WO2023177253A1 - 거짓쌀도둑거저리 유래 아스파테이트 1-디카복실레이스의 변이체 및 이를 포함하는 미생물 - Google Patents

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장연재
양성재
신광수
소이슬
이광우
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01011—Aspartate 1-decarboxylase (4.1.1.11)

Definitions

  • a variant polypeptide of aspartate 1-decarboxylase derived from the false rice thief, a microorganism containing the same, a composition for producing beta-alanine and/or a beta-alanine-derived compound containing the microorganism, and culturing the microorganism A method for producing beta-alanine and/or a beta-alanine derived compound comprising the step is provided.
  • Beta-alanine is a naturally occurring ⁇ -amino acid that has an amino group attached to the ⁇ carbon. Beta-alanine is found naturally in foods such as poultry, meat, and fish, and is used to synthesize carnosine in muscles.
  • Beta-alanine-derived compounds such as beta-alanine and pantothenic acid, are one of the commercially important substances applied in various industrial fields such as health supplements, food, pharmaceuticals, animal feed, etc.
  • the present application provides a variant polypeptide having aspartate 1-dicarboxylase activity in which the amino acid corresponding to residue 139 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 is replaced with another amino acid.
  • the present application provides a polynucleotide encoding the variant polypeptide.
  • the present application provides a composition for producing beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds containing a microorganism containing the variant polypeptide and/or a polynucleotide encoding the same.
  • the present application provides the use of said microorganism for the production of beta-alanine and/or beta-alanine derived compounds.
  • Another example provides a polynucleotide that encodes (or encodes) the polypeptide.
  • microorganism containing one or more species selected from the group consisting of the polypeptide, a polynucleotide encoding the polypeptide, and a recombinant vector containing the polynucleotide.
  • the microorganism may be a microorganism that produces beta-alanine and/or beta-alanine derived compounds.
  • the protein subject to mutation introduction in the present application may be a protein having aspartate 1-dicarboxylase activity.
  • the sequence of the protein can be obtained from NCBI, a known database, and may specifically consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 or may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 and have aspartate 1-dicarboxylase activity. It is not limited to this. That is, meaningless addition of sequences before or after the amino acid sequence of SEQ ID NO. 51, mutations that may occur naturally, or silent mutations thereof are not excluded, and are identical or equivalent to the protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO. 51. If it has the activity, it may correspond to the protein that is the subject of mutation introduction in the present application.
  • the variant polypeptide having the activity of aspartate 1-dicarboxylase is one in which the amino acid corresponding to residue 139 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 is a different amino acid, that is, tryptophan (Trp, W), histidine ( His, H), tyrosine (Tyr, T), alanine (Ala, A), cysteine (Cys, C), proline (Pro, P), serine (Ser, S), leucine (Leu, L), isoleucine (Ile) , I), arginine (Arg, R), lysine (Lys, K), valine (Val, V), methionine (Met, M), aspartic acid (Asp, D), glutamic acid (Glu, E), glycine (Gly) , G), asparagine (Asn, N), glutamine (Gln, Q), and tyrosine (Tyr, Y), and may be substituted with an amino acid, Tr
  • the variant polypeptide having the activity of aspartate 1-dicarboxylase is an amino acid corresponding to the 139th residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 is threonine, alanine, serine, leucine, isoleucine, valine, and aspart. It may be substituted with acid, glycine, histidine, or tyrosine. In one embodiment, the variant polypeptide having aspartate 1-dicarboxylase activity may be one in which the amino acid corresponding to residue 139 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 is substituted with tyrosine.
  • the variant of aspartate 1-dicarboxylace consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 52 to SEQ ID NO: 61, or includes any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 52 to SEQ ID NO: 61. It may be.
  • the variant polypeptide of the present application may have characteristics that increase the ability to produce beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds compared to the wild-type polypeptide having aspartate 1-dicarboxylase activity.
  • variant polypeptides may include variant polypeptides in which a portion has been removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
  • variant polypeptide refers to terms such as variant, modified, variant polypeptide, mutated protein, mutation and variant (English expressions include modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent, variant, etc. ) may be used interchangeably, and are not limited thereto if the terms are used with a modified meaning.
  • the variant polypeptide may be a polypeptide containing an amino acid sequence in which the amino acid corresponding to the 139th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 is replaced with another amino acid.
  • polynucleotide refers to a DNA or RNA strand of a certain length or more, which is a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are connected in a long chain by covalent bonds.
  • the codon encoding the amino acid corresponding to position 139 in SEQ ID NO: 51 in the sequence having homology or identity is a basic amino acid (arginine, histidine, or lysine), an acidic amino acid (aspartic acid or glutamic acid) , may be one of the codons encoding a polar amino acid (serine, threonine, asparagine, or glutamine), alanine, valine, isoleucine, leucine, tyrosine, or glycine.
  • the codon encoding the amino acid corresponding to position 139 in SEQ ID NO: 51 in the sequence having homology or identity is threonine, alanine, serine, leucine, isoleucine, valine, aspartic acid, glycine, histidine, Alternatively, it may be one of the codons coding for tyrosine. In one embodiment, the codon encoding the amino acid corresponding to position 139 in SEQ ID NO: 51 in the sequence having homology or identity may be one of the codons encoding tyrosine.
  • polynucleotides having homology or identity with the polynucleotide of the present application can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55 ° C. and using the conditions described above. Additionally, the Tm value may be 60°C, 63°C, or 65°C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by a person skilled in the art depending on the purpose.
  • the appropriate stringency to hybridize the polynucleotide depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, variables that are well known in the art (e.g., J. Sambrook et al., supra).
  • homology refers to the degree of similarity between two given amino acid sequences or base sequences and can be expressed as a percentage.
  • homology and identity can often be used interchangeably.
  • Such alignments include, for example, the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), the Needle program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. , 2000), Trends Genet. 16: 276-277), etc. may be used, but are not limited thereto, and sequence alignment programs and pairwise sequence comparison algorithms known in the art may be appropriately used.
  • Enhancement of the activity of the polypeptide can be done by applying various methods well known in the art, and is not limited as long as the activity of the target polypeptide can be enhanced compared to that of the microorganism before modification.
  • genetic engineering and/or protein engineering well known to those skilled in the art, which are routine methods of molecular biology, may be used, but are not limited thereto (e.g., Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • the increase in the intracellular copy number of the polynucleotide encoding the polypeptide is due to the introduction into the host cell of a vector capable of replicating and functioning independently of the host to which the polynucleotide encoding the polypeptide is operably linked. It may be achieved by Alternatively, this may be achieved by introducing one or more copies of the polynucleotide encoding the polypeptide into the chromosome of the host cell.
  • the introduction into the chromosome may be performed by introducing a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome of the host cell into the host cell, but is not limited to this.
  • the vector is the same as described above.
  • Examples of known strong promoters include CJ1 to CJ7 promoters (US Patent US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13. (sm3) promoter (US Patent US 10584338 B2), O2 promoter (US Patent US 10273491 B2), tkt promoter, yccA promoter, etc., but is not limited thereto.
  • the base sequence modification encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a base encoding another start codon with a higher polypeptide expression rate than the internal start codon. It may be a substitution by sequence, but is not limited thereto.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) includes deletion, insertion, non-conservative or conservative amino acid sequence of the polypeptide or polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide. It may be a mutation in the sequence due to a substitution or a combination thereof, or a replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have stronger activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to increase activity, but is limited thereto. no.
  • the replacement may be specifically performed by inserting a polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used at this time may additionally include a selection marker to check whether chromosome insertion has occurred. The selection marker is as described above.
  • Introduction of a foreign polynucleotide showing the activity of the polypeptide may be introduction into the host cell of a foreign polynucleotide encoding a polypeptide showing the same/similar activity as the polypeptide.
  • the foreign polynucleotide is not limited in its origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as the polypeptide.
  • the method used for the introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by a person skilled in the art, and by expressing the introduced polynucleotide in the host cell, a polypeptide can be produced and its activity can be increased.
  • Codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide is codon optimization of the native polynucleotide to increase transcription or translation within the host cell, or codon optimization of the foreign polynucleotide to increase transcription or translation within the host cell.
  • the codon may have been optimized to achieve this.
  • Such enhancement of polypeptide activity means that the activity or concentration of the corresponding polypeptide is increased based on the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild type or unmodified microbial strain, or the amount of product produced from the polypeptide is increased. may be increased, but is not limited to this.
