体没有特别限制，且可使用任何已知的表达载体。另外，可利用用于细胞内染色体插入的载体将编码目标多肽的多核苷酸插入到染色体中。多核苷酸在染色体中的插入可通过本领域已知的任何方法(例如，同源重组)进行，但方法不限于此。此外，载体可进一步包括选择标记以确认插入到染色体中。选择标记用于选择转化了载体的细胞，也就是说，用于确认目标核酸分子是否已被插入。可使用提供可选择表型如抗药性、营养缺陷(auxotrophy)、细胞毒剂抗性、或表面蛋白表达的标记。在用选择剂处理的情况下，只有表达选择标记的细胞可存活或表达其它表型性状，因此可选择出转化的细胞。
如本文所用，术语“转化”指代包括编码目标蛋白质的多核苷酸的载体引入宿主细胞中，使得由该多核苷酸编码的蛋白质能够在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸能够在宿主细胞中表达，那么转化后的多核苷酸是被整合到宿主细胞的染色体中并定位在其中还是在染色体外定位则是无关紧要的，并且可以包括这两种情况。
此外，多核苷酸可以包括编码目标蛋白质的DNA和RNA。
多核苷酸可以以任何形式被引入，只要其可以被引入宿主细胞中并在其中表达即可。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式被引入宿主细胞中，表达盒是包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。表达盒通常可以包括与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止子、核糖体结合位点、或翻译终止子。表达盒可以是可自复制的表达载体的形式。另外，多核苷酸可以被原样引入宿主细胞中并被可操作地连接至宿主细胞中表达所需的序列，但不限于此。转化方法包括将多核苷酸引入细胞的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞选择本领域已知的适当的标准技术来进行。例如，方法可以包括电穿孔、钙磷酸盐(Ca(H2PO4)2、CaHPO4或Ca3(PO4)2)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、微注射、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、乙酸锂-DMSO法等，但不限于此。
另外，如本文所用，术语“可操作地连接”可意为多核苷酸序列在功能上与启动和介导编码本公开的目标蛋白质的多核苷酸的转录的启动子序列连接。可操作的连接可以利用本领域已知的基因重组技术制备，并且位点特异性DNA切割和连接可以利用本领域已知的用于切割和连接的酶等制备，但可操作的连接不限于此。
本公开的又一方面可以提供生产L-氨基酸的微生物，其包括：具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽，其中对应于从由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽的N-末端起第312位的氨基酸被另一种氨基酸取代；编码所述修饰多肽的多核苷酸；和包括所述多核苷酸的载体。
SEQ ID NO:1的氨基酸序列、柠檬酸合酶、修饰多肽、核苷酸、和载体如上所述。
微生物可以是包括编码修饰多肽的多核苷酸的微生物，或者是转化有包括编码修饰多肽的多核苷酸的载体的微生物，但不限于此。
另外，所述微生物与包括野生型多肽的微生物相比可具有提高的L-氨基酸生产能力，而不抑制微生物的生长或糖消耗速率。因此，可以从这些微生物中以高产率获得L-氨基酸。
如本文所用，术语“包括修饰多肽的微生物”指代天然具有弱L-氨基酸生产能力的微生物，或在不具有L-氨基酸生产能力的亲本菌株中提供了L-氨基酸生产能力的微生物。具体地，微生物是表达修饰多肽的微生物，所述修饰多肽在具有柠檬酸合酶活性的多肽中包括至少一种氨基酸修饰，并且所述氨基酸修饰可以包括对应于从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N-末端起第312位的氨基酸被另一种氨基酸取代。由所述微生物表达的具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽可以具有减弱的活性，但不限于此。
微生物可以是包括编码修饰多肽的多核苷酸，或转化有包括编码修饰多肽的多核苷酸的载体而使得修饰多肽能够表达的细胞或微生物。出于本公开的目的，可以使用任何宿主细胞或微生物，只要其能够通过包括修饰多肽来生产L-氨基酸即可。
如本文所用，术语“生产L-氨基酸的微生物”包括所有天然或人工遗传修饰的微生物，并且其可以是具体机制由于外源基因的插入或内源基因活性的增强或减弱而增强或减弱的微生物，并且为了生产L-氨基酸，其可以是已发生遗传修饰或活性被减弱的微生物。出于本公开的目的，生产L-氨基酸的微生物可以指代包括了修饰多肽而使得其与野生型或未修饰微生物相比能够从培养基中的碳源生产过量的所期望的L-氨基酸的微生物。在本公开中，“生产L-氨基酸的微生物”可以与“具有L-氨基酸生产能力的微生物”或“L-氨基酸生产微生物”互换使用。
生产L-氨基酸的微生物所生产的L-氨基酸可以是选自亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和o-乙酰高丝氨酸中的任一种或多种，但不限于此。
生产L-氨基酸的微生物的具体实例可以包括埃希氏菌(Escherichia)属、沙雷氏菌(Serratia)属、欧文氏菌(Erwinia)属、肠杆菌(Enterobacteria)属、沙门氏菌(Salmonella)属、链霉菌(Streptomyces)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒状杆菌属等的微生物菌株，并且具体是棒状杆菌属微生物，以及更具体地是谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。
具体地，生产L-氨基酸的微生物可以是通过将异丙基马来酸合酶(isopropylmaleate synthase)[leuA_(R558H,G561D)]的变体引入棒状杆菌属微生物中而具有L-亮氨酸生产能力的CJL-8100菌株、通过将三种突变[pyc(P458S)、hom(V59A)、lysC(T311I)]引入棒状杆菌属微生物中而具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌CJ3P(Binder et al.,GenomeBiology2012,13:R40)、生产缬氨酸的菌株棒状杆菌KCCM11201P(US 8465962 B2)、生产L-异亮氨酸的菌株棒状杆菌KCCM11248P(韩国专利号10-1335789)、或这样的谷氨酸棒状杆菌：其通过在棒状杆菌属微生物中缺失编码胱硫醚γ-合酶——其为O-乙酰高丝氨酸降解途径——的metB基因和编码O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶的metY基因，并通过引入编码天冬氨酸激酶的lysC基因的突变(L377K)(US 10662450 B2)释放对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制来增加O-乙酰高丝氨酸的生物合成而具有O-乙酰高丝氨酸生产能力，但不限于此。出于本公开的目的，生产L-氨基酸的微生物可进一步包括修饰多肽以提高所期望的L-氨基酸的生产能力。
如本文所用，“棒状杆菌属微生物”可以具体地是谷氨酸棒状杆菌、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)等，但不一定限于此。更具体地，本公开的棒状杆菌属微生物可以是谷氨酸棒状杆菌，其中虽然与未修饰微生物相比柠檬酸合酶活性减弱，但L-氨基酸的产率提高同时具有相似的糖消耗速率。
本公开的又一方面可以提供生产L-氨基酸的方法，其包括：
在培养基中培养微生物，所述微生物包括：具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽，其中对应于从由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽的N-末端起第312位的氨基酸被另一种氨基酸取代；编码所述修饰多肽的多核苷酸；或包括所述多核苷酸的载体。
SEQ ID NO:1的氨基酸序列、柠檬酸合酶、修饰多肽、多核苷酸、载体和微生物如上所述。
所述方法可容易由本领域技术人员在优化培养条件和酶活性条件下确定。具体地，微生物可通过已知的分批培养、连续培养、补料分批培养等培养，但不特别限于此。具体地，培养条件不受特别限制，但pH(例如，pH 5至pH 9，具体地pH 6至pH 8，最具体地pH6.8)可用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)适当地调节。可通过向培养物添加氧气或含氧气体混合物来维持有氧条件。培养温度可维持在20℃至45℃，且具体地在25℃至40℃，并且培养可进行约10至160小时，但培养条件不限于此。通过培养产生的L-氨基酸可分泌到培养基中或可仍在细胞内。
