KR102278000B1

KR102278000B1 - 프리페네이트 디하이드라타아제 활성 강화를 통한 l-트립토판을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR102278000B1
Application number: KR1020200032783A
Authority: KR
Inventors: 서창일; 김현아; 손성광; 정기용; 정무영; 김태연
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2021-07-15
Also published as: CA3171191A1; CN115516097A; MX2022011543A; KR20200136813A; JP2023518743A; WO2021187781A1; BR112022018514A2; US20230134555A1

Abstract

본 출원은 프리페네이트 디하이드라타아제(prephenate dehydratase, PheA) 활성 강화를 통한 L-트립토판을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

프리페네이트 디하이드라타아제 활성 강화를 통한 L-트립토판을 생산하는 방법{The method of producing L-tryptophan using enhancing the activity of prephenate dehydratase}

L-트립토판(L-tryptophan)은 필수 아미노산 중 하나로 사료 첨가제, 수액제와 같은 의약품의 원료 및 건강식품의 소재 등으로 널리 사용되어 왔다. 아울러, 현재 L-트립토판 생산에 미생물을 이용한 직접 발효법이 주로 이용되고 있다.

L-트립토판 생산에 사용되는 미생물들은 초기에 화학적 또는 물리적 돌연변이 선별을 통해, L-트립토판 유사체의 내성을 나타내는 균주들을 주로 사용하였으나, 1990년대 유전자 재조합 기술의 급격한 발전과 분자수준의 다양한 조절 기작들이 규명됨에 따라 유전자 조작 기법을 이용한 재조합 균주들이 주로 사용되고 있다.

한편, 재조합 L-트립토판 생산 균주에는 일반적으로 코리스메이트(chorismate)를 기준으로 경쟁 경로 상에 있는 페닐알라닌(Phe) 또는 타이로신(Tyr)의 생합성 경로를 결손 또는 약화시켜 트립토판의 발효수율을 극대화하고자 하였었다[J Ind Microbiol Biotechnol. 2011 Dec;38(12):1921-9], [Appl Environ Microbiol. 1999 Jun;65(6):2497-502].

하지만, 페닐알라닌 또는 타이로신 요구성 L-트립토판 생산균주는 성장 단계(Growth-phase) 및 생산 단계(Production-phase)에서 상기 두 아미노산(페닐알라닌, 타이로신)을 투입하는 양을 달리 조절해야 하는 어려움, 대량 생산에 있어 추가적인 비용의 증가, 및 상기 두 아미노산(페닐알라닌, 타이로신)의 낮은 용해도로 인한 메인(Main), 피드(Feed) 배지 조제상의 어려움이 있었다.

이러한 문제를 개선하기 위해서 본 발명자들은 야생형 코리네박테리움 균주로부터 페닐알라닌 또는 타이로신 경로의 결손 및 약화 없이 고수율의 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 균주를 제작한 바 있다(대한민국 등록특허 제10-1968317호). 상기 고수율의 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 균주를 이용할 경우, 고농도 발효조 배양시 배양액에서 페닐알라닌이 쌓이는 현상은 없었고 배양 종료시점에서 타이로신은 0.2 g/L 수준으로 생성되는 점이 관찰되었다. 그러나, 상기 균주는 배양 후반 안트라닐레이트(anthranilate)가 생성됨에 따라 L-트립토판 생성이 최대화되지 못하는 문제점이 있었다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 상기 고수율의 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 균주에 추가적으로 프리페네이트 디하이드라타아제(prephenate dehydratase, PheA) 활성 강화를 통해서 프로페네이트(prephenate)로부터 페닐알라닌과 타이로신 간의 생합성 분배를 보정하였다. 이러한 경쟁 경로의 아로마틱 아미노산 생성 보정은 배양액 내의 페닐알라닌 또는 타이로신 최종 생성량을 조절할 뿐만 아니라 배양 후반 안트라닐레이트 생성을 저감시켰으며, 결과적으로 L-트립토판 생산량이 획기적으로 향상됨을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원은 프리페네이트 디하이드라타아제(prephenate dehydratase) 활성이 강화된, L-트립토판을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원은 프리페네이트 디하이드라타아제 활성이 강화된, L-트립토판을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-트립토판의 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 출원은 프리페네이트 디하이드라타아제 활성이 강화된, L-트립토판을 생산하는 미생물을 포함하는, L-트립토판 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

이하에서는, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다.

한편, 본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 할 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.

본 출원의 하나의 양태는, 프리페네이트 디하이드라타아제(prephenate dehydratase) 활성이 강화된, L-트립토판을 생산하는 미생물을 제공한다.

본 출원의 용어 "L-트립토판(L-tryptophan)"은 20개 α-아미노산 중 하나로써, 사람을 포함한 많은 생물체에서 생합성되지 않는 필수아미노산이다. 트립토판은 주로 생화학적 전구체로 작용하는 것으로 알려져 있으며, 예를 들면, 세로토닌과 같은 신경전달물질, 멜라토닌과 같은 신경호르몬, 나이아신 및 옥신 등 다양한 물질이 트립토판으로부터 합성된다.