  • the vector used in this application is not particularly limited, and any vector known in the art can be used.
  • Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses, and bacteriophages in a natural or recombinant state.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors can be used.
  • pBluescriptII series, pGEM series, pTZ series, pCL series, and pET series can be used.
  • pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pTop33ori vectors, etc. can be used.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide can be inserted into a chromosome using a vector for intracellular chromosome insertion. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be accomplished by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • a selection marker may be additionally included to confirm whether the chromosome has been inserted. The selection marker is used to select cells transformed with a vector, i.e., to confirm the insertion of a target nucleic acid molecule, and is a selectable phenotype such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface polypeptides. Markers that give may be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selection marker survive or show other expression traits, so transformed cells can be selected.
  • the term "transformation” refers to introducing a vector containing a polynucleotide encoding a target polypeptide into a host cell or microorganism to enable expression of the polypeptide encoded by the polynucleotide within the host cell. .
  • the transformed polynucleotide can be expressed in the host cell, it can include both of these, regardless of whether it is inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • the polynucleotide includes DNA and/or RNA encoding the polypeptide of interest.
  • the polynucleotide can be introduced in any form as long as it can be introduced and expressed into a host cell.
  • the polynucleotide can be introduced into the host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic structure containing all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may typically include a promoter, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal that are operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that the polynucleotide sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of the polynucleotide encoding the target variant of the present application.
  • Another aspect is one or more types selected from the group consisting of the variant polypeptide, a polynucleotide encoding (or encoding) the polypeptide, and a recombinant vector containing the polynucleotide (e.g., one or more types, two or more types , or 1, 2, or 3 species).
  • the microorganism may be a microorganism with increased (or improved) ability to produce beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds.
  • microorganism or strain
  • microorganism includes both wild-type microorganisms and microorganisms that have undergone natural or artificial genetic modification, and in which foreign genes are inserted and/or the activity of intrinsic genes is enhanced or inactivated. It is a microorganism whose specific mechanism is weakened or strengthened due to reasons such as, and may be a microorganism that includes genetic modification for the production of a desired polypeptide, protein, or product (e.g., aspartate 1-dicarboxylase). there is.
  • the microorganism (or strain, recombinant cell) of the present application may be a microorganism that has the ability to produce beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds or has an improved ability (or production) to produce beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds. there is.
  • the microorganism of the present application is a microorganism that naturally has the ability to produce beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds, or a microorganism that does not have the ability to produce beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds. It may be a microorganism endowed with or improved in the ability to produce beta-alanine derived compounds, but is not limited thereto. The microorganism endowed or improved with the ability to produce beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds may be a microorganism into which a variant polypeptide with aspartate 1-dicarboxylase activity has been introduced.
  • the microorganism of the present application is a microorganism containing at least one of the variant polypeptide of the present application, a polynucleotide encoding the variant polypeptide of the present application, and a vector containing the polynucleotide of the present application; Microorganisms modified to express the variant polypeptide of the present application or the polynucleotide of the present application; Microorganisms (e.g., recombinant strains) expressing the variant polypeptide of the present application, or the polynucleotide of the present application; Or it may be a microorganism (eg, a recombinant strain) having the variant polypeptide activity of the present application, but is not limited thereto.
  • the microorganism of the present application may be a Corynebacterium sp. microorganism.
  • the microorganisms in the Corynebacterium genus include Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis , Corynebacterium deserti , and Corynebacterium eph.
  • Corynebacterium efficiens Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis , Corynebacterium singulare , Corynebacterium halotolerans ), Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli , Corynebacterium imitans , Corynebacterium It may be one or more species selected from the group consisting of Corynebacterium testudinoris and Corynebacterium flavescens .
  • the microorganism may have an improved (increased) ability to produce beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds compared to the same type of unmodified microorganism.
  • the term "non-modified microorganism” does not exclude strains containing mutations that may occur naturally in microorganisms, and is either a wild-type strain or a natural strain itself, or a strain that has a genetic mutation caused by natural or artificial factors. It may refer to the strain before change.
  • the unmodified microorganism may refer to a strain in which the variant polypeptide of the present application or a polynucleotide encoding the variant polypeptide is not introduced or is introduced, according to one example.
  • non-modified microorganism may refer to a strain into which aspartate 1-dicarboxylase or a polynucleotide encoding the same derived from wild-type false mealworm has been introduced.
  • the “non-modified microorganism” may be used interchangeably with “pre-transformed strain”, “pre-transformed microorganism”, “non-mutated strain”, “non-modified strain”, “non-mutated microorganism” or “reference microorganism”.
  • the microorganism may have accession number KCCM13077P.
  • the beta-alanine derived compounds include ⁇ -nitropropanoate, ⁇ -amino-propionitrile, and N-acetyl- ⁇ -alanine. , L-aspartate, anserine, spermine, carnosine, ⁇ -alanyl arginine, quinolinate, pantothenate (or pantothenate), malonate semialdehyde, malonate, acetylene-monocarboxylate, etc., but may be limited to one or more selected from the group consisting of no.
  • the microorganism (or strain, recombinant cell) with improved (or increased) production capacity (or production) of beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds may be derived from the parent strain, unmodified microorganism, or other microorganism before mutation.
  • beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds may be increased by about 2.0 times or more, about 2.1 times or more, about 2.2 times or more, about 2.3 times or more, about 2.4 times or more, or about 2.5 times or more, but is not limited thereto.
  • the microorganism (or strain, recombinant cell) with improved (or increased) production capacity (or production) of beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds may be derived from the parent strain, unmodified microorganism, or other microorganism before mutation.
  • the ability to produce beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds is about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, about 140%, or about 150% (or about 2.0 times, about 2.1 times, about 2.2 times, about 2.3 times, about 2.4 times, or about 2.5 times; or about 1.0 g/L, about 1.1 g/L, about 1.2 g/L, about 1.3 g/L, about 1.4 g/L, or about 1.5 g/L). That is not the case.
  • the microorganism (or strain, recombinant cell) with improved (or increased) production capacity (or production) of beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds may be derived from the parent strain, unmodified microorganism, or other microorganism before mutation.
  • Production capacity is about 5% or more, about 10% or more, about 15% or more, about 20% or more, about 25% or more, about 30% or more, about 35% or more, about 40% or more, about 45% or more % or more, about 50% or more, about 55% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 100% or more, about 110% or more, about 120% or more, 125% It may be increased by more than, about 130% or more, about 140% or more, or about 150% or more, but is not limited thereto.
  • the microorganism (or strain, recombinant cell) with improved (or increased) production capacity (or production) of beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds may be derived from the parent strain, unmodified microorganism, or other microorganism before mutation.
  • beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds is about 1.05 times or more, about 1.1 times or more, about 1.15 times or more, about 1.2 times or more, about 1.25 times or more, about 1.3 times or more, about 1.35 times or more, about 1.4 times or more, about 1.45 times or more, about 1.5 times or more.
  • Two times or more about 1.55 times more, about 1.6 times more, about 1.7 times more, about 1.8 times more, about 1.9 times more, about 2 times more, about 2.1 times more, about 2.2 times more, about 2.25 times more, about 2.3 times more It may be increased by more than two times, about 2.4 times more, or about 2.5 times more, but is not limited thereto.
  • the microorganism (or strain, recombinant cell) with improved (or increased) production capacity (or production) of beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds may be derived from the parent strain, unmodified microorganism, or other microorganism before mutation.
  • the microorganism (or strain, recombinant cell) with improved (or increased) production capacity (or production) of beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds is derived from the parent strain before mutation, an unmodified microorganism, or another microorganism.
  • the ability to produce beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds ( or production) is about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 35%, about 40%, about 55%.
  • About 100%, or about 125% (or about 1.1 times, about 1.15 times, about 1.2 times, about 1.25 times, about 1.35 times, about 1.4 times, about 1.55 times, about 2 times, or 2.25 times; or about 0.06 g/L, about 0.1 g/L, about 0.13 g/L, about 0.16 g/L, about 0.23 g/L, about 0.26 g/L, about 0.36 g/L, about 0.5 g/L or about 0.6 g/ L) It may be increased, but is not limited to this.
  • Another aspect is to provide a composition for producing beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds comprising the microorganism of the present application, a medium culturing the microorganism, or a combination thereof.
  • composition of the present application may further comprise any suitable excipients commonly used in compositions for producing beta-alanine and/or beta-alanine derived compounds, such as preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents. , may be a buffer, stabilizer, or isotonic agent, but is not limited thereto.
