CN116670272A

CN116670272A - 生产l-缬氨酸的微生物和使用其生产l-缬氨酸的方法

Info

Publication number: CN116670272A
Application number: CN202180071367.0A
Authority: CN
Inventors: 张真淑; 金善慧; 尹炳勋; 金柱渊; 金亨俊; 崔先亨
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2020-09-01
Filing date: 2021-09-01
Publication date: 2023-08-29
Also published as: EP4190904A1; BR112023003780A2; KR102344689B1; EP4190904A4; WO2022050671A1; CA3191427A1; JP2023540717A; MX2023002502A; US20240026397A1

Abstract

本申请涉及生产L‑缬氨酸的微生物和一种使用该微生物生产L‑缬氨酸的方法。当培养包括具有增强活性的或降低活性的酶的组合的微生物时，可以以高产率生产L‑缬氨酸。

Description

生产L-缬氨酸的微生物和使用其生产L-缬氨酸的方法

技术领域

本公开内容涉及一种生产L-缬氨酸的微生物和一种使用该微生物生产L-缬氨酸的方法。

背景技术

L-缬氨酸是从丙酮酸开始经由乙酰乳酸、二羟基异戊酸和酮异戊酸在微生物中生物合成的一种支链氨基酸。这些中间代谢物是由乙酰羟基酸合成酶、乙酰羟基酸还原异构酶、二羟基酸脱水酶和转氨酶B催化的反应产生。然而，这些酶也参与了从酮丁酸和丙酮酸开始的L-异亮氨酸的生物合成，并且L-亮氨酸也是经由2-异丙基苹果酸、3-异丙基苹果酸和酮异己酸从中间代谢物酮异戊酸生物合成的。因此，由于支链氨基酸，即L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的生物合成途径中使用的酶是相同的，众所周知，通过发酵工业化生产一种支链氨基酸是困难的。此外，最终产品L-缬氨酸或其衍生物会发生反馈抑制，这使得L-缬氨酸的工业化大规模生产变得困难。

然而，迄今为止，已经有关于通过反馈抑制生产缬氨酸的方法的研究(美国专利号10457919)，但还没有关于通过本公开内容的具有增强或降低活性的酶的组合提高缬氨酸生产能力的研究。

发明内容

技术问题

因此，本发明人对生产L-缬氨酸的有效方法进行了持续研究，并且结果证实，与野生型微生物相比，包括增强的二羟基酸脱水酶活性；降低的转氨酶C活性；减弱的丙酮酸脱氢酶活性；降低的柠檬酸合成酶活性；或其组合的微生物具有优越的L-缬氨酸生产能力，从而完成了本发明。

技术方案

本公开内容的一个目的是提供一种生产L-缬氨酸的微生物，其具有增强的二羟基酸脱水酶活性；和选自下述(1)至(3)的任一个或多个组合：

(1)降低的转氨酶C活性；

(2)减弱的丙酮酸脱氢酶活性；

(3)降低的柠檬酸合成酶活性。

本公开内容的另一个目的是提供一种用于生产L-缬氨酸的方法，其包括培养所述微生物。

有益效果

当培养本公开内容的生产L-缬氨酸的微生物时，可以以高产率生产L-缬氨酸。因此，在工业方面可以期待生产便利和生产成本降低的效果。

具体实施方式

下面，将详细描述本公开内容。

同时，本文公开的每个描述和实施方式都可以在共同特征方面适用于其他描述和实施方式。即，本文公开的各种要素的所有组合都在本公开内容的范围内。此外，本公开内容的范围不受下述具体描述的限制。

此外，本领域的普通技术人员只需使用常规实验，就能认识或确认与本文所述发明的特定方面的许多等价物。此外，还打算将这些等价物包括在本公开内容中。

本公开的一个方面提供了一种生产L-缬氨酸的微生物，其具有增强的二羟基酸脱水酶活性；和选自下述(1)至(3)的任一个或多个组合：

(1)降低的转氨酶C活性；

(2)减弱的丙酮酸脱氢酶活性；和

(3)降低的柠檬酸合成酶活性。

在一个实施方式中，生产缬氨酸的微生物可以是具有增强的二羟基酸脱水酶活性和降低的转氨酶C活性的微生物。

在另一个实施方式中，生产缬氨酸的微生物可以是具有增强的二羟基酸脱水酶活性和减弱的丙酮酸脱氢酶活性的微生物。

在又一个实施方式中，生产缬氨酸的微生物可以是具有增强的二羟基酸脱水酶活性和降低的柠檬酸合成酶活性的微生物。

在又一个实施方式中，生产缬氨酸的微生物可以是具有增强的二羟基酸脱水酶活性和降低的柠檬酸合成酶活性，并且另外具有降低的转氨酶C活性或减弱的丙酮酸脱氢酶活性的微生物，但不限于此。

如本文中所使用的，术语“二羟基酸脱水酶”是一种在生产L-缬氨酸的生物合成途径中参与酮异戊酸酯(缬氨酸的前体)的合成的酶，从丙酮酸酯开始经由乙酰乳酸酯、二羟基异戊酸酯到酮异戊酸酯。在本公开内容中，可以通过增强二羟基酸脱水酶的活性来促进L-缬氨酸的生产，并且因此增加酮异戊酸酯的合成。

如本文中所使用的，术语“转氨酶C”是一种参与从丙酮酸合成L-丙氨酸的途径的酶。

如本文中所使用的，术语“丙酮酸脱氢酶”是一种参与从丙酮酸合成乙酰辅酶A的酶。

如本文中所使用的，术语“柠檬酸合成酶”是一种从乙酰辅酶A合成柠檬酸的酶。

如本文中所使用的，术语“增强”是指与蛋白质的内源性活性相比，其活性增加。增强可以与术语比如激活、上调、过表达、增加等互换使用。具体而言，激活、增强、上调、过表达和增加可以包括两种情况，即表现出原来不具备的活性，或者与内源性活性或修饰前的活性相比，活性得到增强。“内源活性”是指当通过自然或人工因素引起的遗传修饰改变性状时，在转化前的亲本菌株或非修饰的微生物最初拥有的特定多肽的活性，并且可以与“修饰前的活性”互换使用。与多肽的内源活性相比，多肽活性的“增强”、“上调”、“过表达”或“增加”是指与转化前的亲本菌株或非修饰的微生物最初拥有的特定多肽相比，多肽的活性和/或浓度(表达水平)增强。

增强可通过引入外来多肽，或通过增强内源性多肽的活性和/或浓度(表达水平)来实现。二羟基酸脱水酶活性的增强可以通过多肽的活性水平、表达水平或多肽排出的产物量的增加来确认。

二羟基酸脱水酶活性的增强可以通过本领域内众所周知的各种方法来应用，并且该方法不受限制，只要与修饰前的微生物相比能提高目标多肽的活性。具体来说，可以使用本领域技术人员众所周知的基因工程和/或蛋白质工程，这是分子生物学的常见方法，但该方法不限于此(例如，Sitnicka等人，Functional Analysis of Genes.Advances in CellBiology.2010，第2卷，1-16，Sambrook等人，Molecular Cloning 2012等)。

