CN115702244A

CN115702244A - L-支链氨基酸生产能力增强的微生物和利用其生产l-支链氨基酸的方法

Info

Publication number: CN115702244A
Application number: CN202180019796.3A
Authority: CN
Inventors: 尹炳勋; 金善慧; 张真淑; 金柱渊; 崔先亨; 金径林; 金朱恩; 金亨俊
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2021-05-20
Publication date: 2023-02-14
Also published as: BR112022017038A2; US20230063145A1; CA3169534A1; KR102311391B1; JP2023511882A; EP4083214A1; MX2022009250A; EP4083214A4; WO2021235855A1

Abstract

公开了具有增强的乙酸代谢调控因子A活性的生产L‑支链氨基酸的微生物和利用其生产L‑支链氨基酸的方法。

Description

L-支链氨基酸生产能力增强的微生物和利用其生产L-支链氨基酸的方法

技术领域

本公开涉及具有乙酸代谢调控因子A的增强的活性的生产L-支链氨基酸的微生物和利用其生产L-支链氨基酸的方法。

背景技术

L-氨基酸，作为蛋白质的基本结构单元，被用作药物、食品添加剂、动物饲料、营养补充剂、杀虫剂、消毒剂等的主要成分。具体地，支链氨基酸(BCAA)，作为必需氨基酸L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的总称，以抗氧化剂作用和直接促进肌肉细胞蛋白质合成的作用而闻名。

同时，利用微生物生产支链氨基酸主要由埃希氏菌(Escherichia)属微生物或棒状杆菌(Corynebacterium)属微生物进行，并且已知通过利用2-酮异己酸作为前体由丙酮酸通过各种阶段进行的生物合成来生产支链氨基酸(US 10316297 B2、US 10526586 B2和US10072278B2)。然而，利用该微生物生产L-支链氨基酸有一个问题在于不容易工业大规模生产。

发明内容

【技术问题】

在此背景下，作为增强利用微生物生产L-支链氨基酸的能力的大量努力的结果，本发明人发现生产L-支链氨基酸的能力通过增加微生物的乙酸代谢调控因子A(以下称为RamA)的表达而显著提高，从而完成本公开。

【技术方案】

本公开的一个目的是提供具有乙酸代谢调控因子A的增强的活性的生产L-支链氨基酸的微生物。

本公开的另一个目的是提供生产L-支链氨基酸的微生物，其包括这样的多核苷酸：具有启动子活性并且包括在选自以下位置的一个或多个相应位置处核苷酸被不同的核苷酸取代：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第34、36、37、41和43位核苷酸。

本公开的另一个目的是提供生产L-支链氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养微生物。

本公开的另一个目的是提供多核苷酸，该多核苷酸具有启动子活性并且包括在选自以下位置的一个或多个相应位置处核苷酸被不同的核苷酸取代：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第34、36、37、41和43位。

【有利效果】

可以通过培养包括本公开的多核苷酸的生产L-支链氨基酸的微生物以高产率生产L-支链氨基酸。

此外，本公开生产的氨基酸可以应用于多种产品，如人类食品、饲料添加剂或药物以及动物饲料或动物饲料添加剂。

具体实施方式

本公开将被详细描述。同时，本公开中公开的各描述和实施方式可以应用于本文的不同描述和实施方式。此外，本公开中公开的各种组分的所有组合被包括在本公开的范围内。此外，本公开的范围不应受以下提供的描述限制。

本领域技术人员将认识到或能够确定，利用不超过常规的实验，(可获得)本公开的具体实施方式的多种等同方式。这样的等同方式意图被包含在所附权利要求的范围内。

本公开的一个方面提供了生产L-支链氨基酸的微生物，其具有乙酸代谢调控因子A的增强的活性。

如本文所用，术语“乙酸代谢调控因子A”是指与乙酸代谢相关的调控蛋白，作为本公开的目标蛋白并且可以由ramA基因编码。

在本公开中，可以增强乙酸代谢调控因子A的表达，并且表达的增强可以导致生产L-支链氨基酸的能力增加。

如本文所用，术语“增强”乙酸代谢调控因子A的活性意为乙酸代谢调控因子A的活性与固有活性相比增加。增强可以与活化、上调、过表达、增加等互换使用。关于这点，活化、增强、上调、过表达和增加可以包括所有呈现非原本具有的活性或呈现与固有活性或修饰前活性相比改进的活性的那些。“固有活性”是指在通过天然或人工因素引起的遗传修饰来转化微生物时，转化前的亲本菌株或未修饰微生物原本具有的具体多肽的活性。该术语可以与“修饰前活性”互换使用。多肽的活性与固有活性相比的“增强”、“上调”、“过表达”或“增加”意为具体多肽的活性和/或浓度(表达水平)与转化前的亲本菌株或未修饰微生物原本具有的那些相比改进。

增强可以通过引入外源多肽或通过增强内源多肽的活性和/或增加内源多肽的浓度(表达水平)来实现。乙酸代谢调控因子A的活性是否增强可以基于多肽的活性或表达水平或从多肽释放的产物量的改进/增加来确定。

乙酸代谢调控因子A活性的增强可以通过应用本领域公知的各种方法来实现，并且方法不受限制，只要目标多肽的活性与修饰前的微生物相比增强。具体地，可以非限制地采用本领域作为常规分子生物学方法公知的任何基因工程和/或蛋白质工程方法(例如，Sitnicka et al.Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,Vol.2.1–16,Sambrook et al.Molecular Cloning 2012)。

具体地，乙酸代谢调控因子A的活性增强可通过以下实现：

1)增加细胞中编码该多肽的多核苷酸的拷贝数；

2)将染色体上编码该多肽的基因表达调控序列替换成改进该多肽的表达的序列或在其中引入修饰；

3)修饰编码该多肽的基因转录物的起始密码子或5'-UTR区的编码核苷酸序列；

4)修饰该多肽的氨基酸序列以增强多肽的活性；

5)修饰编码该多肽的多核苷酸的序列以增强多肽的活性(例如，修饰多肽基因的核苷酸序列以编码经修饰具有增强活性的多肽)；

6)引入有该多肽的活性的外源多肽，编码其的外源多核苷酸；

7)优化编码该多肽的多核苷酸的密码子；

8)修饰或化学修饰通过分析该多肽的三维结构而选择的暴露区；或者

9)选自上述1)至8)中的两种或更多种的任何组合，但不限于此。

更具体地，

以上1)中所述的增加编码该多肽的多核苷酸的拷贝数可以通过将载体引入宿主细胞来实现，该载体不依赖于宿主细胞而复制和工作并且被可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸。或者，拷贝数的增加可以通过将一个拷贝或两个或更多个拷贝的编码该多肽的多核苷酸引入宿主细胞的染色体来实现。在染色体中的引入可以通过将能够将多核苷酸插入宿主细胞染色体的载体引入宿主细胞来进行，但不限于此。载体如下所述。

以上2)所述的将染色体上编码该多肽的基因表达调控序列(或表达调控区)替换成改进该多肽的表达的序列或在其中引入修饰可以例如通过以下实现：通过诱导序列的突变——通过缺失、插入、非保守或保守取代或其任何组合，或通过将基因表达调控序列替换为能够改进该多肽的表达的序列，以进一步增强表达调控区的活性。表达调控区可以包括但不限于启动子、操纵子序列、核糖体结合位点编码序列、调控转录或翻译终止的序列、增强子等。替换可以具体地通过用强异源启动子替换内源启动子的方法进行，但不限于此。