  • the microorganism (strain), medium, etc. are as described in the other aspects above.
  • Another aspect provides a method for producing beta-alanine and/or beta-alanine derived compounds, comprising culturing the microorganism of the present application in a medium.
  • the method for producing beta-alanine and/or beta-alanine derived compounds of the present application may include culturing the microorganism of the present application in a medium.
  • the microorganisms of this application are as described above.
  • “medium” refers to a material that is mainly mixed with nutrients necessary for cultivating the microorganisms of this application, and supplies nutrients and growth factors, including water, which are essential for survival and development.
  • the medium and other culture conditions used for cultivating the microorganisms of the present application can be any medium used for cultivating ordinary microorganisms without particular restrictions, but the microorganisms of the present application can be grown with an appropriate carbon source, nitrogen source, personnel, and inorganic substances. It can be cultured under aerobic conditions in a typical medium containing compounds, amino acids, and/or vitamins, while controlling temperature, pH, etc.
  • culture media for microorganisms of the present application such as strains of the genus Corynebacterium, can be found in the literature ["Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)] .
  • the carbon source includes carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose, etc.; Sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, etc., organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid, etc.; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, etc. may be included.
  • natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice bran, cassava, bagasse and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pre-treated molasses (i.e. converted to reducing sugars).
  • Carbohydrates such as molasses
  • various other carbon sources in an appropriate amount can be used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
  • the nitrogen source includes inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, and glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its decomposition products, defatted soybean cake or its decomposition products, etc. can be used These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, and glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast
  • the agent may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or a corresponding sodium-containing salt.
  • Inorganic compounds may include sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, and calcium carbonate, and may also include amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors. These components or precursors can be added to the medium batchwise or continuously. However, it is not limited to this.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. can be added to the medium in an appropriate manner to adjust the pH of the medium.
  • foam generation can be suppressed by using an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester.
  • oxygen or oxygen-containing gas can be injected into the medium, or to maintain the anaerobic and microaerobic state, nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas can be injected without gas injection, and is limited thereto. That is not the case.
  • the culture temperature can be maintained at 20 to 45°C, specifically 25 to 40°C, and culture can be performed for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • Beta-alanine and/or beta-alanine-derived compounds produced by the culture of the present application may be secreted into the medium or remain within the cells.
  • the method for producing beta-alanine and/or beta-alanine derived compounds of the present application includes preparing a microorganism (strain) of the present application, preparing a medium for culturing the microorganism, or a combination thereof (regardless of the order) , in any order) may be additionally included, for example, before the culturing step.
  • the recovery is performed using a suitable method known in the art according to the method of cultivating the microorganism of the present application, such as a batch, continuous or fed-batch culture method, to obtain the desired beta-alanine and/or beta-alanine-derived compound. It may be collecting. For example, centrifugation, filtration, crystallization, treatment with protein precipitants (salting out), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity.
  • a suitable method known in the art such as a batch, continuous or fed-batch culture method, to obtain the desired beta-alanine and/or beta-alanine-derived compound. It may be collecting. For example, centrifugation, filtration, crystallization, treatment with protein precipitants (salting out), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography,
  • beta-alanine and/or beta-alanine-derived compound can be recovered from the medium or microorganism using a suitable method known in the art. can do.
  • the method for producing beta-alanine and/or beta-alanine derived compounds of the present application may additionally include a purification step.
  • the purification can be performed using a suitable method known in the art.
  • the recovery step and the purification step are performed continuously or discontinuously regardless of the order. , may be performed simultaneously or integrated into one step, but is not limited thereto.
  • Another aspect provides the use of the microorganism of the present application for the production of beta-alanine and/or beta-alanine derived compounds or for the preparation of a composition for the production of beta-alanine and/or beta-alanine derived compounds.
  • the composition for producing the present application microorganism, beta-alanine and/or beta-alanine derived compound or beta-alanine and/or beta-alanine derived compound is as described above.
  • panD gene gene encoding aspartate 1-decarboxylase, or PanD protein
  • the panD gene was used. Mutations were induced using the introduced Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (ATCC13032 ⁇ panD::panD(TC)) as the parent strain.
  • ATCC13032 ⁇ panD::panD(TC) strain was constructed as follows. First, a vector was created to delete the panD gene endogenously present in the Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain. PCR was performed using the genomic DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template and primers of SEQ ID NOs: 73 and 74 and SEQ ID NOs: 75 and 76. PCR denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was performed at 72°C for 1 minute, repeated 30 times.
  • PCR was performed using primers 77 and 78 using genomic DNA extracted from the false rice thief as a template. PCR denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 30 times at 72°C for 1 minute and 30 seconds, and as a result, a 1640 bp DNA fragment was obtained.
  • a DNA fragment was obtained by PCR of the promoter in the same manner as in the above example using Corynebacterium glutamicum genomic DNA as a template and primers 79 and 80.
  • the pDCM2_ ⁇ panD vector treated with the restriction enzyme smaI and then heat-treated at 65°C for 20 minutes and the obtained DNA fragments were cloned at a molar concentration (M) of 2:1:1 using the Infusion Cloning Kit from TaKaRa according to the provided manual.
  • M molar concentration
  • the constructed vector pDCM2_ ⁇ panD::panD(TC) was transformed into Corynebacterium glutamicum ATCC13032 through electroporation, and a strain ( ⁇ panD::panD) into which E. coli-derived panD was introduced onto the chromosome was subjected to a second crossover process. (TC)) was selected. Appropriate substitution of E. coli-derived panD was confirmed using the MASA (Mutant Allele Specific Amplification) PCR technique (Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993)) using the following primer combination.
  • MASA Meat Allele Specific Amplification
  • the primer combination matching the false rice thief panD (SEQ ID NOs: 81 and 80 and SEQ ID NOS: 77 and 82) was first determined by selecting the strain to be amplified, and the panD sequence of the selected strain is SEQ ID NO: 81 and SEQ ID NO: Secondary screening was completed by analysis using 82 primer combinations.
  • the selected Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ⁇ panD::panD(TC) strain was activated by culturing it in activation medium for 16 hours, inoculated into sterilized minimal medium at 121°C for 15 minutes, and cultured for 14 hours, 5 mL of culture medium was recovered. After washing the recovered culture with 100 mM citric buffer, NTG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) was added to a final concentration of 200 mg/L and treated for 20 minutes. Washed with 100 mM phosphate buffer. As a result of measuring the death rate by plating the NTG-treated strain on minimal medium, the death rate was found to be 85%.
  • Corynebacterium glutamicum CJVB5-03-1 Corynebacterium glutamicum CJVB5-03-1 did.
  • composition of the medium used in this example is as follows.
  • Glucose 10% yeast extract 0.4%, ammonium sulfate 1.5%, monobasic potassium phosphate 0.1%, magnesium sulfate hexahydrate 0.05%, iron sulfate hexahydrate 10 mg/L, manganese sulfate monohydrate 6.7 mg/L, biotin 50 ⁇ g/ L, thiamine ⁇ HCl 100 ⁇ g/L, pH 7.2
  • Corynebacterium glutamicum ⁇ panD::panD(TC) 250 ml containing 25 ml of production medium.
  • Corynebacterium glutamicum ⁇ panD::panD(TC) strain and CJVB5-04 mutant strain were inoculated into a corner-barpool flask, respectively, and cultured with shaking at 200 rpm for 48 hours at 33°C .
  • the obtained culture was centrifuged at 20,000 rcf for 10 minutes, the supernatant was diluted 1/10 with TDW (triple distilled water), and HPLC analysis was performed to measure the concentration of beta-alanine.
  • TDW triple distilled water
  • HPLC analysis was performed to measure the concentration of beta-alanine. The results are shown in Table 1 below. indicated.
  • Beta-alanine production capacity of NTG-based mutant strains Beta-alanine concentration (g/L) ATCC13032 ⁇ panD ::panD(TC) 0.5 CJVB5-03-1 1.2
  • Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ⁇ panD::panD(TC) produced beta-alanine at a concentration of 0.5 g/L
  • the mutant Corynebacterium strain according to the present application Glutamicum CJVB5-03-1 produced beta-alanine at a concentration of 1.2 g/L, confirming that beta-alanine productivity increased by about 2.4 times (about 140% increase) compared to the parent strain.
  • the mutant strain obtained through the random mutation method can produce beta-alanine with high efficiency and high yield.
  • panB gene gene encoding 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase, or PanB protein
  • a vector was created to delete .
  • PCR was performed using the genomic DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template and primers of SEQ ID NOs: 41 and 42 and SEQ ID NOs: 43 and 44.
  • PCR denaturation 95°C, 30 s; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was performed at 72°C for 1 minute, repeated 30 times.
  • the pDCM2 (Korea registered patent number 2278000) vector and DNA fragment (1,000 bp gene fragment at the top of the panB gene and 1,000 bp gene fragment at the bottom of the panB gene) were treated with the restriction enzyme smaI and then heat-treated at 65°C for 20 minutes.
  • the vector pDMC2_ ⁇ panB for deleting the panB gene on the chromosome was created by cloning according to the manual provided using TaKaRa's Infusion Cloning Kit at a molar concentration (M) of 2:1:1.
  • PCR was performed using primers 47 and 48 using the genomic DNA of E. coli K12 wild-type strain (KCTC1116) as a template. PCR denaturation 95°C, 30 s; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 30 times at 72°C for 1 minute, and as a result, a 795 bp DNA fragment was obtained.
  • a DNA fragment was obtained by PCR of the promoter in the same manner as in the above example using Corynebacterium glutamicum genomic DNA as a template and primers 45 and 46.
  • the constructed vector pDMC2_ ⁇ panB::panB(EC) was transformed into Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ⁇ panD::panD(TC) and CJVB5-03-1, respectively, through electroporation, and the chromosomes were transferred through a second crossover process. Strains ( ⁇ panB::panB(EC)) into which the E. coli-derived panB gene was introduced were obtained. Appropriate substitution of panB from E. coli was confirmed using the MASA (Mutant Allele Specific Amplification) PCR technique (Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993)) using the following primer combination. That is, the primer combination matching the E.
  • coli panB gene (SEQ ID NOs: 49 and 46 and SEQ ID NOS: 47 and 50) was first determined by selecting the amplified strain, and the panB gene sequence of the selected strain was SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50. Secondary confirmation was made by analysis using a primer combination.
  • Pantothenic acid production capacity of NTG-based mutant strains Pantothenic acid concentration (g/L) L-valine concentration (g/L) ATCC13032 ⁇ panD::panD(TC) ⁇ panB::panB(EC) 0.4 1.5 CJVB5-03-1 ⁇ panB::panB(EC) 0.9 0.7
  • the false rice thief A variant in which phenylalanine at position 139 of the mealworm-derived PanD protein (wild type, SEQ ID NO: 51) was substituted with a different amino acid was created and its effect was confirmed.
  • the 139th position of the PanD protein from the false robin mealworm is an important position for activity, and it was confirmed that this position is an important position that affects the production ability of pantothenic acid when substituted with another amino acid.

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Abstract

본 출원은 아스파테이트 1-디카복실레이스의 활성을 갖는 변이형 폴리펩타이드, 이를 포함하는 미생물, 상기 미생물을 포함하는 베타-알라닌 또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산용 조성물, 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 베타-알라닌 또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산 방법을 제공하며, 베타-알라닌 또는 베타-알라닌 유래 화합물의 생산능이 우수하다.

Description

거짓쌀도둑거저리 유래 아스파테이트 1-디카복실레이스의 변이체 및 이를 포함하는 미생물
관련 출원(들)과의 상호 인용
본 출원은 2022년 3월 18일자 대한민국 특허출원 제10-2022-0034233호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 대한민국 특허출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
거짓쌀도둑거저리 유래 아스파테이트 1-디카복실라아제의 변이형 폴리펩타이드, 이를 포함하는 미생물, 상기 미생물을 포함하는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산용 조성물, 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산 방법이 제공된다.
베타-알라닌(β-alanine)은 β 탄소에 아미노기가 결합하고 있는 자연적으로 생성되는 β-아미노산이다. 베타-알라닌은 가금류, 육류 및 생선과 같은 식품에서 자연적으로 발견되며, 근육에서 카르노신을 합성하는데 사용된다.
베타-알라닌과 판토텐산과 같은 베타-알라닌 유래 화합물은 건강보조식품, 식품, 제약, 동물 사료 등과 같은 다양한 산업 분야에서 적용되는 상업적으로 중요한 물질 중 하나이다.
이에, 생물공학적으로 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물을 제조하는데 유리한 효과를 갖는 미생물 및 이를 이용하여 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물을 고효율로 제조하는 기술의 개발이 요구된다.
선행기술문헌
특허문헌
(특허문헌 1) 미국 등록특허 제7718205호
본 출원은 서열번호 51의 아미노산 서열에서 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 아스파테이트 1-디카복실레이스 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드를 제공한다.
본 출원은 상기 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 출원은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 출원은 상기 변이형 폴리펩타이드 및/또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 제공한다.
본 출원은 상기 변이형 폴리펩타이드 및/또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 포함하는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원은 상기 변이형 폴리펩타이드 및/또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산 방법을 제공한다.
본 출원은 상기 미생물의 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물의 생산에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 출원은 상기 미생물의 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 출원에서는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능을 향상시킬 수 있는 아스파테이트 1-디카복실레이스 (Aspartate 1-decarboxylase, 또는 PanD 단백질) 활성을 갖는 변이형 폴리펩타이드 또는 상기 변이형 폴리펩타이드가 도입된 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능이 우수한 재조합 미생물(균주)을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 일 양상은 아스파테이트 1-디카복실레이스 활성을 갖는 변이형 폴리펩타이드를 제공할 수 있다. 상기 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로 치환을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는(또는 코딩하는) 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 폴리펩타이드의 발현 벡터로서 사용될 수 있다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 미생물을 제공한다. 상기 미생물은 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물을 생산하는 미생물일 수 있다.
다른 예는 상기 미생물을 포함하는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산 방법을 제공한다.
이하, 보다 상세히 설명한다.
폴리펩타이드
본 출원의 일 양상은 아스파테이트 1-디카복실레이스(aspartate 1-decarboxylase; 또는 PanD 단백질)의 활성을 갖는 변이형 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 아스파테이트 1-디카복실레이스 활성을 갖는 변이형 폴리펩타이드는 아스파테이트 1-디카복실레이스 단백질에 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 또는 삽입된 변이가 도입된 변이형 폴리펩타이드일 수 있다.
본 출원의 변이 도입의 대상이 되는 단백질은 아스파테이트 1-디카복실레이스 활성을 가지는 단백질일 수 있다. 상기 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI에서 그 서열을 얻을 수 있고, 구체적으로 서열번호 51의 아미노산 서열로 구성되거나 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하며 아스파테이트 1-디카복실레이스 활성을 갖는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 즉 서열번호 51의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 변이 도입의 대상이 되는 단백질에 해당될 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 변이 도입의 대상이 되는 단백질은 서열번호 51의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함될 수 있다.
일 예에서, 상기 아스파테이트 1-디카복실레이스의 활성을 갖는 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉, 트립토판(Trp, W), 히스티딘(His, H), 타이로신(Tyr, T), 알라닌(Ala, A), 시스테인(Cys, C), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 류신(Leu, L), 이소류신(Ile, I), 아르기닌(Arg, R), 리신(Lys, K), 발린(Val, V), 메티오닌(Met, M), 아스파르트산(Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 글리신(Gly, G), 아스파라긴(Asn, N), 글루타민(Gln, Q), 및 타이로신(Tyr, Y)으로 이루어지는 군에서 선택되고, 원래의 아미노산(페닐알라닌, Phe, F)과 상이한 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 아스파테이트 1-디카복실레이스의 활성을 갖는 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 염기성 아미노산 (아르기닌, 히스티딘, 또는 리신), 산성 아미노산 (아스파르트산 또는 글루탐산), 극성 아미노산 (세린, 트레오닌, 아스파라긴, 또는 글루타민), 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 타이로신, 또는 글리신으로 치환된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 아스파테이트 1-디카복실레이스의 활성을 갖는 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 트레오닌, 알라닌, 세린, 류신, 이소류신, 발린, 아스파르트산, 글리신, 히스티딘, 또는 타이로신으로 치환된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 아스파테이트 1-디카복실레이스의 활성을 갖는 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 타이로신으로 치환된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 아스파테이트 1-디카복실레이스의 변이체는 서열번호 52 내지 서열번호 61 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지거나 서열번호 52 내지 서열번호 61 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 변이형 폴리펩타이드는 아스파테이트 1-디카복실레이스 활성을 갖는 야생형 폴리펩타이드와 비교하여 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능이 증가되도록 하는 특성을 가질 수 있다.
상기 변이형 폴리펩타이드 중 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산을 제외한 일부 아미노산 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가되더라도 아스파테이트 1-디카복실레이스의 활성을 나타내는 한 본 출원의 변이형 폴리펩타이드에 포함될 수 있음은 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 및/또는 내부에 본 출원의 변이형 폴리펩타이드의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 “보존적 치환(conservative substitution)”은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩타이드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
즉, 본 출원의 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 상기 서열번호 51의 아미노산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98.2% 이상, 98.4% 이상, 98.6% 이상, 98.8% 이상, 98.9% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.3% 이상, 99.5% 이상, 99.7% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 또는 서열번호 51의 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98.2% 이상, 98.4% 이상, 98.6% 이상, 98.8% 이상, 98.9% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.3% 이상, 99.5% 이상, 99.7% 이상, 또는 99.9% 이상인 아미노산 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 일 예에서 본 출원의 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 51의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열에서 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 51의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열에서, 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서 상기 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 51의 아미노산 서열과 70% 이상 및 100% 미만, 75% 이상 및 100% 미만, 80% 이상 및 100% 미만, 85% 이상 및 100% 미만, 90% 이상 및 100% 미만, 95% 이상 및 100% 미만, 96% 이상 및 100% 미만, 97% 이상 및 100% 미만, 98% 이상 및 100% 미만, 98.2% 이상 및 100% 미만, 98.4% 이상 및 100% 미만, 98.6% 이상 및 100% 미만, 98.8% 이상 및 100% 미만, 98.9% 이상 및 100% 미만, 99% 이상 및 100% 미만, 99.1% 이상 및 100% 미만, 99.3% 이상 및 100% 미만, 99.5% 이상 및 100% 미만, 99.7% 이상 및 100% 미만 또는 99.9% 이상 및 100% 미만의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 가지거나, 상기 서열을 포함하거나, 또는 상기 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "변이형 폴리펩타이드"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이형 폴리펩타이드의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 변이형 폴리펩타이드는 일반적으로 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩타이드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이형 폴리펩타이드의 능력은 변이 전 폴리펩타이드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이형 폴리펩타이드는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이형 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 다른 변이형 폴리펩타이드는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이형 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이형 폴리펩타이드"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩타이드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상 상기 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 51의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다.
또한, 변이형 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이형 폴리펩타이드의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트될 수 있다. 또한 상기 변이형 폴리펩타이드는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드
다른 양상은 상기 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오타이드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다.
본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 51의 아미노산 서열에서 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 변이형 폴리펩타이드를 코딩하는 것일 수 있다. 또는 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 62의 뉴클레오티드 서열에서 415 내지 417번째 위치에 상응하는 코돈이 다른 아미노산을 코딩하는 코돈으로 치환된, 상기 변이형 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 52 내지 서열번호 61 중에서 선택된 어느 하나의 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 63 내지 서열번호 72 중에서 선택된 어느 하나의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 63 내지 서열번호 72 중에서 선택된 어느 하나의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이형 폴리펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이형 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 63 내지 서열번호 72 중에서 선택된 어느 하나의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 63 내지 서열번호 72 중에서 선택된 어느 하나의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서 서열번호 51에서 139번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은, 트립토판, 히스티딘, 타이로신, 알라닌, 시스테인, 프롤린, 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 리신, 발린, 메티오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 또는 타이로신을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서 서열번호 51에서 139번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은, 염기성 아미노산 (아르기닌, 히스티딘, 또는 리신), 산성 아미노산 (아스파르트산 또는 글루탐산), 극성 아미노산 (세린, 트레오닌, 아스파라긴, 또는 글루타민), 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 타이로신, 또는 글리신을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서 서열번호 51에서 139번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은, 트레오닌, 알라닌, 세린, 류신, 이소류신, 발린, 아스파르트산, 글리신, 히스티딘, 또는 타이로신을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서 서열번호 51에서 139번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은, 타이로신을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 “엄격한 조건(stringent condition)”이란 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오타이드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오타이드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, “상보적”은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오타이드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오타이드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오타이드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당 기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드("유전자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다 또는 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다 또는 표현된다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 무의미한 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 무의미한 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.
본 명세서에서 용어, ‘상동성 (homology)’ 또는 ‘동일성 (identity)’은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오타이드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오타이드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩타이드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩타이드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 52와 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 52의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 명세서에서 용어, 폴리펩타이드 활성의 “강화”는, 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성”은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩타이드의 활성을 의미한다. 이는 “변형 전 활성”과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비하여 “강화”, “상향조절”, “과발현” 또는 “증가”한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩타이드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩타이드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩타이드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩타이드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩타이드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩타이드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩타이드의 활성을 변형 전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩타이드의 강화는
1) 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩타이드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩타이드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩타이드 활성이 강화도록 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩타이드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩타이드를 코딩하도록 상기 폴리펩타이드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩타이드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩타이드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩타이드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩타이드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩타이드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩타이드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩타이드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩타이드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩타이드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩타이드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩타이드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩타이드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩타이드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩타이드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩타이드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
재조합 벡터
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 폴리펩타이드의 발현 벡터로서 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포의 유전체에 삽입 또는 숙주 세포 유전체의 대응 유전자를 대체하기 위한 것일 수 있다.
본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pTop33ori 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩타이드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 코딩하는 폴리펩타이드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
미생물
다른 양상은 상기 변이형 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 (또는 코딩하는) 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상 (예컨대 1종 이상, 2종 이상, 또는 1종, 2종, 또는 3종)을 포함하는 미생물을 제공한다. 일 예에서, 상기 미생물은 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능이 증가된(또는 향상된) 미생물일 수 있다.
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 및/또는 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 산물(예컨대, 아스파테이트 1-디카복실레이스)의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물은 상기 변이형 폴리펩타이드를 포함하거나 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 통해 유전적으로 변형된 미생물(예컨대, 재조합 미생물)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
본 출원의 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능을 가지거나 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 향상된 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물은 자연적으로 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능이 없는 미생물과 비교하여 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능이 부여되거나 향상된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능이 부여되거나 향상된 미생물은 아스파테이트 1-디카복실레이스의 활성을 갖는 변이형 폴리펩타이드가 도입된 미생물일 수 있다.
상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)이 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 증가되거나(또는 향상되거나) 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능을 갖는다는 것은, 상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 비변형 미생물, 재조합 전의 세포, 모균주, 야생형 균주, 다른 미생물(예컨대, 야생형 거짓쌀도둑거저리) 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물보다 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능이 향상되거나; 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능이 없는 비변형 미생물, 재조합 전의 세포, 모균주 및/또는 야생형 균주와는 달리 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능이 부여된 것을 의미할 수 있다.
본 출원의 미생물은 본 출원의 변이형 폴리펩타이드, 본 출원의 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물; 본 출원의 변이형 폴리펩타이드 또는 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 변형된 미생물; 본 출원의 변이형 폴리펩타이드, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 미생물 (예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 변이형 폴리펩타이드 활성을 갖는 미생물 (예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스 (Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티 (Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스 (Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내 (Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스 (Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레 (Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스 (Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼 (Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리 (Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스 (Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스 (Corynebacterium testudinoris), 및 코리네박테리움 플라베스센스 (Corynebacterium flavescens)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 미생물은 동종의 비변형 미생물과 비교하여, 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능이 향상(증가)된 것일 수 있다. 본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 일 예에 따라 본 출원의 변이형 폴리펩타이드 또는 상기 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 또는, 상기 "비변형 미생물"은 야생형 거짓쌀도둑거저리 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 “변형 전 균주”, “변형 전 미생물”, “비변이 균주”, “비변형 균주”, “비변이 미생물” 또는 “기준 미생물”과 혼용될 수 있다. 일 예에서 상기 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, 비변형 미생물은 구체적으로 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주 또는 상기 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주의 panD 대신 야생형 거짓쌀도둑거저리의 panD가 도입된 균주일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 추가적으로 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산이 증가되도록 하는 변이를 포함할 수 있고, 상기 변이의 위치 및/또는 변이 대상이 되는 유전자 및/또는 단백질의 종류는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산이 증가되도록 하는 것이면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 재조합 세포는 형질전환이 가능한 세포라면 제한 없이 사용 가능할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 미생물은 기탁번호 KCCM13077P인 것일 수 있다.
상기 베타-알라닌 유래 화합물은 β-니트로프로파노에이트(β-nitropropanoate), β-아미노-프로피오니트릴(β-amino-propionitrile), N-아세틸-β-알라닌(N-acetyl-β-alanine), L-아스파테이트(L-aspartate), 안세린(anserine), 스퍼민(spermine), 카르노신(carnosine), β-알라닐 아르기닌(β-alanyl arginine), 퀴놀리네이트(quinolinate), 판토테네이트(또는 판토텐산, pantothenate), 말로네이트 세미알데하이드(malonate semialdyhyde), 말로네이트(malonate), 아세틸린-모노카복실레이트(acetylene-monocarboxylate) 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 향상된(증가된) 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 다른 미생물 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물, 또는 야생형 거짓쌀도둑거저리 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물과 비교하여, 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 약 100% 이상, 약 110% 이상, 약 120% 이상, 약 130% 이상, 약 140% 이상, 또는 약 150% 이상 증가된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 향상된(증가된) 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 다른 미생물 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물, 또는 야생형 거짓쌀도둑거저리 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물과 비교하여, 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 약 2.0배 이상, 약 2.1배 이상, 약 2.2배 이상, 약 2.3배 이상, 약 2.4배 이상, 또는 약 2.5배 이상 증가된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 향상된(증가된) 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 다른 미생물 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물, 또는 야생형 거짓쌀도둑거저리 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물과 비교하여, 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 약 1.0 g/L 이상, 약 1.1 g/L 이상, 약 1.2 g/L 이상, 약 1.3 g/L 이상, 약 1.4 g/L 이상 또는 약 1.5 g/L 이상 증가된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로는, 상기 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 향상된(증가된) 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 다른 미생물 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물, 또는 야생형 거짓쌀도둑거저리 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물과 비교하여, 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 또는 약 150% (또는 약 2.0배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 또는 약 2.5배; 또는 약 1.0 g/L, 약 1.1 g/L, 약 1.2 g/L, 약 1.3 g/L, 약 1.4 g/L 또는 약 1.5 g/L) 증가된 것일 수 있으나 이제 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 향상된(증가된) 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 다른 미생물 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물, 또는 야생형 거짓쌀도둑거저리 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물과 비교하여, 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 (예컨대, 판토텐산) 생산능(또는 생산량)이 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 약 110% 이상, 약 120% 이상, 125% 이상, 약 130% 이상, 약 140% 이상, 또는 약 150% 이상 증가된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 향상된(증가된) 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 다른 미생물 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물, 또는 야생형 거짓쌀도둑거저리 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물과 비교하여, 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 약 1.05배 이상, 약 1.1배 이상, 약 1.15배 이상, 약 1.2배 이상, 약 1.25배 이상, 약 1.3배 이상, 약 1.35배 이상, 약 1.4배 이상, 약 1.45배 이상, 약 1.5배 이상, 약 1.55배 이상, 약 1.6배 이상, 약 1.7배 이상, 약 1.8배 이상, 약 1.9배 이상, 약 2배 이상, 약 2.1배 이상, 약 2.2배 이상, 약 2.25배 이상, 약 2.3배 이상, 약 2.4배 이상, 또는 약 2.5배 이상 증가된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 향상된(증가된) 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 다른 미생물 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물, 또는 야생형 거짓쌀도둑거저리 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물과 비교하여, 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 약 0.05 g/L 이상, 약 0.06 g/L 이상, 약 0.07 g/L 이상, 약 0.08 g/L 이상, 약 0.09 g/L 이상, 약 0.1 g/L 이상, 약 0.13 g/L 이상, 약 0.16 g/L 이상, 약 0.19 g/L 이상, 약 0.2 g/L 이상, 약 0.23 g/L 이상, 약 0.26 g/L 이상, 약 0.29 g/L 이상, 약 0.3 g/L 이상, 약 0.33 g/L 이상, 약 0.36 g/L 이상, 약 0.39 g/L 이상, 약 0.4 g/L 이상, 약 0.43 g/L 이상, 약 0.46 g/L 이상, 약 0.49 g/L 이상, 약 0.5 g/L 이상, 약 0.53 g/L 이상, 약 0.56 g/L 이상, 약 0.59 g/L 이상, 약 0.6 g/L 이상, 약 0.63 g/L 이상, 약 0.67 g/L 이상, 약 0.69 g/L 이상, 약 0.7 g/L 이상, 약 0.8 g/L 이상, 약 0.9 g/L 이상, 또는 약 1.0 g/L 이상 증가된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로는, 상기 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 향상된(증가된) 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 다른 미생물 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물, 또는 야생형 거짓쌀도둑거저리 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스가 도입된 미생물과 비교하여, 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능(또는 생산량)이 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 35%, 약 40%, 약 55%. 약 100%, 또는 약 125% (또는, 약 1.1배, 약 1.15배, 약 1.2배, 약 1.25배, 약 1.35배, 약 1.4배, 약 1.55배, 약 2배, 또는 2.25배; 또는 약 0.06 g/L, 약 0.1 g/L, 약 0.13 g/L, 약 0.16 g/L, 약 0.23 g/L, 약 0.26 g/L, 약 0.36 g/L, 약 0.5 g/L 또는 약 0.6 g/L) 증가된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어 “약(about)”은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 양상은 본 출원의 미생물, 상기 미생물을 배양한 배지, 또는 이들의 조합을 포함하는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 조성물에서, 미생물(균주), 또는 배지 등은 상기 다른 양상에서 기재한 바와 같다.
다른 양상은 본 출원의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산방법을 제공한다.
본 출원의 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산방법은 본 출원의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 본 출원의 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서, "배양"은 본 출원의 변이형 폴리펩타이드를 포함하는 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, "배지"는 본 출원의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 미생물, 예컨대 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃ 구체적으로는 25 내지 40℃ 를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산방법은, 본 출원의 미생물(균주)을 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 미생물(예컨대, 코리네박테리움 속 균주)로부터 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 본 출원 미생물의 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물의 생산 또는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 본 출원 미생물, 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 또는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산용 조성물은 전술한 바와 같다.
본 출원은 아스파테이트 1-디카복실레이스의 활성을 갖는 변이형 폴리펩타이드, 이를 포함하는 미생물, 상기 미생물을 포함하는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산용 조성물, 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산 방법을 제공하며, 상기 미생물은 베타-알라닌 및/또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산능이 우수하다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. NTG기반 인공변이법을 통한 무작위 돌연변이주 제작 및 panD 변이형 폴리펩타이드(변이체) 발현 균주 선별
본 실시예에서는 베타-알라닌의 생산능이 보다 더 향상된 미생물 변이주를 얻기 위해 거짓쌀도둑거저리 유래의 panD 유전자(아스파테이트 1-디카복실레이스(Aspartate 1-decarboxylase, 또는 PanD 단백질)를 암호화하는 유전자)가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 (ATCC13032ΔpanD::panD(TC))를 모균주로 하여 변이를 유도하였다.
ATCC13032 ΔpanD::panD(TC) 균주는 다음과 같은 방법으로 제작되었다. 먼저 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 내재적으로 존재하는 panD 유전자를 결손시키기 위한 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 73와 74 및 서열번호 75와 76의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 변성 95 ℃, 30초; 어닐링 55 ℃, 30초; 및 중합반응 72 ℃, 1분을 30회 반복하는 조건으로 수행하였다. 그 결과, panD 유전자 상단부위 1000 bp와 panD 유전자 하단부위 1000 bp의 유전자 단편을 각각 획득하였고, QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 각 증폭산물을 정제하여, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다.
제한효소 smaI으로 처리한 후 65 ℃에서 20분간 열처리한 pDCM2 (대한민국 등록 특허 번호 제2278000호)벡터와 상기 DNA 단편(panD 유전자 상단부위 1000bp의 유전자 단편 및 panD 유전자 하단부위 1000 bp의 유전자 단편)들을 몰농도 (M)가 2:1:1가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 panD 유전자를 염색체상에 결손하기 위한 벡터 pDCM2_ΔpanD를 제작하였다.
거짓쌀도둑거저리 유래의 panD 유전자를 준비하기 위하여, 거짓쌀도둑거저리로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하여 프라이머 77와 78을 이용하여 PCR하였다. PCR은 변성 95 ℃, 30초; 어닐링 55 ℃, 30초; 및 중합반응 72 ℃, 1분 30초를 30회 반복하여 수행하고, 그 결과 1640 bp의 DNA단편을 획득하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 lysC 프로모터를 확보하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 79와 80을 이용하여 프로모터를 상기 예의 방법과 동일하게 PCR하여 DNA 단편을 획득하였다. 제한효소 smaI으로 처리한 후 65 ℃에서 20분간 열처리한 pDCM2_ΔpanD 벡터와 상기 얻어진 DNA 단편들을 몰농도 (M)가 2:1:1가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써, 거짓쌀도둑거저리 유래의 panD 유전자를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2_ΔpanD::panD(TC)를 제작하였다.
제작된 벡터 pDCM2_ΔpanD::panD(TC)를 전기천공법을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에 대장균 유래 panD가 도입된 균주(ΔpanD::panD(TC))를 선별하였다. 대장균 유래 panD의 적절한 치환 여부는 하기의 프라이머 조합을 사용하여 MASA(Mutant Allele Specific Amplification) PCR 기법(Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993))을 사용하여 확인하였다. 즉, 거짓쌀도둑거저리 panD에 부합하는 프라이머 조합(서열번호 81과 80 및 서열번호 77과 82)에서는 증폭되는 균주를 선별함으로써 1차 결정하였으며, 선별된 균주의 panD 서열은 서열번호 81 및 서열번호 82의 프라이머 조합을 이용하여 분석함으로써 2차 선별을 완료하였다.
상기 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔpanD::panD(TC) 균주를 활성화 배지에서 16시간 동안 배양하여 활성화시키고, 121 ℃에서 15분간 멸균한 최소배지에 접종하여 14시간 동안 배양한 후, 배양액 5 mL을 회수하였다. 회수한 배양액을 100 mM 시트르산 완충용액(citric buffer)으로 세척한 후, NTG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 최종농도 200 mg/L가 되도록 첨가하여 20분 동안 처리하고, 100 mM 인산 완충용액(phosphate buffer)으로 세척하였다. NTG가 처리된 균주를 최소배지에 도말하여 사멸율을 측정한 결과, 사멸율은 85%로 나타났다. 생존한 세포들을 생산배지에 접종 및 배양하고, 최종적으로 가장 우수한 베타-알라닌 생산능을 나타내는 변이주를 선별하여 코리네박테리움 글루타미쿰 CJVB5-03-1 (Corynebacterium glutamicum CJVB5-03-1)로 명명하였다.
본 실시예에서 사용한 배지의 조성은 하기와 같다.
<활성화배지>
소고기 추출물 1%, 폴리펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.5%, 효모추출물 1%, 한천 2%, pH 7.2
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.4%, 황산암모늄 1.5%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.05%, 황산철7수염 10 mg/L, 황산망간1수염 6.7 mg/L, 비오틴 50 μg/L, 티아민·HCl 100 μg/L, pH 7.2
<최소배지>
포도당 1.0%, 황산암모늄 0.4%, 황산마그네슘 0.04%, 인산제1칼륨 0.1%, 요소 0.1%, 티아민 0.001%, 비오틴 200 μg/L, 한천 2%, pH 7.2
코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpanD::panD(TC)와 상기 얻어진 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJVB5-03-1의베타-알라닌 생산능을 비교하기 위하여, 생산배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바풀 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpanD::panD(TC) 균주와 CJVB5-04 변이주를 각각 접종한 후, 33 ℃에서 48시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
상기 얻어진 배양액을 20,000 rcf에서 10분동안 원심분리 후 상등액을 TDW(triple distilled water)로 1/10 희석한 후 HPLC 분석을 수행하여 베타-알라닌의 농도를 측정하고, 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.
NTG 기반 변이 균주의 베타-알라닌 생산능
베타-알라닌 농도 (g/L)
ATCC13032ΔpanD ::panD(TC) 0.5
CJVB5-03-1 1.2
그 결과, 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔpanD::panD(TC)는 0.5 g/L의 농도로 베타-알라닌을 생산하였으나, 본 출원에 따른 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJVB5-03-1은 1.2 g/L의 농도로 베타-알라닌을 생산하여, 모균주에 비해 약 2.4배(약 140% 증가) 베타-알라닌 생산성이 증가한 것을 확인하였다.
상기의 결과를 바탕으로 피루브산으로부터 베티-알라닌이 합성되는 생합성 경로에 있는 유전자들을 게놈 시퀀싱 한 결과, 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJVB5-03-1에서, 거짓쌀도둑거저리 유래의 panD 유전자에서 무작위 변위가 확인되었다.
구체적으로 거짓쌀도둑거저리의 야생형 PanD 단백질의 139번째 페닐알라닌(F)을 코딩하는 서열이 타이로신(Y)을 코딩하는 서열로 변이되었음을 확인하였다. 변이형 PanD (F139Y, 거짓쌀도둑거저리 유래의 야생형 PanD (서열번호 51)의 139번째 F(페닐알라닌)가 Y(타이로신)로 변이됨) 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 52로 나타내었다.
상기의 결과로 무작위 돌연변이법을 통해 얻어진 변이주가 베타-알라닌을 고효율 및 고수율로 생산할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 아스파테이트 1-디카복실레이스 변이형 폴리펩타이드의 판토텐산 생산능 확인
실시예 1에서 거짓쌀도둑거저리의 아스파테이트 1-디카복실레이스 변이형 폴리펩타이드의 베타-알라닌 생산능이 증가한 것을 확인하였다. 추가적으로, 거짓쌀도둑거저리의 아스파테이트 1-디카복실레이스 활성을 갖는 변이형 폴리펩타이드의 판토텐산 생산능을 확인하기 위하여 3-메틸-2옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼레이스(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase, PanB)의 활성이 강화된 미생물을 제작하였다.
먼저, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 존재하는 내재적 panB 유전자(3-메틸-2옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼레이스(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase, 또는 PanB 단백질)를 암호화하는 유전자)를 결손시키기 위한 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 41와 42 및 서열번호 43와 44의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 변성 95 ℃, 30초; 어닐링 55 ℃, 30초; 및 중합반응 72 ℃, 1분을 30회 반복하는 조건으로 수행하였다. 그 결과, panB 유전자 상단부위 1,000 bp와 panB 유전자 하단부위 1,000 bp의 유전자 단편을 각각 획득하였고, QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 각 증폭산물을 정제하여, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다.
제한효소 smaI으로 처리한 후 65 ℃에서 20분간 열처리한 pDCM2 (대한민국 등록 특허 번호 제2278000호) 벡터와 DNA 단편(panB 유전자 상단부위 1,000 bp의 유전자 단편 및 panB 유전자 하단부위 1,000 bp의 유전자 단편)을 몰농도 (M) 2:1:1이 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 panB 유전자를 염색체상에 결손하기 위한 벡터 pDMC2_ΔpanB를 제작하였다.
대장균 유래 panB 유전자를 준비하기 위하여, 대장균 K12 야생형 균주(KCTC1116)의 게놈 DNA을 주형으로 하여 프라이머 47와 48를 이용하여 PCR하였다. PCR은 변성 95 ℃, 30초; 어닐링 55 ℃, 30초; 및 중합반응 72 ℃, 1분을 30회 반복하여 수행하고, 그 결과 795 bp의 DNA 단편을 획득하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 lysC 프로모터를 확보하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 45와 46를 이용하여 프로모터를 상기 예의 방법과 동일하게 PCR하여 DNA 단편을 획득하였다. 제한효소 smaI으로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pDMC2_ΔpanB 벡터와 상기 얻어진 DNA 단편들을 몰농도 (M) 2:1:1가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써, 대장균 유래의 panB 유전자를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDMC2_ΔpanB::panB(EC)를 제작하였다.
제작된 벡터 pDMC2_ΔpanB::panB(EC)를 전기천공법을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔpanD::panD(TC) 및 CJVB5-03-1에 각각 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에 대장균 유래 panB 유전자가 도입된 균주(ΔpanB::panB(EC))를 각각 얻었다. 대장균 유래 panB의 적절한 치환 여부는 하기의 프라이머 조합을 사용하여 MASA(Mutant Allele Specific Amplification) PCR 기법(Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993))을 사용하여 확인하였다. 즉, 대장균 panB 유전자에 부합하는 프라이머 조합(서열 49와 46 및 서열번호 47와 50)에서는 증폭되는 균주를 선별함으로써 1차 결정하였으며, 선별된 균주의 panB 유전자 서열은 서열번호 49 및 서열번호 50의 프라이머 조합을 이용하여 분석함으로써 2차 확인하였다.
제작된 균주는 판토텐산 생산성을 확인하기 위해 상기 실시예와 같은 조성으로 이뤄진 생산배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 균주들을 각각 접종한 후, 33 ℃에서 48시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 판토텐산을 제조하고, 그 결과를 아래 표 2에 나타내었다.
NTG 기반 변이 균주의 판토텐산 생산능
판토텐산 농도 (g/L) L-valine농도 (g/L)
ATCC13032ΔpanD::panD(TC) ΔpanB::panB(EC) 0.4 1.5
CJVB5-03-1ΔpanB::panB(EC) 0.9 0.7
그 결과 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔpanD::panD(TC)ΔpanB::panB(EC)은 0.4 g/L의 농도로 판토텐산을 생산하였으나, 본 출원에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 CJVB5-04 ΔpanB::panB(EC)은 0.9 g/L의 농도로 판토텐산을 생산하여, 모균주에 비해 약 2.25배(약 125% 증가) 판토텐산 생산성이 증가한 것을 확인하였다. 상기의 결과는 본 출원에서 거짓쌀도둑거저리 유래의 아스파테이트 1-디카복실레이스 변이형 폴리펩타이드가 베타-알라닌뿐만 아니라 판토텐산도 보다 더 효율적으로 생산할 수 있음을 의미한다.
실시예 3. 아스파테이트 1-디카복실레이스 활성을 갖는 변이형 PanD 발현 벡터 제작
실시예 1에서 확인한 바와 같이, 거짓쌀도둑거저리 유래의 PanD 단백질(야생형, 서열번호 51)의 139번째 위치에 상응하는 위치가 변이되는 것이 베타-알라닌 생산능 증가에 중요한 것임을 확인하기 위하여 거짓쌀도둑거저리 유래의 PanD 단백질(야생형, 서열번호 51)의 139번째 위치의 페닐알라닌이 다른 아미노산으로 치환된 변이형을 제작하여 그 효과를 확인하였다.
야생형 거짓쌀도둑거저리 panD 유전자를 주형으로 표 3의 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 수행하여 아스파테이트 1-디카복실레이스(Aspartate 1-decarboxylase)를 암호화하는 DNA 단편을 증폭하였다. 상기 PCR은 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하여 수행하였으며, 변성 95 ℃, 30초; 어닐링 55 ℃, 30초; 및 중합반응 72 ℃, 1분을 30회 반복하는 조건으로 수행하였다. 그 결과 아스파테이트 1-디카복실레이스를 암호화하는 유전자의 변이(PanD 단백질의 139번 잔기를 암호화하는 코돈의 변이)를 중심으로 5' 상류 부위의 430 bp DNA 단편과 3' 하류 부위의 1224 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 PLM1 프로모터를 확보하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC13032) 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 39와 40의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 바와 동일하게 PCR을 수행하여, 프로모터 DNA 단편을 획득하였다.
Saturated mutagenesis를 위한 프라이머 리스트
변이 플라스미드 치환 아미노산 프라이머 서열번호
tcpanD F139H 서열번호 1, 5 / 6, 4
F139T 서열번호 1, 7 / 8, 4
F139A 서열번호 1, 9 / 10, 4
F139S 서열번호 1, 15 / 16, 4
F139L 서열번호 1, 17 / 18, 4
F139I 서열번호 1, 19 / 20, 4
F139V 서열번호 1, 25 / 26, 4
F139D 서열번호 1, 29 / 30, 4
F139G 서열번호 1, 33 / 34, 4
F139Y 서열번호 1, 83 / 84, 4
WT (서열번호 51) 서열번호 1, 4
제한효소 BamHI으로 처리한 후, 65 ℃에서 20분간 열처리한 pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 얻어진 DNA단편들 (각 panD, PLM1 프로모터)을 몰농도 (M) 2:1:1:1 (pECCG117 벡터 : panD 상류부위 : panD 하류부위 : 프로모터)이 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고, 상기 획득된 11종의 플라스미드의 이름과 도입된 유전자 정보를 표 4에 표기하였다.
139번째 아미노산 변이 벡터 리스트
변이 위치 아미노산 치환 아미노산 치환을 유도하도록 제작된 변이 플라스미드
야생형 tcpanD(서열번호 51)의 139번째 아미노산 잔기 F139H pECCG117-panD(F139H)
F139T pECCG117-panD(F139T)
F139A pECCG117-panD(F139A)
F139S pECCG117-panD(F139H)
F139L pECCG117-panD(F139L)
F139I pECCG117-panD(F139I)
F139V pECCG117-panD(F139V)
F139D pECCG117-panD(F139D)
F139G pECCG117-panD(F139G)
F139Y pECCG117-panD(F139Y)
WT (서열번호 51) pECCG117-panD(WT)
실시예 4. 변이형 PanD의 판토텐산 생산능 평가실시예 3에서 제작된 변이 플라스미드 10종과 pECCG117-panD(WT)을 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔpanB::panB(EC) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신 25 mg/L를 함유하는 선별배지에서 도말하여 각각의 형질전환주를 획득하였다. 그 후, 실시예 2과 동일한 방법으로 플라스크 평가를 진행하였고, 그 결과는 다음 표 5와 같다.
Saturated mutagenesis가 도입된 균주의 판토텐산 생산능
균주 판토텐산 (g/L)
배치1 배치2 배치3
ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC) 0.0 0.0 0.0
ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC)pECCG117- panD(F139T) 0.9 0.9 1.0
ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC)pECCG117- panD(F139A) 0.8 0.7 0.8
ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC)pECCG117- panD(F139S) 0.9 0.9 0.9
ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC)pECCG117- panD(F139L) 0.7 0.8 0.7
ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC)pECCG117- panD(F139I) 1 1 0.8
ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC)pECCG117- panD(F139V) 0.7 0.8 0.9
ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC)pECCG117- panD(F139D) 0.7 0.8 0.7
ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC)pECCG117- panD(F139G) 0.9 0.7 0.9
ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC)pECCG117- panD(F139H) 1.1 1 1
ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC)pECCG117- panD(F139Y) 1.4 1.3 1.3
ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC)pECCG117-panD(WT) 0.7 0.7 0.6
상기의 표 5에서 볼 수 있듯이, 야생형 panD를 도입한 균주 (ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC) pECCG117-panD(WT)) 및 변이형 panD를 도입한 균주는 모두 판토텐산 생산능이 증가하였다.
특히, 야생형 PanD 단백질의 139번째 아미노산이 타이로신으로 변이된 변이형 PanD를 발현하는 변이주를 포함해 총 10종의 변이주(F139T, F139A, F139S, F139L, F139I, F139V, F139D, F139G, F139H, F139Y)에서 각각 야생형 PanD 단백질을 발현하는 균주보다 높은 수준으로 판토텐산을 생성하는 것을 확인하였고, 그 중 1종의 변이주(F139Y)는 야생형보다 2배 이상 높은 판토텐산을 생산하였다. 이와 같은 결과로 거짓도둑쌀거저리 유래의 PanD 단백질의 139번째 위치가 활성에 중요한 위치임을 확인할 수 있었으며 상기 위치가 다른 아미노산으로 치환될 경우 판토텐산의 생산능에 영향을 미치는 중요 위치임을 확인할 수 있었다.
본 실시예에서 판토텐산 생상능이 가장 우수한 것으로 확인된 ATCC 13032 ΔpanB ::panB(EC) pECCG117-panD(F139Y)균주 (Corynebacterium glutamicum CV03-5004로 명명)를 2021년 11월 23자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제동에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁하여 KCCM13077P의 기탁번호를 부여받았다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터
수탁번호 : KCCM13077P
수탁일자 : 20211123
Figure PCTKR2023003572-appb-img-000001

Claims (12)

  1. 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 아스파테이트 1-디카복실레이스 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 트립토판, 히스티딘, 타이로신, 알라닌, 시스테인, 프롤린, 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 리신, 발린, 메티오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 또는 타이로신으로 치환된, 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 트레오닌, 알라닌, 세린, 류신, 이소류신, 발린, 아스파르트산, 글리신, 히스티딘, 또는 타이로신으로 치환된, 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 51의 아미노산 서열과 70% 이상 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖는, 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 아스파테이트 1-디카복실레이스 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 베타-알라닌 또는 베타-알라닌 유래 화합물의 생산능이 증가된, 미생물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물인, 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, 미생물.
  10. 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 아스파테이트 1-디카복실레이스 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 포함하는,
    베타-알라닌 또는 베타-알라닌 유래 화합물 생산용 조성물.
  11. 서열번호 51의 아미노산 서열의 139번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 아스파테이트 1-디카복실레이스 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 베타-알라닌 또는 베타-알라닌 유래 화합물의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 배양하는 단계 이후에, 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 베타-알라닌 또는 베타-알라닌 유래 화합물을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 베타-알라닌 또는 베타-알라닌 유래 화합물의 생산 방법.
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