具体来说，本公开内容的二羟基酸脱水酶活性的增强可以通过以下方式实现：

1)增加编码该多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数；

2)用具有更强活性的序列替换染色体上编码该多肽的基因的表达调控区；

3)修饰编码基因转录物的起始密码子或5'-UTR的核苷酸序列，该基因转录物编码该多肽；

4)修饰该多肽的氨基酸序列，使多肽的活性得到增强；

5)修饰编码该多肽的多核苷酸序列，使多肽的活性得到增强(例如，修饰多肽基因的多核苷酸序列，以编码经过修饰以增强多肽活性的多肽)；

6)引入表现出多肽活性的外来多肽或编码其的外来多核苷酸；

7)对编码该多肽的多核苷酸进行密码子优化；

8)分析多肽的三级结构，并且从而选择和修饰暴露的部位，或对其进行化学修饰；或

9)选自上述1至8)的两个或多个组合，但并不特别限于此。

更具体而言，

1)增加编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数的方法可以通过将载体引入宿主细胞来实现，该载体与编码多肽的多核苷酸可操作地连接，并且无论宿主细胞如何都能复制和发挥作用。可选地，该方法可以通过将编码多肽的多核苷酸的一个拷贝或两个拷贝引入宿主细胞的染色体来实现。向染色体中的引入可以通过将载体引入宿主细胞来进行，该载体能够将多核苷酸插入宿主细胞的染色体中，但不限于此。该载体如上所述。

2)用具有强活性的序列替换染色体上编码多肽的基因的表达调控区(或表达调控序列)的方法可以通过例如通过删除、插入、非保守或保守替换或其组合诱导对该序列进行修饰以进一步增强表达调控区的活性，或通过用具有更强活性的序列替换该序列而实现。表达调控区可以包括但不特别限于启动子、操作子序列、编码核糖体结合位点的序列和调节转录和翻译终止的序列等。在一个实例中，该方法可以包括用强启动子替换原启动子，但不限于此。

已知的强启动子的实例可以包括CJ1至CJ7启动子(US 7662943 B2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(US 10584338 B2)、O2启动子(US 10273491 B2)、tkt启动子、yccA启动子等，但是强启动子不限于此。

3)修饰编码基因转录物的起始密码子或5'-UTR的核苷酸序列(该基因转录物编码多肽)的方法可以通过例如用编码与内源性起始密码子相比具有更高的多肽表达率的另一个起始密码子的核苷酸序列代替该核苷酸序列来实现，但不限于此。

4)和5)修饰氨基酸序列或多核苷酸序列的方法可以通过对多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列进行删除、插入、非保守或保守替换或其组合来诱导对该序列的修饰以增强多肽的活性，或者通过用经修饰以具有更强活性的氨基酸序列或多核苷酸序列或经修饰以增强活性的氨基酸序列或多核苷酸序列取代该序列来实现，但不限于此。替换可以具体通过同源重组将多核苷酸插入染色体中来进行，但不限于此。本文中使用的载体可进一步包括选择标志物，以确认插入到染色体中。该选择标志物如上所述。

6)引入表现出多肽活性的外来多核苷酸的方法可以通过向宿主细胞引入编码多肽的外来多核苷酸来实现，该多核苷酸表现出与多肽相同/相似的活性。外来多核苷酸可以不受限制地使用，无论其来源或序列如何，只要它表现出与多肽相同/相似的活性。本领域普通技术人员可以通过适当地选择本领域已知的转化方法来进行引入，并且引入的多核苷酸在宿主细胞中的表达能够产生多肽，从而提高其活性。

7)编码多肽的多核苷酸的密码子优化方法可以通过对内源多核苷酸的密码子优化来实现，以增加宿主细胞内的转录或翻译，或者通过优化其密码子，使得可以在宿主细胞内实现外来多核苷酸的优化转录和翻译。

此外，8)分析多肽的三级结构，并且从而选择和修饰暴露的位点，或对其进行化学修饰的方法可以通过例如将待分析的多肽的序列信息与数据库进行比较来实现，该数据库中存储有已知蛋白质的序列信息，以根据序列相似程度确定模板蛋白候选者，并且因此基于该信息确认结构，从而选择和转化或修饰要修饰的或化学修饰的暴露位点。

本公开内容的载体是一种DNA分子，其用作人工运输外来遗传物质到其他细胞的媒介，并且可以包括一个DNA构建体，其含有可操作地连接到合适的表达调控区(表达调控序列)的编码目标多肽的多核苷酸的核苷酸序列，以便能够在合适的宿主细胞中表达目标多肽。表达调控区可以包括能够启动转录的启动子、调节转录的任何操作子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和调节转录和翻译终止的序列。一旦转化到合适的宿主细胞中，该载体可以独立于宿主基因组进行复制或发挥作用，或者可以整合到其基因组中。

本公开内容中使用的载体没有特别限制，并且可以使用本领域中已知的任何载体。通常使用的载体的实例可以包括天然或重组的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等；并且作为质粒载体，可以使用基于pDZ、pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL和pET等的那些。具体来说，可以使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。

在一个实例中，编码目标多肽的多核苷酸可以通过用于细胞内染色体插入的载体插入染色体中。将多核苷酸插入染色体中可通过本领域已知的任何方法进行，例如，通过同源重组，但不限于此。载体可进一步包括选择标志物，以确认插入到染色体中。选择标志物用于选择用载体转化的细胞，即确认目标核酸分子是否被插入，并且可以使用提供可选择表型，比如抗药性、营养缺陷型、对细胞毒剂的抗性或表面多肽的表达的标志物。只有表达选择标志物的细胞才能在用选择剂处理的环境下存活或表现出不同的表型，并且因此可以选择转化的细胞。

如本文中所使用的，术语“转化”是指将含有编码目标多肽的多核苷酸的载体引入宿主细胞或微生物，使得由该多核苷酸编码的多肽能在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸能在宿主细胞中表达，那么转化的多核苷酸是整合到宿主细胞的染色体中并位于其中还是位于染色体外并不重要，并且两种情况都可以包括。此外，该多核苷酸可以包括编码目标多肽的DNA和/或RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要它能被引入宿主细胞并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞中，表达盒是一种包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。表达盒通常可以包括与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止子、核糖体结合位点或翻译终止子。表达盒可以采用可自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可按原样引入宿主细胞中，并与宿主细胞中表达所需的序列可操作地连接，但不限于此。

此外，如本文中所使用的，术语“可操作地连接”是指基因序列与启动并介导编码本公开内容的目标蛋白的多核苷酸的转录的启动子序列功能地连接。

蛋白质活性的这种增强可以是指表现出原来不具备的相应蛋白质的活性，或其活性或浓度基于野生型蛋白质或初始微生物菌株的活性或浓度一般增加1％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，并且最大为1000％或2000％或更多，但不限于此。

具体而言，二羟基酸脱水酶活性的增强可指与野生型微生物、修饰前的微生物或具有非修饰蛋白的微生物相比，微生物中的二羟基酸脱水酶活性增强，从而增加了从二羟基-异戊酸酯合成酮异戊酸酯(L-缬氨酸的前体)，导致L-缬氨酸产量增加。