另外，在使用的培养基中，可单独使用或组合使用碳源如糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油、和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸、和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、和有机酸(例如，乙酸)，但不限于此；可单独使用或组合使用氮源如含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉、和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、和硝酸铵)，但不限于此；以及可单独使用或组合使用磷源如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，或其相应的含钠盐，但不限于此。另外，培养基中可含有其它必需的生长刺激物质，包括金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、和维生素，但必需的生长刺激物质不限于此。
所述方法可进一步包括在培养步骤之后从培养基或微生物回收L-氨基酸的步骤，但不限于此。
在回收培养步骤中生产的L-氨基酸的方法中，可以根据培养方法，利用本领域已知的适当方法从培养溶液收集所期望的氨基酸。例如，可利用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可利用本领域已知的适当方法从培养基或微生物回收所期望的L-氨基酸。
此外，回收步骤可包括纯化过程，并且纯化过程可利用本领域已知的适当方法进行。因此，被回收的L-氨基酸可以是纯化形式或含有L-氨基酸的微生物发酵液。
生产L的-氨基酸可以是选自亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和o-乙酰高丝氨酸中的任一种或多种，但不限于此。
本公开的又一方面可以提供用于生产L-氨基酸的组合物，其包括含有具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽的棒状杆菌属微生物或其培养物。
微生物可以是棒状杆菌属微生物，或者具体是谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。微生物如上所述。
用于生产L-氨基酸的组合物可意为能够通过本公开的具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽生产L-氨基酸的组合物。组合物可以不限制地包括具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽或能够操作具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽的配置。具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽可以是包括在载体中的形式，从而在引入的宿主细胞中表达可操作地连接的基因。
组合物可以进一步包括冷冻保护剂或赋形剂。冷冻保护剂或赋形剂可以是非天然存在的物质或天然存在的物质，但不限于此。在另一实施方式中，冷冻保护剂或赋形剂可以是不与微生物天然接触的物质，或不与微生物同时天然含有的物质，但不限于此。
本公开的又一方面可以提供包括具有柠檬酸合酶活性的修饰多肽的棒状杆菌属微生物用于生产L-氨基酸的用途。
实施例
在下文中，将通过实施例详细描述本公开。然而，这些实施例仅用于示例目的，而不旨在限制本公开的范围。
实施例1：gltA突变的发现
1-1.包括gltA的载体的构建
为了构建具有柠檬酸合酶活性的gltA突变文库，首先构建含有部分gltA的重组载体。野生型gltA的氨基酸序列和核苷酸序列分别与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相同。用野生型谷氨酸棒状杆菌菌株的染色体DNA为模板，连同SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物进行PCR，并用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)将扩增产物克隆到大肠埃希氏菌(E.coli)载体pCR2.1中以获得pCR-gltA。
1-2.gltA突变文库的构建
基于实施例1-1构建的载体构建gltA突变文库。用易错PCR试剂盒(clontechPCR随机突变方式试剂盒)构建文库。在可能发生突变的条件下，用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6作为引物进行PCR反应。具体地，在每1,000bp发生0至3个突变的条件下，通过如下进行PCR：在94℃下预热30秒，随后进行25个循环的94℃下变性30秒和68℃下聚合1分30秒。由此获得的PCR产物被用作大引物(megaprimer)(500ng至125ng)，其经历25个循环的95℃下变性50秒，60℃下退火50秒，和68℃下聚合12分钟，用DpnI处理，并转化到大肠埃希氏菌DH5α中，并在含有卡那霉素(25mg/L)的固体LB培养基上涂布转化的大肠埃希氏菌DH5α。选择20种转化菌落并对从中获得的质粒进行多核苷酸序列分析。结果，证实了突变以2个突变/kb的频率引入到彼此不同的位点中。结果，收集约20,000个大肠埃希氏菌转化菌落，并从中提取质粒并命名为pTOPO-gltA文库。
该实施例中使用的引物显示在下表1中。
[表1]
实施例2：构建文库的评估和变体的选择
通过电穿孔将实施例1-2中构建的pTOPO-gltA文库转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中，然后在含有25mg/L卡那霉素的营养培养基上涂布以获得插入突变基因的10,000个菌株的菌落，并将每个菌落从ATCC13032/pTOPO_gltA(mt)1至ATCC13032/pTOPO_gltA(mt)10000分别命名。
通过下列方式对每个菌落进行发酵滴度评估，以在以上获得的10,000个菌落中鉴定出亮氨酸产量增加的菌落。
-生产培养基：葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浆固体(CornSteep Solids)5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺3,000μg、CaCO3 30g(基于1L蒸馏水)，pH 7.0
使用铂环将各菌落接种到在25mL高压灭菌生产培养基中含有25μg/mL卡那霉素的250mL角挡烧瓶(corner-baffle flask)中，并在30℃下以200rpm摇动培养60h。在培养完成后，通过利用高效液相色谱法(HPLC,SHIMAZDU LC20A)的方法测量生产的亮氨酸的量，以选择出与野生型谷氨酸棒状杆菌菌株相比亮氨酸生产能力提高最大的一个菌株。所选菌株中生产的亮氨酸的浓度显示在下表2中。
[表2]
| 菌株 | 亮氨酸(g/L) |
| ATCC13032 | 0.87 |
| ATCC13032/ptopO_gltA(mt)3142 | 1.54 |
接下来，为了证实突变菌株的基因突变，基于ATCC13032/pTOPO_gltA(mt)3142菌株，用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物进行PCR，随后测序以比较gltA基因与野生型ATCC13032。结果，证实了上述菌株在gltA基因中含有突变。
具体地，证实了ATCC13032/pTOPO_gltA(mt)3142菌株中的gltA基因第936位核苷酸G被C取代。这是gltA的氨基酸序列中第312位的甲硫氨酸被异亮氨酸取代的突变。因此，在以下实施例中，试图证实该突变是否对棒状杆菌属微生物中生产的亮氨酸的量有影响。
实施例3：gltA选择突变的亮氨酸生产能力的证实
3-1.含有gltA突变的插入载体的构建
为了将实施例2中选择的突变引入菌株中，试图构建插入载体。利用定点诱变法构建用于引入gltA(M312I)突变的载体。用野生型谷氨酸棒状杆菌菌株的染色体DNA作为模板，连同SEQ ID NO:9和10的引物对和SEQ ID NO:11和12的引物对进行PCR。通过如下进行PCR：94℃下变性5分钟，随后30个循环的94℃下变性30秒，55℃退火30秒，和72℃下聚合1分30秒，然后72℃下聚合5分钟。结果，构建了pDC载体——其中所得的基因片段用SmaI限制酶切割，和pDC-gltA(M312I)载体——其中通过用In-Fusion酶连接和克隆DNA片段末端处15个核苷酸的同源序列，第312位氨基酸甲硫氨酸被异亮氨酸取代。
3-2.将变体引入ATCC13032中及其评估
将实施例3-1中构建的pDC-gltA(M312I)载体转化到ATCC13032中，并在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入到染色体上的菌株。将所选的原代菌株再次进行二次交换(secondary crossover)，并选择引入目标基因突变的菌株。通过用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物进行PCR，然后分析碱基序列，从而证实突变被引入菌株中，证实gltA基因突变引入到了最终转化的菌株中。构建的菌株被命名为ATCC13032_gltA_M312I。
为了评估以上构建的ATCC13032_gltA_M312I菌株的亮氨酸生产能力，还进行了烧瓶发酵滴度评估。将作为亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和以上构建的ATCC13032_gltA_M312I中的每一个用一个铂环接种到含有25mL实施例2的生产培养基的250mL角挡烧瓶中，并在30℃下以200rpm摇动培养60h以生产亮氨酸。在培养完成后，通过HPLC测量生产的亮氨酸的量。每个测试菌株在培养基中的亮氨酸的浓度显示在下表3中。