L-트립토판은 코리스메이트(chorismate; chorismic acid)로부터 합성되며, 이 과정에 관여하는 효소를 암호화하고 있는 유전자군은 트립토판 오페론(tryptophan operon; Trp operon)으로 알려져 있다. 상기 트립토판 오페론은 구조 유전자(Structure Gene) 및 발현조절영역(regulatory region)을 포함하는 것으로 알려져 있다. 통상의 트립토판 오페론은 세포가 요구하는 충분한 양의 트립토판을 생산할 수 있도록 활발히 전사하지만, 세포내 트립토판이 충분히 존재하는 경우에 억제인자(repressor)가 트립토판과 결합하여 트립토판 오페론이 불활성화되므로 전사가 억제된다. 상기 트립토판 오페론은 코리네박테리움 속 미생물, 에스케리키아 속 미생물 등 다양한 미생물로부터 유래할 수 있다. 상기 트립토판 오페론의 "발현조절영역"은 트립토판 오페론을 구성하는 구조 유전자의 업스트림에 존재하여 구조 유전자의 발현을 조절할 수 있는 부위를 의미한다. 코리네박테리움 속 미생물에서 트립토판 오페론을 구성하는 구조 유전자는 trpE, trpG, trpD, trpC, trpB, trpA 유전자로 구성되어 있을 수 있으며, 에스케리키아 속 미생물에서 트립토판 오페론을 구성하는 구조 유전자는 trpE, trpD, trpC, trpB, trpA 유전자로 구성되어 있을 수 있다. 상기 트립토판 오페론의 발현조절영역은 트립토판 오페론 구조 유전자의 5'위치에 있는 trpE의 업스트림에 존재하는 것일 수 있다. 구체적으로, 트립토판 오페론을 구성할 수 있는 구조 유전자를 제외한 트립토판 레귤레이터(trp regulator; trpR), 프로모터(trp promoter), 오퍼레이터(trp operator), 트립토판 리더펩타이드(trp leaderpeptide; trp L) 및 트립토판 감쇠인자(trp attenuator)를 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, 프로모터(trp promoter), 오퍼레이터(trp operator), 트립토판 리더펩타이드(trp leaderpeptide; trp L) 및 트립토판 감쇠인자(trp attenuator)를 포함하는 것일 수 있다.

본 출원의 용어 "프리페네이트 디하이드라타제(prephenate dehydratase, 이하, "PheA")"는 코리스메이트 또는 프리페네이트(prephenate)에서 L-페닐알라닌을 생산하는 경로의 효소이며 타이로신 생합성 경로와 경쟁하는 단계에 있는 효소로 알려져 있다. 상기 단백질은 이중 작용성 코리스메이트 뮤타제/프리페네이트 디하이드라타제(Bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydratase)로도 명명될 수 있다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 그 예로 pheA 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 pheA 유전자는 전술한 트립토판 오페론에 의해 조절될 수 있다. 본 출원에서 'pheA 유전자'는 '프리페네이트 디하이드라타제를 코딩하는 유전자' 및 'pheA 유전자'와 혼용되어 사용될 수 있다.

상기 PheA은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지거나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 1의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank에서 그 서열을 확인할 수 있다.

구체적으로, 상기 PheA은 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 PheA에 상응하는 기능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 PheA도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 출원의 용어 "상동성(homology) 및 동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)], 또는 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)일 수 있다.

본 출원의 용어 "L-트립토판을 생산하는 미생물"이란, 자연적으로 L-트립토판의 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-트립토판의 생산능이 없는 모균주에 L-트립토판의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 구체적으로 상기 미생물은 PheA 활성이 강화된, L-트립토판을 생산하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 "L-트립토판을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함한다. 더욱 구체적으로, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 L-트립토판 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 L-트립토판 생산 활성을 강화시킨 미생물일 수 있다. 본 출원의 목적상, 상기 L-트립토판을 생산하는 미생물은 상기 PheA 활성이 강화되어, 목적하는 L-트립토판 생산능이 증가된 것을 특징으로 하며, 유전적으로 변형된 미생물 또는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 용어 단백질의 "활성 강화"는, 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성에 비하여 향상된 것을 의미한다.

상기 "활성 증가"는 외래의 단백질을 도입하거나, 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성할 수 있으나, 구체적으로는 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성하는 것일 수 있다. 상기 단백질의 활성 강화 여부는 해당 단백질의 활성 정도, 발현량 또는 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.

본 출원에 있어서, 상기 활성 강화의 대상이 되는 단백질, 즉, 목적 단백질은 PheA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 출원에 있어서, 상기 해당 단백질로부터 생산되는 산물은 L-트립토판일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단백질의 활성 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 단백질의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 상기 방법은 유전자 공학 또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자 공학을 이용하여 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면,

1) 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가,

2) 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법,

3) 상기 단백질 활성이 증가되도록 상기 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법,

4) 상기 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법,

5) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는

6) 상기 방법들의 조합 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단백질 공학을 이용하여 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면, 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가는, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 해당 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터를 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있다. 또는, 상기 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 유전자를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 목적 단백질을 발현시키기에 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 형태로 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 코리네박테리움 염색체 내 유전자의 삽입 및 교체를 위해 제작된 pDCM2(도 1, 서열번호 3)일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것이 아니며, 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.

본 출원에서 용어, "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열 또는 발현조절영역과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 2) 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 방법은 구체적으로 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터를 연결시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

공지된 강력한 프로모터의 예에는 변이형 lysC 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0930203호), CJ7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), CJ1 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, Trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터 및 tet 프로모터가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 출원에서 사용 가능한 강력한 프로모터는 변이형 lysC 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0930203호)의 일부 서열을 변경하여 제작된 PlysCm1(서열번호 4)일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것이 아니며, 공지된 프로모터를 사용할 수 있다.

상기 3) 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질의 내재적 개시코돈을 상기 내재적 개시코돈에 비해 단백질 발현율이 더 높은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 4) 상기 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 상기 유전자를 염색체내로 삽입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 도입하고자 하는 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

상기 5) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.

마지막으로, 6) 상기 방법들의 조합은 상기 1) 내지 5) 중 어느 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.

이와 같은 단백질의 활성 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형전 미생물 균주에서 발현된 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원에서 용어, "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 형질 변화는 PheA의 활성 강화일 수 있다. 상기 "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.

본 출원에 있어서, 상기 기준 미생물은 L-트립토판을 생산하는 미생물이라면 특별히 제한되지 않으며, 야생형에 비해 L-트립토판 생산능이 강화된 변이 균주 역시 제한 없이 포함된다. 그 예로, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주, CJ04-8321 균주(대한민국 등록특허 제10-2035844호) 또는 L-트립토판 생합성 경로를 강화하기 위하여 상기 균주에 하나 이상의 유전적 변형이 추가된 균주가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 하나 이상의 유전적 변형은 예를 들면, L-트립토판 오페론(operon)의 활성을 과발현시키거나; L-트립토판의 전구체의 공급 및 효율을 개선하거나; L-트립토판의 배출을 향상시키거나; 경쟁경로의 유전자, L-트립토판 오페론의 방향성 경로의 조절자, L-트립토판 유입유전자, L-트립토판 유입 및 분해 유전자의 활성을 약화 또는 불활성화시키는; 것 중 선택되는 어느 하나 이상의 유전적 변형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 L-트립토판 오페론의 활성을 과발현시키는 유전적 변형은 예를 들면, i) L-트립토판 생합성 유전자 오페론의 프로모터를 강화하는 것일 수 있고, ii) L-트립토판 오페론 내생산 향상에 따른 TrpE 단백질의 피드백 제한(feedback inhibition)을 해소하는 것일 수 있고, iii) L-트립토판 생합성 유전자 오페론의 프로모터를 강화하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 i)은 L-트립토판 생합성 유전자 오페론의 프로모터를 강한 프로모터인 SPL7로 교체하여 강화하는 것일 수 있고, 상기 ii)는 피드백 제한 trpE 형질을 갖는 L-트립토판 오페론인 trpE(P21S)DCBA 또는 trpE(S38R)DCBA을 도입하는 것일 수 있고, 상기 iii)은 L-트립토판 생합성 유전자 오페론의 프로모터를 강한 프로모터인 SPL7로 교체하여 강화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 L-트립토판의 전구체의 공급 및 효율을 개선하는 유전적 변형은 예를 들면, E4P(erythorse-4-phosphate)와 같은 L-트립토판의 전구체의 지속적인 공급과 에너지의 효율적 이용을 위해 관련 유전자의 발현을 강화하는 것일 수 있고, 구체적으로 tkt(트랜스케토라제)를 코딩하는 유전자를 도입하거나 이의 발현을 강화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 L-트립토판의 배출을 향상시키는 유전적 변형은 예를 들면, L-트립토판의 배출을 향상시키는 외래 막 단백질을 도입하는 것일 수 있고, 구체적으로 허바스필리움 리조스페레(Herbaspirillum rhizosphaerae) 유래 막 단백질을 코딩하는 유전자(등록번호 NZ_LFLU01000012.1)를 도입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 하나 이상의 유전적 변형이 추가된 균주는 예를 들면, ATCC13869 균주에 강한 프로모터인 SPL7를 포함하고 피드백 제한 trpE 형질을 갖는 L-트립토판 오페론인 trpE(S38R)DCBA가 도입된 CA04-8325(대한민국 등록특허 제10-1968317호), CA04-8325 균주에 tkt 유전자가 삽입된 CA04-8352(대한민국 등록특허 제10-2035844호), CJ04-8352 균주에 허바스필리움 리조스페레 유래 막 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 제작한 CA04-8405 균주(대한민국 등록특허 제10-1968317호)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 목적상, 상기 L-트립토판을 생산하는 미생물은 전술한 방법으로 PheA 활성이 강화되어, L-트립토판을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 본 출원에서 상기 "L-트립토판을 생산하는 미생물"은 "L-트립토판 생산 미생물", "L-트립토판 생산능을 갖는 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.

