CN116917473A - 预苯酸脱水酶变体以及使用其生产支链氨基酸的方法 - Google Patents

预苯酸脱水酶变体以及使用其生产支链氨基酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116917473A
CN116917473A CN202280012955.1A CN202280012955A CN116917473A CN 116917473 A CN116917473 A CN 116917473A CN 202280012955 A CN202280012955 A CN 202280012955A CN 116917473 A CN116917473 A CN 116917473A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
amino acid
val
gly
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280012955.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李河胤
金朱恩
李智惠
金径林
李羲奭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CJ CheilJedang Corp filed Critical CJ CheilJedang Corp
Publication of CN116917473A publication Critical patent/CN116917473A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01051—Prephenate dehydratase (4.2.1.51)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Abstract

本申请涉及一种预苯酸脱水酶变体。

Description

预苯酸脱水酶变体以及使用其生产支链氨基酸的方法
技术领域
本公开涉及一种预苯酸脱水酶变体以及使用其生产支链氨基酸的方法。
背景技术
L-氨基酸是蛋白质的基本结构单元，并且用作制药原材料和食品添加剂、动物饲料、营养物质、杀虫剂、杀菌剂等的重要材料。因此，氨基酸的工业生产已成为经济上重要的工业过程。
为了有效地生产氨基酸，已经进行了各种研究，例如努力开发高效生产氨基酸的微生物或发酵工艺技术。具体来说，已经开发了目标材料专用的方法，诸如增加编码参与氨基酸生物合成的酶的基因的表达或去除在棒状杆菌属菌株中的氨基酸合成不必要的基因(美国专利号9109242B2、美国专利号8030036B2)。除了这些方法之外，还利用了删除不参与氨基酸生产的基因的方法以及删除在氨基酸生产中的具体功能未知的基因的方法。
支链氨基酸是指缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸三种氨基酸，并且已知主要在肌肉中代谢且用作活动期间的能量来源。由于已知支链氨基酸在活动期间维持肌肉和增加肌肉质量方面具有重要作用，因此它们的消耗正在增加。
发明内容
本公开的一个目的是提供一种预苯酸脱水酶变体，在所述预苯酸脱水酶变体中，对应于自氨基酸序列SEQ ID NO:1的N末端起位置182的氨基酸被另一个氨基酸取代。
本公开的另一目的是提供一种编码所述变体的多核苷酸以及一种包含所述多核苷酸的载体。
本公开的又一目的是提供一种棒状杆菌属的微生物，所述微生物包含变体、多核苷酸和载体中的一种或多种。
本公开的又一目的是提供一种生产支链氨基酸的方法，所述方法包括在培养基中培养微生物的步骤。
具体实施方式
将如下详细地描述本公开。同时，本公开中所公开的每个描述和实施方案也可以应用于其他描述和实施方案。即，本公开中所公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受下文所述的具体描述的限制。
此外，本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本公开的具体实施方案的许多等效物。此外，这些等效物应解释为落入本公开内。
本公开的一个方面提供一种预苯酸脱水酶变体，在所述预苯酸脱水酶变体中，对应于自氨基酸序列SEQ ID NO:1的N末端起位置182的氨基酸被另一个氨基酸取代。
预苯酸脱水酶变体是指这样的变体，在所述变体中，对应于自SEQ ID NO:1的预苯酸脱水酶的N末端起位置182的氨基酸被具有预苯酸脱水酶活性的多肽中或预苯酸脱水酶中的另一个氨基酸取代。
如本文所用，术语“预苯酸脱水酶”是催化以下反应的酶。
本公开的预苯酸脱水酶可以是预苯酸脱水酶或具有预苯酸脱水酶活性的多肽，对所述多肽应用了用于制备本公开中提供的预苯酸脱水酶变体的修饰。具体地说，所述多肽可以是天然存在的多肽或野生型多肽或者其成熟多肽，并且可以包括其变体或其功能片段，但本公开的预苯酸脱水酶可以不受限制地包括任一种，只要其可以是本公开的预苯酸脱水酶变体的母体即可。
在本公开中，预苯酸脱水酶可以是但不限于SEQ ID NO:1的多肽。在一个实施方案中，预苯酸脱水酶可以是与SEQ ID NO:1的多肽具有约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多序列同一性的多肽，并且任一种均包括在预苯酸脱水酶的范围内，只要其活性与由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成的多肽相同或对应即可。
本公开的预苯酸脱水酶的序列可以从已知数据库NCBI的GenBank获得。具体地说，预苯酸脱水酶可以是由pheA基因编码的多肽，但不限于此。
如本文所用，“变体”是指这样的多肽，其通过保守取代和/或对一个或多个氨基酸的修饰而具有与修饰之前的变体的氨基酸序列不同的氨基酸序列，但是维持功能或性质。这种变体通常可以通过修饰多肽的氨基酸序列的一个或多个氨基酸并评估修饰的多肽的性质来鉴定。换句话说，与变异之前的多肽的能力相比，变体的能力可能增加、不变或降低。一些变体可能包括去除了一个或多个部分(诸如N末端前导序列或跨膜结构域)的变体。其他变体可能包括从成熟蛋白去除了N末端和/或C末端的一部分的变体。术语“变体”可以与诸如修饰、修饰的多肽、修饰的蛋白、突变体、突变蛋白和趋异体(divergent)的术语互换使用，并且不限于此，只要其是以变异含义而使用的术语即可。
此外，变体可以包括缺失或添加对多肽的性质和二级结构影响最小的氨基酸。例如，以共同翻译的方式或以翻译后的方式参与蛋白质易位的信号(或前导)序列可以缀合至变体的N末端。此外，变体可以与其他序列或接头缀合，以便被鉴定、纯化或合成。
本公开中提供的变体可以是预苯酸脱水酶变体，其中对应于自氨基酸序列SEQ IDNO:1的N末端起位置182的氨基酸被另一个氨基酸取代，但不限于此。
对应于自氨基酸序列SEQ ID NO:1的N末端起位置182的氨基酸可以是精氨酸。
本公开中提供的变体可以包括对应于自氨基酸序列SEQ ID NO:1的N末端起位置182的氨基酸被除了精氨酸以外的另一个氨基酸取代，但不限于此。
“另一个氨基酸”没有限制，只要其是与取代之前的氨基酸不同的氨基酸即可。另一方面，当在本公开中表述为‘被特定氨基酸取代’时，显然氨基酸被与取代之前的氨基酸不同的氨基酸取代，即使没有单独指示氨基酸被不同的氨基酸取代。
在一个实施方案中，本公开的变体可以是这样的变体，其中对应于氨基酸序列SEQID NO:1(其为参考蛋白)中的位置182的氨基酸被在疏水性氨基酸或脂肪族氨基酸之中与取代之前的氨基酸不同的氨基酸取代。
具体地说，变体可以是这样的变体，其中对应于氨基酸序列SEQ ID NO:1中的位置182的氨基酸被疏水性(非极性)氨基酸或脂肪族氨基酸的一个氨基酸取代。脂肪族氨基酸可以是例如选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成的组的氨基酸，但不限于此。疏水性(非极性)氨基酸可以是例如选自甘氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸，但不限于此。
在一个实施方案中，本公开的变体可以是这样的变体，其中对应于氨基酸序列SEQID NO:1中的位置182的氨基酸被小尺寸氨基酸之中与取代之前的氨基酸不同的氨基酸取代，但不限于此。
如本文所用，术语“小尺寸氨基酸”包括甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和天冬酰胺，它们是20种氨基酸中相对较小的氨基酸，并且具体地说，其可以指甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸，但不限于此。更具体地说，其可以指甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸，例如丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸，但不限于此。
更具体地说，在本公开的变体中，被另一个氨基酸取代可以是被丙氨酸取代，但不限于此。
如本文所用，术语“对应于”是指多肽中列出的位置处的氨基酸残基，或与多肽中列出的氨基酸残基类似、相同或同源的氨基酸残基。鉴定对应位置处的氨基酸可以是确定称为特定序列的序列中的特定氨基酸。如本文所用，“对应区域”通常是指相关蛋白或参考蛋白中类似或对应的位置。
例如，将任意氨基酸序列与SEQ ID NO:1比对，并且在此基础上，可以参考对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基的氨基酸残基将氨基酸序列中的每个氨基酸残基编号。例如，如本公开中所述的序列比对算法可通过与查询序列(也称为“参考序列”)比较来确定氨基酸位置或修饰诸如取代、插入或缺失发生的位置。
针对此类比对，可以使用例如Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)、EMBOSS包的Needleman程序(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)等等，但不限于此，并且可以适当地使用本领域中已知的序列比对程序、成对序列比较算法等。
在一个实施方案中，本公开的变体可以与SEQ ID NO:1的多肽具有约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多序列同一性，其中对应于SEQID NO:1的位置182的氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一个实施方案中，本公开的变体可以包括与由SEQ ID NO:5描述的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或更多同源性或同一性的氨基酸序列。
具体地说，本公开的变体可以具有由SEQ ID NO:5描述的氨基酸序列，包含其或由其组成，或者可以基本上由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本公开的变体可以包括这样的氨基酸序列，其基于氨基酸序列SEQ ID NO:1具有丙氨酸作为对应于位置182的氨基酸，并且与由SEQ ID NO:5描述的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或更高同源性或同一性。另外，明显的是，具有缺失、修饰、取代、保守取代或添加了一些序列的氨基酸序列的变体也包括在本公开的范围内，只要所述氨基酸序列具有此类同源性或同一性并表现出对应于本公开的变体的功效的功效即可。
例如，变体可以包括这些变体，其在氨基酸序列的N末端、C末端和/或内部具有不改变本公开的变体的功能的序列添加或缺失，或者天然存在的突变、沉默突变或保守取代。
“保守取代”意指一个氨基酸被具有类似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代。这种氨基酸取代可以通常基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的类似性而发生。通常，保守取代可能几乎不影响或不影响蛋白质或多肽的活性。
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”意指两个给定氨基酸序列或碱基序列之间的类似性程度并且可以表述为百分比。术语“同源性和同一性”常常可互换使用。
保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性通过标准比对算法确定，并且可以一起使用由所用的程序建立的默认空位罚分。基本上，同源或相同的序列通常能够在中等或高度严格的条件下与整个序列或其一部分杂交。明显的是，杂交还包括多核苷酸与包含通用密码子或考虑到密码子简并性的密码子的多核苷酸的杂交。
任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、类似性或同一性可以使用已知的计算机算法来确定，诸如“FASTA”程序，例如使用如Pearson等人(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]:2444中的默认参数。替代地，同源性、类似性或同一性可以使用如EMBOSS包的Needleman程序(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)(5.0.0版本或后续版本)(包括GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984)),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul,[S.][F.,][等人,J MOLEC BIOL 215]:403(1990)；Guide to HugeComputers,Martin J.Bishop,[编,]Academic Press,San Diego,1994以及[CARILLO等人](1988)SIAM J Applied Math 48:1073)中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。例如，可以使用美国国家生物技术信息中心的BLAST或ClustalW确定同源性、类似性或同一性。
多核苷酸或多肽的同源性、类似性或同一性可以通过使用例如GAP计算机程序比较序列信息来确定，诸如Needleman等人(1970),J Mol Biol.48:443，如在例如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中所发表。概括地说，GAP程序可以定义为通过将两个序列中的较短序列中类似性比对的符号(即，核苷酸或氨基酸)的数目除以符号总数所获得的值。GAP程序的默认参数可以包括(1)二元比较矩阵(包括对于同一性为1的值和对于非同一性为0的值)和Gribsko等人,(1986)Nucl.Acids Res.14:6745(或EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵)的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff编,Atlas OfProtein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,第353-358页(1979)中所公开；(2)每个空位的罚分为3.0并且每个空位中的每个符号额外罚分0.10(或空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.5)；以及(3)末端空位没有罚分。
在一个实施方案中，本公开的变体可以具有预苯酸脱水酶活性。在一个实施方案中，与野生型或未修饰的预酚酸脱水酶相比，本公开的变体可以具有增加支链氨基酸的生产力的活性。在一个实施方案中，与野生型或未修饰的预苯酸脱水酶相比，本公开的变体可以具有降低支链氨基酸生产途径中副产物的生产水平的活性。在一个实施方案中，与野生型或未修饰的预苯酸脱水酶相比，本公开的变体可以具有减弱的活性，但不限于此。
本公开的另一个方面提供一种编码本公开的变体的多核苷酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”为具有一定长度的或以其中核苷酸单体通过共价键连接成长链的核苷酸聚合物形式的更长的DNA或RNA链，并且更具体地说，其意指编码变体的多核苷酸片段。
编码本公开的变体的多核苷酸可以包括编码由SEQ ID NO:5描述的氨基酸序列的核苷酸序列。在本公开的一个实施方案中，本公开的多核苷酸可以具有或包含序列SEQ IDNO:6。另外，本公开的多核苷酸可以由序列SEQ ID NO:6组成或基本上由其组成。
在本公开的多核苷酸中，可以在编码区中进行各种修饰，只要本公开的变体的氨基酸序列不由于密码子简并性或在旨在表达本公开的变体的生物体中优选的密码子而变化即可。具体地说，本公开的多核苷酸可以具有或包含与序列SEQ ID NO:6具有70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多并且小于100％同源性或同一性的核苷酸序列，或者可以由与序列SEQ IDNO:6具有70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多并且小于100％同源性或同一性的核苷酸序列组成或基本上由其组成，但不限于此。
就这一点而言，在具有这种同源性或同一性的序列中，编码对应于SEQ ID NO:6的位置182的氨基酸的密码子可以是编码丙氨酸的密码子之一。
此外，本公开的多核苷可以包括探针，其可以由已知基因序列制备，例如没有限制的序列，只要其为可以在严格条件下与本公开的多核苷酸序列的全部或一部分的互补序列杂交的序列即可。“严格条件”意指实现多核苷酸之间的特异性杂交的条件。这些条件明确描述于文件中(参见J.Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2ndEdition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,9.50-9.51,11.7-11.8)。其实例包括具有较高同源性或同一性的多核苷酸(即具有70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多同源性或同一性的多核苷酸)彼此杂交，而具有较低同源性或同一性的多核苷酸彼此不杂交的条件，或者普通Southern杂交的洗涤条件，其中在相当于60℃、1X SSC、0.1％ SDS的盐浓度和温度下(具体地说，60℃、0.1X SSC、0.1％ SDS，更具体地说，68℃、0.1X SSC、0.1％ SDS)进行一次(具体地说，二至三次)洗涤。
杂交要求两个核酸具有互补序列，但根据杂交的严格性，允许碱基之间的错配。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开的多核苷酸还可以包含基本上类似的核酸序列以及与整个序列互补的分离的核酸片段。
具体地说，与本公开的多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸可以使用包括在55℃的Tm值下的杂交步骤的杂交条件和上文所述的条件来检测。Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域的技术人员根据目的进行适当调整。
杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且变量是本领域众所周知的(例如，J.Sambrook等人,同上)。