如本文所使用的，术语“降低”是一个综合概念，包括在自然状态下或修饰前在微生物中表现出的蛋白质的活性被削弱或去除(删除)的情况，即与内源性活性或细胞中编码该蛋白质的基因的一个拷贝相比时，并且可能意味着活性为0％或更高至100％或更低。

蛋白质的这种“活性的降低”是指蛋白质本身的活性被去除或实现低于其原有功能的效果，但并不特别限于此。即，活性的降低具体包括“活性的删除”和“活性的减弱”。

“活性的删除”可以指与天然野生型菌株、亲本菌株或具有非修饰蛋白的菌株相比，酶或蛋白完全不表达，或者即使酶或蛋白被表达，也观察不到其活性。

在本公开内容中，活性的删除可以通过应用本领域众所周知的各种方法来实现。这些方法的实例包括1)删除编码蛋白质的部分或全部基因；2)修饰编码蛋白质的基因序列，使蛋白质的活性被去除或减弱；3)引入反义寡核苷酸(例如，反义RNA)，它与编码蛋白质的基因转录物互补结合；4)在编码蛋白质的基因的SD序列的前端加入与Shine-Dalgarno(SD)序列互补的序列，形成二级结构，从而抑制核糖体的附着；5)逆转录工程(RTE)，在编码蛋白质的基因序列的开放阅读框(ORF)的3′末端上增加将被逆转录的启动子；或其组合，但不特别限于此。

此外，“活性的减弱”可以是指实现低于其原有功能的效果，并且可以通过以下方法实现：删除染色体上编码蛋白质的基因的一部分；用突变的基因替换染色体上编码蛋白质的基因，使蛋白质的活性降低；将突变引入染色体上编码蛋白质的基因的表达调控序列；用具有弱活性的序列替换编码蛋白质的基因的表达调控序列(例如，用比内源性启动子弱的启动子替换该基因的启动子)，等等，但不限于此，并且可以不受限制地使用已知的减弱活性的方法。

这种蛋白质活性的减弱可以是指相应蛋白质的活性被去除，或其活性或浓度基于野生型蛋白质或初始微生物菌株中的活性或浓度一般减少0％、1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％，但不限于此。

具体来说，与天然野生型菌株、突变前的亲本菌株或具有非修饰蛋白的菌株相比，微生物中转氨酶C的活性可能会降低。在一个实施方式中，由于转氨酶C基因的缺失，微生物可能没有转氨酶C蛋白的活性，或者由于转氨酶C基因的起始密码子编码序列被修饰为GTG，从而降低了转氨酶C蛋白的表达，因此可能具有减弱的活性。

此外，具体而言，与天然野生型菌株、突变前的亲本菌株或具有非修饰蛋白的菌株相比，微生物中丙酮酸脱氢酶的活性可能降低。在一个实施方式中，由于丙酮酸脱氢酶基因的缺失，该微生物可能没有丙酮酸脱氢酶蛋白的活性，或者由于丙酮酸脱氢酶基因的起始密码子编码序列被修饰为GTG，从而降低了丙酮酸脱氢酶蛋白的表达，因此可能具有减弱的活性。在另一个实施方式中，由于丙酮酸脱氢酶基因的序列在微生物中发生突变，该微生物可表达具有比野生型蛋白更弱的活性的丙酮酸脱氢酶突变体，其中对应于从SEQ ID NO：3的氨基酸序列的N-末端起第432或435位的氨基酸被另一个氨基酸取代。特别是，具有比野生型蛋白更弱的活性的丙酮酸脱氢酶突变体可以包括SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的序列，但不限于此。

此外，具体而言，与天然野生型菌株、突变前的亲本菌株或具有非修饰蛋白的菌株相比，微生物中柠檬酸合成酶的活性可能降低。在一个实施方式中，由于柠檬酸合成酶基因的缺失，该微生物可能没有柠檬酸合成酶蛋白的活性，或者由于柠檬酸合成酶基因的起始密码子编码序列被修饰为GTG，从而降低了柠檬酸合成酶蛋白的表达，因此可能具有减弱的活性。在另一个实施方式中，由于柠檬酸合成酶基因的序列在微生物中发生突变，该微生物可表达具有比野生型蛋白活性降低的柠檬酸合成酶突变体，其中对应于从SEQ ID NO：4的氨基酸序列的N-末端起第241位或第312位的氨基酸被另一个氨基酸取代。特别是，具有比野生型蛋白活性降低的柠檬酸合成酶突变体可以包括SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列，但不限于此。

只要取代前的氨基酸被另一个氨基酸取代，‘用另一个氨基酸取代’的表述就没有限制。具体来说，它可以被选自赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、精氨酸和谷氨酰胺的任一种氨基酸取代。

更具体而言，具有减弱活性的丙酮酸脱氢酶可以是其中对应于从SEQ ID NO：3的氨基酸序列的N-末端起第432或435位的氨基酸被非极性氨基酸取代的丙酮酸脱氢酶。

此外，更具体而言，具有降低活性的柠檬酸合成酶可以是其中对应于从SEQ IDNO：4的氨基酸序列的N-末端起第241位或第312位的氨基酸被极性或非极性氨基酸取代的柠檬酸合成酶。

如本文中所使用的，术语“对应于”是指在蛋白质或多肽中的所述位置的氨基酸残基，或与蛋白质或多肽中所述残基类似、相同或同源的氨基酸残基。如本文中所使用的，“相应区域”一般是指相关蛋白质或参考蛋白质中的类似或相应位置。

在本公开内容中，可以采用本文所用蛋白质中氨基酸残基位置的具体编号。例如，可以通过将本公开内容的蛋白质的序列与待比较的目标蛋白质对齐，将本公开内容的蛋白质的氨基酸残基位置重新编号为相应位置。

如本文中所使用的，术语‘同源性’或‘同一性’是指两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并且可以用百分比表示。术语同源性和同一性常常可以互换使用。

保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准的比对算法来确定，并且可以结合由所使用的程序确定的默认缺口罚分使用。实质上，通常期望同源或相同的序列在中等或高度严格的条件下与全部或部分序列进行杂交。显然，也包括与杂交多核苷酸中含有一般密码子或简并密码子的多核苷酸的杂交。

例如，可以使用默认参数通过已知的计算机算法，比如“FASTA”程序(Pearson等人，(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]：2444)来确定任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性。可选地，可以通过Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来确定，该算法使用EMBOSS软件包的Needleman程序进行(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，Trends Genet.16：276-277)(优选地，5.0.0版本或其后的版本)(GCG程序包(Devereux，J.等人，Nucleic AcidsResearch 12：387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，[S.][F.,][ET AL.，J MOLECBIOL 215]：403(1990)；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，[ED.,]AcademicPress，San Diego，1994和[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例如，可以使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性或同一性。

例如，可以通过使用例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math(1981)2:482中公开的GAP计算机程序，比如Needleman等人(1970)，J Mol Biol.48：443比较序列信息来确定多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性。总之，GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为用相似的排列符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短的符号的总数得到的值。GAP程序的默认参数可以包括：(1)单数比较矩阵(包含值1(对于同一性)和0(对于非同一性))和Gribskov等人(1986)，Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵(如Schwartz和Dayhoff编，Atlas of Protein Sequence and Structure，National BiomedicalResearch Foundation，pp.353-358(1979)所公开的)(或EDNAFULL替代矩阵(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本))；(2)对每个缺口罚分3.0，并对每个缺口的每个符号再罚分0.10(或缺口开口罚分10，缺口延伸罚分0.5)；以及(3)对末端缺口不罚分。

如本文中所使用的，术语“变体”是指通过保守取代和/或修饰而不同于所述序列的具有一个或多个氨基酸的蛋白质，从而保留了蛋白质的功能和特性。这些变体与通过取代、删除或增加几个氨基酸而确定的序列不同。这种变体一般可以通过修饰蛋白质的一个或多个上述氨基酸序列并评估修饰后的蛋白质的特性来确定。即，相对于原生蛋白，变体的能力可能会增强、不变或降低。其他变体可以包括那些从成熟蛋白质的N-和/或C-末端去除区域的变体。术语“变体”可与术语比如修饰物、修饰蛋白、修饰多肽、突变体、突变蛋白质、分歧体、变体等互换使用，只要这些术语用于表示变异，但这些术语不限于此。就本公开内容的目的而言，变体可以是那些与天然野生型蛋白或非修饰蛋白相比，蛋白活性降低或减弱的那些，但不限于此。

如本文中所使用的，术语“保守取代”是指氨基酸用具有类似结构和/或化学性质的另一种氨基酸替代。这种氨基酸取代通常可基于极性、电荷(碱性、酸性)、可溶性、疏水性、亲水性和/或残基的两亲性的相似性而发生。

此外，变体还可以包括对多肽的性质和二级结构影响最小的氨基酸的删除或添加。例如，多肽可以在N-末端与参与蛋白质共同翻译或翻译后转移的信号(或前导)序列缀合。此外，多肽还可以与另一个序列或接头缀合以识别、纯化或合成多肽。

如本文中所使用的，术语“生产L-缬氨酸的微生物”是指与野生型或非修饰微生物相比，能够在培养基中从碳源产生过量的L-缬氨酸的微生物。此外，生产L-缬氨酸的微生物可以是重组的微生物。具体来说，该微生物不受其类型的特别限制，只要能产生L-缬氨酸，并且可以是肠杆菌属、埃希氏杆菌属、欧文氏菌属、沙雷特氏菌属、普罗维登斯菌属、棒状杆菌属和短杆菌属的微生物。更具体而言，它可以是棒状杆菌属或埃希氏杆菌属的微生物。

甚至更具体而言，埃希氏杆菌属的微生物可以是大肠埃希杆菌，并且棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌，并且可以包括能够增加L-缬氨酸产量的棒状杆菌属或埃希氏杆菌属的任何微生物，其中引入了增强的二羟基酸脱水酶活性；和选自降低的转氨酶C活性；降低的丙酮酸脱氢酶活性；或降低的柠檬酸合成酶活性中的任一个或多个组合。

生产L-缬氨酸的微生物的亲本菌株只要是生产L-缬氨酸的微生物，就没有特别限制，该微生物被修饰为具有增强的二羟基酸脱水酶活性；和选自下述(1)至(3)的任一个或多个组合：

(1)降低的转氨酶C活性；

(2)减弱的丙酮酸脱氢酶活性；和

(3)降低的柠檬酸合成酶活性。

生产L-缬氨酸的微生物可以是天然微生物本身，或者也可以是通过插入与外部L-缬氨酸生产机制有关的基因或增强或降低(减弱或抑制)内源性基因的活性而具有改进的L-缬氨酸生产能力的微生物。

在一个实施方式中，微生物可以是与突变前的野生型或亲本菌株相比具有增强的二羟基酸脱水酶的活性和与突变前的野生型或亲本菌株相比具有降低的转氨酶C的活性的生产L-缬氨酸的微生物。特别是，二羟基酸脱水酶可由ilvD基因编码，并且转氨酶C可由avtA基因编码。基因可以源自谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。

在另一个实施方式中，该微生物可以是与突变前的野生型或亲本菌株相比具有增强的二羟基酸脱水酶的活性和与突变前的野生型或亲本菌株相比具有减弱的丙酮酸脱氢酶的活性的生产L-缬氨酸的微生物。特别是，二羟基酸脱水酶可由ilvD基因编码，并且丙酮酸脱氢酶可由aceE基因编码。基因可以源自谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。

在另一个实施方式中，微生物可以是与突变前的野生型或亲本菌株相比具有增强的二羟基酸脱水酶的活性和与突变前的野生型或亲本菌株相比具有降低的柠檬酸合成酶的活性的生产L-缬氨酸的微生物。特别是，二羟基酸脱水酶可由ilvD基因编码，并且柠檬酸合成酶可由gltA基因编码。基因可以源自谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。

除上述微生物外，还可以是这样的生产L-缬氨酸的微生物，其中与突变前的野生型或亲本菌株相比转氨酶C的活性降低或丙酮酸脱氢酶的活性降低，或者可以是这样的生产L-缬氨酸的微生物，其中与突变前的野生型或亲本菌株相比转氨酶C的活性降低和丙酮酸脱氢酶的活性降低。

本公开内容的另一个方面提供了一种生产L-缬氨酸的方法，其包括：培养一种生产L-缬氨酸的微生物，其特征在于具有增强的二羟基酸脱水酶活性；和选自下述(1)至(3)的任一个或多个组合：

(1)降低的转氨酶C活性；

(2)减弱的丙酮酸脱氢酶活性；和

(3)降低的柠檬酸合成酶活性。

本公开内容的“L-缬氨酸”不仅可以包括L-缬氨酸本身，而且还可以包括其盐形式。

如本文中所使用的，术语“培养”是指微生物在适当控制的环境条件下生长。本公开内容的培养过程可以在本领域已知的合适的培养基和培养条件下进行。这样的培养过程可由本领域的技术人员根据要选择的菌株容易地调整使用。具体来说，培养可以是分批培养、连续培养和补料分批培养，但不限于此。

如本文中所使用的，术语“培养基”是指一种物质混合物，它含有培养微生物所需的营养物质作为主要成分，并且它提供营养物质和生长因子，以及生存和生长所必需的水。具体来说，用于培养本公开内容的微生物的培养基和其他培养条件可以是用于常规培养微生物的任何培养基，没有任何特别限制。然而，本公开内容的微生物可以在有氧条件下，在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常规培养基中培养，同时调整温度、pH值等。

在本公开内容中，碳源可以包括碳水化合物，比如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等；糖醇，比如甘露醇、山梨醇等；有机酸，比如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；氨基酸，比如谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等。此外，碳源可以包括天然有机营养物质，比如淀粉水解产物、糖蜜、黑葡萄糖蜜、米糠、木薯、甘蔗糖蜜和玉米浆等。具体来说，可以使用碳水化合物，比如葡萄糖和灭菌的预处理糖蜜(即转化为还原糖的糖蜜)，并且此外，可以不受限制地使用适量的其他各种碳源。这些碳源可以单独使用，或者也可以两种或多种组合使用，但不限于此。