상기 미생물은 예를 들면, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있고, 구체적으로, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물일 수 있다.

보다 구체적으로, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스Cxorynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens) 등일 수 있고, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으며, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물은 제한 없이 포함될 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 프리페네이트 디하이드라타아제 활성이 강화된, L-트립토판을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-트립토판의 생산 방법을 제공한다.

상기 프리페네이트 디하이드라타아제, 활성 강화 및 L-트립토판을 생산하는 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 7.0)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 아미노산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

또한, 본 출원에 따른 방법은 배양된 배지 또는 미생물로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 아미노산을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 아미노산을 회수 할 수 있다.

또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 아미노산은 정제된 형태 또는 아미노산을 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008). 또한, 상기 배양 단계의 전후, 상기 회수 단계의 전후에 당해 분야에서 공지된 적합한 방법을 추가하여, 목적 아미노산의 회수를 효율적으로 수행할 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 프리페네이트 디하이드라타아제 활성이 강화된, L-트립토판을 생산하는 미생물을 포함하는, L-트립토판 생산용 조성물을 제공한다.

상기 L-트립토판 생산용 조성물은 상기 PheA를 코딩하는 pheA 유전자를 포함하며, 상기 PheA 또는 pheA 유전자를 강화시킬 수 있는 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 구성은 도입된 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있도록 벡터 내에 포함된 형태일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다. 구체적으로, 상기 프리페네이트 디하이드라타제를 코딩하는 유전자인 pheA 유전자의 발현은 유전자의 카피수 증가 또는 강한 프로모터로의 교체를 통해 강화되는 것일 수 있다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 L-트립토판 생산을 위한, 조성물의 용도를 제공한다.

본 출원의 프리페네이트 디하이드라타아제 활성이 강화된, L-트립토판을 생산하는 미생물은 안트라닐레이트(anthranilate)의 축적을 최소화하며, L-트립토판을 고효율로 생산할 수 있다.

도 1은 pDCM2 플라스미드의 모식도이다.

이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.

실시예 1: 플라스미드의 제작

코리네박테리움 염색체 내 유전자의 삽입 및 교체를 위한 플라스미드(pDCM2, 도 1, 서열번호 3)을 디자인하였고, 바이닉스(주)의 유전자 합성(Gene-synthesis) 서비스를 이용하여 플라스미드를 합성하였다. 일반적으로 알려진 sacB 시스템 관련 논문[Gene, 145 (1994) 69-73]을 참고로 하여 클로닝에 활용하기 용이한 제한효소(restriction enzyme)를 포함하도록 플라스미드를 설계하였다. 이렇게 합성된 pDCM2 플라스미드는 다음과 같은 특성을 갖는다.

1) 대장균에서만 작용하는 복제 기점(replication origin)을 가지고 있어 대장균 내에서는 자가 복제(self-replication)가 가능하나 코리네박테리움에서는 자가 복제가 불가능한 특성을 갖는다.

2) 선별 마커로 카나마이신 내성 유전자를 갖는다.

3) 2차 양성 선별(positive-selection) 마커로 레반 수크라제(Levan sucrose) 유전자(sacB)를 갖는다.

4) 최종 제작된 균주에는 pDCM2 플라스미드로부터 유래한 어떠한 유전자 정보도 남지 않는다.

실시예 2: 프리페네이트 디하이드라타아제 강화용 플라스미드의 제작

프리페네이트 디하이드라타아제(prephenate dehydratase, 이하 "pheA")의 활성을 강화시키기 위해서, 강한 프로모터로 알려진 변이형 lysC 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0930203호)를 기반으로 일부 서열을 변경하여 서열번호 4로 디자인하고 바이오닉스(주) 유전자 합성 서비스를 이용하여 합성하였으며, 이를 PlysCm1 프로모터로 명명하였다. 상기 PlysCm1 프로모터를 이용하여, pheA 유전자를 추가 삽입하거나 pheA 유전자의 야생형 프로모터를 PlysCm1으로 교체함으로써 프리페네이트 디하이드라타아제 활성을 강화하는 플라스미드를 제작하였다.