本公开的另一方面提供一种载体，其包含本公开的多核苷酸。载体可以是用于在宿主细胞中表达多核苷酸的表达载体，但不限于此。
本公开的“载体”是指DNA构建体，其包含编码感兴趣的多肽的多核苷酸基序列，所述序列可操作地连接至合适的表达控制区(或表达控制序列)，使得感兴趣的多肽可以在合适的宿主中表达。表达控制区可以包括能够起始转录的启动子、用于调控转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及调控转录和翻译终止的序列。可以将载体转化到合适的宿主细胞中，然后独立于宿主基因组被复制或起作用，或者可以将其整合到基因组本身中。
本公开中所用的载体没有特别限制，可以使用本领域中已知的任何载体。通常使用的载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等等可以用作噬菌体载体或粘粒载体。pDC系统、pBR系统、pUC系统、pBluescript II系统、pGEM系统、pTZ系统、pCL系统、pET系统等等可以用作质粒载体。具体地说，可以使用pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等等。
例如，可以将编码感兴趣的多肽的多核苷酸通过载体插入到染色体中，以实现细胞内染色体插入。将多核苷酸插入到染色体中可以通过本领域中已知的任何方法(例如，同源重组)进行，但不限于此。载体可以还包含选择标志物，以用于鉴定染色体插入。选择标志物用于选择用载体转化的细胞，即鉴定感兴趣的核酸分子的插入，并且可以使用赋予可选择表型诸如药物抗性、营养缺陷型、细胞毒性剂抗性或表面多肽的表达的标志物。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标志物的细胞存活或表现出其他表型性状，并且因此可以选择转化的细胞。
如本文所用，术语“转化”意指将包含编码靶多肽的多核苷酸的载体引入到宿主细胞或微生物中，使得由多核苷酸编码的多肽可以在宿主细胞中表达。转化的多核苷酸可以通过插入到宿主细胞的染色体中来定位，或定位于染色体外，只要其可以在宿主细胞中表达即可。另外，多核苷酸包括编码感兴趣的多肽的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要其可以引入到宿主细胞中然后表达即可。例如，可以将多核苷酸以表达盒的形式引入到宿主细胞中，表达盒为包含自我表达所需的所有元件的基因构建体。表达盒通常可以包含与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。另外，多核苷酸可以以其自身的形式引入到宿主细胞中并且可操作地连接至在宿主细胞中表达所需的序列，但不限于此。
另外，如本文所用，术语“可操作地连接”意指多核苷酸序列与启动子序列功能性地连接，启动子序列起始并介导编码本公开的感兴趣变体的多核苷酸的转录。
本公开的又一方面提供一种棒状杆菌属微生物，所述微生物包含本公开的变体、本公开的多核苷酸或本公开的载体。
本公开的微生物可以包含本公开的多肽变体、编码所述多肽的多核苷酸或包含本公开的多核苷酸的载体。
本文所用，术语“微生物”或“菌株”包括所有野生型微生物或天然或人工基因修饰的微生物，并且其可以为特定机制由于将外来基因的插入或内源性基因的活性增强或失活而减弱或加强的微生物，或者其可以是包含针对产生感兴趣的多肽、蛋白质或产物的基因修饰的微生物。
本公开的菌株可以是：包含本公开的变体、本公开的多核苷酸和包含本公开的多核苷酸的载体中的任一种或多种的菌株；被修饰成表达本公开的变体或本公开的多核苷酸的菌株；表达本公开的变体或本公开的多核苷酸的菌株(例如，重组菌株)；或具有本公开的变体的活性的菌株(例如，重组菌株)，但不限于此。
本公开的菌株可以是具有支链氨基酸生产能力的菌株。
本公开的菌株可以是天然具有预苯酸脱水酶或支链氨基酸生产能力的微生物，或者通过将本公开的变体或编码其的多核苷酸(或包含多核苷酸的载体)引入至不具有预苯酸脱水酶或不具有支链氨基酸生产能力的亲本菌株中并且/或者通过向亲本菌株提供支链氨基酸生产能力来制备的微生物，但不限于此。
例如，本公开的菌株可以是通过用本公开的多核苷酸或包含编码本公开的变体的多核苷酸的载体转化而表达本公开的变体的细胞或微生物，并且就本公开的目的而言，本公开的菌株可以包含通过包含本公开的变体而能够生产支链氨基酸的所有微生物。例如，本公开的菌株可以是具有增强的支链氨基酸生产能力的重组菌株，其中预苯酸脱水酶变体通过将编码本公开的变体的多核苷酸引入至天然野生型或支链氨基酸生产微生物中来表达。具有增强的支链氨基酸生产能力的重组菌株可以是与天然野生型或预苯酸脱水酶未修饰的微生物(即，表达野生型预苯酸脱水酶的微生物)相比具有增强的支链氨基酸生产能力的微生物，但不限于此。
例如，作为用于比较支链氨基酸生产能力是否增加的目标菌株的预苯酸脱水酶未修饰的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株。又例如，作为用于比较支链氨基酸生产能力是否增加的目标菌株的预苯酸脱水酶未修饰的微生物可以是CJL-8109、KCCM12739P(CA10-3101)、KCCM11201P，但不限此。
例如，重组菌株的支链氨基酸生产能力可以比修饰之前的亲本菌株或未修饰的微生物的支链氨基酸生产能力高约1％或更多，并且具体地说，约3％或约5％，但不限于此，只要与修饰之前的亲本菌株或未修饰的微生物的生产相比，其具有正值的增加量即可。
又例如，与修饰之前的亲本菌株或未修饰的微生物相比，重组菌株可能具有约50％或更少，具体地说，约30％或更少或约10％或更少的在支链氨基酸生产途径中生成的副产物，但不限于此。
术语“约”包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的所有范围，并且包括等同于在术语“约”之后的数值的范围的所有数值，但不限于此。
如本文所用，术语“支链氨基酸”是指在侧链中具有支链烷基的氨基酸，并且包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。具体地说，在本公开中，支链氨基酸可以是L-支链氨基酸，并且L-支链氨基酸可以是选自L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸中的一种或多种，但不限于此。
在本公开中，在支链氨基酸生产途径中生成的副产物是指除支链氨基酸以外的物质，具体地说，芳香族氨基酸，并且更具体地说，选自L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的一种或多种，但不限于此。
由于术语“未修饰的微生物”不排除包含可能在微生物中天然存在的突变的菌株，并且可以是野生型菌株或天然菌株本身，或者可以是通过因天然或人工因素所致的遗传变异而性状改变之前的菌株。例如，未修饰的微生物可以是未引入或尚未引入本公开的预苯酸脱水酶变体的菌株。术语“未修饰的微生物”可以与“修饰之前的菌株”、“修饰之前的微生物”、“未变异的菌株”、“未修饰的菌株”、“未变异的微生物”或“参考微生物”互换使用。
在一个实施方案中，本公开的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)、克氏棒状杆菌(Corynebacterium crudilactis)、沙漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)、单一棒状杆菌(Corynebacterium singulare)、耐盐棒状杆菌(Corynebacteriumhalotolerans)、纹带棒状杆菌(Corynebacterium striatum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、污染棒状杆菌(Corynebacterium pollutisoli)、亚胺棒状杆菌(Corynebacterium imitans)、龟板棒状杆菌(Corynebacterium testudinoris)或微黄棒状杆菌(Corynebacterium flavescens)。
本公开的微生物还可以包含增加支链氨基酸生产能力的变异。
在一个实施方案中，本公开的微生物可以包含对异丙基苹果酸合酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸脱水酶、支链氨基酸氨基转移酶和柠檬酸合酶中的一种或多种的活性的修饰。
在一个实施方案中，本公开的微生物可以这样的微生物，其中异丙基苹果酸合酶、高丝氨酸脱氢酶、支链氨基酸转氨酶和苏氨酸脱水酶中的一种或多种的活性被另外增强。
然而，微生物不限于上文描述，并且本领域技术人员可以根据待生产的支链氨基酸适当地选择微生物中所包含的额外修饰。
如本文所用，术语多肽活性的“增强”意指与固有活性相比，多肽的活性增加。增强可以与诸如活化、上调、过表达、增加等的术语互换使用。在此，活化、增强、上调、过表达和增加可包括表现出最初没有的活性和表现出与固有活性或修饰之前的活性相比改善的活性。“固有活性”意指性状改变之前的亲本菌株或通过因天然或人工因素所致的遗传变异而性状改变时的未修饰的微生物最初拥有的特定多肽的活性。这可以与“修饰之前的活性”互换使用。与固有活性相比，多肽的活性“增强”、“上调”、“过表达”或“增加”的事实意指与性状改变之前的亲本菌株或未修饰的微生物最初拥有的特定多肽的活性和/或浓度(表达水平)相比，多肽的活性改善。
可以通过引入外来多肽或增强多肽的固有活性和/或浓度(表达水平)来实现增强。多肽的活性增强可以通过对应多肽的活性程度和表达水平或者由对应多肽产生的产物的量的增加来确认。
对于多肽的活性增强，可以应用本领域中熟知的各种方法，并且方法不受限制，只要感兴趣的多肽的活性与修饰之前微生物的活性相比可以增强即可。具体地说，可以使用本领域的技术人员熟知的基因工程和/或蛋白质工程，其为分子生物学的例行方法，但方法不限于此(例如，Sitnicka等人Functional Analysis of Genes.Advances in CellBiology.2010,第2卷.1-16,Sambrook等人Molecular Cloning 2012等)。
具体地说，本公开的多肽的增强可以是：
1)编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数增加；
2)用表现出强活性的序列置换编码多肽的染色体上的基因表达调控区；
3)修饰编码多肽的基因转录物或编码5'-UTR区的碱基序列的起始密码子；
4)修饰多肽的氨基酸序列以增强多肽的活性；
5)修饰编码多肽的多核苷酸以增强多肽的活性(例如，修饰多肽基因的多核苷酸序列以编码被修饰成增强多肽的活性的多肽)；
6)引入表现出多肽的活性的外来多肽或编码多肽的外来多核苷酸；
7)密码子优化编码多肽的多核苷酸；
8)分析多肽的三级结构以选择暴露的位点并进行对暴露的位点的修饰或化学修饰；或
9)选自1)至8)的两种或更多种的组合，但不特别限于此。
更具体地说，1)编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数的增加可以通过将载体引入至宿主细胞中来进行，所述载体不依赖于宿主细胞而复制和发挥功能并且可操作地连接至编码对应多肽的多核苷酸。替代地，可以通过将编码对应多肽的多核苷酸的一个拷贝或两个或更多个拷贝引入至宿主细胞的染色体中来实现增加。引入到染色体中可以通过将能够将多核苷酸插入到宿主细胞的染色体中的载体引入宿主细胞中来进行，但不限于此。载体如上文所述。
2)用表现出强活性的序列置换编码多肽的染色体上的基因表达控制区(或表达控制序列)可以是例如由于缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而发生序列的变异，或用表现出较强活性的序列置换，使得表达控制区的活性进一步增强。表达控制区没有特别限制，但可以包含启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列等。例如，置换可以是用强启动子置换初始启动子，但不限于此。
已知强启动子的实例包括cj1至cj7启动子(美国专利号7662943B2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(美国专利号10584338B2)、O2启动子(美国专利号10273491B2)、tkt启动子、yccA启动子等，但不限于此。
3)修饰编码多肽的基因转录物或编码5'-UTR区的碱基序列的起始密码子可以是例如用编码与内源性起始密码子相比具有较高多肽表达速率的另一种起始密码子的碱基序列取代，但不限于此。
4)和5)氨基酸序列或多核苷酸序列的修饰可以是由于多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而发生序列的变异，或者用被修饰以表现出较强活性的氨基酸序列或多核苷酸序列或被修饰以更具活性的氨基酸序列或多核苷酸序列置换，使得多肽的活性增强，但不限于此。置换可具体地通过将多核苷酸通过同源重组插入到染色体中来进行，但不限于此。此处所用的载体可以还包含选择标志物，以用于确认染色体插入。选择标志物如上文所述。
6)引入表现出多肽的活性的外来多核苷酸可以是将编码表现出与多肽的活性相同或类似的活性的多肽的外来多核苷酸引入到宿主细胞中。外来多核苷酸的来源或序列不受限制，只要其表现出与多肽的活性相同或类似的活性即可。引入中所用的方法可以通过适当地选择本领域的技术人员已知的转化方法来进行。当引入的多核苷酸在宿主细胞中表达时，可以产生多肽，并且其活性可以增加。
7)编码多肽的多核苷酸的密码子优化可以是内源性多核苷酸的密码子优化，以便增加宿主细胞中的转录或翻译，或者是外来多核苷酸的密码子优化，以便在宿主细胞中进行优化的转录或翻译。
8)分析多肽的三级结构以选择暴露的位点并对暴露的位点进行修饰或化学修饰可以是例如通过将待分析的多肽的序列信息与储存已知蛋白的序列信息的数据库比较来根据序列的类似性程度确定模板蛋白候选物，基于此来确认结构并选择和修饰或化学修饰待修饰或化学修饰的暴露部分。
多肽活性的此类增强可以是对应多肽的活性或浓度(表达水平)的基于野生型或修饰之前的微生物菌株中表达的多肽的活性或浓度的增加，或者由对应多肽产生的产物的量的增加，但不限于此。
在本公开的微生物中，多肽的一部分或整个修饰可以通过以下来诱导：(a)使用在微生物中插入染色体的载体进行同源重组或使用工程核酸酶(例如，CRISPR-Cas9)进行基因组编辑；和/或(b)用光诸如紫外线和辐射和/或化学品进行处理，但不限于此。修饰基因的一部分或全部的方法可以包括使用DNA重组技术的方法。例如，通过将含有与感兴趣的基因同源的核苷酸序列的核苷酸序列或载体引入微生物中以引起同源重组，可以缺失基因的一部分或全部。引入的核苷酸序列或载体可以包含显性选择标志物，但不限于此。
如本文所用，术语多肽活性的“减弱”是包括与内源活性相比活性降低或活性不存在这两种情况的概念。减弱可以与诸如失活、缺陷、下调、降低、减少、衰减等的术语互换使用。
减弱还可以包括：与微生物最初拥有的活性相比，由于编码多肽多核苷酸的变异等而多肽本身的活性降低或消除的情况；与天然菌株相比，由于编码多肽的多核苷酸的基因的表达受到抑制或通过对翻译成多肽的抑制，从而细胞中的总体多肽活性水平和/或浓度(表达水平)较低的情况；多核苷酸根本不表达的情况；和/或即使多核苷酸表达，也不存在多肽活性的情况。“内源性活性”意指性状改变之前的亲本菌株或野生型或未修饰微生物最初拥有的特定多肽的活性，所述性状通过因天然或人工因素所致的遗传变异而改变。内源性活性可与“修饰之前的活性”互换使用。与内源性活性相比，多肽的活性“失活、缺陷、降低、下调、减少或衰减”的事实意指与性状改变之前的亲本菌株或未修饰的微生物最初拥有的特定多肽的活性相比，多肽的活性降低。
此类多肽活性减弱可以通过本领域中已知的任何方法进行，但是方法不限于此，并且减弱可以通过应用本领域中熟知的各种方法来实现(例如，Nakashima N等人,Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing.Int JMolSci.2014；15(2):2773-2793；Sambrook等人Molecular Cloning 2012等)。
具体地说，本公开的多肽的减弱可以是：
1)缺失编码多肽的基因的全部或一部分；
2)修饰表达调控区(或表达调控序列)以降低编码多肽的基因的表达；
3)修饰构成多肽的氨基酸序列以消除或减弱多肽活性(例如，氨基酸序列中一个或多个氨基酸的缺失/取代/添加)；
4)修饰编码多肽的基因序列以消除或减弱多肽活性(例如，经过修饰以消除或减弱多肽活性的编码多肽的多肽基因的核酸碱基序列中一个或多个核酸碱基的缺失/取代/添加)；
5)修饰编码多肽的基因转录物或编码5'-UTR区的碱基序列的起始密码子；
6)引入与编码多肽的基因的转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如，反义RNA)；
7)在编码多肽的基因的SD序列(Shine-Dalgarno sequence)之前添加与SD序列互补的序列以形成不可连接核糖体的二级结构；
8)添加在编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3'末端的相反方向上转录的启动子(逆转录工程化，RTE)；或
9)选自1)至8)的两种或更多种的组合，但不特别限于此。
例如，
1)缺失编码多肽的基因的一部分或全部可以是除去染色体中编码感兴趣的固有多肽的全部多核苷酸、用缺失一些核苷酸的多肽置换、或用标志物基因置换。
另外，2)修饰表达调控区(或表达调控序列)可以是由于缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而在表达调控区(或表达调控序列)中发生变异，或者用表现出较弱活性的序列置换。表达调控区包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译终止的序列，但不限于此。
另外，3)修饰编码多肽的基因转录物或编码5'-UTR区的碱基序列的起始密码子可以是用编码与固有起始密码子相比具有较低多肽表达速率的另一种起始密码子的碱基序列取代，但不限于此。
另外，4)和5)氨基酸序列或多核苷酸序列的修饰可以是由于多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而发生序列的变异，或者用被修饰以表现出较弱活性的氨基酸序列或多核苷酸序列或被修饰成非活性的氨基酸序列或多核苷酸序列置换，使得多肽的活性减弱，但不限于此。例如，基因表达可以通过将变异引入到多核苷酸序列中并形成终止密码子来抑制或减弱，但不限于此。
另外，6)对于与编码多肽的基因的转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如，反义RNA)的引入可以参考文件，例如Weintraub,H.等人,Antisense-RNA as amolecular toolfor genetic analysis,Reviews-Trends in Genetics,第1卷(1)1986。
另外，7)在编码多肽的基因的SD序列之前添加与SD序列互补的序列以形成不可连接核糖体的二级结构可以是使mRNA不能翻译或减慢mRNA翻译速率。
另外，8)添加在编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3'末端的相反方向上转录的启动子(逆转录工程化，RTE)可以是通过制备与编码多肽的基因的转录物互补的反义核苷酸来减弱活性。
在本公开的微生物中，变体、多核苷酸、载体和支链氨基酸如其他方面所述。
本公开的又一方面提供一种生产支链氨基酸的方法，所述方法包括在培养基中培养本公开的棒状杆菌属微生物的步骤。
如本文所用，术语“培养”意指使本公开的棒状杆菌属微生物在适当控制的环境条件下生长。本公开的培养过程可以根据本领域已知的合适的培养基和培养条件进行。本领域技术人员可以根据选择的菌株容易地调整和使用这种培养过程。具体地说，培养可以是分批型、连续型和/或分批补料型，但不限于此。