[表3]
| 菌株名称 | 亮氨酸(g/L) |
| ATCC13032 | 0.87 |
| ATCC13032_gltA_M312I | 1.25 |
实施例4：生产亮氨酸的菌株中gltA选择突变的亮氨酸生产能力的证实
尽管棒状杆菌属野生型菌株生产亮氨酸，但仅生产非常微量的亮氨酸。因此，构建衍生自ATCC13032的生产亮氨酸的菌株，并进行实验以证实引入所选突变带来的亮氨酸生产能力。具体实验如下。
4-1.生产亮氨酸的菌株CJL-8100的构建
为了构建衍生自ATCC13032的生产高浓度亮氨酸的菌株，构建了引入异丙基苹果酸合酶(下文称为“IPMS”)变体的CJL-8100菌株。突变包括编码IPMS的leuA基因第1,673位核苷酸G被A取代，使得IPMS蛋白的第558位氨基酸精氨酸被组氨酸取代的突变，以及第1,682位和第1,683位核苷酸GC被AT取代，使得第561位氨基酸甘氨酸被天冬氨酸取代的突变。
将含有leuA突变的pDC-leuA(R558H,G561D)载体转化到ATCC13032中，并在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入到染色体上的菌株。将所选的原代菌株再次进行二次交换，并选择引入leuA基因突变的菌株。通过用SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物进行PCR，然后分析碱基序列，从而证实突变被引入，证实突变引入到了最终转化的菌株中。转化pDC-leuA(R558H,G561D)载体的ATCC13032_leuA_(R558H,G561D)菌株被命名为CJL-8100。
4-2.将gltA变体引入CJL-8100菌株中及其评估
用实施例3-1中构建的pDC-gltA(M312I)载体转化生产亮氨酸的菌株CJL-8100，并在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入到染色体上的菌株。将所选的原代菌株再次进行二次交换，并选择引入目标基因突变的菌株。通过用SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8的引物进行PCR，然后分析碱基序列，从而证实gltA突变被引入菌株中，证实gltA基因引入到了最终转化的菌株中。构建的CJL8100_gltA_M312I被命名为CA13-8104，并于2019年12月20日根据布达佩斯条约保藏在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms)(KCCM)，登录号为KCCM 12649P。
评估以上构建的CA13-8104菌株的亮氨酸生产能力。以与实施例2相同的方式进行烧瓶培养，并在培养完成后，通过利用HPLC的方法测量生产的亮氨酸的量，并将培养结果显示在下表4中。
[表4]
| 菌株名称 | 亮氨酸(g/L) |
| ATCC13032 | 0.87 |
| ATCC13032_leuA_(R558H,G561D):CJL-8100 | 2.7 |
| CJL8100_gltA_M312I:CA13-8104 | 3.0 |
如表4所示，证实了与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032相比，生产亮氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌CJL8100显著提高了亮氨酸生产能力。此外，证实了与亲本菌株CJL8100相比，向谷氨酸棒状杆菌CJL8100菌株中引入gltA M312I突变的CJL8104菌株——生产亮氨酸的菌株——将亮氨酸生产能力提高10％。
另外，通过电穿孔，用实施例1-2中构建的pTOPO-gltA文库中的pTOPO-gltA(mt)3142转化生产亮氨酸的菌株CJL-8100，然后在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择转化了载体的菌株。所选的菌株被命名为CJL8100/pTOPO_gltA(mt)3142。
评估以上构建的CJL8100/pTOPO_gltA(mt)3142菌株的亮氨酸生产能力。以与实施例2相同的方式进行烧瓶培养，并在培养完成后，通过利用HPLC的方法测量生产的亮氨酸的量，并将培养结果显示在下表5中。
[表5]
| 菌株名称 | 亮氨酸(g/L) |
| CJL8100 | 2.6 |
| CJL8100/ptopO_gltA(mt)3142 | 2.8 |
通过以上实施例的结果，可以证实柠檬酸合酶gltA的氨基酸序列中第312位的氨基酸是gltA酶活性的重要位置。
实施例5：引入gltA突变体株(M312I)的CJ3P菌株的构建和分析生产的赖氨酸量
为了证实甚至在属于生产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌的菌株中是否也存在改变柠檬酸合酶活性的效果，以与实施例3相同的方式，基于通过将三种突变[pyc(P458S)、hom(V59A)、lysC(T311I)]引入野生菌株中而具有L-赖氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌CJ3P(Binder et al.,Genome Biology 2012,13:R40)来构建引入gltA(M312I)突变的菌株。由此构建的菌株被命名为CJ3P::gltA(M312I)。通过下列方法测量作为对照组的CJ3P菌株和CJ3P::gltA(M312I)的所生产的赖氨酸的量。首先，将各菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL角挡烧瓶中，并在30℃下以200rpm摇动培养20h。然后，将1mL种子培养溶液接种到含有24mL生产培养基的250mL角挡烧瓶中，并在32℃下以200rpm摇动培养72h。以下显示了种子培养基和生产培养基的组成。在培养完成后，利用HPLC(Waters 2478)测量L-赖氨酸的浓度，并将结果显示在表6中。
<种子培养基(pH 7.0)>
葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺2,000μg(基于1L蒸馏水)
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浆固体5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺3,000μg、CaCO3 30g(基于1L蒸馏水)
[表6]
如表6所示，与亲本菌株相比，向谷氨酸棒状杆菌CJ3P中引入gltA(M312I)突变的CJ3P::gltA(M312I)菌株——生产赖氨酸的菌株——将生产的赖氨酸的量提高127％。
实施例6：生产缬氨酸的菌株中gltA选择突变的缬氨酸生产能力的证实
为了证实所选突变是否对缬氨酸——跟亮氨酸一样属于代表性支链氨基酸——具有影响，通过将所选突变引入棒状杆菌属生产缬氨酸的菌株KCCM11201P(US 8465962B2)中，进行证实缬氨酸生产能力的实验。
用实施例3-1中构建的pDC-gltA(M312I)载体转化KCCM11201P，并在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入染色体上的菌株。将所选的原代菌株再次进行二次交换，并选择引入目标基因突变的菌株。通过用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物进行PCR，然后分析碱基序列，从而证实gltA突变被引入菌株中，证实gltA基因突变引入到了最终转化的菌株中。将由此构建的菌株命名为KCCM11201P-gltA(M312I)。
评估以上构建的KCCM11201P-gltA(M312I)菌株的缬氨酸生产能力。以与实施例2-2相同的方式进行烧瓶培养，并在培养完成后，通过利用HPLC的方法测量生产的缬氨酸的量，并将培养结果显示在下表7中。
[表7]
| 菌株名称 | 缬氨酸(g/L) |
| KCCM11201P-gltA(M312I) | 2.6 |
| KCCM11201P-gltA(M312I) | 2.8 |
如表7所示，证实了与亲本菌株KCCM11201P相比，向谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P菌株引入gltA M312I突变的KCCM11201P-gltA(M312I)菌株——生产缬氨酸的菌株——将缬氨酸生产能力提高7％。
通过以上结果，可以证实柠檬酸合酶gltA的氨基酸序列中第312位的氨基酸是gltA酶活性的重要位置。
实施例7：生产异亮氨酸的菌株中gltA选择突变的L-异亮氨酸生产能力的证实
7-1.生产L-异亮氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11248P中引入gltA(M312I)ORF突变的L-异亮氨酸菌株的构建及其L-异亮氨酸生产能力的评估