실시예 2-1: 유전자 삽입을 위한 플라스미드의 제작

상기의 PlysCm1 프로모터를 이용하여, pheA 유전자를 추가 삽입하기 위해, 야생종의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하고 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍을 이용하여 염색체상 상동재조합(Homologous recombiantion)이 발생하는 업스트림(Upstream) 지역을, 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍을 이용하여 다운스트림(Downsteam) 지역을 증폭한 뒤 각각의 유전자 단편을 수득하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

서열번호	명칭	서열(5'→ 3')
5	HR1 F	tgaattcgagctcggtacccAGGGTTTAGTGATGTCCG
6	HR1 R	ATGGCTCCCTAAGGAGCACTGTCCGCGGCAAGACAGT
7	HR2 F	ACTTGTCGACTTTCCAGGAC
8	HR2 R	gtcgactctagaggatccccCGCAACGCATGCTGAA

상기의 단편들을 획득하기 위해서 PCR이 진행되었다. 중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭은 95℃에서 4분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 50초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다.

또한, 기합성된 서열번호 4를 주형으로 서열번호 9과 서열번호 10를 이용하여 PlysCm1 프로모터 단편을 획득하였다. 추가적으로 야생종의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 11과 서열번호 12를 이용하여 pheA 유전자 단편(서열번호 2)을 수득하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.

서열번호	명칭	서열(5'→ 3')
9	PlysCm1 F	ACTGTCTTGCCGCGGACAGTGCTCCTTAGGGAGCCAT
10	PlysCm1 R	CGTCGCTCATATGTGTGCACCTTTCGA
11	PheA F	GTGCACACATATGAGCGACGCACCAAT
12	PheA R	GTCCTGGAAAGTCGACAAGTCTAGTTAAGTTTCCTTCCTTCG

중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭은 95℃에서 4분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다.

상기의 과정으로 획득된 염색체상 상동재조합이 발생하는 지역의 업스트림 단편, 다운스트림 단편, PlysCm1 프로모터 단편, pheA 유전자 단편, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDCM2을 깁슨 어셈블리 방법(DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDCM2-Tn::PlysCm1_pheA로 명명하였다.

실시예 2-2: 프로모터 교체를 위한 플라스미드 제작

pheA 유전자의 야생형 프로모터를 PlysCm1으로 교체함으로써 프리페네이트 디하이드라타아제 활성을 강화하는 플라스미드를 제작하고자 하였다. 구체적으로, 야생종의 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC13869) 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍을 이용하여 염색체상 상동재조합(Homologous recombiantion)이 발생하는 pheA 유전자의 야생형 프로모터 업스트림(Upstream) 지역의 유전자 단편을 수득하였다. 그리고 앞서 제작한 pDCM2-Tn::PlysCm1_pheA 플라스미드를 주형으로 프라이머 서열번호 15 및 서열번호 16을 이용하여 PlysCm1 프로모터 및 이의 다운스트림을 함께 포함한 유전자 단편을 수득하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 3과 같다.

서열번호	명칭	서열(5'→ 3')
13	UP F	tgaattcgagctcggtacccACGCACTTGGGTGGCCAC
14	UP R	ATGGCTCCCTAAGGAGCACTGTCCGCGGCAAGACAGT
15	PlysCm1 F2	ACTTGTCGACTTTCCAGGAC
16	pheA partialR	gtcgactctagaggatccccCGCAACGCATGCTGAA

상기의 단편들을 획득하기 위해서 중합효소 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭은 95℃에서 4분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 50초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다.

상기의 과정으로 획득된 pheA 프로모터의 업스트림 단편, PlysCm1를 포함한 프로모터 및 다운스트림 단편, SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDCM2을 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDCM2-Pn::PlysCm1_pheA로 명명하였다.

실시예 3: 프리페네이트 디하이드라타아제 발현이 강화된 균주의 제작 및 트립토판의 생산 확인

허바스필리움 리조스페레(Herbaspirillum rhizosphaerae) 유래 막 단백질을 코딩하는 유전자(등록번호 NZ_LFLU01000012.1)를 트립토판 생산 균주인 CA04-8352 균주(대한민국 등록특허 제10-1968317호)에 도입하여 제작한 CA04-8405 균주(KCCM12099P, 대한민국 등록특허 제10-1968317호)에 상기 실시예 2-1에서 제작한 pDCM2-Tn::PlysCm1_pheA를 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)을 이용하여 형질전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 PlysCm1_pheA 유전자가 추가로 삽입된 균주를 얻었다. 해당 상동재조합 업스트림 지역 및 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭 및 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전자가 삽입되었음을 확인하였다. 상기 유전자가 삽입된 균주를 CM05-9157로 명명하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 4와 같다.

서열번호	명칭	서열(5'→ 3')
17	confirm_F1	CCAGCGACTAAGCTTG
18	confirm_R1	AAGCCATCCAAGCAGC

상기와 동일한 방법으로 CA04-8405 균주에 상기 실시예 2-2에서 제작한 pDCM2-Pn::PlysCm1_pheA를 전기천공법을 이용하여 형질전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 야생형 pheA 프로모터가 PlysCm1 프로모터로 교체된 균주를 얻었다. 해당 상동재조합 업스트림 지역 및 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭 및 게놈 시퀀싱을 통해 프로모터가 교체되었음을 확인하였다. 상기 프로모터가 교체된 균주를 CM05-9158로 명명하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 5와 같다.

서열번호	명칭	서열(5'→ 3')
19	confirm_F2	TCTGGTGCGTGGTTGAAG
20	confirm_R2	TGGCACATTCGGTAGGG

상기 과정을 통해 제작된 CM05-9157 및 CM05-9158 균주의 트립토판 생산을 확인하기 위해, CA04-8405 균주를 대조군으로 하여 하기와 같은 방법으로 배양 및 트립토판 생산량을 비교하였다. 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 후, 균주별로 각각 3개씩 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크를 새로 준비하고 여기에 상기 종 배양액을 1 ㎖ 접종하였으며 30℃에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 진탕 배양 종료 후 HPLC를 이용하여 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.

종 배지 (pH 7.0)

포도당 20g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

생산 배지 (pH 7.0)

포도당 30g, (NH₄)₂SO₄ 15 g, MgSO₄ 7H₂O 1.2 g, KH₂PO₄ 1 g, 효모추출물 5 g, 바이오틴 900 ㎍, 티아민 염산염 4500 ㎍, 칼슘-판토텐산 4500 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준).

CA04-8405, pheA 발현이 강화된 CM05-9157 및 CM05-9158 균주의 배양 후, 배지 중 L-트립토판 생산에 대한 결과는 하기 표 6과 같다.

	OD562 (표준편차)	L-트립토판 (g/L) (표준편차)	트립토판 수율 (*100 g/g, %) (표준편차)	안트라닐레이트 (g/L) (표준편차)
CA04-8405	53.2 (0.82)	1.57 (0.03)	5.22 (0.11)	0.17 (0.01)
CM05-9157	56.5 (0.45)	1.93 (0.02)	6.43 (0.07)	0.00
CM05-9158	56.4 (0.08)	1.94 (0.02)	6.48 (0.06)	0.00

pheA 발현이 강화된 CM05-9157 및 CM05-9158 균주의 배양 결과 각각 1.93 및 1.94 g/L의 L-트립토판을 생산하였다. 이는 대조군인 CA04-8405 균주에 비해 약 0.37 g/L이 증가한 것이며, 발효 수율은 약 23~24% 향상된 것이다. 또한, pheA 발현의 강화로 안트라닐레이트(anthranilate) 생성이 줄어들었음을 확인하였으며, 이로 인해 트립토판 생산량이 증가한 것을 확인하였다.

상기 CM05-9157 균주는 2020년 02월 20일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12670P로 기탁번호를 부여받았다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12670P

20200220

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> The method of producing L-tryptophan using enhancing the activity of prephenate dehydratase <130> KPA191635-KR <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 201 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> C.glutamicum pheA <400> 1 Met Ser Asp Ala Pro Ile Val Val Ala Tyr Leu Gly Pro Ala Gly Thr 1 5 10 15 Phe Thr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Phe Ala Asp Ala Gly Val Phe Gly 20 25 30 Asp Gly Glu Ile Glu Gln Leu Pro Ala Lys Ser Pro Gln Glu Ala Val 35 40 45 Asp Ala Val Arg His Gly Thr Ala Gln Phe Ala Val Val Ala Ile Glu 50 55 60 Asn Phe Val Asp Gly Pro Val Thr Pro Thr Phe Asp Ala Leu Asp Gln 65 70 75 80 Gly Ser Asn Val Gln Ile Ile Ala Glu Glu Glu Leu Asp Ile Ala Phe 85 90 95 Ser Ile Met Val Arg Pro Gly Thr Ser Leu Ala Asp Val Lys Thr Leu 100 105 110 Ala Thr His Pro Val Gly Tyr Gln Gln Val Lys Asn Trp Met Ala Thr 115 120 125 Thr Ile Pro Asp Ala Met Tyr Leu Ser Ala Ser Ser Asn Gly Ala Gly 130 135 140 Ala Gln Met Val Ala Glu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser 145 150 155 160 Arg Ala Ala Glu Leu Phe Gly Leu Glu Arg Leu Val Asp Asp Val Ala 165 170 175 Asp Val Arg Gly Ala Arg Thr Arg Phe Val Ala Val Gln Ala Gln Ala 180 185 190 Ala Val Ser Glu Pro Thr Gly His Asp 195 200 <210> 2 <211> 603 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> C.glutamicum pheA <400> 2 atgagcgacg caccaattgt tgtggcctat ttggggcctg ccggaacctt caccgaagaa 60 gccctctaca aatttgccga cgccggcgta ttcggcgacg gtgagatcga gcagctacca 120 gccaaatcgc cacaagaagc tgtcgacgcg gtccgccacg gcaccgccca gttcgcggtg 180 gtcgccatcg aaaacttcgt cgacggcccc gtcaccccca ccttcgacgc ccttgaccag 240 ggctccaacg tgcaaatcat cgccgaagaa gaactcgata ttgccttttc catcatggtc 300 cggccaggga cttcgcttgc cgacgtcaaa accctcgcca cccacccggt tgggtaccaa 360 caagtgaaaa actggatggc aaccaccatt ccggacgcca tgtatctttc agcaagctcc 420 aacggcgccg gcgcacaaat ggttgccgaa ggaaccgccg acgcagccgc agcgccctcc 480 cgcgcagccg aactcttcgg actggaacgc cttgttgatg atgtcgccga cgtccgcggc 540 gcccgcaccc gcttcgttgc agtccaagcc caagcagccg tttccgaacc gaccggccac 600 gac 603 <210> 3 <211> 5803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDCM2 <400> 3 gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc ccactgcaag 60 ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag tagctgacat 120 tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta cgtgttccgc ttcctttagc 180 agcccttgcg ccctgagtgc ttgcggcagc gtgaagctag cttttatcgc cattcgccat 240 tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 300 tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt 360 cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag 420 tcgacctgca ggcatgcaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 480 tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 540 ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 600 tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 660 ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 720 ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 780 gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 840 gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 900 cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 960 ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 1020 tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg 1080 gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 1140 tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 1200 ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 1260 ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 1320 ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 1380 accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 1440 tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 1500 cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttgggg 1560 tgggcgaaga actccagcat gagatccccg cgctggagga tcatccagcc ctgatagaaa 1620 cagaagccac tggagcacct caaaaacacc atcatacact aaatcagtaa gttggcagca 1680 tcacccgacg cactttgcgc cgaataaata cctgtgacgg aagatcactt cgcagaataa 1740 ataaatcctg gtgtccctgt tgataccggg aagccctggg ccaacttttg gcgaaaatga 1800 gacgttgatc ggcacgtaag aggttccaac tttcaccata atgaaataag atcactaccg 1860 ggcgtatttt ttgagttatc gagattttca ggagctgata gaaacagaag ccactggagc 1920 acctcaaaaa caccatcata cactaaatca gtaagttggc agcatcaccc gacgcacttt 1980 gcgccgaata aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat cctggtgtcc 2040 ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg 2100 taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt 2160 tatcgagatt ttcaggagct ctttggcatc gtctctcgcc tgtcccctca gttcagtaat 2220 ttcctgcatt tgcctgtttc cagtcggtag atattccaca aaacagcagg gaagcagcgc 2280 ttttccgctg cataaccctg cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc 2340 tttttcgcac gatatacagg attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc 2400 caacggcgtc agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc 2460 ttcactgtcc cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg 2520 ccggctaccg ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc 2580 aggaagggca gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag 2640 gaaaaggcgg cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc 2700 tacaaaatca cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agggcgtccc ggaaaacgat 2760 tccgaagccc aacctttcat agaaggcggc ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt 2820 gggcgtcgct tggtcggtca tttcgaaaaa ggttaggaat acggttagcc atttgcctgc 2880 ttttatatag ttcantatgg gattcacctt tatgttgata agaaataaaa gaaaatgcca 2940 ataggatatc ggcattttct tttgcgtttt tatttgttaa ctgttaattg tccttgttca 3000 aggatgctgt ctttgacaac agatgttttc ttgcctttga tgttcagcag gaagctcggc 3060 gcaaacgttg attgtttgtc tgcgtagaat cctctgtttg tcatatagct tgtaatcacg 3120 acattgtttc ctttcgcttg aggtacagcg aagtgtgagt aagtaaaggt tacatcgtta 3180 ggcggatcaa gatccatttt taacacaagg ccagttttgt tcagcggctt gtatgggcca 3240 gttaaagaat tagaaacata accaagcatg taaatatcgt tagacgtaat gccgtcaatc 3300 gtcatttttg atccgcggga gtcagtgaac aggtaccatt tgccgttcat tttaaagacg 3360 ttcgcgcgtt caatttcatc tgttactgtg ttagatgcaa tcagcggttt catcactttt 3420 ttcagtgtgt aatcatcgtt tagctcaatc ataccgagag cgccgtttgc taactcagcc 3480 gtgcgttttt tatcgctttg cagaagtttt tgactttctt gacggaagaa tgatgtgctt 3540 ttgccatagt atgctttgtt aaataaagat tcttcgcctt ggtagccatc ttcagttcca 3600 gtgtttgctt caaatactaa gtatttgtgg cctttatctt ctacgtagtg aggatctctc 3660 agcgtatggt tgtcgcctga gctgtagttg ccttcatcga tgaactgctg tacattttga 3720 tacgtttttc cgtcaccgtc aaagattgat ttataatcct ctacaccgtt gatgttcaaa 3780 gagctgtctg atgctgatac gttaacttgt gcagttgtca gtgtttgttt gccgtaatgt 3840 ttaccggaga aatcagtgta gaataaacgg atttttccgt cagatgtaaa tgtggctgaa 3900 cctgaccatt cttgtgtttg gtcttttagg atagaatcat ttgcatcgaa tttgtcgctg 3960 tctttaaaga cgcggccagc gtttttccag ctgtcaatag aagtttcgcc gactttttga 4020 tagaacatgt aaatcgatgt gtcatccgca tttttaggat ctccggctaa tgcaaagacg 4080 atgtggtagc cgtgatagtt tgcgacagtg ccgtcagcgt tttgtaatgg ccagctgtcc 4140 caaacgtcca ggccttttgc agaagagata tttttaattg tggacgaatc aaattcagaa 4200 acttgatatt tttcattttt ttgctgttca gggatttgca gcatatcatg gcgtgtaata 4260 tgggaaatgc cgtatgtttc cttatatggc ttttggttcg tttctttcgc aaacgcttga 4320 gttgcgcctc ctgccagcag tgcggtagta aaggttaata ctgttgcttg ttttgcaaac 4380 tttttgatgt tcatcgttca tgtctccttt tttatgtact gtgttagcgg tctgcttctt 4440 ccagccctcc tgtttgaaga tggcaagtta gttacgcaca ataaaaaaag acctaaaata 4500 tgtaaggggt gacgccaaag tatacacttt gccctttaca cattttaggt cttgcctgct 4560 ttatcagtaa caaacccgcg cgatttactt ttcgacctca ttctattaga ctctcgtttg 4620 gattgcaact ggtctatttt cctcttttgt ttgatagaaa atcataaaag gatttgcaga 4680 ctacgggcct aaagaactaa aaaatctatc tgtttctttt cattctctgt attttttata 4740 gtttctgttg catgggcata aagttgcctt tttaatcaca attcagaaaa tatcataata 4800 tctcatttca ctaaataata gtgaacggca ggtatatgtg atgggttaaa aaggatcacc 4860 ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc 4920 gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc 4980 agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc 5040 acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc 5100 gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatccgc gccttgagcc tggcgaacag 5160 ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc 5220 ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt 5280 agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc 5340 aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc 5400 ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc 5460 cacgatagcc gcgctgcctc gtcttggagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg 5520 acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc agagcagccg 5580 attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct 5640 gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat 5700 cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag 5760 ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccg 5803 <210> 4 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlysCm1 <400> 4 gctccttagg gagccatctt ttggggtgcg gagcgcgatc cggtgtctga ccacggtgcc 60 ccatgcgatt gttaatgccg atgctagggc gaaaagcacg gcgagcagat tgctttgcac 120 ttgattcagg gtagttgact aaagagttgc tcgcgaagta gcacctgtca cttttgtctc 180 aaatattaaa tcgaatatca atatatggtc tgtttattgg aacgcgtccc agtggctgag 240 acgcatccgc taaagcccca ggaaccctgt gcagaaagaa aacactcctc tggctaggta 300 gacacagttt attgtggtag agttgagcgg gtaactgtca gcacgtagat cgaaaggtgc 360 acacat 366 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR1 F <400> 5 tgaattcgag ctcggtaccc agggtttagt gatgtccg 38 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR1 R <400> 6 atggctccct aaggagcact gtccgcggca agacagt 37 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR2 F <400> 7 acttgtcgac tttccaggac 20 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR2 R <400> 8 gtcgactcta gaggatcccc cgcaacgcat gctgaa 36 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlysCm1 F <400> 9 actgtcttgc cgcggacagt gctccttagg gagccat 37 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlysCm1 R <400> 10 cgtcgctcat atgtgtgcac ctttcga 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PheA F <400> 11 gtgcacacat atgagcgacg caccaat 27 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PheA R <400> 12 gtcctggaaa gtcgacaagt ctagttaagt ttccttcctt cg 42 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP F <400> 13 tgaattcgag ctcggtaccc acgcacttgg gtggccac 38 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP R <400> 14 atggctccct aaggagcact gtccgcggca agacagt 37 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlysCm1 F2 <400> 15 acttgtcgac tttccaggac 20 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pheA partial R <400> 16 gtcgactcta gaggatcccc cgcaacgcat gctgaa 36 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Claims

프리페네이트 디하이드라타아제(prephenate dehydratase) 활성이 강화된, L-트립토판 생산능이 증가된 미생물.
제1항에 있어서, 상기 프리페네이트 디하이드라타아제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는, 미생물.
제1항에 있어서, 상기 활성 강화는 상기 프리페네이트 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자의 카피수 증가 또는 상기 유전자 프로모터의 강한 프로모터로의 교체를 통한 것인, 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.)인, 미생물.
제4항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-트립토판의 생산 방법.
제6항에 있어서, 상기 방법은 배양된 배지 또는 미생물로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 더 포함하는, L-트립토판의 생산 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 미생물을 포함하는, L-트립토판 생산용 조성물.