如本文所用，术语“培养基”意指含有培养本公开的棒状杆菌属微生物所需的营养物质作为主要组分的混合物质，并且培养基供应存活和发展不可缺少的营养物质和生长因子等，包括水。明确地说，作为用于培养本公开的棒状杆菌属微生物的培养基和其他培养条件，可以没有特别限制地使用任何一种，只要其为用于微生物的普通培养的培养基即可。本公开的棒状杆菌属微生物可以在有氧条件下控制温度、pH等的同时在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等的普通培养基中培养。
具体地说，棒状杆菌属微生物的培养基可见于文件“Manual of Methods forGeneral Bacteriology”,the American Society for Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981)中。
在本公开中，碳源包括碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖(saccharose)、乳糖、果糖、蔗糖(sucrose)、麦芽糖等；糖醇，诸如甘露醇、山梨醇等；有机酸，诸如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；以及氨基酸，诸如谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等；等等。可以使用天然有机营养物质，诸如淀粉水解物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浆。具体地说，可以使用碳水化合物，诸如葡萄糖和经过灭菌的预处理糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)，并且可以以各种方式使用适当量的其他碳源而没有限制。这些碳源可以单独使用或以其两种或更多种的组合其使用，但不限于此。
作为氮源，可以使用：无机氮源，诸如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；和有机氮源，诸如氨基酸(诸如谷氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺等)、蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物以及脱脂豆饼或其分解产物等。这些氮源可以单独使用或以其两种或更多种的组合其使用，但不限于此。
磷源可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其对应的含钠盐。作为无机化合物，可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。除这些化合物之外，还可以包含氨基酸、维生素和/或合适的前体等。这些组分或前体可以分批或连续地添加到培养基中，但不限于此。
另外，在培养本公开的棒状杆菌属微生物期间，可以通过以适当方式向培养基中添加化合物诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸或硫酸来调节培养基的pH。在培养期间，可以通过使用消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制起泡。可以向培养基中注入氧气或含氧气体以维持培养基的好氧状态，或可以不注入气体或可以注入氮气、氢气或二氧化碳气体以维持培养基的厌氧和微氧状态，但不限于此。
在本公开的培养中，培养温度可维持在20℃至45℃，具体地说，25℃至40℃，并且微生物可以培养约10小时至160小时，但不限于此。
通过本公开的培养物生产的支链氨基酸可以被分泌到培养基中或可以保留在细胞中。
本公开的生产支链氨基酸的方法还可以包括，例如在培养步骤之前，制备本公开的棒状杆菌属微生物的步骤、制备用于菌株培养的培养基的步骤或这些步骤的组合(以任何顺序)。
本公开的生产支链氨基酸的方法还可以包括从根据培养物的培养基(进行培养的培养基)或从本公开的棒状杆菌属微生物中回收支链氨基酸的步骤。在培养步骤之后还可以包括回收步骤。
回收可以是根据培养本公开的培养微生物的方法例如分批、连续或分批补料培养方法，通过本领域已知的合适方法来收集感兴趣的支链氨基酸。例如，可以使用离心、过滤、用结晶蛋白质沉淀剂处理(盐析)、提取、超声分解、超滤、渗析、各种形式的色谱法诸如分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法和亲和亲和色谱法、HPLC或其组合。可以通过本领域已知的合适方法从培养基或微生物中回收感兴趣的支链氨基酸。
另外，本公开的生产支链氨基酸的方法还可以包括纯化步骤。纯化可以通过本领域已知的合适方法进行。例如，当本公开的生产支链氨基酸的方法包括回收步骤和纯化步骤时，回收步骤和纯化步骤可以不分顺序地间断(或连续)进行，或者可以同时或通过合并成一个步骤来进行，但不限于此。
在本公开的方法中，变体、多核苷酸、载体、微生物等如其他方面所述。
本公开的又一个方面提供一种用于生产支链氨基酸的组合物，所述组合物包含本公开的变体、编码变体的多核苷酸、包含多核苷酸的载体或包含本公开多核苷酸的棒状杆菌属微生物；已培养有微生物的培养基；或其两种或更多种的组合。
本公开的组合物还可以包含常用于生产支链氨基酸的组合物中的任意合适的赋形剂。此类赋形剂可为例如防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂，但不限于此。
在本公开的组合物中，变体、多核苷酸、载体、菌株、培养基、支链氨基酸等如其他方面所述。
本公开的又一方面提供微生物在生产支链氨基酸中的用途，所述微生物包含以下中的一种或多种：本公开的预苯酸脱水酶变体；编码所述预苯酸脱水酶变体的多核苷酸；以及包含所述多核苷酸的载体。
在本公开的使用中，变体、多核苷酸、载体、微生物等如其他方面所述。
在下文中，将参考实施例和实验实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例和实验实施例仅用于说明本公开，并且本公开的范围不旨在受这些实施例和实验实施例的限制。
实施例1：pheA变异的探索
实施例1-1.包含pheA的载体的构建
为了构建具有预苯酸脱水酶活性的pheA突变体文库，首先构建了包含pheA的重组载体。为了扩增来源于野生型谷氨酸棒状杆菌的编码pheA蛋白(SEQ ID NO:1，Uniprot ID:P10341)的pheA基因(SEQ ID NO:2)，使用野生型菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体作为模板以及SEQ ID NO:3和4引物，在以下条件进行PCR：25个在94℃下变性1分钟，在58℃下退火30秒，在72℃下用Pfu DNA聚合酶聚合1分钟的循环。所用的引物的具体序列列于表1中。使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)将扩增产物克隆到大肠杆菌载体pCR2.1中，以获得“pCR-pheA”。
[表1]
实施例1-2.pheA突变体文库的构建
基于实施例1-1中制备的载体，使用易错PCR试剂盒(clontechPCR随机诱变试剂盒)构建pheA突变体文库。使用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4作为引物，在每1000bp可发生0至3个突变的条件下进行PCR反应。详细地说，通过在94℃下预加热30秒，之后进行25个在94℃下30秒和在68℃下1分30秒的循环，进行PCR反应。将因此获得的PCR产物用作大引物(50至125ng)，之后进行25个在95℃下50秒和在60℃下50秒的循环以及在68℃下12分钟，然后用DpnI处理，并且通过热休克方法转化到大肠杆菌DH5α中，并铺在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。选择20种类型的转化菌落，并且获得质粒，之后进行序列分析。结果证实，在不同位置处引入了变异，频率为2个突变/kb。取约20,000个转化的大肠杆菌菌落并提取质粒，将其命名为‘pTOPO-pheA-文库’。
实施例2：构建的文库的评估和变体的选择
实施例2-1.具有增加或减少的L-亮氨酸和L-苯丙氨酸生产的突变菌株的选择
将实施例1-2中制备的pTOPO-pheA-文库通过电穿孔转化至野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中，然后铺板于含有25mg/L卡那霉素的营养培养基(表2)上。选择插入了突变基因的菌株的10,000个菌落。每个选定的菌落从ATCC13032/pTOPO_pheA(mt)1到ATCC13032/pTOPO_pheA(mt)10,000进行命名。
为了在获得的10,000个菌落中鉴定显示L-亮氨酸的生产增加和L-苯丙氨酸(其为芳香族氨基酸)的生产增加或减少的菌落，按以下方式评价每个菌落的发酵效价。
[表2]
使用铂环，将每个菌落接种到含有在25ml高压灭菌的生产培养基(表2)中的25μg/mL卡那霉素的250ml角挡板(corner-baffle)烧瓶中，然后在以200rpm摇动下，在30℃下培养60小时。培养完成之后，通过使用高效液相色谱(HPLC,SHIMAZDU LC20A)的方法测量L-亮氨酸和芳香族氨基酸中的L-苯丙氨酸。
在获得的10,000个菌落中，选择与野生型谷氨酸棒状杆菌菌株(ATCC13032)相比，具有最为改善的L-亮氨酸生产能力和减少的L-苯丙氨酸生产的一种类型的菌株(ATCC13032/pTOPO_pheA(mt)3891)。所选菌株中产生的L-亮氨酸(Leu)和L-苯丙氨酸(Phe)的浓度示出于以下表3中。
[表3]
菌株名称 Leu(g/L) Phe(g/L)
ATCC13032 0.87 1.85
ATCC13032/ptopO_pheA(mt)3891 1.25 0.26
如表3中所示，证实了与亲本菌株相比，具有pheA基因变异的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/pTOPO_pheA(mt)3891显示出L-亮氨酸生产提高约1.4倍并且L-苯丙氨酸生产减少约7倍。
实施例2-2.具有增加或减少的L-亮氨酸和L-苯丙氨酸生产的菌株中的变异的鉴定
为了鉴定所选突变菌株ATCC13032/pTOPO_pheA(mt)3891的pheA基因变异，将每个突变菌株的DNA用作模板，并且使用表1中所述的引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4在以下条件下进行PCR：在94℃下变性5分钟，之后进行30个在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下1分钟30秒的循环，然后在72℃下5分钟。然后，进行DNA测序。
测序结果证实，ATCC13032/pTOPO_pheA(mt)3891菌株的在pheA基因的位置544至546处的核苷酸CGC被GCG取代，指示其编码变体(以下称为R182A)，其中丙氨酸取代作为在pheA蛋白的位置182处的氨基酸的精氨酸。pheA变体(R182A)的氨基酸序列和编码其的pheA变体的碱基序列如SEQ ID NO:5和6中所示。
因此，在以下实施例中，尝试证实变异(R182A)是否影响棒状杆菌属微生物生产L-亮氨酸和芳香族氨基酸。
实施例3：选定突变菌株的L-亮氨酸和L-苯丙氨酸生产能力的检测
实施例3-1.包含pheA变异的插入型载体的构建
为了将实施例2中选择的变异引入到菌株中，旨在构建插入型载体。使用定点诱变方法构建用于引入pheA(R182A)变异的载体。为了使用野生型谷氨酸棒状杆菌的染色体作为模板来生成R182A变异，使用引物对SEQ ID NO:7和8以及引物对SEQ ID NO:9和10进行PCR。详细地说，在以下条件下进行PCR：在94℃下变性5分钟，之后进行30个在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下1分30秒的循环，然后在72℃下5分钟。所用的引物的具体序列列于表4中。
[表4]
SEQ ID NO. 序列(5'->3')
SEQ ID NO:7 GTGAATTCGAGCTCGGTACCCGTGGCATGGATGAAAAG
SEQ ID NO:8 TTGGACAGCAACGAAGCGGGTcgcGGCGCCACGGAC
SEQ ID NO:9 GTCGCCGACGTCCGTGGCGCCgcgACCCGCTTCGTTG
SEQ ID NO:10 GGTCGACTCTAGAGGATCCCCGTGGCTGTCCATGATTC
将所得PCR产物克隆至用SmaI限制酶消化的线性pDCM2载体(韩国专利公开号KR10-2020-0136813A)中，通过使用In-Fusion酶融合DNA片段之间的末端15个碱基的同源序列来构建载体‘pDCM2-pheA(R182A)’，其中在pheA的位置182处的氨基酸被丙氨酸取代。
实施例3-2.向ATCC13032菌株中引入变体并进行评价
将实施例3-1中构建的pDCM2-pheA(R182A)载体通过电穿孔转化到ATCC13032中，并且在含25mg/L卡那霉素的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入在染色体上的菌株。将选定的初级菌株再次进行二次交换(crossover)，并且选择引入了靶基因变异的菌株。最后，通过使用引物SEQ ID NO:3和4进行PCR，然后分析核苷酸序列，以鉴定变异被引入到菌株中，从而确认pheA基因变异是否被引入到转化的菌株中。制备了共计3种类型的菌株，并且命名为ATCC13032_pheA_R182A。
为了评价因此制备的共计3个菌株的L-亮氨酸和芳香族氨基酸生产能力，评价了烧瓶发酵效价。将各一铂环的亲本菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和制备的ATCC13032_pheA_R182A接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，然后在30℃、200rpm摇动下培养60小时，以生产L-亮氨酸。培养完成之后，通过HPLC测量L-亮氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸生产。各测试菌株的培养基中亮氨酸的浓度示出于以下表5中。
[表5]
菌株名称 Leu(g/L) Phe(g/L)
ATCC13032 0.87 1.85
ATCC13032_pheA_R182A 1.27 0.22
如表5中所示，与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032相比，ATCC13032_pheA_R182A显示L-亮氨酸产量提高约1.5倍。ATCC13032_pheA_R182A显示L-苯丙氨酸生产减少约8倍。
实施例4：亮氨酸生产菌株中选定的pheA变异的亮氨酸和苯丙氨酸生产能力的检测
棒状杆菌属的野生型菌株尽管生产亮氨酸，但其仅生产痕量的亮氨酸。因此，制备来源于ATCC13032的亮氨酸生产菌株，并且引入选定的变异以进行用于检测亮氨酸和苯丙氨酸生产能力的实验。详细的实验方法如下。
实施例4-1.生产L-亮氨酸的CJL-8109菌株的制备
制备了作为用于生产高浓度L-亮氨酸的菌株的ATCC13032来源的菌株，每个菌株包含(1)变异(R558H)，其中通过用A取代在leuA基因的位置1673处的核苷酸G，从而用组氨酸取代在LeuA蛋白的位置558处的氨基酸精氨酸，(2)变异(G561D)，其中通过用AT取代在leuA基因的位置1682和1683处的核苷酸GC，从而用天冬氨酸取代在LeuA蛋白的位置561处的氨基酸甘氨酸，或(3)变异(P247C)，其中通过用TG取代在leuA基因的位置739和740处的核苷酸CC，从而用半胱氨酸取代在LeuA蛋白的位置247处的氨基酸脯氨酸。
详细地说，通过电穿孔将包含leuA基因变异的pDCM2-leuA(P247C、R558H、G561D)载体转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中，并且在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择其中通过同源序列的重组将载体插入在染色体上的菌株。将选定的初级菌株再次进行二次交换，并且选择引入有leuA基因变异的菌株。最后，通过使用表6的引物SEQ ID NO:11和12进行PCR(在94℃下5分钟，之后进行30个在94℃下30秒/在55℃下30秒/在72℃下90秒的循环，以及在72℃下5分钟)，然后分析核苷酸序列，从而鉴定P247C、R558H、G561D变异的引入来证实变异是否被引入到转化的菌株中。用pDCM2-leuA(P247C、R558H、G561D)载体转化的ATCC13032_leuA_(P247C、R558H、G561D)菌株被命名为‘CJL-8105’。
[表6]
SEQ ID NO: 序列(5'->3')
SEQ ID NO:11 TATGCTTCACCACATGACTTC
SEQ ID NO:12 AAATCATTTGAGAAAACTCGAGG
为了增加所制备的CJL-8105菌株中的L-亮氨酸产量，制备引入有编码支链氨基酸转氨酶的ilvE变体(V156A)的菌株(韩国专利号KR 10-2143964B1)。详细地说，通过电穿孔将包含ilvE基因变异的pDCM2-ilvE(V156A)载体转化到谷氨酸棒状杆菌CJL-8105中，并且在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择其中通过同源序列的重组将载体插入在染色体上的菌株。将选定的初级菌株再次进行二次交换，并且选择引入有ilvE基因变异的菌株。最后，通过使用以下表7的引物SEQ ID NO:13和14进行PCR(在94℃下5分钟，之后进行30个在94℃下30秒/在55℃下30秒/在72℃下90秒的循环，之后在72℃下5分钟)，然后分析核苷酸序列，从而鉴定V156A变异的引入来证实变异是否被引入到转化的菌株中。用pDCM2-ilvE(V156A)载体转化的菌株被命名为‘CJL-8108’。
[表7]
SEQ ID NO: 序列(5'->3')
13 GTCACCCGATCGTCTGAAG
14 GTCTTAAAACCGGTTGAT
为了增加所制备的CJL-8108菌株中的L-亮氨酸产量，制备引入有柠檬酸合酶活性减弱的gltA变体(M312I；SEQ ID NO:25)的菌株。详细地说，通过电穿孔将包含gltA基因变异的pDCM2-gltA(M312I)载体转化到谷氨酸棒状杆菌CJL-8108中，并且在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择其中通过同源序列的重组将载体插入在染色体上的菌株。将选定的初级菌株再次进行二次交换，并且选择引入了gltA基因变异的菌株。最后，通过使用表8的引物SEQ ID NO:15和16进行PCR(在94℃下5分钟，之后进行30个在94℃下30秒/在55℃下30秒/在72℃下90秒的循环，之后在72℃下5分钟)，然后分析核苷酸序列，从而鉴定M312I变异的引入来证实变异是否被引入到转化的菌株中。用pDCM2-gltA(M312I)载体转化的菌株被命名为‘CJL-8109’。
[表8]
SEQ ID NO: 序列(5'->3')
15 CAATGCTGGCTGCGTACGC
16 CTCCTCGCGAGGAACCAACT
实施例4-2.向CJL-8109菌株中引入pheA变体并进行评价