以与实施例4中相同的方式，通过对染色体同源重组来制备菌株——其中实施例3-1中构建的重组质粒pDC-gltA(M312I)被引入生产L-异亮氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11248P(韩国专利号10-1335789)，并命名为KCCM11248P::gltA(M312I)。以下列方式培养由此构建的菌株以比较异亮氨酸生产能力。
将各菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL角挡烧瓶中，并在30℃下以200rpm摇动培养20h。然后，将1mL种子培养溶液接种到含有24mL生产培养基的250mL角挡烧瓶中，并在30℃下以200rpm摇动培养48h。以下显示了种子培养基和生产培养基的组成。
<种子培养基(pH 7.0)>
葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺2,000μg(基于1L蒸馏水)
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖50g、(NH4)2SO4 12.5g、大豆蛋白2.5g、玉米浆固体5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺3,000μg、CaCO3 30g(基于1L蒸馏水)
在培养完成后，通过HPLC测量L-异亮氨酸生产能力。各测试菌株在培养溶液中的L-异亮氨酸的浓度显示在下表8中。
[表8]
如表8所示，证实了与生产L-异亮氨酸的菌株KCCM11248P相比，引入gltA(M312I)突变的KCCM11248P::gltA(M312I)中L-异亮氨酸的浓度增加约36％。基于该结果，证实了通过gltA(M312I)基因的突变可以提高L-异亮氨酸生产能力。
以上结果表明，在棒状杆菌属生产L-异亮氨酸的菌株中引入gltA(M312I)突变对于L-异亮氨酸的生产是有效的。
7-2.谷氨酸棒状杆菌野生型菌株ATCC13032中引入gltA(M312I)ORF突变的L-异亮氨酸菌株的构建及其L-异亮氨酸生产能力的评估
为了证实引入gltA(M312I)突变对L-异亮氨酸生产能力的影响，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(下文称WT)菌株构建引入lysC(L377K)变体(韩国专利号10-2011994)和hom(R407H)变体的菌株，并将ilvA(V323A)突变(Appl.Enviro.Microbiol.,Dec.1995,p.4315-4320)引入编码已知苏氨酸脱水酶(L-苏氨酸脱水酶)的基因中，以比较L-异亮氨酸生产能力。
用WT染色体DNA作为模板，连同SEQ ID NO:15和16或SEQ ID NO:17和18的引物进行PCR。所用引物的序列显示在下表9中。
[表9]
| SEQ ID NO: | 名称 | 序列(5'→3') |
| 15 | lysC上F | tcctctagaGCTGCGCAGTGTTGAATACG |
| 16 | lysC上R | TGGAAATCttTTCGATGTTCACGTTGACAT |
| 17 | lysC下F | ACATCGAAaaGATTTCCACCTCTGAGATTC |
| 18 | lysC下R | gactctagaGTTCACCTCAGAGACGATTA |
在如下PCR条件下进行PCR：95℃下变性5分钟，随后30个循环的95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下聚合30秒，然后72℃下聚合7分钟。结果，围绕lysC基因的突变获得了5’上区域的509bp DNA片段和3’下区域的520bp DNA片段。
用这两个扩增的DNA片段作为模板，连同SEQ ID NO:15和18的引物，通过95℃下变性5分钟，随后30个循环的95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下聚合60秒，然后72℃下聚合7分钟来进行PCR。结果，扩增了含有编码天冬氨酸激酶变体的lysC基因的突变的1,011bp DNA片段，其中第377位亮氨酸被赖氨酸取代。
用限制酶XbaI处理不能在谷氨酸棒状杆菌中复制的pDZ载体(韩国专利号0924065)和该1,011bp DNA片段，用DNA连接酶连接，然后克隆以获得质粒，其被命名为pDZ-lysC(L377K)。
通过电脉冲法将以上获得的pDZ-lysC(L377K)载体引入WT菌株中(Appl.Microbiol.Biothcenol.(1999,52:541-545))，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中获得转化的菌株。通过二次交换，获得WT::lysC(L377K)——一种通过DNA片段插入染色体上将核苷酸突变引入到lysC基因中的菌株。用SEQ ID NO:15和18的引物通过PCR，随后测序，并将序列与野生型lysC基因的序列进行比较，最终证实了引入核苷酸突变的基因。
另外，为了构建引入hom(R407H)的载体，用WT基因组DNA作为模板，连同SEQ IDNO:19和20和SEQ ID NO:21和22的引物进行PCR。所用引物的序列显示在下表10中。
[表10]
| SEQ ID NO: | 名称 | 序列(5'→3') |
| 19 | Hom上F | tcctctagaCTGGTCGCCTGATGTTCTAC |
| 20 | Hom上R | CACGATCAGATGTGCATCATCAT |
| 21 | Hom下F | ATGATGATGCACATCTGATCGTG |
| 22 | Hom下R | gactctagaTTAGTCCCTTTCGAGGCGGA |
在如下PCR条件下进行PCR：95℃下变性5分钟，随后30个循环的95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下聚合30秒，然后72℃下聚合7分钟。结果，围绕hom基因突变获得了5’上区域的220bp DNA片段和3’下区域的220bp DNA片段。用这两个扩增的DNA片段作为模板，用SEQ ID NO:5和8的引物进行PCR。在如下PCR扩增条件下进行PCR：95℃下变性5分钟，随后30个循环的95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下聚合30秒，然后72℃下聚合7分钟。结果，扩增了含有hom基因突变的440bp DNA片段。
将以上使用的pDZ载体和该440bp DNA片段用限制酶XbaI处理，用DNA连接酶连接，然后克隆以获得质粒，其被命名为pDZ-hom(R407H)。
通过电脉冲法将以上获得的pDZ-hom(R407H)载体引入WT::lysC(L377K)菌株中，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中获得转化的菌株。通过二次交换，获得WT::lysC(L377K)-hom(R407H)——一种通过DNA片段插入染色体上将核苷酸突变引入hom基因中的菌株。
以与以上实施例相同的方式，通过对染色体同源重组来制备菌株——其中实施例3-1中构建的重组质粒pDC-gltA(M312I)被引入WT::lysC(L377K)-hom(R407H)菌株中，并命名为WT::lysC(L377K)-hom(R407H)-gltA(M312I)。
围绕突变位点设计用于扩增5’上区域的引物对(SEQ ID NO:23和24)和用于扩增3’下区域的引物对(SEQ ID NO:25和26)，从而基于ilvA基因构建引入已知ilvA(V323A)突变的载体。SEQ ID NO:23和26的引物在每一端都插入有BamHI限制酶位点(用下划线表示)，而SEQ ID NO:24和25的引物被设计成彼此交换，以对设计位点处的核苷酸取代突变(用下划线表示)进行定位。引物的序列显示在下表11中。
[表11]
| SEQ ID NO: | 名称 | 序列(5'→3') |
| 23 | ilvA V323A上F | ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG |
| 24 | ilvA V323A上R | ACACCACGgCAGAACCAGGTGCAAAGGACA |
| 25 | ilvA V323A下F | CTGGTTCTGcCGTGGTGTGCATCATCTCTG |
| 26 | ilvA V323A下R | ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC |
用WT染色体DNA作为模板，连同SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQID NO:26的引物进行PCR。在如下PCR条件下进行PCR：95℃下变性5分钟，随后30个循环的95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下聚合30秒，然后72℃下聚合7分钟。结果，围绕ilvA基因的突变获得了5’上区域的627bp DNA片段和3’下区域的608bp DNA片段。
用这两个扩增的DNA片段作为模板，用SEQ ID NO:23和26的引物，通过95℃下变性5分钟，随后30个循环的95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下聚合60秒，然后72℃下聚合7分钟进行PCR。结果，扩增了1,217bp DNA片段，其含有编码ilvA变体的ilvA基因的突变——其中第323位的缬氨酸被丙氨酸取代。
用限制酶BamHI处理pECCG117载体(韩国专利号10-0057684)和该1,011bp DNA片段，用DNA连接酶连接，然后克隆以获得质粒，其被命名为pECCG117-ilvA(V323A)。
构建了pECCG117-ilvA(V323A)载体引入以上实施例的ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-gltA(M312I)中的菌株。另外，还构建了仅ilvA(V323A)突变被引入ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)中的菌株作为对照。
以与实施例4-1中所示的烧瓶培养法相同的方式培养由此构建的菌株，以分析培养溶液中的L-异亮氨酸浓度，并将结果显示在下表12中。
[表12]
如表12所示，证实了与野生型菌株ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(V323A)相比，引入gltA(M312I)突变的ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-gltA(M312I)/pECCG117-ilvA(V323A)中L-异亮氨酸的浓度增加约43％。
以上结果表明，将gltA(M312I)突变引入棒状杆菌属生产L-异亮氨酸的菌株中对于生产L-异亮氨酸是有效的。
实施例8：O-乙酰高丝氨酸生产能力提高的菌株的构建和O-乙酰高丝氨酸生产能
力的评估
为了研究引入gltA(M312I)突变对O-乙酰高丝氨酸生产的影响，通过缺失O-乙酰高丝氨酸降解途径中编码胱硫醚γ-合酶的metB基因，和O-乙酰高丝氨酸降解途径中编码O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶的metY基因，并通过向编码天冬氨酸激酶的lysC基因(SEQID NO:11)引入lysC基因的突变(L377K)(US 10662450 B2)释放对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制来构建生产O-乙酰高丝氨酸的菌株，以提高O-乙酰高丝氨酸的生物合成。
首先，为了缺失metB基因，用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板，通过PCR获得编码O-乙酰高丝氨酸降解途径的胱硫醚γ-合酶的metB基因。从美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的GenBank(NIH GenBank)获得metB基因的核苷酸序列信息(NCBI注册号Ncgl2360,SEQ ID NO:27)。基于该信息，合成包括metB基因的N-末端区域和连接体区域的引物(SEQ ID NO:28和29)和包括C-末端区域和连接体区域的引物(SEQ ID NO:30和31)。引物序列显示在下表13中。
[表13]
用ATCC13032的染色体DNA作为模板，连同SEQ ID NO:28和29及SEQ ID NO:30和31的引物进行PCR。用PfuUltraTM高保真(high-reliability)DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶，并通过重复30个循环的96℃下变性30秒，53℃下退火30秒，和72℃下聚合1分钟进行PCR。结果，各自获得了包括metB基因的N-末端区域和连接体区域的558bp扩增基因，和包括metB基因的C-末端区域和连接体区域的527bp扩增基因。
用以上获得的两个扩增DNA基因作为模板，通过重复10个循环的96℃下变性60秒，50℃下退火60秒，和72℃下聚合1分钟来进行PCR，并在添加SEQ ID NO:2和5的引物后，使聚合反应再重复20次。结果，获得了包括metB基因的N-末端-连接体-C-末端的1,064bp失活盒(inactivation cassette)。用包含在通过PCR获得的PCR片段的末端的限制酶XbaI和SalI处理所得的基因，并与用限制酶XbaI和SalI处理的pDZ载体(US 9109242B2)连接和克隆，从而最终构建克隆了metB失活盒的pDZ-ΔmetB重组载体。
通过电脉冲法将由此构建的pDZ-ΔmetB载体转化到ATCC13032中，并通过二次交换过程，获得染色体上metB基因失活的ATCC13032ΔmetB。通过与metB基因未失活的ATCC13032在用SEQ ID NO:28和31的引物进行PCR后进行比较，最终证实了失活的metB基因。
为了缺失编码参与O-乙酰高丝氨酸的另一降解途径的酶的metY基因，通过用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板进行的PCR获得编码O-乙酰高丝氨酸降解途径的O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶的metY基因。从美国国立卫生研究院的GenBank(NIHGenBank)获得metY基因的核苷酸序列信息(NCBI注册号Ncgl0625,SEQ ID NO:32)。基于该信息，合成包括metY基因的N-末端区域和连接体区域的引物(SEQ ID NO:33和34)和包括metY基因的C-末端区域和连接体区域的引物(SEQ ID NO:35和36)。引物序列显示在下表14中。
[表14]
用ATCC13032的染色体DNA作为模板，连同SEQ ID NO:33和34及SEQ ID NO:35和36的引物进行PCR。用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶，并通过重复30个循环的96℃下变性30秒，53℃下退火30秒，和72℃下聚合1分钟进行PCR。结果，各自获得了包括metY基因的N-末端区域和连接体区域的548bp扩增基因和包括metY基因的C-末端区域和连接体区域的550bp扩增基因。用以上获得的两个扩增DNA基因作为模板，通过重复10个循环的96℃下变性60秒，50℃下退火60秒，和72℃下聚合1分钟来进行PCR，并在添加SEQ IDNO:33和34的引物后，使聚合反应再重复20次。结果，获得了包括metY基因的N-末端-连接体-C-末端的1,077bp失活盒。用包含在通过PCR获得的PCR片段的末端的限制酶XbaI和SalI处理所得的基因，并与用限制酶XbaI和SalI处理的pDZ载体(US 9109242 B2)连接和克隆，从而最终构建克隆了metY失活盒的pDZ-ΔmetY重组载体。
通过电脉冲法将由此构建的pDZ-ΔmetY载体转化到ATCC13032ΔmetB菌株中，并通过二次交换过程，获得染色体上metY基因失活的ATCC13032ΔmetBΔmetY。通过与metY基因未失活的ATCC13032用SEQ ID NO:7和10的引物进行PCR后进行比较，最终证实了失活的metY基因。
为了提高O-乙酰高丝氨酸的生产，通过电脉冲法将实施例7-2中构建的pDZ-lysC(L377K)载体转化到ATCC13032ΔmetBΔmetY菌株中，以向源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的编码天冬氨酸激酶的lysC基因(SEQ ID NO:11)引入lysC基因的突变(L377K)(US10662450 B2)释放对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制。之后，通过二次交换过程获得核苷酸突变引入染色体上的lysC基因的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032ΔmetBΔmetY lysC(L377K)。通过用SEQ ID NO:15和18的引物进行的PCR，随后进行测序，并将序列与野生型lysC基因进行比较，最终证实了引入核苷酸突变的基因。
通过电脉冲法将实施例3-1中构建的pDC-gltA(M312I)载体转化到ATCC13032ΔmetBΔmetY lysC(L377K)菌株中，并通过二次交换过程获得核苷酸突变引入染色体上的gltA基因中的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032ΔmetBΔmetY lysC(L377K)gltA(M312I)。通过用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物进行PCR，然后分析碱基序列，从而证实突变被引入菌株中，证实gltA基因突变引入到了最终转化的菌株中。
为了比较以上构建的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032ΔmetBΔmetY lysC(L377K)和ATCC13032ΔmetBΔmetY lysC(L377K)gltA(M312I)菌株的O-乙酰高丝氨酸生产能力，通过以上描述的方法培养这些菌株，并分析培养基中的O-乙酰高丝氨酸。
将菌株接种到含有25mL以下培养基的250mL角挡烧瓶中(接种环)，并在37℃下以200rpm摇动培养20h。利用HPLC分析O-乙酰高丝氨酸浓度，并将分析后的浓度显示在下表15中。
L-O-乙酰高丝氨酸生产培养基(pH 7.2)
葡萄糖30g、KH2PO4 2g、尿素3g、(NH4)2SO4 40g、蛋白胨2.5g、CSL(Sigma)5g(10mL)、MgSO4.7H2O 0.5g、甲硫氨酸400mg、CaCO3 20g(基于1L蒸馏水)