本领域已知的强启动子的实例可以包括CJ1至CJ7启动子(美国专利号US 7662943B2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(美国专利号US 10584338 B2)、O2启动子(美国专利号US 10273491 B2)、tkt启动子和yccA启动子，但不限于此。

以上3)所述的修饰编码该多肽的基因转录物的起始密码子或5'-UTR区的编码核苷酸序列可以例如通过用编码另一起始密码子(具有比内源起始密码子更高的多肽表达水平)的核苷酸序列取代所述核苷酸序列来实现，但不限于此。

以上4)和5)所述的修饰氨基酸序列或核苷酸序列可以通过以下实现：通过在该多肽的氨基酸序列或编码该多肽的核苷酸序列中诱导突变——通过缺失、插入、非保守性或保守取代或其任何组合，或通过将该氨基酸序列或核苷酸序列替换为经修饰具有更强活性的氨基酸序列或核苷酸序列或经修饰增加活性的氨基酸序列或核苷酸序列，以进一步增强该多肽的活性，但不限于此。所述替换可以具体地通过经由同源重组将多核苷酸插入染色体中来进行，但不限于此。关于这点，其所用载体可以进一步包括选择标记以确认其在染色体中的插入。选择标记将在下文描述。

以上6)所述的具有该多肽的活性的外源多肽可以通过将编码呈现与该多肽相同/相似活性的多肽的外源多核苷酸引入宿主细胞来实现。外源多核苷酸的来源或序列没有具体限制，只要该外源多核苷酸呈现与该多肽相同/相似的活性。所述引入中使用的方法可以由本领域普通技术人员适当地选择。由于引入的多核苷酸在宿主细胞中被表达，生产所述多肽并且其活性可以增加。

以上7)所述的优化编码该多肽的多核苷酸的密码子可以通过优化密码子以增加宿主细胞中内源多核苷酸的转录或翻译，或通过优化密码子以允许优化外源多核苷酸在宿主细胞中的转录或翻译来实现。

以上8)所述的修饰或化学修饰通过分析该多肽的三维结构而选择的暴露区可以例如例如通过以下来实现：根据序列之间的相似性、基于待分析多肽的序列信息和存储现有蛋白质序列信息的数据库之间的比较来确定候选模板蛋白，在此基础上确定结构，选择待修饰或化学修饰的暴露区，以及修饰或化学修饰该暴露区。

如上所述的乙酸代谢调控因子A的活性的增强可以是，与野生型或未修饰的微生物菌株中表达的乙酸代谢调控因子A的活性或浓度相比，多肽的活性或浓度(表达水平)增加，或由该多肽获得的产物量增加，但不限于此。

更具体地，如本文所用，术语“基因表达调控序列”——可与“基因表达调控区”互换使用——是指可操作地连接至目标基因以使目标基因表达的序列，并且可以包括本公开的修饰多核苷酸。如上所述，本公开的基因表达调控序列可以指代进行基因转录的启动子、增强子等，并且可以是进一步包括下列的概念：控制转录的操纵子序列、编码适当mRNA核糖体结合位点的序列、和调控转录和翻译终止的DNA。

在本公开的实施方式中，基因表达调控序列可以是启动子，但不限于此。

在本公开的实施方式中，乙酸代谢调控因子A的表达可以通过在启动子中引入修饰或将启动子替换为具有更强活性的启动子来增强，但不限于此。

如本文所用，术语“启动子”是指非翻译的核苷酸序列，其包括聚合酶结合位点，位于编码区上游，并且具有启动目标基因至mRNA的转录的活性，即，当聚合酶与其结合时导致基因转录开始的DNA区域。启动子可以位于mRNA转录起始位点的5'区。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指功能性地连接至目标基因的序列，使得具有本公开的启动子活性的多核苷酸启动和介导目标基因的转录。可操作的连接可以利用本领域已知的遗传重组技术实现，并且可以利用限制酶、连接酶等进行位点特异性DNA切割和连接，但不限于此。

在本公开中，目标基因是指编码其表达将在微生物中被调控的目标蛋白的基因，具体地，该基因可以是编码乙酸代谢调控因子A的基因，但不限于此。.更具体地，该基因可以是ramA基因，但不限于此。

此外，ramA基因可以是内源基因或外源基因，并且可以包括调节活性的突变。ramA基因的序列可以容易地被本领域技术人员由已知的数据库如National Institutes ofHealth(U.S.A.)的GenBank获得。

本公开的另一方面提供了生产L-支链氨基酸的微生物，其包括这样的多核苷酸：具有启动子活性并且包括在选自SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第34、36、37、41和43位的一个或多个相应位置处核苷酸被不同的核苷酸取代。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指作为核苷酸多聚体具有一定最小长度的DNA链，其中核苷酸单体通过共价键以长链的形式彼此连接。

考虑对“启动子”的描述，在本公开中，术语“具有启动子活性的多核苷酸”可以与“修饰多核苷酸”、“修饰启动子”或“修饰ramA启动子”互换使用，并且上述术语全部可以在本文中使用。

在这方面，术语“修饰”是指遗传或非遗传稳定的表型变化，并且在本文中可以与“突变”互换使用。

具体地，本公开的修饰多核苷酸，与不具有修饰的多核苷酸相比，可以具有改变的(增加的)启动子活性。因此，ramA基因(即，可操作地连接至本公开的修饰多核苷酸的目标基因)的表达和由该ramA基因编码的蛋白质的活性可以被调节(增加)，并且其他基因以及目标基因的表达也可以被调节。

鉴于本公开的目的，具有启动子活性的多核苷酸是指能够使氨基酸(具体地支链氨基酸，更具体地包括亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸在内的氨基酸)生产增加所涉及的蛋白质表达的多核苷酸，但不限于此。

如本文所用，术语“SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列”可以指代编码乙酸代谢调控因子A(RamA)的基因的启动子序列。

本公开的具有启动子活性的多核苷酸是修饰的多核苷酸，其不具有天然来源的序列但具有启动子活性，并且与SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列相比，其可操纵地连接的目标蛋白的表达可增加。

具体地，本公开的修饰多核苷酸可以是这样的多核苷酸：其中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，即ramA基因的启动子序列，被修饰，并且选自该序列的第34、36、37、41和43位核苷酸的至少一个核苷酸可以被不同的核苷酸取代。

更具体地，本公开的修饰多核苷酸可以包括，在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中，第34位核苷酸被T取代；第36位核苷酸被T取代；第37位核苷酸被G取代；第41位核苷酸被T取代；第43位核苷酸被A取代；或其任何组合，但不限于此。通过该修饰，本公开的多核苷酸可以由选自SEQ ID NO：3至5的一种核苷酸序列组成。

在一个实施方式中，本公开的修饰多核苷酸可以包括，在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中，第34位核苷酸被T取代；第36位核苷酸被T取代；并且第37位核苷酸被G取代。在这种情况下，本公开的修饰多核苷酸可以由SEQ ID NO：5组成。

在另一个实施方式中，本公开的修饰多核苷酸可以包括，在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中，第41位核苷酸被T取代；并且第43位核苷酸被A取代。在这种情况下，本公开的修饰多核苷酸可以由SEQ ID NO：4组成。

在另一个实施方式中，本公开的修饰多核苷酸可以包括，在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中，第34位核苷酸被T取代；第36位核苷酸被T取代；第37位核苷酸被G取代；第41位核苷酸被T取代；并且第43位核苷酸被A取代。在这种情况下，本公开的修饰多核苷酸可以由SEQ ID NO：3组成。

本公开的生产L-支链氨基酸的微生物可以是包括如下多核苷酸的微生物：具有启动子活性，并且包括，在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中，第34位核苷酸被T取代；第36位核苷酸被T取代；第37位核苷酸被G取代；第41位核苷酸被T取代；第43位核苷酸被A取代；或其任何组合。