用实施例3-1中制备的pDCM2-pheA(R182A)载体转化L-亮氨酸生产菌株CJL-8109，并且在含25mg/L卡那霉素的培养基中选择其中通过同源序列的重组将载体插入在染色体上的菌株。将选定的初级菌株再次进行二次交换，并且选择引入了靶基因变异的菌株。最后，通过使用引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4进行PCR，然后分析核苷酸序列，以鉴定pheA变异被引入到菌株中，从而确认pheA基因变异是否被引入到转化的菌株中。制备的CJL8109_pheA_R182A被命名为CA13-8116，并且于2021年1月22日保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM12943P。
对制备的CA13-8116和ATCC13032 CJL-8109菌株的亮氨酸生产能力进行评价。以与实施例2中相同的方式，进行烧瓶培养，并且在培养完成之后，通过使用HPLC的方法测量亮氨酸生产，并且培养结果如以下表9中所示。
[表9]
如表9中所示，证实了与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032相比，在pheA基因中包含额外的R182A变异的L-亮氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌CA13-8116显示L-亮氨酸生产能力提高约4倍。还证实了与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌CJL-8109相比，L-亮氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌CA13-8116显示L-亮氨酸生产能力提高约1.2倍。与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌CJL-8109相比，CA13-8116显示L-苯丙氨酸生产能力减少约5.4倍。
这些结果指示，在pheA蛋白的氨基酸序列的位置182处的氨基酸是增加L-亮氨酸生产的重要位点。
实施例5：异亮氨酸生产菌株中选定的pheA变异的亮氨酸和苯丙氨酸生产能力的检测
为了检测选定的变异是否表现出对作为代表性支链氨基酸的亮氨酸和异亮氨酸的影响，通过将变异引入棒状杆菌异亮氨酸生产菌株中来进行确认异亮氨酸生产能力的实验。详细的实验方法如下。
实施例5-1.生产L-异亮氨酸的CA10-3101菌株的制备
从野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032开发L-异亮氨酸生产菌株。详细地说，为了解除生物合成途径中对作为异亮氨酸前体的苏氨酸的反馈抑制，在作为编码高丝氨酸脱氢酶的基因的hom的位置407处的氨基酸精氨酸被组氨酸取代(US2020-0340022 A1)。详细地说，为了制备引入有hom(R407H)变异的菌株，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体作为模板以及引物SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20进行PCR。这里使用的引物的序列示于以下表10中。
[表10]
SEQ ID NO. 序列(5'->3')
SEQ ID NO:17 TCGAGCTCGGTACCCCGCTTTTGCACTCATCGAGC
SEQ ID NO:18 CACGATCAGATGTGCATCATCAT
SEQ ID NO:19 ATGATGATGCACATCTGATCGTG
SEQ ID NO:20 CTCTAGAGGATCCCCGAGCATCTTCCAAAACCTTG
将PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)用作PCR反应的聚合酶，并且PCR条件包括28个以下的循环：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟。结果，分别获得了以hom基因的变异为中心的5'上游的1000bp DNA片段和3'下游的1000bpDNA片段。使用扩增的两个DNA片段作为模板以及引物SEQ ID NO:17和20进行PCR。在以下条件下进行PCR：在95℃下变性5分钟；28个在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒和在72℃下聚合2分钟的循环；以及在72℃下聚合5分钟。
结果，扩增了2kb DNA片段，DNA片段包含编码高丝氨酸脱氢酶变体的hom基因变异，其中在位置407处的精氨酸被组氨酸取代。使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化扩增产物并将其用作载体构建的插入DNA片段。纯化的扩增产物用限制酶smaI处理。以1:2的摩尔浓度(M)比制成在65℃下热处理20分钟的pDCM2载体和扩增产物，即插入DNA片段，并且使用融合克隆试剂盒(TaKaRa)，根据提供的手册进行克隆，从而构建pDCM2-R407H载体，以便将hom(R407H)变异引入到染色体中。
通过电穿孔将制备的载体转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中并进行二次交换，获得在染色体上包含hom(R407H)变异的菌株并命名为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 hom(R407H)。
为了解除L-异亮氨酸的反馈抑制并增加制备的ATCC13032 hom(R407H)菌株的活性，制备了引入有作为编码L-苏氨酸脱水酶的基因的ilvA的变体(T381A、F383A)的菌株。更具体地说，为了制备引入有ilvA(T381A、F383A)变异的菌株，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体作为模板以及引物SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24进行PCR。这里使用的引物的序列示于以下表11中。
[表11]
SEQ ID NO. 序列(5'->3')
SEQ ID NO:21 TCGAGCTCGGTACCCATGAGTGAAACATACGTGTC
SEQ ID NO:22 GCGCTTGAGGTACTCtgcCAGCGcGATGTCATCATCCGG
SEQ ID NO:23 CCGGATGATGACATCgCGCTGgcaGAGTACCTCAAGCGC
SEQ ID NO:24 CTCTAGAGGATCCCCCGTCACCGACACCTCCACA
将PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)用作PCR反应的聚合酶，并且PCR条件包括28个以下的循环：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟。结果，分别获得了以ilvA基因的变异为中心的5'上游的1126bp DNA片段和3'下游的286bpDNA片段。使用扩增的两个DNA片段作为模板以及引物SEQ ID NO:21和24进行PCR。在以下条件下进行PCR：在95℃下变性5分钟；28个在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒和在72℃下聚合2分钟的循环；以及在72℃下聚合5分钟。
结果，扩增了1.4kb的DNA片段，DNA片段包含编码苏氨酸脱水酶变体的ilvA基因变异，其中在位置381处的苏氨酸被丙氨酸取代，并且在位置383处的苯丙氨酸被丙氨酸取代。使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化扩增产物并将其用作载体构建的插入DNA片段。纯化的扩增产物用限制酶smaI处理。以1:2的摩尔浓度(M)比制成在65℃下热处理20分钟的pDCM2载体和扩增产物，即插入DNA片段，并且使用融合克隆试剂盒(TaKaRa)，根据提供的手册进行克隆，从而构建pDCM2-ilvA(T381A、F383A)载体，以便将ilvA(T381A、F383A)变异引入到染色体中。
通过电穿孔将制备的载体转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 hom(R407H)中并进行二次交换，获得在染色体上包含ilvA(T381A、F383A)变异的菌株并命名为谷氨酸棒状杆菌CA10-3101。
实施例5-2.向CA10-3101菌株中引入pheA变体并进行评价
用实施例3-1中制备的pDCM2-pheA(R182A)载体转化L-异亮氨酸生产菌株CA10-3101，并且在含25mg/L卡那霉素的培养基中选择其中通过同源序列的重组将每个载体插入在染色体上的菌株。将选定的初级菌株再次进行二次交换，并且选择引入了靶基因变异的菌株。最后，通过使用表1的引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4进行PCR，然后分析核苷酸序列，以鉴定pheA变异被引入到菌株中，从而确认pheA基因变异是否被引入到转化的菌株中。
评价制备的CA10-3101_pheA_R182A和ATCC13032 CA10-3101菌株的L-异亮氨酸和L-苯丙氨酸生产能力。将亲本菌株和pheA变体分别接种于含有25ml异亮氨酸生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，并且在32℃、200rpm摇动下培养60小时以生产L-异亮氨酸。本实施例中使用的生产培养基的组成如下。
<生产培养基>
10％葡萄糖、0.2％酵母提取物、1.6％硫酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.1％七水合硫酸镁、10mg/l七水合硫酸铁、10mg/l一水合硫酸锰、200μg/L生物素，pH 7.2
培养完成之后，使用高效液相色谱(HPLC)测量L-异亮氨酸和L-苯丙氨酸的生产，并且各测试的菌株的培养基中L-异亮氨酸和副产物的浓度显示在以下表12中。
[表12]
L-异亮氨酸浓度(g/L) L-Phe浓度(g/L)
ATCC13032 0.0 1.2
CA10-3101(亲本菌株) 2.5 0.6
CA10-3101_pheA_R182A 3.0 0.2
如表12中所示，证实了与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌CA10-3101相比，在pheA基因中包含额外的R182A变异的L-亮氨酸生产菌株显示L-异亮氨酸生产能力提高约1.1倍，并且CA10-3101_pheA_R182A菌株显示副产物L-苯丙氨酸减少。
这些结果指示，在pheA蛋白的氨基酸序列的位置182处的氨基酸是增加L-异亮氨酸生产的重要位点。
实施例6：缬氨酸生产菌株中选定的pheA变异的缬氨酸和苯丙氨酸生产能力的检测
为了检测选定的变异是否还表现出对作为代表性支链氨基酸诸如亮氨酸的L-缬氨酸的影响，通过将选定的变异引入棒状杆菌属缬氨酸生产菌株KCCM11201P中来进行确认缬氨酸和苯丙氨酸生产能力的实验。详细的实验方法如下。
实施例6-1.向KCCM11201P菌株中引入pheA变体并进行评价
为了检测对应的变异是否对增加L-缬氨酸生产能力有影响，使用L-缬氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P(US 8465962 B2)。用实施例3-1中制备的pDCM2-pheA(R182A)载体转化缬氨酸生产菌株KCCM11201P，并且在含25mg/L卡那霉素的培养基中选择其中通过同源序列的重组将载体插入在染色体上的菌株。将选定的初级菌株再次进行二次交换，并且选择引入了靶基因变异的菌株。最后，通过使用表1的引物SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4进行PCR，然后分析核苷酸序列，以鉴定pheA变异被引入到菌株中，从而确认pheA基因变异是否被引入到转化的菌株中。将制备的菌株分别命名为KCCM11201P-pheA(R182A)。
对制备的KCCM11201P-pheA(R182A)菌株的亮氨酸生产能力进行评价。以与实施例2中相同的方式，进行烧瓶培养，并且在培养完成之后，通过使用HPLC的方法测量缬氨酸生产，并且培养结果如以下表13中所示。
[表13]
菌株名称 Val(g/L) Phe(mg/L)
KCCM11201P 2.60 146.62
KCCM11201P-pheA(R182A) 2.86 27.33
如表13中所示，证实了与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P相比，在pheA基因中包含额外的R182A变异的L-缬氨酸生产谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P-pheA(R182A)显示L-缬氨酸生产能力提高约1.1倍。证实了与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P相比，KCCM11201P-pheA(R182A)显示L-苯丙氨酸生产能力减少约5.36倍。这些结果指示，在pheA蛋白的氨基酸序列的位置182处的氨基酸是增加L-缬氨酸生产的重要位点。
参考实施例1：gltA(M312I)变异对亮氨酸生产的影响的检测
参考实施例1-1.包含gltA变异的插入型载体的构建
使用定点诱变方法构建用于引入gltA(M312I；SEQ ID NO:25)变异的载体。
使用野生型谷氨酸棒状杆菌的染色体作为模板和引物对SEQ ID NO:27和28以及引物对SEQ ID NO:29和30进行PCR。
在以下条件下进行PCR：在94℃下变性5分钟，之后进行30个在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下1分30秒的循环，之后进行在72℃下聚合5分钟。使用In-Fusion酶，通过DNA片段之间末端15个碱基的同源序列的融合，将所得基因片段克隆到用SmaI限制性酶消化的线性pDCM2载体中，从而构建用异亮氨酸取代在位置312处的氨基酸甲硫氨酸的pDCM2-gltA(M312I)载体。
[表14]
参考实施例1-2.向ATCC13032菌株中引入变体并进行评价
用参考实施例1-1中制备的pDCM2-gltA(M312I)载体转化野生型ATCC13032，并且在含25mg/L卡那霉素的培养基中选择其中通过同源序列的重组将每个载体插入在染色体上的菌株。将选定的初级菌株再次进行二次交换，并且选择引入有靶基因变异的菌株。最后，通过使用引物SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16(实施例4-1，表8)进行PCR，然后分析核苷酸序列，以鉴定变异(SEQ ID NO:26)被引入到菌株中，从而确认gltA基因变异是否被引入到转化的菌株中。将制备的菌株命名为ATCC13032_gltA_M312I。
为了评价所制备的ATCC13032_gltA_M312I菌株的亮氨酸生产能力，评价烧瓶发酵效价。将各一铂环的亲本菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和制备的ATCC13032_gltA_M312I接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，然后在30℃、200rpm摇动下培养60小时，以生产亮氨酸。培养完成之后，通过HPLC测量亮氨酸生产。各测试菌株的培养基中亮氨酸的浓度示出于以下表15中。
-生产培养基：100g葡萄糖、40g(NH4)2SO4、2.5g大豆蛋白、5g玉米浆固体、3g尿素、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1,000μg盐酸硫胺素、2000μg泛酸钙、3,000μg烟酰胺、30g CaCO3；(基于1升蒸馏水)，pH 7.0。
[表15]
菌株名称 亮氨酸(g/L)
ATCC13032 0.87
ATCC13032_gltA_M312I 1.25
由此证实了，gltA的M312I取代是增加亮氨酸生产的有效变异。
参考实施例2：ilvA(T381A、F383A)变异对异亮氨酸生产的影响的检测参考实施例2-1.pECCG117-ilvA(F383A)的构建
为了扩增作为编码苏氨酸脱水酶(SEQ ID NO:31)的基因的ilvA(SEQ ID NO:32)，基于先前报告的引入有F383A变异的ilvA序列(World J MicrobiolBiotechnol(2015)31:1369-1377)，在引物(SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34)的两端插入BamHI限制性酶位点，以实现从启动子区(起始密码子上游约300bp)到终止子区(起始密码子下游约100bp)的扩增。此外，使用用于将F383A变异引入ilvA的引物(SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36)。这里使用的引物的序列示于以下表16中。
[表16]
SEQ ID NO: 名称 序列
33 引物1 ggatccGACTGAGCCTGGGCAACTGG
34 引物2 ggatccCCGTCACCGACACCTCCACA
35 引物3 ACATCACGCTGgcaGAGTACCTCAA
36 引物4 TTGAGGTACTCtgcCAGCGTGATGT
使用野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的染色体作为模板以及引物SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36进行PCR。在以下条件下进行PCR：在95℃下变性5分钟，之后进行30个在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒和在72℃下聚合90秒的循环，然后在72℃下聚合5分钟。
结果，分别获得了以ilvA基因的变异为中心的5'上游的1460bp DNA片段和3'下游的276bp DNA片段。
使用扩增的两个DNA片段作为模板以及引物SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36进行PCR。
结果，扩增了1531bp DNA片段，其包含用丙氨酸取代在位置383处的苯丙氨酸的ilvA变异，将pECCG117(韩国专利号10-0057684)载体和ilvA DNA片段用限制性酶BamHI处理，并且使用DNA接合酶接合，然后克隆以获得质粒，其命名为pECCG117-ilvA(F383A)。
参考实施例2-2：向pECCG117-ilvA(F383A)中额外引入随机突变
为了获得编码L-苏氨酸脱水酶的基因的变体，使用随机诱变试剂盒(AgilentTechnologies,USA)制备ilvA变体基因质粒。使用参考实施例2-1的ilvA(F383A)染色体作为模板以及引物SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36进行PCR。在以下条件下进行PCR：在95℃下变性2分钟，之后进行30个在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒和在72℃下聚合90秒的循环，然后在72℃下聚合10分钟。
结果，扩增了1531bp DNA片段，其为编码L-苏氨酸脱水酶的ilvA变体，除了用丙氨酸取代位置383处的苯丙氨酸的变异之外，还具有额外随机变异。将pECCG117载体和ilvA变体DNA片段用限制性酶BamHI处理，使用DNA接合酶接合，然后克隆以获得质粒组。