氮源可以包括无机氮源，比如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；氨基酸，比如谷氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺等；以及有机氮源，比如蛋白胨、NZ-胺、肉类提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解产物、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物等。这些氮源可以单独使用，或者也可以两种或多种组合使用，但不限于此。

磷源可以包括磷酸一钾、磷酸二钾，或相应的含钠盐等。无机化合物的实例可以包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。此外，还可以包括氨基酸、维生素和/或适当的前体。这些构成成分或前体可以以批量或连续的方式添加到培养基中，但这些磷源并不限于此。

在本公开内容中，在微生物的培养过程中，可以通过添加化合物比如氢氧化铵、氢氧化钾、氨水、磷酸、硫酸等，以适当的方式调整培养基的pH。此外，在培养过程中可以使用消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇酯来防止气泡形成。此外，可向培养基注入氧气或含有氧气的气体，以维持培养基的需氧条件；或者可以注入氮气、氢气或二氧化碳，以维持厌氧或微需氧条件，而不需要注入气体，但气体不限于此。

培养基的温度可在20℃至50℃的范围内，具体为30℃至37℃，但不限于此。培养可以进行到获得所需的有用物质的生产量，具体来说是大约10至100小时，但不限于此。

通过本公开内容的培养生产的L-缬氨酸可以释放到培养基中或者保留在细胞中。

本公开内容的生产L-缬氨酸的方法可进一步包括制备本公开内容的微生物的步骤，制备用于培养菌株的培养基的步骤，或其组合(不考虑顺序，以任何顺序)，例如，在培养步骤之前。

本公开内容的生产L-缬氨酸的方法可进一步包括从培养基(培养物生长的培养基)或本公开内容的微生物中回收L-缬氨酸的步骤。回收步骤可进一步包括在培养步骤之后。

在回收步骤中，可使用培养本公开内容的微生物的方法，例如，使用本领域已知的适当方法，按照分批培养、连续培养或补料分批培养方法，收集所需的L-缬氨酸。例如，可以使用诸如离心、过滤、用蛋白结晶沉淀剂处理(盐析法)、萃取、超声破坏、超滤、透析、各种色谱法比如分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等、HPLC或其组合的方法，并且可以使用本领域已知的合适方法从培养基或微生物中回收所需的L-缬氨酸。

此外，本公开内容的生产L-缬氨酸的方法可进一步包括纯化步骤，该步骤可使用本领域已知的适当方法进行。在一个实例中，当本公开内容的生产L-缬氨酸的方法包括回收步骤和纯化步骤时，回收步骤和纯化步骤可以连续或间歇地进行(不分先后)或同时进行，或者可以整合成一个步骤，但该方法不限于此。

在本公开内容的方法中，多核苷酸、载体、微生物、L-缬氨酸等，如上述其他方面所述。

本公开内容的又一方面提供一种用于增加L-缬氨酸生产能力的方法，包括修饰一种微生物，其特征在于具有增强的二羟基酸脱水酶活性；和选自下述(1)至(3)的任一个或多个组合：

(1)降低的转氨酶C活性；

(2)减弱的丙酮酸脱氢酶活性；和

(3)降低的柠檬酸合成酶活性。

本公开内容的又另一方面提供了微生物在生产L-缬氨酸中的用途，该微生物具有增强的二羟基酸脱水酶活性；和选自下述(1)至(3)的任一个或多个组合：

(1)降低的转氨酶C活性；

(2)减弱的丙酮酸脱氢酶活性；和

(3)降低的柠檬酸合成酶活性。

实施例

下文，将通过实施例详细地描述本公开。然而，这些实施例只是给出的优选实施例，用于阐释性目的，并且因此，本公开内容的范围不旨在限于这些实施例或受这些实施例的限制。

实施例1：基于缬氨酸产生的菌株的构建及其评估

将一种类型的突变[ilvN(A42V)；Biotechnology and Bioprocess Engineering，June 2014，Volume 19，Issue 3，pp 456-467]引入野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067和ATCC13869菌株中，以构建具有增强的L-缬氨酸生产能力的菌株。

具体而言，使用G-spin总DNA提取mini试剂盒(intron，货号17045)根据试剂盒中提供的方案，提取野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067菌株的基因组DNA。分别使用SEQ IDNO：9和10的引物对和SEQ ID NO：11和12的引物对基于作为模板的基因组DNA进行PCR以获得537bp的基因片段。PCR条件如下：在94℃下变性5分钟，并且然后在94℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；和在72℃下聚合60秒，随后在72℃下聚合7分钟，25个循环。

基于上面获得的两个片段作为模板，使用SEQ ID NO：9和12的引物对进行重叠PCR以获得1044bp的PCR产物(下文称为“引入突变的片段2”)。

用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MaA)处理如此获得的引入突变的片段2，并且然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接至已经用相同的限制酶处理过的pDZ载体中，以构建含有引入突变的片段2的载体。用于将A42V突变引入ilvN基因中的载体命名为pDZ-ilvN(A42V)。

[表1]

其后，将pDZ-ilvN(A42V)转化至野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067和ATCC13869菌株中的每一个中以在染色体上诱导同源重组(van der Rest等人，Appl MicrobiolBiotechnol52:541-545，1999)。在含有25mg/L的卡那霉素的培养基中选择通过同源序列的重组而在染色体上引入载体的菌株。

随后，使用SEQ ID NO：18和21的引物对通过PCR，基于上面选择的谷氨酸棒状杆菌转化株，扩增基因片段，并且通过测序分析确认突变的引入。重组菌株分别命名为谷氨酸棒状杆菌CJ7V和CJ8V。

基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067和ATCC13869，以及上面构建的CJ7V和CJ8V菌株，进行关于发酵效价的实验。在营养物培养基中将每种菌株进行传代培养，并且然后接种至250ml的三角烧瓶(corner-baffle flask)(含有25ml的生产培养基)中并且在30℃下200rpm震荡培养72小时。其后，使用HPLC分析L-缬氨酸的浓度，并且L-缬氨酸的分析浓度显示在下面的表2中。

<营养物培养基(pH 7.2)>

葡萄糖10g，肉提取物5g，多价蛋白胨10g，氯化钠2.5g，酵母提取物5g，琼脂20g，尿素2g(基于1L的蒸馏水)

<生产培养基(pH 7.0)>

葡萄糖100g，(NH₄)₂SO₄ 40g，大豆蛋白2.5g，玉米粉固体5g，尿素3g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，生物素100μg，硫胺素-HCl 1㎎，泛酸钙2㎎，烟酰胺3㎎，CaCO₃ 30g(基于1L的蒸馏水)

[表2]

如上面的结果中显示的，确认与野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067和ATCC13869菌株相比，在引入ilvN(A42V)基因突变的CJ7V和CJ8V菌株中增加了L-缬氨酸生产能力。

实施例2：具有高缬氨酸生产能力的菌株的构建及其评估

实施例2-1、增强缬氨酸生物合成基因ilvD的菌株的构建及其评估

使用SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16以及SEQ ID NO：17和18的引物对构建用于替换ilvD基因启动子的pDZ-Pcj7-ilvD载体，以便构建具有高缬氨酸生产能力的菌株，其中增强了缬氨酸生物合成基因ilvD的表达。

[表3]

用于构建增强了ilvD的载体的引物序列

具体而言，为了构建pDZ-Pcj7-ilvD，分别使用SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16以及SEQ ID NO：17和18的引物对，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067的基因组DNA作为模板，进行PCR，以获得基因片段。PCR条件如下：在94℃下变性5分钟，并且然后在94℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；和在72℃下聚合60秒，随后在72℃下聚合7分钟，25个循环。

基于上面获得的片段作为模板，使用SEQ ID NO：13和18的引物对，进行重叠PCR，以获得引入突变的片段3。用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MaA)处理如此获得的引入突变的片段3，并且然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接至已经用相同的限制酶处理过的pDZ载体中，以构建载体，命名为pDZ-Pcj7-ilvD。

其后，将上面构建的pDZ-Pcj7-ilvD转化至作为缬氨酸产生类菌株的CJ7V、CJ8V和KCCM11201P中的每一个中，以在染色体上诱导同源重组(van der Rest等人，ApplMicrobiol Biotechnol 52:541-545，1999)。在含有25mg/L的卡那霉素的培养基中选择通过同源序列的重组而在染色体上引入载体的菌株。随后，基于上面选择的谷氨酸棒状杆菌转化株，通过PCR，使用SEQ ID NO：13和18的引物对，扩增基因片段，并且通过基因测序分析确认突变的引入。将选择的重组菌株分别命名为谷氨酸棒状杆菌CJ7V:ilvD、CJ8V:ilvD、KCCM11201P:ilvD。以与实施例1中相同的方式进行选择的ilvD基因-增强菌株的发酵效价并且结果显示在下面。

[表4]

ilvD-增强菌株的L-缬氨酸生产能力

菌株	OD600	缬氨酸(g/L)
			CJ7V	77	2.2
CJ7V:ilvD	73	2.6
			CJ8V	89	1.9
CJ8V:ilvD	88	2.2
			KCCM11201P	62	2.6
KCCM11201P:ilvD	60	2.9

如上面的结果中显示的，当增强ilvD(缬氨酸生物合成基因中的一种)时，确认增加了所有生产缬氨酸的菌株CJ7V、CJ8V和KCCM11201P的缬氨酸生产能力。

实施例2-2、avtA缺失和a1g减弱菌株的构建及其评估

为了构建具有高缬氨酸生产能力的菌株，尝试减弱(用GTG修饰avtA基因的起始密码子)或缺失avtA。因此，使用下面SEQ ID NO：19和20以及SEQ ID NO：21和22的引物对构建用于构建avtA减弱菌株(用GTG修饰avtA基因的起始密码子)的载体，以及使用下面SEQ IDNO：23和24以及SEQ ID NO：25和26的引物对构建用于构建avtA-缺失活性的载体，分别命名为pDZ-avtA(A1g)和pDZ-avtA(del)。

具体而言，为了构建avtA减弱载体(pDZ-avtA(A1g))，使用SEQ ID NO：19和20以及SEQ ID NO：21和22的引物对，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067的基因组DNA作为模板，进行PCR。PCR条件如下：在94℃下变性5分钟，并且然后在94℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；和在72℃下聚合60秒，随后在72℃下聚合7分钟，25个循环。基于上面获得的片段中的每一个作为模板，使用SEQ ID NO：19和22的引物对，进行重叠PCR，以获得引入突变的片段4。用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MaA)处理如此获得的引入突变的片段4，并且然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接至已经用相同的限制酶处理过的pDZ载体中，以构建pDZ-avtA(A1g)DNA载体。

为了构建avtA-缺失载体(pDZ-avtA(del))，使用SEQ ID NO：23和24以及SEQ IDNO：25和26的引物对，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067的基因组DNA作为模板，进行PCR。PCR条件如下：在94℃下变性5分钟，并且然后在94℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；和在72℃下聚合60秒，随后在72℃下聚合7分钟，25个循环。基于上面获得的片段中的每一个作为模板，使用SEQ ID NO：23和26的引物对，进行重叠PCR以获得引入突变的片段5。用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MaA)处理如此获得的引入突变的片段5，并且然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接至已经用相同的限制酶处理过的pDZ载体中，以构建pDZ-avtA(del)载体。

[表5]

用于构建avtA减弱或缺失菌株的载体的引物序列

其后，将pDZ-avtA(del)和pDZ-avtA(A1g)转化至作为生产缬氨酸的菌株的CJ7V:ilvD、CJ8V:ilvD和KCCM11201P:ilvD中的每一个中，以在染色体上诱导同源重组(van derRest等人，Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545，1999)。在含有25mg/L的卡那霉素的培养基中选择通过同源序列的重组而在染色体上引入载体的菌株。

随后，基于上面选择的谷氨酸棒状杆菌转化株，通过PCR，使用SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、SEQ ID NO：23和24以及SEQ ID NO：25和26的引物对，扩增基因片段，并且通过基因测序分析以与实施例1中相同的方式确认突变的引入。重组菌株命名为谷氨酸棒状杆菌CJ7V:ilvD-avtA(del)、CJ7V:ilvD-avtA(a1g)、CJ8V:ilvD-avtA(del)、CJ8V:ilvD-avtA(a1g)、KCCM11201P:ilvD-avtA(del)和KCCM11201P:ilvD-avtA (a1g)，如下面显示的，并且以与实施例1中相同的方式进行效价评估。

[表6]

avtA缺失和减弱菌株的L-缬氨酸生产能力

/>

如上面的结果中显示的，当删除avtA时，增强了缬氨酸生产能力，并且当avtA表达减弱时，与CJ8V:ilvD菌株相比，在CJ8V:ilvD-avtA(alg)菌株中增加了缬氨酸生产能力，与对照ilvD-增强菌株相比，显示相等或更高水平的缬氨酸生产能力。确认与CJ7V、CJ8V和KCCM11201P菌株相比，在所有情况的ilvD-增强菌株和avtA-缺失或减弱菌株中增强了缬氨酸生产能力，如表4中显示的。

实施例2-3、aceE缺失和减弱(a1g，Q432A，K435A)菌株的构建及其评估

为了构建具有高缬氨酸生产能力的菌株，尝试减弱或缺失aceE。因此，为了构建aceE减弱菌株，使用SEQ ID NO：27和28以及SEQ ID NO：29和30的引物对构建用于构建菌株的载体，其中aceE基因的起始密码子被修饰为GTG，使用SEQ ID NO：27和32以及SEQ ID NO：33和36的引物对构建用于构建aceE(Q432A)菌株的载体，并且使用SEQ ID NO：27和34以及SEQ ID NO：35和36的引物对构建用于构建aceE(K435A)菌株的载体。另外，使用SEQ ID NO：37和38以及SEQ ID NO：39和40的引物对构建用于构建aceE-缺失菌株(aceE(del))的载体。如此构建的载体分别命名为pDZ-aceE(A1g)、pDZ-aceE(Q432A)、pDZ-aceE(K435A)和pDZ-aceE(del)。

具体而言，为了构建用于减弱aceE的起始密码子的载体，使用SEQ ID NO：27和28以及SEQ ID NO：29和30的引物对，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067的基因组DNA作为模板进行PCR。PCR条件如下：在94℃下变性5分钟，并且然后在94℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；和在72℃下聚合60秒，随后在72℃下聚合7分钟，25个循环。基于上面获得的片段中的每一个作为模板，使用SEQ ID NO：27和30的引物对进行重叠PCR以获得引入突变的片段6。用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MaA)处理如此获得的引入突变的片段6，并且然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接至已经用相同的限制酶处理过的pDZ载体中，以构建pDZ-aceE(A1g)DNA载体。

为了构建用于引入aceE(Q432A)突变的载体，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067的基因组DNA作为模板，使用SEQ ID NO：27和28以及SEQ ID NO：33和36的引物对进行PCR。PCR条件如下：在94℃下变性5分钟，并且然后在94℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；和在72℃下聚合60秒，随后在72℃下聚合7分钟，25个循环。基于上面获得的片段中的每一个作为模板，使用SEQ ID NO：27和36的引物对进行重叠PCR以获得引入突变的片段7。用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MaA)处理如此获得的引入突变的片段7，并且然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接至已经用相同的限制酶处理过的pDZ载体中，以构建pDZ-aceE(Q432A)DNA载体。

为了构建用于引入aceE(K435A)突变的载体，使用SEQ ID NO：27和34以及SEQ IDNO：35和36的引物对，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067的基因组DNA作为模板进行PCR。PCR条件如下：在94℃下变性5分钟，并且然后在94℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；和在72℃下聚合60秒，随后在72℃下聚合7分钟，25个循环。基于上面获得的片段中的每一个作为模板，使用SEQ ID NO：27和36的引物对进行重叠PCR以获得引入突变的片段8。用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MaA)处理如此获得的引入突变的片段8，并且然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接至已经用相同的限制酶处理过的pDZ载体中，以构建pDZ-aceE(K435A)DNA载体。

为了引入用于引入aceE(del)突变的载体，使用SEQ ID NO：37和38以及SEQ IDNO：39和40的引物对，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067的基因组DNA作为模板进行PCR。PCR条件如下：在94℃下变性5分钟，并且然后在94℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；和在72℃下聚合60秒，随后在72℃下聚合7分钟，25个循环。基于上面获得的片段中的每一个作为模板，使用SEQ ID NO：37和40的引物对进行重叠PCR以获得引入突变的片段9。用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MaA)处理如此获得的引入突变的片段9，并且然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接至已经用相同的限制酶处理过的pDZ载体中，以构建pDZ-aceE(del)DNA载体。

[表7]

用于构建aceE缺失和减弱菌株的载体的引物序列

/>

其后，将pDZ-aceE(del)、pDZ-aceE(A1g)、pDZ-aceE(Q432A)和pDZ-aceE(K435A)转化至作为生产缬氨酸的菌株的CJ7V:ilvD、CJ8V:ilvD和KCCM11201P:ilvD中的每一个中，以在染色体上诱导同源重组(van der Rest等人，Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545，1999)。在含有25mg/L的卡那霉素的培养基中选择通过同源序列的重组而在染色体上引入载体的菌株。

随后，基于上面选择的谷氨酸棒状杆菌转化株，通过PCR，使用SEQ ID NO：27和36的引物对扩增基因片段，并且通过基因测序分析确认突变的引入。重组菌株命名为谷氨酸棒状杆菌CJ7V:ilvD-aceE(del)、CJ7V:ilvD-aceE(a1g)、CJ7V:ilvD-aceE(Q432A)、CJ7V:ilvD-aceE(K435A)、CJ8V:ilvD-aceE(del)、CJ8V:ilvD-aceE(a1g)、CJ8V:ilvD-aceE(Q432A)、CJ8V:ilvD-aceE(K435A)、KCCM11201P:ilvD-aceE(del)、KCCM11201P:ilvD-aceE(a1g)、KCCM11201P:ilvD-aceE(Q432A)和KCCM11201P:ilvD-aceE(K435A)，如下面显示的，并且以与实施例1中相同的方式进行效价评估。

[表8]

aceE缺失和减弱菌株的L-缬氨酸生产能力

如上面的结果中显示的，当在具有增强的二羟基酸脱水酶(ilvD)活性的菌株中另外删除aceE时，生长和糖消耗速率快速降低，导致降低的缬氨酸生产能力。同时，在具有减弱的aceE的菌株的情况下，确认尽管减弱的水平存在差异，但是生长和糖消耗速率微不足道并且增加了缬氨酸生产能力。

实施例2-4.gltA减弱(a1g、N241T、M312I)菌株的构建及其评估

为了构建具有高缬氨酸生产能力的菌株，试图减弱gltA。因此，使用SEQ ID NO：41和42以及SEQ ID NO：43和44的引物对构建了用于构建gltA减弱菌株的载体，其中gltA基因的起始密码子被修饰为GTG，使用SEQ ID NO：45和46以及SEQ ID NO：47和50的引物对构建用于构建gltA(N241T)菌株的载体，并使用SEQ ID NO：45和48以及SEQ ID NO：49和50的引物对构建用于构建gltA(M312I)菌株的载体。这样构建的载体被分别命名为pDZ-gltA(A1g)、pDZ-gltA(N241T)和pDZ-gltA(M312I)。

为了引入用于引入减弱gltA起始密码子的突变的载体，基于野生型谷氨酸杆菌ATCC14067的基因组DNA为模板，使用SEQ ID NO：41和42以及SEQ ID NO：43和44的引物对进行PCR。PCR条件如下：在94℃下变性5分钟，并且然后在94℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；和在72℃下聚合60秒，随后在72℃下聚合7分钟，25个循环。基于上面获得的片段(A，B)中的每一个作为模板，使用SEQ ID NO：41和44的引物对进行重叠PCR以获得引入突变的片段10。用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MaA)处理如此获得的引入突变的片段10，并且然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接至已经用相同的限制酶处理过的pDZ载体中，以构建pDZ-gltA(A1g)DNA载体。

为了引入用于引入gltA(N241T)突变的载体，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067的基因组DNA作为模板，使用SEQ ID NO：45和46以及SEQ ID NO：47和50的引物对进行PCR。PCR条件如下：在94℃下变性5分钟，并且然后在94℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；和在72℃下聚合60秒，随后在72℃下聚合7分钟，25个循环。基于上面获得的片段(A，B)中的每一个作为模板，使用SEQ ID NO：45和50的引物对进行重叠PCR以获得引入突变的片段11。用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MaA)处理如此获得的引入突变的片段11，并且然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接至已经用相同的限制酶处理过的pDZ载体中，以构建pDZ-gltA(N241T)DNA载体。

为了引入用于引入gltA(M312I)突变的载体，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067的基因组DNA作为模板，使用SEQ ID NO：45和48以及SEQ ID NO：49和50的引物对进行PCR。PCR条件如下：在94℃下变性5分钟，并且然后在94℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；和在72℃下聚合60秒，随后在72℃下聚合7分钟，25个循环。基于上面获得的片段(A，B)中的每一个作为模板，使用SEQ ID NO：45和50的引物对进行重叠PCR以获得引入突变的片段12。用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MaA)处理如此获得的引入突变的片段12，并且然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接至已经用相同的限制酶处理过的pDZ载体中，以构建pDZ-gltA(M312I)DNA载体。

[表9]

用于构建gltA减弱菌株的载体的引物序列

其后，将pDZ-gltA(A1g)、pDZ-gltA(N241T)和pDZ-gltA(M312I)转化至作为生产缬氨酸的菌株CJ7V:ilvD、CJ8V:ilvD和KCCM11201P:ilvD中的每一个中，以在染色体上诱导同源重组(van der Rest等人，Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545，1999)。在含有25mg/L的卡那霉素的培养基中选择通过同源序列的重组而在染色体上引入载体的菌株。

随后，基于上面选择的谷氨酸棒状杆菌转化株，通过PCR，使用SEQ ID NO：45和50的引物对扩增基因片段，并且通过基因测序分析确认突变的引入。重组菌株被命名为谷氨酸棒状杆菌CJ7V:ilvD-gltA(a1g)、CJ7V:ilvD-gltA(N241T)、CJ7V:ilvD-gltA(M312I)、CJ8V:ilvD-gltA(a1g)、CJ8V:ilvD-gltA(N241T)、CJ8V:ilvD-gltA(M312I)、KCCM11201P:ilvD-gltA(a1g)、KCCM11201P:ilvD-gltA(N241T)、和KCCM11201P:ilvD-gltA(M312I)，并且以与实施例1中相同的方式进行效价评估。

[表10]

gltA减弱菌株的L-缬氨酸生产能力

/>

如上面的结果中显示的，当在具有增强的二羟基酸脱水酶(ilvD)活性的菌株中减弱gltA时，尽管根据减弱的程度有差异，但是证实生长和糖消耗速率不明显，并且缬氨酸生产能力增加。

实施例2-5.有效突变体性状的菌株组合的构建及其评价

由实施例2-2至2-4中确认的结果，试图确定当各种突变组合在一起时是否对缬氨酸生产能力有协同作用。将pDZ-avtA(del)和pDZ-aceE(K435A)载体转化到CJ7V:ilvD-gltA减弱(N241T)、CJ8V:ilvD-gltA减弱(N241T)和KCCM11201P:ilvD-gltA减弱(N241T)中的每一个中，这些菌株是实施例2-4中构建的生产缬氨酸的菌株(van der Rest等人，ApplMicrobiol Biotechnol 52:541-545，1999)。在含有25mg/L的卡那霉素的培养基中选择通过同源序列的重组而在染色体上引入载体的菌株。

此后，基于完成二次重组的谷氨酸棒状杆菌转化体，通过PCR，使用SEQ ID NO：23和26以及SEQ ID NO：27和36的引物对扩增基因片段，并且然后通过基因测序分析确认引入突变的菌株。重组菌株被命名为如下所示，并以与实施例1相同的方式进行了效价评估。

[表11]

菌株的有效组合的L-缬氨酸生产能力

/>

如上述结果所示，证实当将aceE减弱的菌株和avtA缺失的菌株引入ilvD增强的菌株和gltA减弱的菌株后，其生长速度和糖消耗速率处于同一水平，并且缬氨酸的生产能力进一步增加。

将pDZ-aceE(K435A)载体转化到KCCM11201P:ilvD-gltA减弱(N241T)菌株中，并将通过同源序列重组引入染色体上ace(K435A)突变的菌株命名为CA08-1592。CA08-1592于2020年7月3日根据布达佩斯条约保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)，保藏号为KCCM12761P。

从上述内容来看，本公开内容所涉及的技术领域的技术人员将能够理解，本公开内容可以以其他具体形式体现出来，而不会修改本公开内容的技术概念或基本特征。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅用于说明目的，并且不应解释为限制本公开内容的范围。相反，本公开内容旨在不仅涵盖示例性实施方式，而且还包括各种替代方案、修改、等同物和其他实施方式，这些方案可能包括在本公开内容的精神和范围内，如所附的权利要求所定义的。

国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约国际表格

原始保藏接收证明由该页下部确定的国际保藏机构根据第7.1条发出至：CJ第一制糖株式会社

CJ第一制糖中心

330，DONGHO-RO，JUNG-GU，首尔100-400

大韩民国

证明上述翻译与原文内容没有相互违背

2020年9月1日专利代理人Min Son印。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 生产L-缬氨酸的微生物和使用其生产L-缬氨酸的方法

<130> OPA21084-PCT

<150> KR 10-2020-0111084

<151> 2020-09-01

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<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

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Claims

1.一种生产L-缬氨酸的微生物，其具有增强的二羟基酸脱水酶活性；和选自下述(1)至(3)的任一个或多个组合：

(1)降低的转氨酶C活性；

(2)减弱的丙酮酸脱氢酶活性；和

(3)降低的柠檬酸合成酶活性。

2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物具有增强的二羟基酸脱水酶活性；和降低的转氨酶C活性。

3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物具有增强的二羟基酸脱水酶活性；和减弱的丙酮酸脱氢酶活性。

4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物具有增强的二羟基酸脱水酶活性；和降低的柠檬酸合成酶活性。

5.根据权利要求4所述的微生物，其中所述微生物进一步具有降低的转氨酶C活性或减弱的丙酮酸脱氢酶活性。

6.根据权利要求1所述的微生物，其中所述二羟基酸脱水酶是由ilvD基因编码的。

7.根据权利要求1所述的微生物，其中所述转氨酶C是由avtA基因编码的。

8.根据权利要求1所述的微生物，其中所述丙酮酸脱氢酶是由aceE基因编码的。

9.根据权利要求1所述的微生物，其中所述柠檬酸合成酶是由gltA基因编码的。

10.根据权利要求1所述的微生物，其中所述减弱的丙酮酸脱氢酶的特征在于对应于从SEQ ID NO：3的氨基酸序列的N-末端起第432或435位的氨基酸被另一个氨基酸取代。

11.根据权利要求1所述的微生物，其中所述降低的柠檬酸合成酶的特征在于对应于从SEQ ID NO：4的氨基酸序列的N-末端起第241或312位的氨基酸被另一个氨基酸取代。

12.根据权利要求1所述的微生物，其中所述生产L-缬氨酸的微生物是棒状杆菌属的微生物。

13.根据权利要求12所述的微生物，其中所述棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌。

14.一种用于生产L-缬氨酸的方法，包括培养根据权利要求1至13中任一项所述的微生物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法进一步包括从培养的微生物或培养基回收L-缬氨酸。