具体地，本公开的生产L-支链氨基酸的微生物可以是包括如下多核苷酸的微生物：具有启动子活性，并且由选自SEQ ID NO：3至5的一种核苷酸序列或与其具有至少80％或更高且小于100％序列同源性的核苷酸序列组成。本公开的修饰多核苷酸将在下文被更详细地描述。

如本文所用，术语“支链氨基酸”是指在侧链具有分支烷基的氨基酸，并且包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。具体地，在本公开中，支链氨基酸可以是L-支链氨基酸，并且L-支链氨基酸可以是L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸，但不限于此。

如本文所用，术语“生产支链氨基酸的微生物”包括所有野生型微生物和其中发生天然或人工遗传修饰的微生物，并且可以是这样的微生物：包括遗传修饰以生产目标支链氨基酸或具有改进的活性，其中某特定机制通过引入外源基因或增强或灭活内源基因的活性而被削弱或增强。在本公开中，“能够生产L-支链氨基酸的微生物”可以与“生产支链氨基酸的微生物”和“具有支链氨基酸生产能力的微生物”互换使用。

鉴于本公开的目的，微生物可以是能够生产支链氨基酸并且包括本公开的修饰多核苷酸的任何微生物。具体地，生产支链氨基酸的微生物可以是特征在于通过包含修饰的多核苷酸而增加生产目标支链氨基酸的能力的微生物。具体地，在本公开中，生产支链氨基酸的微生物或具有生产支链氨基酸的能力的微生物可以是其中支链氨基酸生物合成途径中的一些基因被增强或减弱的微生物或其中支链氨基酸分解途径中的一些基因被增强或减弱的微生物，但不限于此。

在一个实施方式中，在本公开中，具有支链氨基酸生产能力的棒状杆菌属微生物可以指代包含本公开的修饰多核苷酸或用包括编码本公开的多核苷酸的基因的载体转化以具有改进的支链氨基酸生产能力的棒状杆菌属微生物。“具有增强的支链氨基酸生产能力的棒状杆菌属微生物”是指与转化前的亲本菌株或未修饰微生物所具有的氨基酸能力相比具有增强的支链氨基酸生产能力的微生物。“未修饰的微生物”不排除具有微生物中可能天然存在的突变的菌株，并且指代不包含本公开的多核苷酸的微生物或未用包含本公开的多核苷酸的载体转化的微生物。

棒状杆菌属微生物可具体地包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、高效棒状杆菌(Corynebacteriumefficiens)、静止棒状杆菌(Corynebacterium stationis)等，但不限于此。

如本文所用，术语“载体”是指人工DNA分子，其包括使目标多肽在适当的宿主细胞中表达的遗传物质，具体地，DNA构建体——其包括编码目标多肽并且可操作地连接到能够使目标基因表达的适当表达调控区的多核苷酸的核苷酸序列。在用载体转化适当的宿主细胞后，载体可以独立于宿主基因组复制或工作，或者可以整合到该基因组中。

本公开中使用的载体没有具体限制，并且可以使用本领域已知的任何载体。常规载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等。作为质粒载体，可以使用pDZ系、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系、pET系等。具体地，可以使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC载体。

例如，可以通过使用染色体插入载体将目标多核苷酸插入染色体中。多核苷酸在染色体中的插入可以通过本领域已知的任何方法进行，例如同源重组，但不限于此。多核苷酸可还包括选择标记以确认染色体的插入。选择标记用于选择被载体转化的细胞，即识别目标核酸分子是否被插入，并且可以使用提供选择性表型如耐药性、营养物需求、细胞毒性剂抗性或表面多肽表达的标记。因为只有表达选择标记的细胞才能在用选择剂处理的环境下存活或显示不同的表型，可以选择被转化的细胞。

如本文所用，术语“转化”是指将包含目标多核苷酸的载体引入宿主细胞或微生物使得多核苷酸在宿主细胞中表达的过程。转化的多核苷酸可以是插入宿主细胞染色体的形式或位于染色体外的形式，只要多肽在宿主细胞中被表达。此外，多核苷酸可以包括编码目标多肽的DNA和/或RNA。多核苷酸可以以任何形式被引入宿主细胞，只要多核苷酸被引入宿主细胞并在其中被表达。例如，多核苷酸可以以表达盒(即包含自我复制所需的所有必需元件的基因构建体)的形式被引入宿主细胞。表达盒可以总体上包括与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是可自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以以其原始形式被引入宿主细胞中并且在宿主细胞中被可操作地连接到表达所需的序列，但不限于此。

本公开的另一方面提供了生产L-支链氨基酸的方法，包括在培养基中培养微生物。

此外，生产L-支链氨基酸的方法可以还包括从培养基或微生物回收或分离目标物质。

“多核苷酸”、“棒状杆菌属微生物”、“载体”和“L-支链氨基酸”如上所述。

如本文所用，术语“培养”是指使本公开的微生物在适当调整的环境中生长。本公开的培养过程可以利用本领域公知的适当培养基和培养条件进行。本领域技术人员可以根据所选择的菌株适当调整培养过程。具体地，培养可以通过分批培养法、连续培养法和分批补料培养法进行，但不限于此。

如本文所用，术语“培养基”是指其中混合培养本公开的微生物所需的营养物作为主要元素并提供存活和生长所必需的营养物和生长因子以及水的材料。具体地，尽管本公开的棒状杆菌属微生物的培养基和其他培养条件没有具体限制——只要该培养基常用于培养微生物，但本公开的微生物可以在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的普通培养基中在有氧条件下被培养——同时调节温度、pH等。

具体地，用于棒状杆菌属微生物的培养基被公开于文件(“Manual of MethodsforGeneral Bacteriology”，the American Society for Bacteriology(WashingtonD.C.,U.S.A.,1981))。

在本公开中，作为碳源，可以使用碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖和麦芽糖；糖醇，如甘露醇和山梨醇；有机酸，如丙酮酸、乳酸和柠檬酸；和氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸。此外，还可以使用天然有机营养物质，如淀粉水解物、糖蜜、赤糖糊(blackstrap molasses)、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浆，并且具体地，可以使用碳水化合物，如葡萄糖和无菌预处理糖蜜(即转化为还原糖的糖蜜)，并且也可以使用适量的任何其他碳源，而没有限制。这些碳源可以单独使用，或其至少两种组合使用，但不限于此。

作为氮源，可以使用无机氮源，如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵；和有机氮源，如氨基酸，例如谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺、蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼或其降解产物和脱脂大豆饼或其降解产物。这些氮源可以单独使用或其至少两种组合使用，但不限于此。

作为磷源，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或其对应的含钠盐。作为无机化合物，可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。此外，还可以包括氨基酸、维生素和/或适当的前体。这些组分或前体可以以分批或连续过程添加到培养基，但不限于此。

另外，在培养本公开的微生物的过程中，可以通过以适当的方法加入诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸的化合物来调节培养基的pH值。此外，在培养过程中，可以通过使用消泡剂如脂肪酸聚二醇酯来防止泡沫形成。此外，可以将氧气或含氧气体注入培养基以保持培养基处于有氧条件，或者可以将氮气、氢气或二氧化碳气体注入培养基以保持培养基处于无氧和微氧条件，而不为此注入任何其他气体，但不限于此。

在本公开中，培养温度可以维持在20℃至45℃，具体地25℃至40℃，并且培养可以进行约10至160小时，但不限于此。

通过本公开的培养生产的L-支链氨基酸可以被释放到培养基中或保留在细胞中。

根据本公开的生产L-支链氨基酸的方法还可以包括制备本公开的微生物，制备用于培养菌株的培养基，或其任何组合(无论顺序如何，以任何顺序)，例如在培养之前。

根据本公开的用于生产L-支链氨基酸的方法可以进一步包括从培养基(其中已进行培养)或本公开的微生物回收L-支链氨基酸。回收步骤可以在培养过程之后另外进行。

根据本公开的培养微生物的方法，如分批、连续或补料-分批方法，回收步骤可以通过利用本领域已知的适当方法收集目标L-支链氨基酸来进行。例如，可以采用离心、过滤、用蛋白质沉淀剂处理(盐析)、萃取、超声崩解、超滤、透析、各种色谱方法如分子筛色谱(凝胶渗透)、吸附色谱、离子交换色谱和亲和色谱、HPLC、SMB、以及其任何组合。可以利用本领域已知的任何适当方法从培养基或微生物回收目标L-支链氨基酸。

另外，根据本公开的生产L-支链氨基酸的方法还可以包括纯化步骤。纯化可以利用本领域已知的适当方法进行。例如，当根据本公开的生产L-支链氨基酸的方法包括回收步骤和纯化步骤时，回收步骤和纯化步骤可以无论顺序如何而连续或不连续地进行，或可以同时或作为一个整合步骤进行，但不限于此。

本公开的另一方面提供了多核苷酸，该多核苷酸具有启动子活性并且包括选自SEQ IDNO：1所示核苷酸序列的第34、36、37、41和43位核苷酸的至少一个核苷酸被不同的核苷酸取代。

“多核苷酸”和“启动子”如上所述。

此外，本公开的修饰多核苷酸的序列可以通过本领域公知的诱变而被修饰，例如直接进化(evolution)和定点诱变。

因此，本公开的修饰多核苷酸可以包括具有如下核苷酸序列的多核苷酸：其中第34位碱基固定为T；第36位碱基固定为T；第37位碱基固定为G；第41位碱基固定为T；并且第43位碱基固定为A，并且该核苷酸序列的其他部分与SEQ ID NO：3的核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或同一性。

另外，本公开的修饰多核苷酸可以包括具有如下核苷酸序列的多核苷酸：其中第41位碱基固定为T；并且第43位碱基固定为A，并且该核苷酸序列的其他部分与SEQ ID NO：4的核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或同一性。

此外，本公开的修饰多核苷酸可以包括具有如下核苷酸序列的多核苷酸：其中第34位碱基固定为T；第36位碱基固定为T；并且第37位碱基固定为G，并且该序列的其他部分与SEQ ID NO：5的核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或同一性。

在这种情况下，具有所述同源性或同一性的核苷酸序列可以排除具有100％同一性的序列或者可以是具有小于100％同一性的序列。

显然，具有包括第34、36、37、41或43位以外的一个或若干核苷酸的缺失、修饰、取代或添加的核苷酸序列的任何多核苷酸在本公开的范围内，只要该核苷酸序列保持同源性和与选自SEQ ID NO：3至5的至少一种核苷酸序列相同或等同的生物学活性。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并且可以以百分比表示。术语同源性和同一性通常可以互换使用。

保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且通过程序建立的默认空位罚分可以与其一起联用。基本上，同源或同一序列可以总体上在中等或高度严格的条件下全部或部分地彼此杂交。显然，杂交包括一个多核苷酸与包含通用密码子或考虑密码子简并性的密码子的多核苷酸的杂交。

多核苷酸或多肽的两个序列之间的同源性、相似性或同一性可以利用本领域已知的任何计算机算法来确定，例如“FASTA”程序，利用Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444引进的默认参数。或者，同源性、相似性或同一性可以利用以下确定：EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276–277)(5.0.0版或更高版本)(包括GCG程序包(Devereux,J.et al.,Nucleic AcidsResearch 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.et al.,J MOLEC BIOL215:403(1990)；Guide to Huge Computers,MartinJ.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994和CARILLO et al.(1988)SIAM JApplied Math 48:1073)的Needleman程序中执行的Needleman–Wunsch算法(Needlemanand Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)。例如，同源性、相似性或同一性可以利用来自National Center for Biotechnology信息数据库BLAST或ClustalW来确定。

多核苷酸或多肽之间的同源性、相似性或同一性可以通过利用Needleman etal.,(1970),J Mol Biol.48:443as disclosed by Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482引进的GAP计算机程序比较序列信息来确定。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中的较短者的符号总数。GAP程序的默认参数可包括：(1)二进制比较矩阵(包含数值1表示相同，0表示不相同)和Gribskov,et al.(1986),Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵——如Schwartz andDayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence and Structure,National BiomedicalResearch Foundation,pp.353–358(1979)所述(或EDNAFULL(EMBOSS版本的NCBI NUC4.4)取代矩阵)；(2)每个空位罚分3.0，每个空位中的每个符号另外罚分0.10(或空位开放罚分10和空位扩展罚分0.5)；(3)末端空位无罚分。

此外，本公开的修饰多核苷酸可包括在编码区中进行的、通过密码子简并性或考虑表达多核苷酸的活生物体优选的密码子而提供的不改变核苷酸序列的各种修饰。此外，多核苷酸可非限制地包括具有启动子活性并与利用已知基因序列(例如，在严格条件下与该核苷酸序列完全或部分互补的核苷酸序列)构建的探针杂交以在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中包括至少一个取代的核苷酸的任何核苷酸序列。术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这种条件被详细公开于已知的文件(例如，J.Sambrook等)。例如，该条件可以包括在具有高同源性(例如，同源性40％或更多，具体地70％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，更具体地95％或更多，甚至更具体地97％或更多，最具体地99％或更多)的基因之间进行杂交，而不在同源性或同一性低于上述那些的基因之间进行杂交，或进行一次杂交，具体地2或3次——在Southern杂交的常规洗涤下，在如下盐浓度和温度下：60℃、1×SSC和0.1％SDS，具体地60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更具体地68℃、0.1×SSC和0.1％SDS。

杂交需要两个核酸具有互补序列，尽管根据杂交的严格程度碱基会错配。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸的碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开可以不仅包括基本上相似的核酸序列，还包括分离的但与完整序列互补的核酸片段。

具体地，具有同源性或同一性的多核苷酸可以利用上述杂交条件检测，包括在55℃的T_m值下的杂交过程。此外，T_m值可以是但不限于60℃、63℃或65℃，并且可以由本领域技术人员根据预期目的适当地调整。

多核苷酸杂交的适当严格程度可取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且其参数在本领域中是公知的(Sambrook等，同上，9.50-9.51、11.7-11.8)。

具体地，表述“修饰多核苷酸由选自SEQ ID NO：3至5的一种核苷酸序列或具有至少80％或更多且小于100％的序列同源性的核苷酸序列组成”不排除在与目标基因的连接过程(例如利用限制酶)中可能发生的核苷酸的添加和/或缺失和/或突变——在多核苷酸作为启动子以与目标基因连接的状态使用的情况下。

例如，由选自SEQ ID NO：3至5的一种核苷酸序列组成并具有启动子活性的多核苷酸还可以包括在严格条件下与选自SEQ ID NO：3至5的一种核苷酸序列的完全或部分互补核苷酸序列杂交以具有本公开的启动子活性的多核苷酸。

包括本公开的修饰多核苷酸的微生物的特征在于包括缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸在内的支链氨基酸的生产增加。虽然属于棒状杆菌属的野生型菌株不能生产支链氨基酸或生产痕量的支链氨基酸，但本公开的具有启动子活性的多核苷酸的意义在于其增加了支链氨基酸的生产。

【实施例】

在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本公开。然而，以下实施例仅被展示以示例本公开，而本公开的范围不限于此。

实施例1.通过人工诱变选择缬氨酸生产能力增强的突变菌株

实施例1-1.通过UV辐射诱导人工突变

为了选择具有增强的缬氨酸(代表性支链氨基酸)生产能力的突变菌株，将作为缬氨酸生产菌株的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCCM11201P(韩国专利号10-1117022)涂在含琼脂的营养培养基上，并且在30℃下培养36小时。从中获得数百个集落并将其在室温下暴露于UV射线以诱导菌株基因组的随机突变。

实施例1-2.突变诱导菌株的发酵效价(Titer)评估和选择

为了选择与用作亲本菌株的谷氨酸棒杆菌KCCM11201P相比具有增强的L-缬氨酸生产能力的突变菌株，对诱导了随机突变的菌株进行发酵效价测试。在营养培养基中对每个集落进行继代培养后，将各菌株接种到含有25mL生产培养基的250mL带挡板三角烧瓶(corner-baffled flask)中，并在30℃以200rpm振荡培养72小时。然后，利用HPLC分析L-缬氨酸的浓度，并且L-缬氨酸的分析浓度显示在下表1中。

营养培养基(pH 7.2)

10g葡萄糖、5g肉汁、10g聚蛋白胨、2.5g氯化钠、5g酵母提取物、20g琼脂、2g尿素(基于1L蒸馏水)

生产培养基(pH 7.0)

100g葡萄糖、40g硫酸铵、2.5g大豆蛋白、5g玉米浆、3g尿素、1g磷酸氢二钾、0.5g七水硫酸镁、100μg生物素、1mg硫胺素-HCl、2mg泛酸钙、3mg烟酰胺和30g碳酸钙(基于1L蒸馏水)

表1

与用作对照的KCCM11201P菌株相比，选择缬氨酸生产增加最多的A7菌株(参见表1)。

实施例2.通过基因测序确认突变

对具有增强的缬氨酸生产能力的A7菌株的主要基因进行测序，并与KCCM11201P菌株和野生型谷氨酸棒杆菌ATCC14067菌株的主要基因进行比较。结果是，证实A7菌株在乙酸代谢调控因子A的启动子位置处含有突变。

具体地，证实A7菌株具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列，其包括在ramA基因的启动子区域(SEQ ID NO：1)处的突变。

在以下实施例中，考察插入ramA基因启动子区域的特定位置的修饰对缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸(其是棒状杆菌属微生物的支链氨基酸)生产的影响和通过ramA基因启动子的改进或取代而增强的RamA表达对缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸生产的影响。

实施例3.引入有修饰的菌株的构建和缬氨酸生产能力的确认

实施例3-1.启动子修饰在谷氨酸棒杆菌KCCM11201P菌株中的引入和L-缬氨酸生产能力的评价

为了将SEQ ID NO：2表示的ramA基因启动子被修饰的多核苷酸插入谷氨酸棒杆菌KCCM11201P中，制备包括目标修饰的载体。具体地，利用G-spin Total DNA ExtractionMini试剂盒(Intron，目录号17045)按照该试剂盒的方案提取A7菌株的基因组DNA，并且利用该基因组DNA为模板进行PCR。PCR在以下条件下进行：94℃变性5分钟；25个循环的94℃变性30秒，55℃退火30秒，和72℃聚合150秒；然后72℃聚合7分钟，利用SEQ ID NO：9和10获得1114bp的PCR产物(以下称为“修饰引入片段1”)。

在用限制酶XbaI((New England Biolabs,Beverly,MA)处理所获得的修饰引入片段1后，利用T4连接酶(New England Biolabs,Beverly,MA)将修饰引入片段1连接到经相同限制酶处理的pDZ载体(韩国专利号10-0924065和国际专利申请公开号2008-033001)。在用所构建的基因转化大肠杆菌(E.coli)DH5α后，在含有卡那霉素的LB培养基中选择转化的菌株，并利用DNA-spin质粒DNA纯化试剂盒(iNtRON)从中获得DNA，以制备包含修饰引入片段1的pDZ-Pm-ramA载体。

表2

引物	碱基序列	SEQ ID NO:
			Pm(TATAAT)-F1	gctctagaTAGGCCGGTTCGGACTCGCCCTGCC	SEQ ID NO:9
Pm(TATAAT)-R1	gctctagaaacgtgcgcgcagtcatggtgactt	SEQ ID NO:10

将谷氨酸棒杆菌KCCM11201P通过染色体同源重组(van der Rest et al.,ApplMicrobiol Biotechnol 52:541-545,1999)用pDZ-Pm-ramA载体转化。在含有卡那霉素(25mg/l)的培养基中选择通过同源序列重组染色体中插入了该载体的菌株。然后，对利用SEQ ID NO：9和10完成二次重组的谷氨酸棒杆菌转化体进行PCR，并且确认其中染色体上ramA(SEQ ID NO：1)的上游区域处的启动子中插入修饰的菌株。该重组菌株被命名为谷氨酸棒杆菌KCCM11201P-Pm-ramA。

为了在生产缬氨酸的谷氨酸棒杆菌KCCM11201P和KCCM11201P-Pm-ramA之间比较缬氨酸生产能力，进行烧瓶评价。在营养培养基中对各菌株进行继代培养后，将各菌株接种到含有25mL生产培养基的250mL带挡板三角烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养72小时。然后，利用HPLC分析L-缬氨酸的浓度，并且L-缬氨酸的分析浓度示于下表3中。

营养培养基(pH 7.2)

生产培养基(pH 7.0)

100g葡萄糖、40g硫酸铵、2.5g大豆蛋白、5g玉米浆、3g尿素、1g磷酸氢二钾、0.5g七水硫酸镁、100μg生物素、1mg硫胺素-HCl、2mg泛酸钙、3mg烟酰胺、30g碳酸钙(基于1L蒸馏水)

表3

KCCM11201P和KCCM11201P-Pm-ramA的L-缬氨酸生产能力

结果是，证实与KCCM11201P相比，KCCM11201P-Pm-ramA菌株的L-缬氨酸生产能力增强约23％。

实施例3-2。启动子被改进和取代的谷氨酸棒杆菌KCCM11201P突变菌株的构建及所构建菌株的L-缬氨酸生产能力评价

如上述实施例3-1的结果所示，证实通过修饰ramA基因启动子增强了缬氨酸生产能力，因此基于SEQ ID NO：2的修饰启动子构建了用于改进或取代ramA启动子的载体。以进一步增加ramA的表达。

为了构建包含修饰的载体，合成表4的引物3(SEQ ID NO：11)至引物10(SEQ IDNO：18)，以在5'端和3'端具有xbaI限制性酶区域。

改进的ramA启动子被命名为Pm1、Pm2和Pm3-ramA，并且利用SEQ ID NO：11和13的引物对；以及SEQ ID NO：12和14的引物对来构建Pm1-ramA，并且利用SEQ ID NO：11和15的引物对以及SEQ ID NO：12和14的引物对来构建Pm2-ramA。此外，利用SEQ ID NO：11和17的引物对；以及SEQ ID NO：12和18的引物对来构建Pm3-ramA。

利用野生型谷氨酸棒杆菌的各引物和染色体DNA作为模板进行PCR[Sambrook etal.,Molecular Cloning,a Laboratory Manual(1989),Cold Spring HarborLaboratories]。

在这种情况下，PCR在以下条件下进行：95℃变性5分钟；30个循环的94℃变性30秒，56℃退火30秒，和72℃聚合1分钟；然后72℃聚合7分钟。

然后，将从上述过程获得的PCR产物和先前制备的pDZ-Pm-ramA载体用xbaI限制酶处理，然后融合克隆。融合克隆利用

HD克隆试剂盒(Clontech)进行。用其转化大肠杆菌DH5α并涂在含有卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基上。通过PCR选择其中插入了目标基因的质粒所转化的集落，并且通过提取得到质粒，分别命名为pDZ-Pm1-ramA、pDZ-Pm2-ramA和pDZ-Pm3-ramA。

表4

另外，分开地，为了将ramA启动子用更强的启动子Pcj7取代，合成表4的引物11(SEQ ID NO：19)至引物16(SEQ ID NO：24)以在5'端和3'端具有xbaI限制酶区域。

利用SEQ ID NO：19和20的引物对；SEQ ID NO：21和22的引物对；以及SEQ ID NO：23和24的引物对，以与上述实施例3-1中构建载体的方法相同的方式构建pDZ-Pcj7-ramA载体。

通过染色体同源重组(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545,1999)，用pDZ-Pm1-ramA、pDZ-Pm2-ramA、pDZ-Pm3-ramA和pDZ-Pcj7-ramA载体转化谷氨酸棒杆菌KCCM11201P。在含有卡那霉素(25mg/l)的培养基中选择其染色体中通过同源序列重组而插入了所述载体的菌株。然后，利用其中使用SEQ ID NO：9和10完成二次重组的谷氨酸棒杆菌转化体进行PCR，并确认其中ramA启动子被改进和被Pcj7启动子取代的菌株。

在重组菌株中，谷氨酸棒杆菌KCCM11201P-Pm1-ramA、KCCM11201P-Pm2-ramA和KCCM11201P-Pm3-ramA分别被命名为CA08-1518、CA08-1519和CA08-1520，并于2020年4月27日被保藏在认定为布达佩斯条约下的国际保藏机构的韩国微生物保藏中心(theKoreanCulture Center of Microorganisms)(KCCM)，登录号分别为KCCM12704P、KCCM12705P和KCCM12706P。

另外，经Pcj7启动子取代的菌株被命名为KCCM11201P-Pcj7-ramA。随后，以与上述实施例3-1相同的方式评价缬氨酸生产能力，并且结果示于下表5中。

表5

基于表5的结果，证实KCCM11201P-Pm1-ramA(CA08-1518)、KCCM11201P-Pm2-ramA(CA08-1519)和KCCM11201P-Pm3-ramA(CA08-1520)菌株——其包括与KCCM11201P菌株相比改进的启动子——的L-缬氨酸生产分别增加约27％、23％和19％，其类似于或高于经更强启动子取代的KCCM11201P-Pcj7-ramA菌株的L-缬氨酸生产能力。

实施例3-3：其中ramA基因启动子被改进和取代的谷氨酸棒杆菌CJ7V菌株的突变菌株的构建和所构建菌株的L-缬氨酸生产能力评价

为了鉴定在属于谷氨酸棒杆菌的其他L-缬氨酸生产菌株中是否实现增强L-缬氨酸生产能力的效果，在野生型谷氨酸棒杆菌ATCC14067中引入一种修饰[ilvN(A42V)；Biotechnology and Bioprocess Engineering,June 2014,Volume 19,Issue 3,pp 456-467]，以制备具有增强的L-缬氨酸生产能力的菌株。

具体地，利用G-spin Total DNA Extraction Mini试剂盒(Intron，目录17045)按照试剂盒的方案进行提取野生型谷氨酸棒杆菌ATCC14067菌株的基因组DNA。利用该基因组DNA作为模板进行PCR。为了构建将A42V修饰引入ilvN基因的载体，分别利用SEQ ID NO：25和26的引物对；以及为SEQ ID NO：27和28的引物对获得基因片段A和B。PCR在以下条件下进行：94℃变性5分钟；25个循环的94℃变性30秒，55℃退火30秒，和72℃聚合60秒，然后72℃聚合7分钟。

结果是，获得了多核苷酸片段A和B，两者均包括537bp。利用这两个片段作为模板通过SEQ ID NO：25和26进行重叠PCR，得到1044bp的PCR产物(以下称为“修饰引入片段2”)。

在用限制酶XbaI(New England Biolabs,Beverly,MA)处理获得的引入修饰片段2后，利用T4连接酶(New England Biolabs,Beverly,MA)将修饰引入片段2连接到用相同限制酶处理的pDZ载体。用所构建的基因转化大肠杆菌DH5α后，在含有卡那霉素的LB培养基中选择转化的菌株，并利用DNA-spin质粒DNA纯化试剂盒(iNtRON)从中获得DNA。用于引入ilvN基因的A42V修饰的载体被命名为pDZ-ilvN(A42V)。

表6

引物	碱基序列	SEQ ID NO:
			引物17	aatttctagaggcagaccctattctatgaagg	SEQ ID NO:25
引物18	agtgtttcggtctttacagacacgagggac	SEQ ID NO:26
			引物19	gtccctcgtgtctgtaaagaccgaaacact	SEQ ID NO:27
引物20	aatttctagacgtgggagtgtcactcgcttgg	SEQ ID NO:28

随后，通过染色体同源重组(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol52:541-545,1999)用pDZ-ilvN(A42V)载体转化野生型谷氨酸棒杆菌ATCC14067。在含有卡那霉素(25mg/l)的培养基中选择其染色体中通过同源序列重组插入了所述载体的菌株。然后，通过对利用SEQ ID NO：25和26完成了二次重组的谷氨酸棒杆菌转化体进行的PCR，使基因片段扩增，并通过基因测序确认其中插入了修饰的菌株。重组菌株被命名为谷氨酸棒杆菌CJ7V。

最后，以与实施例3-1和3-2相同的方式用载体转化谷氨酸棒杆菌CJ7V，并且菌株分别被命名为谷氨酸棒杆菌CJ7V-Pm1-ramA、CJ7V-Pm2-ramA、CJ7V-Pm3-ramA和CJ7V-Pcj7-ramA。为在所构建菌株之间比较L-缬氨酸生产能力，以与上述实施例3-1相同的方式培养菌株，分析L-缬氨酸的浓度，并且L-缬氨酸的分析浓度示于下表7中。

表7

L-缬氨酸生产能力的比较

如表7所示，证实包含改进的启动子的CJ7V-Pm1-ramA、CJ7V-Pm2-ramA和CJ7V-Pm3-ramA菌株的L-缬氨酸生产分别增加约23％、18％和14％，其类似于或高于经更强启动子取代的CJ7V-Pcj7-ramA菌株的L-缬氨酸生产能力。

实施例3-4：其中ramA基因启动子被改进和取代的谷氨酸棒杆菌CJ8V的突变菌株的构建及所构建菌株的L-缬氨酸生产能力评价

为了鉴定在属于谷氨酸棒杆菌的其他L-缬氨酸生产菌株中是否实现增强L-缬氨酸生产能力的效果，以与实施例3-3的方法相同的方式在野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869中引入一种修饰，以制备具有L-缬氨酸生产能力的菌株，并将该重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌CJ8V。

最后，以与实施例3-1和3-2的方法相同的方式用载体转化谷氨酸棒杆菌CJ8V，并且该菌株分别被命名为谷氨酸棒杆菌CJ8V-Pm1-ramA、CJ8V-Pm2-ramA、CJ8V-Pm3-ramA和CJ8V-Pcj7-ramA。为了在所构建菌株之间比较L-缬氨酸生产能力，将菌株以与上述实施例3-1相同的方式培养，分析L-缬氨酸的浓度，并且L-缬氨酸的分析浓度示于下表8中。

表8

L-缬氨酸生产能力

如表8所示，证实与CJ8V菌株相比，包括改进的启动子的CJ8V-Pm1-ramA、CJ8V-Pm2-ramA和CJ8V-Pm3-ramA菌株的L-缬氨酸生产分别增加约21％、16％和10％，其类似于或高于经更强启动子取代的CJ8V-Pcj7-ramA菌株的L-缬氨酸生产能力。

实施例4.其中引入了启动子修饰的L-亮氨酸生产谷氨酸棒杆菌KCCM11661P和 KCCM11662P的突变菌株的构建和L-亮氨酸生产能力的评价

通过染色体同源重组(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541–545,1999)，用pDZ-Pm1-ramA、pDZ-Pm2-ramA、pDZ-Pm3-ramA和pDZ-Pcj7-ramA载体转化谷氨酸棒杆菌KCCM11661P和KCCM11662P。在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基中选择其染色体中通过同源序列重组插入了载体的菌株。然后，对利用SEQ ID NO：9和10完成二次重组的谷氨酸棒杆菌转化体进行PCR，并确认其中ramA启动子被改进和被Pcj7取代的菌株。重组菌株分别被命名为谷氨酸棒杆菌KCCM11661P-Pm1-ramA、KCCM11661PPm2-ramA、KKCCM11661P-Pm3-ramA、KCCM11661P-Pcj7-ramA和KCCM11662P-Pm1-ramA、KCCM11662P-Pm2-ramA、KCCM11662P-Pm3-ramA和KCCM11662P-Pcj7-ramA。

按照以下方法培养所构建的菌株并比较亮氨酸生产能力。

在营养培养基中继代培养各菌株后，将各菌株接种到含有25mL生产培养基的250mL带挡板三角烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养72小时。然后，利用HPLC分析L-亮氨酸的浓度，并且L-亮氨酸的分析浓度示于下表9中。

<营养培养基(pH 7.2)>

<生产培养基(pH 7.0)>

50g葡萄糖、20g硫酸铵、20g玉米浆、1g磷酸氢二钾、0.5g七水硫酸镁、100μg生物素、1mg硫胺素-HCl和15g碳酸钙(基于1L蒸馏水)

表9L-亮氨酸生产能力

结果是，证实包括改进的启动子的KCCM11661P-Pm1-ramA、KCCM11661P-Pm2-ramA和KCCM11661P-Pm3-ramA菌株的L-亮氨酸生产与KCCM11661P菌株相比分别增加了11％、7％和11％，其类似于或高于经更强启动子取代的KCCM11661P-Pcj7-ramA菌株的L-亮氨酸生产能力。

此外，证实包括改进的启动子的KCCM11662P-Pm1-ramA、KCCM11662P-Pm2-ramA和KCCM11662P-Pm3-ramA菌株的L-亮氨酸生产与KCCM11662P菌株相比分别增加10％、6％和10％，其类似于或高于经更强启动子取代的KCCM11662P-Pcj7-ramA菌株的L-亮氨酸生产能力。

实施例5.其中ramA基因启动子被改进和取代的L-异亮氨酸生产谷氨酸棒杆菌KCCM11248P突变菌株的构建和L-异亮氨酸生产能力的评价

为了鉴定在属于谷氨酸棒杆菌的其他L-异亮氨酸生产菌株中是否实现增强L-异亮氨酸生产能力的效果，以与上述实施例3-1和3-2相同的方式用载体转化生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌KCCM11248P菌株，并且转化的菌株分别被命名为谷氨酸棒杆菌KCCM11248P-Pm-ramA、KCCM11248P-Pm1-ramA、KCCM11248P-Pm2-ramA、KCCM11248P-Pm3-ramA和KCCM11248P-Pcj7-ramA。按照以下方法培养KCCM11248P-Pm-ramA、KCCM11248P-Pm1-ramA、KCCM11248P-Pm2-ramA、KCCM11248P-Pm3-ramA和KCCM11248P-Pcj7-ramA菌株，并评价异亮氨酸生产能力。

将各菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL带挡板三角烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL种子培养基接种到含有24mL生产培养基的250mL带挡板三角烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。

<种子培养基(pH 7.0)>

20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH₂PO₄、8g K₂HPO₄、0.5gMgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1000μg硫胺素HCl、2000μg泛酸钙和2000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)

<生产培养基(pH 7.0)>

50g葡萄糖、12.5g(NH₄)₂SO₄、2.5g大豆蛋白、5g玉米浆、3g尿素、1g KH₂PO₄、0.5gMgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1000μg硫胺素HCl、2000μg泛酸钙、3000μg烟酰胺、30g CaCO₃(基于1L蒸馏水)

培养完成后，通过HPLC测量L-异亮氨酸的浓度，并且L-异亮氨酸的测量浓度示于下表10中。

表10

结果是，证实包含改进的启动子的KCCM11248P-Pm1-ramA、KCCM11248P-Pm2-ramA和KCCM11248P-Pm3-ramA菌株的L-异亮氨酸生产与KCCM11248P菌株相比分别增加39％、32％和18％，其类似于或高于经更强启动子取代的KCCM11248P-Pcj7-ramA菌株的L-异亮氨酸生产能力。

本公开的上述描述以示例目的提供，并且本领域技术人员将理解，在不改变本公开的技术构思和基本特征的情况下，可以进行各种改变和修改。因此，显然，上述实施方式在所有方面都是示例性的，并且不限制本公开。因此，本公开的范围不是由详细描述限定，而是由权利要求及其等同形式限定，并且权利要求及其等同形式范围内的所有变型都将被解释为被包括在本公开中。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> L-支链氨基酸生产能力增强的微生物和利用其生产L-支链氨基酸的方法

<130> OPA21067-PCT

<150> KR 10-2020-0061175

<151> 2020-05-21

<160> 28

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RamA基因启动子

<400> 1

gcgatccgcc tcgactatgt tcacccccaa aggggaagta cactgtaccc ttgtc 55

<210> 2

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RamA基因启动子变体

<400> 2

gcgatccgcc tcgactatgt tcacccccaa aggggaagta taatgtaccc ttgtcgaatg 60

attgttactc gtgacgcgcc ctatgggtgt accagcacgg gtgtaaagca ggaggaaatc 120

tgaag 125

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RamA基因启动子变体Pm1

<400> 3

gcgatccgcc tcgactatgt tcacccccaa aggtgtggta taatggaccc ttgtc 55

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RamA基因启动子变体Pm2

<400> 4

gcgatccgcc tcgactatgt tcacccccaa aggggaagta taatggaccc ttgtc 55

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RamA基因启动子变体Pm3

<400> 5

gcgatccgcc tcgactatgt tcacccccaa aggtgtggta cactggaccc ttgtc 55

<210> 6

<211> 512

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RamA基因启动子变体Pcj7

<400> 6

gcgatccgcc tcgactatgt tcacccccaa aggggaagta cactgtaccc ttgtcgaatg 60

attgttactc gtgacgcgcc ctatgggtgt accagcacgg gtgtaaagca ggaggaaatc 120

tgaaggtacc gccggcatag cctaccgatg tagattccac cccatctgtc tcccagtaca 180

ttttttcatg accccagaaa catcccagcg ctactaatag ggagcgttga ccttccttcc 240

acggaccggt aatcggagtg cctaaaaccg catgcggctt aggctccaag ataggttctg 300

cgcggccggg taatgcatct tctttagcaa caagttgagg ggtaggtgca aataagaacg 360

acatagaaat cgtctccttt ctgtttttaa tcaacataca ccaccaccta aaaattcccc 420

gaccagcaag ttcacagtat tcgggcacaa tatcgttgcc aaaatattgt ttcggaatat 480

catgggatac gtacccaacg aaaggaaaca ct 512

<210> 7

<211> 846

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RamA基因ATCC14067

<400> 7

gtggataccc agcggattaa agatgacgaa gatgctattc gttcggcgct gacatcgctg 60

aaaaccgcaa caggcatccc agtcaccatg ttcgccactg tgttgcagga caatcgcctg 120

caaattactc agtgggttgg gttgcgtacc ccggctctgc agaatctggt cattgaacca 180

ggtgtgggcg ttggtggacg cgtcgtcgca acccgtcgtc cggttggtgt gagtgattac 240

accagggcaa atgtcatttc acatgagaag gattccgcga ttcaggatga gggccttcat 300

tccattgtcg cagttcccgt gatcgtgcac cgcgaaatcc gtggcgtttt gtatgttggc 360

gttcactctg cggtgcgtct cggcgacact gttattgaag aagtcaccat gactgcgcgc 420

acgttggaac aaaacctggc gatcaactcc gcgcttcgcc gcaatggcgt tcctgatggt 480

cgcggttccc tcaaagctag ccgcgtgatg aatggggcgg agtgggagca ggttcgttcc 540

actcattcca agctgcgcat gctggcaaat cgtgtgaccg atgaggatct gcgccgcgat 600

ttggaagagc tttgcgatca gatggtcacc ccagtccgca tcaagcagac caccaagctg 660

tccgcgcgtg agttggacgt gctggcttgt gtcgcgctcg gtcacaccaa cgtcgaagct 720

gctgaagaga tgggcatcgg cgcggaaacc gtcaagagct acctgcgctc ggtcatgcgc 780

aagctcggcg cccacacgcg ctacgaggca gtcaacgcag cacgccggat cggcgcactg 840

ccttaa 846

<210> 8

<211> 281

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RamA基因ATCC14067 a.a.

<400> 8

Met Asp Thr Gln Arg Ile Lys Asp Asp Glu Asp Ala Ile Arg Ser Ala

1 5 10 15

Leu Thr Ser Leu Lys Thr Ala Thr Gly Ile Pro Val Thr Met Phe Ala

20 25 30

Thr Val Leu Gln Asp Asn Arg Leu Gln Ile Thr Gln Trp Val Gly Leu

35 40 45

Arg Thr Pro Ala Leu Gln Asn Leu Val Ile Glu Pro Gly Val Gly Val

50 55 60

Gly Gly Arg Val Val Ala Thr Arg Arg Pro Val Gly Val Ser Asp Tyr

65 70 75 80

Thr Arg Ala Asn Val Ile Ser His Glu Lys Asp Ser Ala Ile Gln Asp

85 90 95

Glu Gly Leu His Ser Ile Val Ala Val Pro Val Ile Val His Arg Glu

100 105 110

Ile Arg Gly Val Leu Tyr Val Gly Val His Ser Ala Val Arg Leu Gly

115 120 125

Asp Thr Val Ile Glu Glu Val Thr Met Thr Ala Arg Thr Leu Glu Gln

130 135 140

Asn Leu Ala Ile Asn Ser Ala Leu Arg Arg Asn Gly Val Pro Asp Gly

145 150 155 160

Arg Gly Ser Leu Lys Ala Ser Arg Val Met Asn Gly Ala Glu Trp Glu

165 170 175

Gln Val Arg Ser Thr His Ser Lys Leu Arg Met Leu Ala Asn Arg Val

180 185 190

Thr Asp Glu Asp Leu Arg Arg Asp Leu Glu Glu Leu Cys Asp Gln Met

195 200 205

Val Thr Pro Val Arg Ile Lys Gln Thr Thr Lys Leu Ser Ala Arg Glu

210 215 220

Leu Asp Val Leu Ala Cys Val Ala Leu Gly His Thr Asn Val Glu Ala

225 230 235 240

Ala Glu Glu Met Gly Ile Gly Ala Glu Thr Val Lys Ser Tyr Leu Arg

245 250 255

Ser Val Met Arg Lys Leu Gly Ala His Thr Arg Tyr Glu Ala Val Asn

260 265 270

Ala Ala Arg Arg Ile Gly Ala Leu Pro

275 280

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

gctctagata ggccggttcg gactcgccct gcc 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

gctctagaaa cgtgcgcgca gtcatggtga ctt 33

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

gctcggtacc cggggatcct ctagataggc cggttcggac tcgccctgcc 50

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

ttacgccaag cttgcatgct ctagaaacgt gcgcgcagtc atggtgactt 50

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

cgacaagggt ccattatacc acacctttgg gggt 34

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

acccccaaag gtgtggtata atggaccctt gtcg 34

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

tcgacaaggg tacattatac ttccccttt 29

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

aaaggggaag tataatgtac ccttgtcga 29

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

aagggtacag tgtaccacac ctttgggggt 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

acccccaaag gtgtggtaca ctgtaccctt 30

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

attcgagctc ggtacccggt ctagatcaag aaactgcagg tgtgtaccga 50

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

catcggtagg ctatgccggc ggtaccttca gatttcctcc tgctttacac 50

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

gtaccgccgg catagcctac cgatg 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

agtgtttcct ttcgttgggt acgta 25

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

tacgtaccca acgaaaggaa acactgtgga tacccagcgg attaaagatg 50

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

tgcatgcctg caggtcgact ctagaatcgc ggcgcagatc ctcatcggtc 50

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

aatttctaga ggcagaccct attctatgaa gg 32

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac 30

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact 30

<210> 28

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

aatttctaga cgtgggagtg tcactcgctt gg 32

Claims

1.生产L-支链氨基酸的微生物，其具有乙酸代谢调控因子A的增强的活性。

2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述增强的活性是通过以下获得的：在乙酸代谢调控因子A的基因表达调控序列中引入修饰；将所述基因表达调控序列替换成改进表达的序列；另外向所述基因引入修饰以增强所述活性；或其组合。

3.根据权利要求2所述的微生物，其中所述基因表达调控序列是启动子。

4.根据权利要求2所述的微生物，其中所述微生物包含多核苷酸，所述多核苷酸具有启动子活性并且包括在选自SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第34、36、37、41和43位的一个或多个相应位置处核苷酸被不同的核苷酸取代。

5.根据权利要求4所述的微生物，其中所述多核苷酸包含，在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中，第34位核苷酸被T取代；第36位核苷酸被T取代；第37位核苷酸被G取代；第41位核苷酸被T取代；第43位核苷酸被A取代；或其组合。

6.根据权利要求4所述的微生物，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：3至5的一种核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是棒状杆菌(Corynebacterium)属微生物。

8.根据权利要求7所述的微生物，其中所述棒状杆菌属微生物包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

9.生产L-支链氨基酸的方法，所述方法包括在培养基中培养根据权利要求1-8中任一项所述的微生物。

10.根据权利要求9所述的方法，进一步包括从所述培养基或所述微生物回收或分离所述L-支链氨基酸。

11.多核苷酸，所述多核苷酸具有启动子活性并且包括在选自SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第34、36、37、41和43位的一个或多个相应位置处核苷酸被不同的核苷酸取代。

12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含，在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中，第34位核苷酸被T取代；第36位核苷酸被T取代；第37位核苷酸被G取代；第41位核苷酸被T取代；第43位核苷酸被A取代；或其组合。

13.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：3至5的一种核苷酸序列。