参考实施例2-3：CJILE-301菌株的制备
将pECCG117-ilvA(F383A)引入野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 hom(R407H)菌株中，并且将引入有所制备的质粒的菌株命名为ATCC13032 hom(R407H)/pECCG117-ilvA(F383A)。此外，将参考实施例2-2中获得的变体质粒组引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 hom(R407H)菌株中，然后将其铺在基本培养基上。获得死亡率，并且结果死亡率为70％，并且将活细胞接种在种子培养基中并培养，最终选择显示比对照ATCC13032 hom(R407H)/pECCG117-ilvA(F383A)的异亮氨酸生产能力更高的变体菌株，且命名为谷氨酸棒状杆菌CJILE-301。
从CJILE-301菌株中分离质粒，并对ilvA基因进行测序。结果证实了，ilvA基因的位置1141处的碱基序列A被G取代，编码了ilvA蛋白的位置381的T被A取代并且ilvA蛋白的位置383处的F被A取代的变体蛋白。序列由SEQ ID NO:38表示。
参考实施例2-4：ilvA变体(T381A、F383A)的引入
为了将ilvA变体(T381A、F383A)引入野生型菌株中，制备了引物SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:24(实施例5-1，表11)。
为了制备引入有ilvA变体(T381A、F383A)的菌株，使用从CJILE-301菌株提取的质粒DNA作为模板以及引物SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:24进行PCR。
将PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)用作PCR反应的聚合酶，并且PCR条件包括28个以下的循环：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟。
结果，获得了1411bp基因片段，其包含1311bp ilvA基因的约100bp终止子区。
使用PCR纯化试剂盒纯化扩增产物并将其用作载体构建的插入DNA片段。纯化的扩增产物用限制酶smaI处理。以1:2的摩尔浓度(M)比制成在65℃下热处理20分钟的pDCM2载体和扩增产物，即插入DNA片段，并且使用融合克隆试剂盒，根据提供的手册进行克隆，从而构建pDCM2-T381A_F383A载体，以便将T381A、F383A变异引入到染色体中。
通过电穿孔将制备的载体转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 hom(R407H)中并进行二次交换，获得在染色体上包含ilvA(T381A、F383A；SEQ ID NO:37)变异的菌株并命名为CA10-3101。
菌株CA10-3101被于2020年5月27日保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM12739P。
将KCCM12739P菌株接种于含有25ml异亮氨酸生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，然后在32℃、200rpm摇动下培养60小时以生产L-异亮氨酸。所用的生产培养基的组成如下。
<生产培养基>
10％葡萄糖、0.2％酵母提取物、1.6％硫酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.1％七水合硫酸镁、10mg/l七水合硫酸铁、10mg/l一水合硫酸锰、200μg/L生物素，pH 7.2。
培养完成之后，使用高效液相色谱(HPLC)测量培养基中L-异亮氨酸和L-苏氨酸的浓度，并且结果如以下表17所示。
[表17]
如表17所示，证实了亲本菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032hom(R407H)不能生产L-异亮氨酸，而ATCC13032 hom(R407H)ilvA(T381A、F383A)变体菌株以浓度3.9g/L生产L-异亮氨酸，与亲本菌株相比，表现出L-异亮氨酸生产力显著增加。
由此证实了，ilvA(T381A、F383A)变异是增加异亮氨酸生产的有效变异。
参考实施例3：leuA(P247C、R558H、G561D)对亮氨酸生产的影响的检测
参考实施例3-1.CJL-8100菌株的制备
通过电穿孔将包含leuA基因变异的pDCM2-leuA(R558H、G561D)载体(如KR 10-2018-0077008A中所公开)转化到野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中，并且在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择其中通过同源序列的重组将载体插入在染色体上的菌株。将选定的初级菌株再次进行二次交换，并且选择引入有leuA基因变异的菌株。最后，通过使用引物SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:43进行PCR(在94℃下5分钟，之后进行30个在94℃下30秒/在55℃下30秒/在72℃下90秒的循环，以及在72℃下5分钟)，然后分析核苷酸序列，以鉴定R558H、G561D变异被引入，从而证实变异是否被引入到转化的菌株中。用pDCM2-leuA(R558H、G561D)载体转化的ATCC13032_leuA_(R558H、G561D)菌株被命名为‘CJL-8100’。
参考实施例3中使用的引物的序列示于以下表18中。
[表18]
参考实施例3-2.包含LeuA变异的插入型载体的构建
构建用于将P247C变异引入L-亮氨酸生产菌株CJL-8100的载体，其中两个变异(R558H、G561D)被引入LeuA中。
使用CJL-8100菌株的染色体作为模板和引物对SEQ ID NO:39和40以及引物对SEQID NO:41和42进行PCR。在以下条件下进行PCR：在94℃下变性5分钟，之后进行30个在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下1分30秒的循环，然后在72℃下5分钟。使用In-Fusion酶，通过DNA片段之间的末端15个碱基的同源序列的融合，将所得PCR片段克隆到用SmaI限制性酶消化的线性pDCM2载体中，从而构建pDCM2-leuA(P247C、R558H、G561D)载体，其包含编码LeuA变体的leuA变异，其中组氨酸取代野生型菌株的LeuA氨基酸序列的位置558处的氨基酸精氨酸，并且天冬氨酸取代LeuA的位置561处的氨基酸甘氨酸，且半胱氨酸(Cys)取代位置247处的氨基酸脯氨酸(Pro)。
参考实施例3-3.向CJL-8100菌株中引入LeuA变体(P247C)并进行评价
L-亮氨酸生产菌株CJL-8100用参考实施例3-2中制备的pDCM2-leuA(P247C、R558H、G561D)载体转化，并且在含25mg/L卡那霉素的培养基中选择其中通过同源序列的重组将载体插入在染色体上的菌株。将选定的初级菌株再次进行二次交换，并且选择引入由靶基因变异的菌株。最后，通过使用引物SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:45进行PCR(在94℃下5分钟，之后进行30个在94℃下30秒/在55℃下30秒/在72℃下90秒的循环，然后在72℃下5分钟)，然后分析核苷酸序列，以证实leuA基因变异是否被引入到转化的菌株中。测序分析的结果证实，leuA变异被引入到菌株中，leuA变异编码LeuA变体(P247C、R558H、G561D)，其中通过用A取代菌株染色体中的leuA基因的位置1673处的核苷酸G，用AT取代位置1682和1683处的核苷酸GC，并且用TG取代位置739和740处的核苷酸CC，使得组氨酸取代LeuA的位置558处的氨基酸精氨酸，天冬氨酸取代LeuA的位置561处的氨基酸甘氨酸，并且半胱氨酸(Cys)取代LeuA的位置247处的氨基酸脯氨酸(Pro)。将制备的CJL8100_leuA_P247C命名为‘CA13-8105’，并且于2020年4月29日保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM12709P。
包含共计3种类型的变异的LeuA变体(P247C、R558H、G561D)的氨基酸序列和编码其的leuA变体的碱基序列分别如SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所示。
对ATCC13032、所制备的CJL-8100和CA13-8105菌株的L-亮氨酸生产能力进行评价。详细地说，以与实施例2-1相同的方式进行烧瓶培养。培养完成之后，通过HPLC测量亲本菌株和变异菌株的L-亮氨酸生产，并且结果如以下表19所示。
[表19]
如表19所示，与亲本菌株ATCC13032相比，L-亮氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌CJL8100显示L-亮氨酸生产能力提高约130％。与亲本菌株CJL8100相比，通过将额外的leuA_P247C变异引入CJL8100菌株来制备的CA13-8105菌株显示L-亮氨酸生产能力提高约150％。
由此证实了，leuA(R558H、G561D、P247C)变异是增加亮氨酸氨酸生产的有效变异。
基于以上描述，本领域技术人员将理解，本公开可以在不改变其技术精神或基本特征的情况下以不同的具体形式实施。就这一点而言，应当理解，上文实施方案不是限制性的，而是在所有方面中是说明性的。本公开的范围由所附权利要求书而不是前面的描述来限定，并且因此，所有落在权利要求书的边界或界限或此类边界或界限的等效物内的所有改变和修改都旨在由权利要求书所涵盖。
本发明的效果
当使用本公开的预苯酸脱水酶变体时，与不使用其相比，有可能以高产率生产支链氨基酸。
/>
/>
/>
序列表
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 预苯酸脱水酶变体以及使用其生产支链氨基酸的方法
<130> OPA21407
<150> KR 10-2021-0014077
<151> 2021-02-01
<160> 47
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PheA_WT
<400> 1
Met Ser Asp Ala Pro Thr Val Val Ala Tyr Leu Gly Pro Ala Gly Thr
1 5 10 15
Phe Thr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Phe Ala Asp Ala Gly Val Phe Gly
20 25 30
Asp Gly Glu Ile Glu Gln Leu Pro Ala Lys Ser Pro Gln Glu Ala Val
35 40 45
Asp Ala Val Arg His Gly Thr Ala Gln Phe Ala Val Val Ala Ile Glu
50 55 60
Asn Phe Val Asp Gly Pro Val Thr Pro Thr Phe Asp Ala Leu Asp Gln
65 70 75 80
Gly Ser Asn Val Gln Ile Ile Ala Glu Glu Glu Leu Asp Ile Ala Phe
85 90 95
Ser Ile Met Val Arg Pro Gly Thr Ser Leu Ala Asp Val Lys Thr Leu
100 105 110
Ala Thr His Pro Val Gly Tyr Gln Gln Val Lys Asn Trp Met Ala Thr
115 120 125
Thr Ile Pro Asp Ala Met Tyr Leu Ser Ala Ser Ser Asn Gly Ala Gly
130 135 140
Ala Gln Met Val Ala Glu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser
145 150 155 160
Arg Ala Ala Glu Leu Phe Gly Leu Glu Arg Leu Val Asp Asp Val Ala
165 170 175
Asp Val Arg Gly Ala Arg Thr Arg Phe Val Ala Val Gln Ala Gln Ala
180 185 190
Ala Val Ser Glu Pro Thr Gly His Asp Arg Thr Ser Val Ile Phe Ser
195 200 205
Leu Pro Asn Val Pro Gly Ser Leu Val Arg Ala Leu Asn Glu Phe Ala
210 215 220
Ile Arg Gly Val Asp Leu Thr Arg Ile Glu Ser Arg Pro Thr Arg Lys
225 230 235 240
Val Phe Gly Thr Tyr Arg Phe His Leu Asp Ile Ser Gly His Ile Arg
245 250 255
Asp Ile Pro Val Ala Glu Ala Leu Arg Ala Leu His Leu Gln Ala Glu
260 265 270
Glu Leu Val Phe Val Gly Ser Trp Pro Ser Asn Arg Ala Glu Asp Ser
275 280 285
Thr Pro Gln Thr Asp Gln Leu Ala Lys Leu His Lys Ala Asp Glu Trp
290 295 300
Val Arg Ala Ala Ser Glu Gly Arg Lys Leu Asn
305 310 315
<210> 2
<211> 948
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pheA_WT
<400> 2
atgagcgacg caccaactgt tgtggcctat ttggggcctg ccggaacctt caccgaagaa 60
gccctctaca aatttgccga cgccggcgta ttcggcgacg gtgagatcga gcagctacca 120
gccaaatcgc cacaagaagc tgtcgacgcc gtccgccacg gcaccgccca gttcgcggtg 180
gtcgccatcg aaaacttcgt cgacggcccc gtcaccccca ccttcgacgc ccttgaccag 240
ggctccaacg tgcaaatcat cgccgaagaa gaactcgaca tcgccttttc catcatggtc 300
cggccaggga cttcgcttgc cgacgtcaaa accctcgcca cccacccggt tgggtaccaa 360
caagtgaaaa actggatggc aaccaccatt ccggacgcca tgtatctttc agcaagctcc 420
aacggcgccg gcgcacaaat ggttgccgaa ggaaccgccg acgcagccgc agcgccctcc 480
cgcgcagccg aactcttcgg actggaacgc cttgttgatg atgtcgccga cgtccgtggc 540
gcccgcaccc gcttcgttgc tgtccaagcc caagcagccg tttccgaacc gaccggccac 600
gaccgcacct ccgtcatttt ctccctaccg aatgtgccag gcagcctcgt gcgcgccctc 660
aacgaattcg ccatccgcgg cgttgacctc acccgcatcg aatcccgccc cacccgcaaa 720
gtcttcggaa cctaccgctt ccacctggac atatccggac atatccgcga tatccccgtc 780
gccgaagccc tccgcgcact ccacctccaa gccgaagaac tcgtcttcgt cggctcctgg 840
ccctccaacc gtgcggaaga cagcacgccc caaaccgacc aactagctaa gctacacaag 900
gcggacgaat gggttcgcgc agcaagcgaa ggaaggaaac ttaactag 948
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
ttgaggtcct tggctgg 17
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
cgcaacacga tggagctg 18
<210> 5
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PheA_R182A
<400> 5
Met Ser Asp Ala Pro Thr Val Val Ala Tyr Leu Gly Pro Ala Gly Thr
1 5 10 15
Phe Thr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Phe Ala Asp Ala Gly Val Phe Gly
20 25 30
Asp Gly Glu Ile Glu Gln Leu Pro Ala Lys Ser Pro Gln Glu Ala Val
35 40 45
Asp Ala Val Arg His Gly Thr Ala Gln Phe Ala Val Val Ala Ile Glu
50 55 60
Asn Phe Val Asp Gly Pro Val Thr Pro Thr Phe Asp Ala Leu Asp Gln
65 70 75 80
Gly Ser Asn Val Gln Ile Ile Ala Glu Glu Glu Leu Asp Ile Ala Phe
85 90 95
Ser Ile Met Val Arg Pro Gly Thr Ser Leu Ala Asp Val Lys Thr Leu
100 105 110
Ala Thr His Pro Val Gly Tyr Gln Gln Val Lys Asn Trp Met Ala Thr
115 120 125
Thr Ile Pro Asp Ala Met Tyr Leu Ser Ala Ser Ser Asn Gly Ala Gly
130 135 140
Ala Gln Met Val Ala Glu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser
145 150 155 160
Arg Ala Ala Glu Leu Phe Gly Leu Glu Arg Leu Val Asp Asp Val Ala
165 170 175
Asp Val Arg Gly Ala Ala Thr Arg Phe Val Ala Val Gln Ala Gln Ala
180 185 190
Ala Val Ser Glu Pro Thr Gly His Asp Arg Thr Ser Val Ile Phe Ser
195 200 205
Leu Pro Asn Val Pro Gly Ser Leu Val Arg Ala Leu Asn Glu Phe Ala