[表15]
| 菌株名称 | O-AH(g/L) |
| ATCC13032ΔmetBΔmetY lysC(L377K) | 0.70 |
| ATCC13032ΔmetBΔmetY lysC(L377K)gltA(M312I) | 0.92 |
如表15的结果所示，证实了与ATCC13032ΔmetBΔmetY lysC(L377K)菌株相比，引入gltA(M312I)突变的ATCC13032ΔmetBΔmetY lysC(L377K)gltA(M312I)菌株将O-乙酰-L-高丝氨酸生产能力提高31％。
通过以上结果，可以证实柠檬酸合酶gltA的氨基酸序列中第312位氨基酸是gltA酶活性的重要位置。
本领域普通技术人员将认识到，本公开可以其它具体形式体现而不背离其精神或本质特征。在这方面，所描述的实施方式在所有方面均应被视为仅是示例性的而非限制性的。因此，本公开的范围由所附权利要求而不是由前述描述指示。落入权利要求的等同含义和范围内的所有改变均包含在本公开的范围内。
/>
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 柠檬酸合酶活性减弱的新型修饰多肽及使用其生产L-氨基酸的方法
<130> OPA20120-PCT
<150> KR 10-2020-0010823
<151> 2020-01-30
<160> 37
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 437
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> gltA AA
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Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu
1 5 10 15
His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu
20 25 30
Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu
35 40 45
Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys
50 55 60
Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr
85 90 95
Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe
100 105 110
Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser
115 120 125
Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala
130 135 140
Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro
145 150 155 160
Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys
165 170 175
Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg
195 200 205
Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met
210 215 220
Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln
225 230 235 240
Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn
245 250 255
Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu
260 265 270
His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys
275 280 285
Ser Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Glu Phe Met Asn Lys Val Lys Asn
290 295 300
Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys
305 310 315 320
Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile
325 330 335
Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu
340 345 350
Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr
355 360 365
Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe
370 375 380
Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly
385 390 395 400
Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile
405 410 415
Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val
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Pro Arg Glu Glu Arg
435
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<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> gltA NT
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atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60
ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120
aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180
accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240
gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300
ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360
cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420
gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggacca gctgaaccca 480
ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540
gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600
aatgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660
gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720
aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780
atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840
ctggagatgc tcgaagacat caagagcaac cacggtggcg acgcaaccga gttcatgaac 900
aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960
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gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200
tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcaggca acaagatcaa ccgcccacgc 1260
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Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr
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Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro
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aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780
atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840
ctggagatgc tcgaagacat caagagcaac cacggtggcg acgcaaccga gttcatgaac 900
aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatcggct tcggacaccg cgtttacaag 960
aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020
ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080
tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140
gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200
tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcaggca acaagatcaa ccgcccacgc 1260
caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCR-gltA F
<400> 5
ctaatctcga ggtcacccat gtttgaaagg 30
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCR-gltA R
<400> 6
tcgcgaggag cgctaaaacc ggttgat 27
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gltA F
<400> 7
caatgctggc tgcgtacgc 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gltA R
<400> 8
ctcctcgcga ggaaccaact 20
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gltA M312I上F
<400> 9
gtgaattcga gctcggtacc cgcgggaatc ctgcgttacc gc 42
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gltA M312I上R
<400> 10
tgtaaacgcg gtgtccgaag ccgatgaggc ggacgccgtc tt 42
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gltA M312I下F
<400> 11
aagacggcgt ccgcctcatc ggcttcggac accgcgttta ca 42
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gltA M312I下R
<400> 12
ggtcgactct agaggatccc cttagcgctc ctcgcgagga ac 42
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> leuA F
<400> 13
accgaaattg gcttgggtgc cagcccagct gatgcctac 39
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> leuA R
<400> 14
aagcttgcat gcctgcagct taaagtcacc tacgttttgt ac 42
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC上F
<400> 15
tcctctagag ctgcgcagtg ttgaatacg 29
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC上R
<400> 16
tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC下F
<400> 17
acatcgaaaa gatttccacc tctgagattc 30
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC下R
<400> 18
gactctagag ttcacctcag agacgatta 29
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hom上F
<400> 19
tcctctagac tggtcgcctg atgttctac 29
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hom上R
<400> 20
cacgatcaga tgtgcatcat cat 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hom下F
<400> 21
atgatgatgc acatctgatc gtg 23
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hom下R
<400> 22
gactctagat tagtcccttt cgaggcgga 29
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvA V323A上F
<400> 23
acggatccca gactccaaag caaaagcg 28
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvA V323A上R
<400> 24
acaccacggc agaaccaggt gcaaaggaca 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvA V323A下F
<400> 25
ctggttctgc cgtggtgtgc atcatctctg 30
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvA V323A下R
<400> 26
acggatccaa ccaaacttgc tcacactc 28
<210> 27
<211> 1161
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 谷氨酸棒状杆菌metB
<400> 27
ttgtcttttg acccaaacac ccagggtttc tccactgcat cgattcacgc tgggtatgag 60
ccagacgact actacggttc gattaacacc ccaatctatg cctccaccac cttcgcgcag 120
aacgctccaa acgaactgcg caaaggctac gagtacaccc gtgtgggcaa ccccaccatc 180
gtggcattag agcagaccgt cgcagcactc gaaggcgcaa agtatggccg cgcattctcc 240
tccggcatgg ctgcaaccga catcctgttc cgcatcatcc tcaagccggg cgatcacatc 300
gtcctcggca acgatgctta cggcggaacc taccgcctga tcgacaccgt attcaccgca 360
tggggcgtcg aatacaccgt tgttgatacc tccgtcgtgg aagaggtcaa ggcagcgatc 420
aaggacaaca ccaagctgat ctgggtggaa accccaacca acccagcact tggcatcacc 480
gacatcgaag cagtagcaaa gctcaccgaa ggcaccaacg ccaagctggt tgttgacaac 540
accttcgcat ccccatacct gcagcagcca ctaaaactcg gcgcacacgc agtcctgcac 600
tccaccacca agtacatcgg aggacactcc gacgttgttg gcggccttgt ggttaccaac 660
gaccaggaaa tggacgaaga actgctgttc atgcagggcg gcatcggacc gatcccatca 720
gttttcgatg catacctgac cgcccgtggc ctcaagaccc ttgcagtgcg catggatcgc 780
cactgcgaca acgcagaaaa gatcgcggaa ttcctggact cccgcccaga ggtctccacc 840
gtgctctacc caggtctgaa gaaccaccca ggccacgaag tcgcagcgaa gcagatgaag 900
cgcttcggcg gcatgatctc cgtccgtttc gcaggcggcg aagaagcagc taagaagttc 960
tgtacctcca ccaaactgat ctgtctggcc gagtccctcg gtggcgtgga atccctcctg 1020
gagcacccag caaccatgac ccaccagtca gctgccggct ctcagctcga ggttccccgc 1080
gacctcgtgc gcatctccat tggtattgaa gacattgaag acctgctcgc agatgtcgag 1140
caggccctca ataaccttta g 1161
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metB_N_del F
<400> 28
tctagacgcc cgcatactgg cttc 24
<210> 29
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metB_N_del R
<400> 29
cccatccact aaacttaaac agatgtgatc gcccggc 37
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metB_C_del F
<400> 30
tgtttaagtt tagtggatgg ggaagaacca cccaggcc 38
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metB_C_del R
<400> 31
gtcgaccaat cgtccagagg gcg 23
<210> 32
<211> 1314
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 谷氨酸棒状杆菌metY
<400> 32
atgccaaagt acgacaattc caatgctgac cagtggggct ttgaaacccg ctccattcac 60
gcaggccagt cagtagacgc acagaccagc gcacgaaacc ttccgatcta ccaatccacc 120
gctttcgtgt tcgactccgc tgagcacgcc aagcagcgtt tcgcacttga ggatctaggc 180
cctgtttact cccgcctcac caacccaacc gttgaggctt tggaaaaccg catcgcttcc 240
ctcgaaggtg gcgtccacgc tgtagcgttc tcctccggac aggccgcaac caccaacgcc 300
attttgaacc tggcaggagc gggcgaccac atcgtcacct ccccacgcct ctacggtggc 360
accgagactc tattccttat cactcttaac cgcctgggta tcgatgtttc cttcgtggaa 420
aaccccgacg accctgagtc ctggcaggca gccgttcagc caaacaccaa agcattcttc 480
ggcgagactt tcgccaaccc acaggcagac gtcctggata ttcctgcggt ggctgaagtt 540
gcgcaccgca acagcgttcc actgatcatc gacaacacca tcgctaccgc agcgctcgtg 600
cgcccgctcg agctcggcgc agacgttgtc gtcgcttccc tcaccaagtt ctacaccggc 660
aacggctccg gactgggcgg cgtgcttatc gacggcggaa agttcgattg gactgtcgaa 720
aaggatggaa agccagtatt cccctacttc gtcactccag atgctgctta ccacggattg 780
aagtacgcag accttggtgc accagccttc ggcctcaagg ttcgcgttgg ccttctacgc 840
gacaccggct ccaccctctc cgcattcaac gcatgggctg cagtccaggg catcgacacc 900
ctttccctgc gcctggagcg ccacaacgaa aacgccatca aggttgcaga attcctcaac 960
aaccacgaga aggtggaaaa ggttaacttc gcaggcctga aggattcccc ttggtacgca 1020
accaaggaaa agcttggcct gaagtacacc ggctccgttc tcaccttcga gatcaagggc 1080
ggcaaggatg aggcttgggc atttatcgac gccctgaagc tacactccaa ccttgcaaac 1140
atcggcgatg ttcgctccct cgttgttcac ccagcaacca ccacccattc acagtccgac 1200
gaagctggcc tggcacgcgc gggcgttacc cagtccaccg tccgcctgtc cgttggcatc 1260
gagaccattg atgatatcat cgctgacctc gaaggcggct ttgctgcaat ctag 1314
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metY_N_del F
<400> 33
tctagaccat cctgcaccat ttag 24
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metY_N_del R
<400> 34
cccatccact aaacttaaac acgctcctgc caggttc 37
<210> 35
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metY_C_del F
<400> 35
tgtttaagtt tagtggatgg gcttggtacg caaccaagg 39
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metY_C_del R
<400> 36
gtcgacgatt gctccggctt cgg 23
<210> 37
<211> 1266
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 谷氨酸棒状杆菌lysC
<400> 37
gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
Claims (9)
1.修饰多肽，所述修饰多肽具有柠檬酸合酶活性并且由以下氨基酸序列组成：SEQ IDNO:1的氨基酸序列，其中对应于从由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽的N-末端起第312位的氨基酸被异亮氨酸取代。
2.多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的修饰多肽。
3.载体，其包含根据权利要求2所述的多核苷酸。
4.生产L-氨基酸的棒状杆菌属微生物，其表达根据权利要求1所述的修饰多肽或编码所述修饰多肽的多核苷酸，
其中所述L-氨基酸是选自亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和O-乙酰高丝氨酸中的任一种或多种。
5.生产L-氨基酸的棒状杆菌属微生物，其经根据权利要求3所述的载体转化，
其中所述L-氨基酸是选自亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和O-乙酰高丝氨酸中的任一种或多种。
6.根据权利要求4所述的微生物，其中所述棒状杆菌属微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
7.用于生产L-氨基酸的方法，包括：
在培养基中培养根据权利要求4或5所述的微生物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法进一步包括从培养后的培养基或微生物回收L-氨基酸。
9.生产L-氨基酸的根据权利要求4或5所述的微生物用于L-氨基酸生产的用途。
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| CN110168083A (zh) * | 2017-06-30 | 2019-08-23 | Cj第一制糖株式会社 | 新型天冬氨酸激酶变体和使用其生产l-氨基酸的方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Yuechao Ma等.Identification and application of a growth-regulated promoter for improving L-valine production in Corynebacterium glutamicum.《Microb Cell Fact》.2018,第17卷(第1期),第1-10页. * |
Also Published As
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