210 215 220
Ile Arg Gly Val Asp Leu Thr Arg Ile Glu Ser Arg Pro Thr Arg Lys
225 230 235 240
Val Phe Gly Thr Tyr Arg Phe His Leu Asp Ile Ser Gly His Ile Arg
245 250 255
Asp Ile Pro Val Ala Glu Ala Leu Arg Ala Leu His Leu Gln Ala Glu
260 265 270
Glu Leu Val Phe Val Gly Ser Trp Pro Ser Asn Arg Ala Glu Asp Ser
275 280 285
Thr Pro Gln Thr Asp Gln Leu Ala Lys Leu His Lys Ala Asp Glu Trp
290 295 300
Val Arg Ala Ala Ser Glu Gly Arg Lys Leu Asn
305 310 315
<210> 6
<211> 948
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pheA_R182A
<400> 6
atgagcgacg caccaactgt tgtggcctat ttggggcctg ccggaacctt caccgaagaa 60
gccctctaca aatttgccga cgccggcgta ttcggcgacg gtgagatcga gcagctacca 120
gccaaatcgc cacaagaagc tgtcgacgcc gtccgccacg gcaccgccca gttcgcggtg 180
gtcgccatcg aaaacttcgt cgacggcccc gtcaccccca ccttcgacgc ccttgaccag 240
ggctccaacg tgcaaatcat cgccgaagaa gaactcgaca tcgccttttc catcatggtc 300
cggccaggga cttcgcttgc cgacgtcaaa accctcgcca cccacccggt tgggtaccaa 360
caagtgaaaa actggatggc aaccaccatt ccggacgcca tgtatctttc agcaagctcc 420
aacggcgccg gcgcacaaat ggttgccgaa ggaaccgccg acgcagccgc agcgccctcc 480
cgcgcagccg aactcttcgg actggaacgc cttgttgatg atgtcgccga cgtccgtggc 540
gccgcgaccc gcttcgttgc tgtccaagcc caagcagccg tttccgaacc gaccggccac 600
gaccgcacct ccgtcatttt ctccctaccg aatgtgccag gcagcctcgt gcgcgccctc 660
aacgaattcg ccatccgcgg cgttgacctc acccgcatcg aatcccgccc cacccgcaaa 720
gtcttcggaa cctaccgctt ccacctggac atatccggac atatccgcga tatccccgtc 780
gccgaagccc tccgcgcact ccacctccaa gccgaagaac tcgtcttcgt cggctcctgg 840
ccctccaacc gtgcggaaga cagcacgccc caaaccgacc aactagctaa gctacacaag 900
gcggacgaat gggttcgcgc agcaagcgaa ggaaggaaac ttaactag 948
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
gtgaattcga gctcggtacc cgtggcatgg atgaaaag 38
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
ttggacagca acgaagcggg tcgcggcgcc acggac 36
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
gtcgccgacg tccgtggcgc cgcgacccgc ttcgttg 37
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
ggtcgactct agaggatccc cgtggctgtc catgattc 38
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
tatgcttcac cacatgactt c 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
aaatcatttg agaaaactcg agg 23
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
gtcacccgat cgtctgaag 19
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
gtcttaaaac cggttgat 18
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
caatgctggc tgcgtacgc 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
ctcctcgcga ggaaccaact 20
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
tcgagctcgg taccccgctt ttgcactcat cgagc 35
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
cacgatcaga tgtgcatcat cat 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
atgatgatgc acatctgatc gtg 23
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
ctctagagga tccccgagca tcttccaaaa ccttg 35
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
tcgagctcgg tacccatgag tgaaacatac gtgtc 35
<210> 22
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
gcgcttgagg tactctgcca gcgcgatgtc atcatccgg 39
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
ccggatgatg acatcgcgct ggcagagtac ctcaagcgc 39
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
ctctagagga tcccccgtca ccgacacctc caca 34
<210> 25
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GltA_M312I
<400> 25
Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu
1 5 10 15
His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu
20 25 30
Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu
35 40 45
Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys
50 55 60
Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr
85 90 95
Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe
100 105 110
Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser
115 120 125
Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala
130 135 140
Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro
145 150 155 160
Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys
165 170 175
Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg
195 200 205
Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met
210 215 220
Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln
225 230 235 240
Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn
245 250 255
Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu
260 265 270
His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys
275 280 285
Ser Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Glu Phe Met Asn Lys Val Lys Asn
290 295 300
Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Ile Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys
305 310 315 320
Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile
325 330 335
Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu
340 345 350
Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr
355 360 365
Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe
370 375 380
Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly
385 390 395 400
Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile
405 410 415
Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val
420 425 430
Pro Arg Glu Glu Arg
435
<210> 26
<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gltA_M312I
<400> 26
atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60
ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120
aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180
accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240
gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300
ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360
cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420
gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggacca gctgaaccca 480
ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540
gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600
aatgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660
gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720
aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780
atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840
ctggagatgc tcgaagacat caagagcaac cacggtggcg acgcaaccga gttcatgaac 900
aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatcggct tcggacaccg cgtttacaag 960
aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020
ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080
tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140
gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200
tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcaggca acaagatcaa ccgcccacgc 1260
caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
gtgaattcga gctcggtacc cgcgggaatc ctgcgttacc gc 42
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
tgtaaacgcg gtgtccgaag ccgatgaggc ggacgccgtc tt 42
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
aagacggcgt ccgcctcatc ggcttcggac accgcgttta ca 42
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
ggtcgactct agaggatccc cttagcgctc ctcgcgagga ac 42
<210> 31
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IlvA_WT
<400> 31
Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg
20 25 30
Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu
35 40 45
Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln
50 55 60
Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln
65 70 75 80
Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly
85 90 95
Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln
100 105 110
Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg
115 120 125
Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn
130 135 140
Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr
145 150 155 160
Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly
165 170 175
Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly
180 185 190
Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu
195 200 205
Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile
210 215 220
Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His
225 230 235 240
Asn Gly Gly Pro Ile Thr Leu Glu Thr Val Asp Pro Phe Val Asp Gly
245 250 255
Ala Ala Val Lys Arg Val Gly Asp Leu Asn Tyr Thr Ile Val Glu Lys
260 265 270
Asn Gln Gly Arg Val His Met Met Ser Ala Thr Glu Gly Ala Val Cys
275 280 285
Thr Glu Met Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Ile Ile Ala Glu Pro
290 295 300
Ala Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro
305 310 315 320
Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu
325 330 335
Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys
340 345 350
His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His
355 360 365
Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Thr Leu Phe Glu
370 375 380
Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile
385 390 395 400
His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu
405 410 415
Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr
420 425 430
Glu Tyr Leu Thr
435
<210> 32
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvA_WT
<400> 32
atgagtgaaa catacgtgtc tgagaaaagt ccaggagtga tggctagcgg agcggagctg 60
attcgtgccg ccgacattca aacggcgcag gcacgaattt cctccgtcat tgcaccaact 120
ccattgcagt attgccctcg tctttctgag gaaaccggag cggaaatcta ccttaagcgt 180
gaggatctgc aggatgttcg ttcctacaag atccgcggtg cgctgaactc tggagcgcag 240
ctcacccaag agcagcgcga tgcaggtatc gttgccgcat ctgcaggtaa ccatgcccag 300
ggcgtggcct atgtgtgcaa gtccttgggc gttcagggac gcatctatgt tcctgtgcag 360
actccaaagc aaaagcgtga ccgcatcatg gttcacggcg gagagtttgt ctccttggtg 420
gtcactggca ataacttcga cgaagcatcg gctgcagcgc atgaagatgc agagcgcacc 480
ggcgcaacgc tgatcgagcc tttcgatgct cgcaacaccg tcatcggtca gggcaccgtg 540
gctgctgaga tcttgtcgca gctgacttcc atgggcaaga gtgcagatca cgtgatggtt 600
ccagtcggcg gtggcggact tcttgcaggt gtggtcagct acatggctga tatggcacct 660
cgcactgcga tcgttggtat cgaaccagcg ggagcagcat ccatgcaggc tgcattgcac 720
aatggtggac caatcacttt ggagactgtt gatccctttg tggacggcgc agcagtcaaa 780
cgtgtcggag atctcaacta caccatcgtg gagaagaacc agggtcgcgt gcacatgatg 840
agcgcgaccg agggcgctgt gtgtactgag atgctcgatc tttaccaaaa cgaaggcatc 900
atcgcggagc ctgctggcgc gctgtctatc gctgggttga aggaaatgtc ctttgcacct 960
ggttctgtcg tggtgtgcat catctctggt ggcaacaacg atgtgctgcg ttatgcggaa 1020
atcgctgagc gctccttggt gcaccgcggt ttgaagcact acttcttggt gaacttcccg 1080
caaaagcctg gtcagttgcg tcacttcctg gaagatatcc tgggaccgga tgatgacatc 1140
acgctgtttg agtacctcaa gcgcaacaac cgtgagaccg gtactgcgtt ggtgggtatt 1200
cacttgagtg aagcatcagg attggattct ttgctggaac gtatggagga atcggcaatt 1260
gattcccgtc gcctcgagcc gggcacccct gagtacgaat acttgaccta a 1311
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
ggatccgact gagcctgggc aactgg 26
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
ggatccccgt caccgacacc tccaca 26
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
acatcacgct ggcagagtac ctcaa 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
ttgaggtact ctgccagcgt gatgt 25
<210> 37
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IlvA_T381A, F383A
<400> 37
Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg
20 25 30
Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu
35 40 45
Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln
50 55 60
Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln
65 70 75 80
Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly
85 90 95
Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln
100 105 110
Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg
115 120 125
Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn
130 135 140
Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr
145 150 155 160
Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly
165 170 175
Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly
180 185 190
Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu
195 200 205
Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile
210 215 220
Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His
225 230 235 240
Asn Gly Gly Pro Ile Thr Leu Glu Thr Val Asp Pro Phe Val Asp Gly
245 250 255
Ala Ala Val Lys Arg Val Gly Asp Leu Asn Tyr Thr Ile Val Glu Lys
260 265 270
Asn Gln Gly Arg Val His Met Met Ser Ala Thr Glu Gly Ala Val Cys
275 280 285
Thr Glu Met Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Ile Ile Ala Glu Pro
290 295 300
Ala Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro
305 310 315 320
Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu
325 330 335
Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys
340 345 350
His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His
355 360 365
Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Ala Leu Ala Glu
370 375 380
Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile
385 390 395 400
His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu
405 410 415
Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr
420 425 430
Glu Tyr Leu Thr
435
<210> 38
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvA_T381A, F383A
<400> 38
atgagtgaaa catacgtgtc tgagaaaagt ccaggagtga tggctagcgg agcggagctg 60
attcgtgccg ccgacattca aacggcgcag gcacgaattt cctccgtcat tgcaccaact 120
ccattgcagt attgccctcg tctttctgag gaaaccggag cggaaatcta ccttaagcgt 180
gaggatctgc aggatgttcg ttcctacaag atccgcggtg cgctgaactc tggagcgcag 240
ctcacccaag agcagcgcga tgcaggtatc gttgccgcat ctgcaggtaa ccatgcccag 300
ggcgtggcct atgtgtgcaa gtccttgggc gttcagggac gcatctatgt tcctgtgcag 360
actccaaagc aaaagcgtga ccgcatcatg gttcacggcg gagagtttgt ctccttggtg 420
gtcactggca ataacttcga cgaagcatcg gctgcagcgc atgaagatgc agagcgcacc 480
ggcgcaacgc tgatcgagcc tttcgatgct cgcaacaccg tcatcggtca gggcaccgtg 540
gctgctgaga tcttgtcgca gctgacttcc atgggcaaga gtgcagatca cgtgatggtt 600
ccagtcggcg gtggcggact tcttgcaggt gtggtcagct acatggctga tatggcacct 660
cgcactgcga tcgttggtat cgaaccagcg ggagcagcat ccatgcaggc tgcattgcac 720
aatggtggac caatcacttt ggagactgtt gatccctttg tggacggcgc agcagtcaaa 780
cgtgtcggag atctcaacta caccatcgtg gagaagaacc agggtcgcgt gcacatgatg 840
agcgcgaccg agggcgctgt gtgtactgag atgctcgatc tttaccaaaa cgaaggcatc 900
atcgcggagc ctgctggcgc gctgtctatc gctgggttga aggaaatgtc ctttgcacct 960
ggttctgtcg tggtgtgcat catctctggt ggcaacaacg atgtgctgcg ttatgcggaa 1020
atcgctgagc gctccttggt gcaccgcggt ttgaagcact acttcttggt gaacttcccg 1080
caaaagcctg gtcagttgcg tcacttcctg gaagatatcc tgggaccgga tgatgacatc 1140
gcgctggcag agtacctcaa gcgcaacaac cgtgagaccg gtactgcgtt ggtgggtatt 1200
cacttgagtg aagcatcagg attggattct ttgctggaac gtatggagga atcggcaatt 1260
gattcccgtc gcctcgagcc gggcacccct gagtacgaat acttgaccta a 1311
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
aacacgaccg gcatcccgtc gc 22
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
aaatcatttg agaaaactcg agg 23
<210> 41
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
gtgaattcga gctcggtacc caaatcattt gagaaaactc gaggc 45
<210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
ggtgatcatc tcaacggtgg aacacaggtt gatgatcatt gggtt 45
<210> 43
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
aacccaatga tcatcaacct gtgttccacc gttgagatga tcacc 45
<210> 44
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
ggtcgactct agaggatccc caagaaggca acatcggaca gc 42
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
atccattcaa tggagtctgc g 21
<210> 46
<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> leuA_P247C, R558H, G561D
<400> 46
Met Ser Pro Asn Asp Ala Phe Ile Ser Ala Pro Ala Lys Ile Glu Thr
1 5 10 15
Pro Val Gly Pro Arg Asn Glu Gly Gln Pro Ala Trp Asn Lys Gln Arg
20 25 30
Gly Ser Ser Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val
35 40 45
Glu Asp Ile Ser Leu Pro Asp Arg Thr Trp Pro Asp Lys Lys Ile Thr
50 55 60
Val Ala Pro Gln Trp Cys Ala Val Asp Leu Arg Asp Gly Asn Gln Ala
65 70 75 80
Leu Ile Asp Pro Met Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu
85 90 95
Leu Val Gln Met Gly Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala
100 105 110
Ser Gln Thr Asp Phe Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Gly Met
115 120 125
Ile Pro Asp Asp Val Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His
130 135 140
Leu Ile Arg Arg Thr Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile
145 150 155 160
Val His Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe
165 170 175
Arg Met Asp Lys Val Gln Val Lys Lys Leu Ala Thr Asp Ala Ala Glu
180 185 190
Leu Ile Lys Thr Ile Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp
195 200 205
Gln Tyr Ser Pro Glu Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys
210 215 220
Glu Val Val Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn
225 230 235 240
Pro Met Ile Ile Asn Leu Cys Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn
245 250 255
Val Tyr Ala Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg
260 265 270
Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly
275 280 285
Val Gly Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu
290 295 300
Gly Cys Leu Phe Gly Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val
305 310 315 320
Thr Leu Ala Leu Asn Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp
325 330 335
Phe Thr Asp Ile Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln
340 345 350
Leu Arg Val Pro Glu Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr
355 360 365
Ala Phe Ser Gly Ser His Gln Asp Ala Val Asn Lys Gly Leu Asp Ala
370 375 380
Met Ala Ala Lys Val Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp
385 390 395 400
Glu Gln Leu Arg Asp Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile Asp
405 410 415
Pro Lys Asp Val Gly Arg Asp Tyr Glu Ala Val Ile Arg Val Asn Ser
420 425 430
Gln Ser Gly Lys Gly Gly Val Ala Tyr Ile Met Lys Thr Asp His Gly
435 440 445
Leu Gln Ile Pro Arg Ser Met Gln Val Glu Phe Ser Thr Val Val Gln
450 455 460
Asn Val Thr Asp Ala Glu Gly Gly Glu Val Asn Ser Lys Ala Met Trp
465 470 475 480
Asp Ile Phe Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Arg Thr Ala Pro Val Glu Gln
485 490 495
Ile Ala Leu Arg Val Glu Asn Ala Gln Thr Glu Asn Glu Asp Ala Ser
500 505 510
Ile Thr Ala Glu Leu Ile His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly
515 520 525
Arg Gly Asn Gly Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu
530 535 540
Gly Ile Asp Val Glu Ile Gln Glu Tyr Asn Gln His Ala His Thr Ser
545 550 555 560
Asp Asp Asp Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly
565 570 575
Arg Lys Val Trp Gly Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser
580 585 590
Leu Lys Ala Val Thr Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His
595 600 605
Glu Ala Val Leu Ala Gly Gly Val
610 615
<210> 47
<211> 1851
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> leuA_P247C, R558H, G561D
<400> 47
atgtctccta acgatgcatt catctccgca cctgccaaga tcgaaacccc agttgggcct 60
cgcaacgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120
tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat atttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180
aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240
ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300
ggcttcaaag aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360
cgtgagatca tcgaaaaggg catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420
gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480
gtgcacttct acaactccac ctccatcctg cagcgcaacg tggtgttccg catggacaag 540
gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactaa tcaagaccat cgctcaggat 600
tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660
gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720
ccaatgatca tcaacctgtg ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780
tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840
ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900
gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960
accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020
cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080
tacggcggtg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140
ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200
gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260
ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320
tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380
accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440
gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500
gtcgagaacg ctcagaccga aaacgaggat gcatccatca ccgccgagct catccacaac 1560
ggcaaggacg tcaccgtcga tggccgcggc aacggcccac tggccgctta cgccaacgcg 1620
ctggagaagc tgggcatcga cgttgagatc caggaataca accagcacgc ccacacctcg 1680
gatgacgatg cagaagcagc cgcctacgtg ctggctgagg tcaacggccg caaggtctgg 1740
ggcgtcggca tcgctggctc catcacctac gcttcgctga aggcagtgac ctccgccgta 1800
aaccgcgcgc tggacgtcaa ccacgaggca gtcctggctg gcggcgttta a 1851

Claims (15)

1.一种预苯酸脱水酶变体，其中对应于自氨基酸序列SEQ ID NO:1的N末端起位置182的氨基酸被另一个氨基酸取代。
2.如权利要求1所述的预苯酸脱水酶变体，其中所述变体包括对应于自氨基酸序列SEQID NO:1的N末端起位置182的氨基酸被除了精氨酸以外的另一个氨基酸取代。
3.如权利要求1所述的预苯酸脱水酶变体，其中所述被另一个氨基酸取代是被非极性氨基酸或小尺寸氨基酸取代。
4.如权利要求1所述的预苯酸脱水酶变体，其中另一个氨基酸是丙氨酸(Ala)。
5.如权利要求1所述的预苯酸脱水酶变体，其中所述预苯酸脱水酶与SEQ ID NO:5具有99％或更高的同源性或同一性。
6.如权利要求1所述的预苯酸脱水酶变体，其中与SEQ ID NO:1的预苯酸脱水酶相比，所述预苯酸脱水酶变体具有减弱的活性。
7.一种多核苷酸，其编码如权利要求1至6中任一项所述的预苯酸脱水酶变体。
8.一种载体，其包含如权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种棒状杆菌属的微生物，所述微生物包含以下中的一种或多种：如权利要求1至6中任一项所述的预苯酸脱水酶变体；编码所述预苯酸脱水酶变体的多核苷酸；和包含所述多核苷酸的载体。
10.如权利要求9所述的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。
11.如权利要求9所述的微生物，其中所述微生物用于生产支链氨基酸。
12.如权利要求11所述的微生物，其中所述支链氨基酸是选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸中的一种或多种。
13.一种生产支链氨基酸的方法，所述方法包括在培养基中培养如权利要求9所述的微生物的步骤。
14.如权利要求13所述的方法，其还包括从所述微生物或从所述培养基回收所述支链氨基酸的步骤。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述支链氨基酸是选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸中的一种或多种。
CN202280012955.1A 2021-02-01 2022-01-19 预苯酸脱水酶变体以及使用其生产支链氨基酸的方法 Pending CN116917473A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0014077 2021-02-01
KR1020210014077A KR102527096B1 (ko) 2021-02-01 2021-02-01 프리페네이트 탈수 효소 (Prephenate dehydratase) 변이체 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산 방법
PCT/KR2022/000984 WO2022164118A1 (ko) 2021-02-01 2022-01-19 프리페네이트 탈수 효소 변이체 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116917473A true CN116917473A (zh) 2023-10-20

Family

ID=82653618

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280012955.1A Pending CN116917473A (zh) 2021-02-01 2022-01-19 预苯酸脱水酶变体以及使用其生产支链氨基酸的方法

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4303301A1 (zh)
JP (1) JP2024506841A (zh)
KR (1) KR102527096B1 (zh)
CN (1) CN116917473A (zh)
AU (1) AU2022211934A1 (zh)
CA (1) CA3206397A1 (zh)
WO (1) WO2022164118A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240031779A (ko) 2022-09-01 2024-03-08 현대모비스 주식회사 배터리 전압 측정 장치 및 이의 제어 방법

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3225597B2 (ja) * 1992-06-15 2001-11-05 味の素株式会社 発酵法によるｌ−フェニルアラニンの製造法
EP1649403A2 (en) 2003-07-29 2006-04-26 Ajinomoto Co., Inc. Method for determining metabolic flux affecting substance production
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
EP3170889A1 (en) 2006-09-15 2017-05-24 CJ Cheiljedang Corporation A corynebacteria having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same
KR101117022B1 (ko) 2011-08-16 2012-03-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-발린 제조방법
KR101632642B1 (ko) 2015-01-29 2016-06-22 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 그의 용도
BR112019004161B1 (pt) 2016-08-31 2021-07-27 Cj Cheiljedang Corporation Molécula de ácido nucleico que possui uma atividade promotora, cassete de expressão gênica, vetor recombinante, micro-organismo recombinante do gênero corynebacterium e método de produzir um produto-alvo
KR101830002B1 (ko) * 2016-10-11 2018-02-19 대상 주식회사 부기질의 공급 강화를 통한 l-트립토판이 과발현되는 균주 및 이를 이용하는 l-트립토판의 제조 방법
CA3048802C (en) 2016-12-28 2021-10-19 Cj Cheiljedang Corporation A novel isopropylmalate synthase variant and a method of producing l-leucine using the same
KR101996769B1 (ko) 2018-12-21 2019-10-01 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법
KR102143964B1 (ko) 2019-12-06 2020-08-12 씨제이제일제당 주식회사 신규한 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 류신 생산방법
KR102278000B1 (ko) * 2020-03-17 2021-07-15 씨제이제일제당 주식회사 프리페네이트 디하이드라타아제 활성 강화를 통한 l-트립토판을 생산하는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR102527096B1 (ko) 2023-04-28
KR20220110992A (ko) 2022-08-09
EP4303301A1 (en) 2024-01-10
CA3206397A1 (en) 2022-08-04
AU2022211934A1 (en) 2023-08-17
WO2022164118A1 (ko) 2022-08-04
JP2024506841A (ja) 2024-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7295276B2 (ja) Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体及びそれを用いたｌ－トレオニン生産方法
CN116917473A (zh) 预苯酸脱水酶变体以及使用其生产支链氨基酸的方法
CN115023498B (zh) 新型脱氧鸟苷三磷酸盐三磷酸水解酶变体及使用其生产l-色氨酸的方法
KR102273638B1 (ko) 신규한 포스포글리세린산 디하이드로게나제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
KR102279696B1 (ko) 신규한 l-세린 암모니아 분해 효소 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
KR102233376B1 (ko) 메조 디아미노피멜레이트 디하이드로게네이즈 변이형 폴리펩타이드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법
CN117321193A (zh) 新型支链氨基酸转氨酶变体及使用其生产异亮氨酸的方法
CN115135760A (zh) 新型亚铁熬合酶变体及使用其生产l-色氨酸的方法
CN114402070A (zh) 新的l-苏氨酸脱水酶变体及使用其生产l-异亮氨酸的方法
CN114981419A (zh) 新天冬酰胺合酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法
CN115103906A (zh) 新型胞嘧啶通透酶变体及使用其生产l-色氨酸的方法
CN114981292B (zh) 新型蛋白质htrl变体及使用其生产l-色氨酸的方法
KR102495918B1 (ko) aroG 알돌라아제 (Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase) 변이체 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산 방법
CN114585734B (zh) 新型水解酶变体及使用其生产l-色氨酸的方法
CN115135761B (zh) 新型互变异构酶ppta变体及使用其生产l-色氨酸的方法
CN115052977B (zh) 新ii型柠檬酸合酶变体及使用其生产l-赖氨酸的方法
CN115066430B (zh) 新型氰酸盐转运体家族蛋白变体及使用其生产l-色氨酸的方法
CN114729340B (zh) 新dahp合酶变体及使用其生产l-赖氨酸的方法
CN114981293B (zh) 新引发体组装蛋白变体及使用其生产l-赖氨酸的方法
CN115052976B (zh) 新型乙酰羟酸合酶变体和包括其的微生物
CA3233417A1 (en) Novel acetohydroxy acid synthase variant, and method for producing l-isoleucine using same
CA3233425A1 (en) Novel acetohydroxy acid synthase mutant and l-isoleucine production method using same
KR20220069864A (ko) L-글루타민 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-글루타민 생산 방법
CN114450400A (zh) 新型铜转运p型atp酶a变体及使用其生产l-色氨酸的方法
CN114981289A (zh) 新蛋白变体及使用其生产l-赖氨酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination