KR20210146670A

KR20210146670A - 신규 l-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-타이로신을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20210146670A
Application number: KR1020200063778A
Authority: KR
Inventors: 김현아; 김희정; 정무영; 서창일; 송규현
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2021-12-06
Also published as: BR112022023964A2; JP2023527830A; JP7547511B2; EP4144848A4; WO2021242032A1; EP4144848A1; JP2024112996A; CN116472352A; KR102647745B1; US20230272441A1

Abstract

본 출원은 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체, 이를 발현하는 미생물 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

신규 L-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-타이로신을 생산하는 방법 {Novel L-tyrosine exporter variant and the method of producing L-tyrosine using the same}

본 출원은 L-타이로신 배출 활성을 갖는 신규한 단백질 변이체 및 상기 단백질 변이체를 포함하는 L-타이로신을 생산하는 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-타이로신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-타이로신은 아미노산의 하나로써, 약품 원료와 식품 첨가제, 동물 사료, 영양제 등의 중요 소재로 사용된다. 상기 L-타이로신 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다.

미생물의 L-타이로신 생산 과정은 5탄당 회로의 중간 물질인 E4P(Erythrose-4-Phosphate)와 해당과정(glycolysis)의 중간 물질인 PEP(Phosphoenolpyruvate)가 중합 반응하여 만들어지는 DAHP(3-Deoxy-D-arobino-heptulosonate-7-phosphate)로부터 시작된다. 이후 DAHP는 방향족 공통 생합성 경로를 거쳐 코리스믹산(chorismate)에서 프레펜산(prephenate)을 거쳐 L-타이로신 생합성 경로를 통해 최종적으로 L-타이로신으로 전환된다.

한편, 특정 아미노산 배출 유전자의 발현은 미생물에서 해당 아미노산의 생산성 향상을 야기하여 왔다. 코리네박테리움 속 미생물의 L-라이신 배출유전자 (lysE)의 발현 강화는 라이신의 생산성을 향상시켰다 (US 6858406 B1). 또한 대장균에서 rhtC 유전자의 강화는 L-쓰레오닌 (L-threonine)에 대한 내성을 향상시켰으며, 동시에 L-호모세린, L-쓰레오닌, L-류신의 생산성이 향상되었다 (EP1013765A1). 대장균에서 기능이 공지되지 않은 유전자들, yahN 유전자, yeaS 유전자, yfiK 유전자 그리고 yggA 유전자를 강화시킴으로써 L-글루타민산, L-라이신, L-쓰레오닌, L-알라닌, L-히스티딘, L-프롤린, L-아르기닌, L-발린 및 L-이소류신의 생산성이 향상되었다는 특허(EP1016710B1)도 개시되어 있다.

하지만 현재 L-타이로신에 특이성을 보이는 배출 단백질은 보고된 바 없다. 방향족 아미노산의 배출 단백질로 대장균의 yddG 유전자가 알려져 있지만, L-타이로신이나 L-트립토판보다 L-페닐알라닌에 높은 특이성을 보인다 (FEMS Microbiol Lett 275 (2007) 312-318). 또한 L-아미노산 발효의 생산 균주로서 주로 이용되는 코리네박테리움 속 미생물에서는 L-타이로신 또는 방향족 아미노산 배출 유전자가 전혀 보고된 바 없다. (J Ind Microbiol Biotechnol. 2015 May;42(5):787-97)

이러한 배경하에서, 본 출원에서는 신규 L-타이로신 배출 단백질 변이체를 도입하여 L-타이로신 생산량이 획기적으로 향상됨을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원은 서열번호 52의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 출원은 상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 하나 이상을 포함하여 L-타이로신을 생산하는 미생물을 제공한다.

본 출원은 상기 미생물을 배양하는 것을 포함하는 L-타이로신 생산 방법을 제공한다.

본 출원은 상기 단백질 변이체, 상기 폴리뉴클레오티드; 상기 벡터 및 상기 미생물 중 어느 하나 이상을 포함하는 L-타이로신 생산용 조성물을 제공한다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.

본 출원의 하나의 양태는 서열번호 52의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 제공한다.

상기 단백질 변이체는 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체일 수 있다.

본 출원의 용어 "L-타이로신(L-Tyrosine)"은 20개 α-아미노산 중 하나로써, 극성 아미노산(polar amino acid) 또는 방향족 아미노산으로 분류될 수 있다. 타이로신은 의약품이나 플라보노이드, 알카노이드 등의 전구체로 사용되는 상업적으로 중요한 아미노산이다.

본 출원에서 "L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질"은 특이적으로 L-타이로신을 세포 밖으로 배출할 수 있는 활성을 가지는 단백질일 수 있다.

본 출원의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체는 허바스필리움 리조스페레 (Herbaspirillum rhizosphaerae) 유래의 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질로부터 유래하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

여기서, "허바스필리움 리조스페레 (Herbaspirillum rhizosphaerae)"란 허바스필리움 속에 속하는 그람 음성 박테리아로, 국내에서는 울릉도 등에서 분리된 균주로, 토양 내 근권 (rhizosphere)에서 분리될 수 있다.

상기 허바스필리움 리조스페레 (Herbaspirillum rhizosphaerae)유래의 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질은 예를 들면, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 상기 서열번호 52의 아미노산 서열과 동일한 활성을 갖고 있으며 서열번호 52의 79번째 위치에 상응하는 서열이 야생형이 아닌 본 출원의 다른 아미노산으로 치환되어 L-타이로신 배출능을 갖게될 수 있는 서열은 79번 위치에 상응하는 잔기의 아미노산 변이가 일어나는 대상 단백질로 그 유래에 제한 없이 본 출원의 범위에 포함됨은 자명하다. 상기 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 52의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 52의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 혼용되어 사용될 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 변이체일 수 있다.

상기 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 L-트립토판 배출 활성을 가지는 단백질로, 본 출원에 이르러 상기 단백질의 79번째 위치에 상응하는 아미노산을 변이시킨 변이체가 L-타이로신 배출 활성을 가진다는 것을 새롭게 규명하였다.

본 출원에서 서열번호 52의 아미노산을 포함하는 단백질은, 본 출원의 변이를 도입할 수 있는 단백질 중 대표적인 예로서, 서열번호 52의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원에서 변이를 도입할 수 있는 단백질에 속한다.

예를 들어, 본 출원에서 변이를 도입할 수 있는 단백질은 서열번호 52의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, '서열번호 52의 아미노산 서열로 이루어진 단백질'은, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 단백질'에 속할 수 있음은 자명하다.

본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열 (the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다. 변이체는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)와 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질 (mature protein) 의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이형 폴리펩티드, 변이, 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상, 상기 변이체는 천연의 야생형 또는 비변형 단백질 대비 변이된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.

예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged side chain)을 갖는 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함하는 것으로 분류할 수 있다.

또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.

본 출원에서 제공하는 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체는, 상기에서 설명한 단백질 중 특이적 위치 또는 이에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어, 단백질의 L-타이로신 배출 활성이 변이 전 단백질 대비 100%를 초과되는 변이체를 의미할 수 있다.

본 출원에서, '다른 아미노산으로 치환'은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다 즉, 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산인 류신이 "류신 이외의 아미노산"으로 치환되는 것을 "서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는" 것으로 표현할 수 있다. 한편, 본 출원에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.

본 출원의 단백질 변이체는, 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 본 출원의 단백질 변이체는 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 알라닌, 글리신, 이소류신, 메티오닌, 세린, 프롤린, 쓰레오닌, 타이로신, 아스파라긴, 아르기닌 또는 트립토판으로 치환된 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 본 출원의 단백질 변이체는 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 알라닌, 글리신, 이소류신, 메티오닌, 쓰레오닌, 타이로신, 아스파라긴, 아르기닌 또는 트립토판으로 치환된 변이체 일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 단백질 변이체는 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 알라닌 또는 글리신으로 치환된 변이체 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.

이와 같은 본 출원의 단백질 변이체는 변이 전 단백질에 비해 강화된 L-타이로신 배출능을 갖는다.

본 출원의 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체는, 서열번호 52의 아미노산 서열의 N 또는 C 말단, 또는 중간의 아미노산 결실/부가/삽입 등에 의해 79번이 아닌 다른 위치로 기재되는 경우라고 하더라도, 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 포함하는 것은 자명하다.

또한, 본 출원에서 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질로서 서열번호 52의 N-말단으로부터 79번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 기재하였으나, 본 출원의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체는 서열번호 52의 변이체에 제한되지 않고, 그 밖에 서열번호 52의 아미노산 서열과 동일한 활성 혹은 L-타이로신 배출 활성을 가지는 임의의 아미노산 서열에서 "서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산"이 다른 아미노산으로 치환되어 L-타이로신 배출 활성을 가지는 변이체 역시 본 출원의 단백질 변이체의 범위에 포함되는 것은 자명하다.

임의의 아미노산 서열 내에서 "서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산" 은, 당업계에 공지된 다양한 서열 얼라인먼트(alignment) 방법을 통해 확인할 수 있다.

본 출원의 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체는, 서열번호 52의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질일 수 있다.

본 출원의 단백질 변이체는, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 77 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 77 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 77 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 단백질 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 77 내지 83 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 다른 구현예로 본 출원의 단백질 변이체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 단백질 변이체는, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84 및 서열번호 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 출원의 단백질 변이체는, 서열번호 1, 2, 서열번호 77 내지 83 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 출원의 단백질 변이체는, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.

한편 본 출원의 단백질 변이체는 전술한 서열번호의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되거나, 전술한 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 단백질 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 77 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 79번째 아미노산은 고정되고, 이와 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 79번 위치 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위에 포함됨은 자명하다.

상동성(homology) 및 동일성(identity)은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.

용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

본 출원의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, L-타이로신 배출능을 갖는 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.

본 출원에서 변이 대상이 되는 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 wex 유전자일 수 있으며, 허바스필리움 리조스페레 유래일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 52의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 서열번호 52의 아미노산 서열에서 79번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 단백질 변이체, 구체적으로는 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 77 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 상동성 또는 동일성에 대해서는 전술한 바와 같다.

또한, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여 서열번호 52의 아미노산 서열의 79번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 코딩하는 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니며, 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)..

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하여, L-타이로신을 생산하는 미생물을 제공한다.

상기 L-타이로신을 생산하는 미생물은, 야생형의 서열번호 52을 포함하는 미생물에 비하여, 상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하여 L-타이로신 생산능이 증대된 미생물일 수 있다.

상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물은, L-타이로신 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어 "L-타이로신을 생산하는 미생물" 또는 "L-타이로신 생산능을 가지는 미생물"은 자연적으로 타이로신 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 타이로신 생산능이 없는 모균주에 타이로신 생산능이 부여된 미생물일 수 있다.

상기 미생물은 배지 중의 탄소원으로부터 L-타이로신을 야생형이나 비변형 미생물과 비교하여 과량으로 생산할 수 있는 미생물일 수 있다. 또한, 상기 L-타이로신을 생산하는 미생물은 재조합 미생물일 수 있다. 구체적으로 상기 미생물은 L-타이로신을 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있다. 보다 구체적으로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 보다 구체적으로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물일 수 있고, 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

보다 더욱 구체적으로는 에스케리키아속(Escherichia) 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있으며, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질이 도입 또는 강화되어 L-타이로신 생산량이 증가될 수 있는 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물은 제한 없이 포함될 수 있다.

본 출원의 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하여 L-타이로신을 생산하는 미생물은, 본 출원의 단백질 변이체를 발현하는 미생물일 수 있다.

본 출원에서 용어, 단백질이 "발현되도록/되는"은 목적 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미한다. 상기 목적 단백질이 미생물 내 존재하는 단백질인 경우 내재적 또는 변형전에 비하여 그 활성이 강화된 상태를 의미한다.

본 출원의 단백질 변이체를 발현하는 미생물은 단백질 변이체를 발현하도록 변형된 미생물일 수 있고, 따라서 본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 단백질 변이체를 발현하는 미생물의 제조 방법을 제공한다.

본 출원의 목적상 "목적 단백질"은 전술한 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체일 수 있다.

구체적으로, "단백질의 도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다. 또한, "활성의 강화"는 미생물이 가진 특정 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.

구체적으로, 본 출원의 활성 강화는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가, 상기 단백질 변이체를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 암호화하는 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 염색체상의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 자연형 단백질을 코딩하는 유전자를 상기 단백질 변이체를 암호화하는 유전자로 대체하는 방법, 상기 단백질 변이체의 활성이 강화되도록 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법, 및 미생물에 단백질 변이체를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기에서 유전자의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.

다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 프로모터가 연결될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, P_L 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터 (대한민국 등록특허 제 10-1783170호), O2 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1632642), tkt 프로모터 및 yccA 프로모터 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.

이와 같은 단백질 활성의 도입 및 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 비변형 미생물 균주에서의 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, “비변형 균주"는 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 균주"는 "비변이 균주", "변형 전 균주","변형 전 미생물","비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다. 일 구현예로 상기 비변형 미생물은 본 출원의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 포함하지 않는 균주일 수 있다.

본 출원의 미생물은 타이로신 생산능을 가지는 천연형 미생물 자체, 타이로신 생산 기작과 관련된 유전자의 활성을 강화시키거나 불활성시켜 향상된 타이로신 생산능을 가지게 된 미생물, 또는 외부유전자의 활성을 도입 또는 강화시켜 향상된 타이로신 생산능을 가지게 된 미생물일 수 있다.

본 출원의 미생물에 L-타이로신 생산능을 부여하거나, 생산능을 증가시키기 위해, E4P(Erythrose-4-Phosphate)와 같은 전구체의 지속적인 공급, 에너지의 효율적 이용을 위한 변형, 생합성 경로에서의 곁가지 경로를 차단시켜 생합성을 증가시키는 방법 또는 ATP를 적게 사용하는 변형 등을 사용할 수 있다.

구체적으로 본 출원에서 상기 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체 발현되도록 변형된 L-타이로신을 생산하는 미생물의 모균주는, L-타이로신을 생산하는 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다. L-타이로신을 생산하는 미생물은 L-타이로신 생합성 경로를 강화하기 위하여, 경쟁경로의 유전자, L-타이로신 오페론의 방향성 경로의 조절자, L-타이로신 유입유전자, L-타이로신 유입 및 분해 유전자의 활성의 약화 또는 불활성화 시키거나, 및/또는 L-타이로신 오페론의 활성을 조절한 미생물일 수 있다.

미생물 변형의 예를 들면, 방향족 아미노산 유입 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화 또는 제거될 수 있고 (예를 들어, aroP 활성 약화/제거), 피드백 조절에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들면 tyrA, aroG)에 변이를 도입하여 피드백을 해제시킬 수 있다. 또한, 전구체 공급에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들어, tkt 유전자)의 발현을 강화시킬 수 있다. 또한, 경쟁 경로의 유전자 (예를 들어 pheA) 의 활성을 내재적 활성에 비해 약화 또는 제거, 혹은 변경 (예를 들어, L-트립토판 농도 의존적으로 변경) 시킬 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하는 것을 포함하는, L-타이로신의 생산 방법을 제공한다.

상기 단백질 변이체, 단백질의 발현, 및 미생물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

배지의 온도는 20℃ 내지 50℃, 구체적으로는 30℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 L-타이로신을 회수하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

상기 타이로신을 회수하는 것은 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 목적하는 L-타이로신을 회수할 수 있다. 예컨대 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 생산방법은, 추가적인 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제공정은 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 회수된 L-타이로신을 정제할 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 상기 단백질 변이체를 발현하는 미생물 중 어느 하나 이상을 포함하는, L-타이로신 생산용 조성물을 제공한다.

단백질 변이체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 출원의 조성물은 상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 또는 상기 단백질 변이체를 발현하는 미생물을 이용하여 L-타이로신을 생산할 수 있는 추가적인 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 예를 들어, 미생물 발효용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제 또는 배지의 구성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 단백질 변이체를 발현하는 미생물은 이를 발현하지 않는 모균주에 비하여 L-타이로신 생산량이 획기적으로 향상시킬 수 있으므로, 이를 이용하여 L-타이로신을 효과적으로 생산할 수 있다.

이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: L-타이로신 생산 균주 제작

야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-타이로신을 생산하는 능력은 있으나, 배양액으로 배출할 만큼 과량 생산하지는 않는다. 본 출원의 목적에 따라 L-타이로신 생산능을 증가시키는 유전형질을 확인하기 위하여, 야생형 균주보다는 L-타이로신 생산능이 증가된 균주를 활용하였다. 따라서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주에 L-타이로신을 생산하는데 필요한 유전자들을 강화하여 L-타이로신 생산 균주를 제작 하였다.

먼저, L-타이로신의 전구체로서 E4P(Erythrose-4-Phosphate)의 원활한 공급을 위해 tkt 유전자의 과발현을 진행하였다. 이와 동시에 L-타이로신을 세포 내부로 유입하는 방향족 아미노산 유입 유전자인 aroP의 결손을 진행하였다.

상기 유전자 조작을 위해 우선 tkt 유전자를 대체 삽입할 aroP 다운스트림 (Downstream) 과 업스트림 (Upsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 3와 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 aroP 다운스트림 (Downstream) 지역을, 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 업스트림 (Upsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

또한, tkt 프로모터를 포함한 tkt 유전자를 확보하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 7와 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 150초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

증폭된 aroP 프로모터 업스트림과 다운스트림 지역, tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자 단편, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ(특허등록 제10-0924065호) 는 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔaroP::Pn-tkt로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.

상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

서열번호	서열(5'-3')
3	TCGAGCTCGGTACCCTGGGAACTTGTCGACGCTAT
4	TGTTCGGCAAGCATTGTGGTGTGGGCAATGATCAC
5	ATTAACGGTTAAAGTACTCATTGTGAGGTGGCGGG
6	CTCTAGAGGATCCCCGGAGCTGCTGTCCAACGTGG
7	CCACACCACAATGCTTGCCGAACATTTTTCTTTTC
8	CACAATGAGTACTTTAACCGTTAATGGAGTCCTTG

제작된 pDZ-ΔaroP::Pn-tkt 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 aroP 유전자를 결손하는 동시에 tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 9과 서열번호 10의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0001로 명명하였다.

서열번호	서열(5'-3')
9	ACGCGCCAAGTCGGACG
10	CGCACGATGTTTACCTGCG

L-타이로신 경로를 강화하기 위해서, 기존에 코리네박테리움 글루타미쿰이 가지고 있는 L-타이로신에 의한 피드백 조절을 받는 tyrA 유전자를 강한 프로모터인 gapA 프로모터를 포함한 대장균 유래의 피드백 조절을 받지 않는 변이형 tyrA로 교체하였다. 대장균 유래 tyrA 단백질은 53번 메티오닌(Methionine)이 이소류신(Isoleucine)으로, 354번 알라닌(Alanine)이 발린(Valine)으로 변이되면 피드백이 해제되는 것으로 알려져 있고 이 형태 (서열번호 11)를 사용하였다 (Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 103-110 (2007)).

상기 유전자 조작을 위해 우선 tyrA 유전자를 교체 삽입할 tyrA 업스트림 (Upstream) 과 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 12과 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 tyrA 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 14와 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

또한, gapA 프로모터를 포함한 대장균 유래 변이 tyrA 유전자를 확보하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 16과 서열번호 17의 프라이머를 이용하여 gapA 프로모터 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였고, 대장균 유래 변이 tyrA 합성 DNA를 주형으로 하여 서열번호 18와 서열번호 19의 프라이머를 이용하여 대장균 유래 변이 tyrA 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다.

중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

증폭된 tyrA 업스트림과 다운스트림 지역, gapA 프로모터를 포함하는 대장균 유래 변이 tyrA 유전자 단편, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ 는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm 으로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.

상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.

서열번호	서열(5'-3')
12	TTCGAGCTCGGTACCCTATCAAAACCGAGTTCTTCC
13	GTCGTTTTTAGGCCTCCTGACAAGTGTGGCACATAC
14	TGACAATCGCCAGTAATTTTATCGGCTGATGATTCT
15	ACTCTAGAGGATCCCCAACGCGATTGCATTCGGCTC
16	GTGCCACACTTGTCAGGAGGCCTAAAAACGACCGAG
17	TCAATTCAGCAACCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGAT
18	TTAGAGGAGACACAACATGGTTGCTGAATTGACCGC
19	TCATCAGCCGATAAAATTACTGGCGATTGTCATTCG

제작된 pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm 벡터를 CM06-0001 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 tyrA 유전자를 결손하는 동시에 gapA 프로모터를 포함하는 대장균 유래 변이 tyrA 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 20과 서열번호 21의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0002 로 명명하였다.

서열번호	서열(5'-3')
20	GCCCACTAGTCGAATCCC
21	CTGTCCGCAACCTGTGCG

L-타이로신 생산을 늘리기 위해 방향족 공통 생합성 경로의 첫 단계인 aroG 유전자를 대장균 유래 피드백 조절 해제 변이형 aroG에 강한 프로모터를 추가하여 강화하였다. 대장균 유래 aroG 단백질은 150번 프롤린(Proline)이 루이신(Leucine)으로 치환될 경우 피드백이 해제되는 것으로 알려져 있으며, 이 형태 (서열번호 22)를 사용하였다 (Appl. Environ. Microbiol. 63, 761-762 (1997)).

이러한 유전자 조작을 위해 우선 aroG 유전자를 추가 삽입할 업스트림 (Upstream)과 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 23와 서열번호 24의 프라이머를 이용하여 BBD29_14470유전자의 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 25와 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

증폭된 변이형 aroG를 추가 삽입할 업스트림과 다운스트림 지역, SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔBBD29_14470 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.

또한, gapA 프로모터를 포함한 대장균 유래 변이형 aroG 유전자를 확보하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 27와 서열번호 28의 프라이머를 이용하여 gapA 프로모터 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였고, 대장균 유래 피드백 해제 변이형 aroG 합성 DNA를 주형으로 하여 서열번호 29와 서열번호 30의 프라이머를 이용하여 변이형 aroG 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

증폭된 gapA 프로모터를 포함하는 변이형 aroG 유전자 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ-ΔBBD29_14470 는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm 으로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.

상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.

서열번호	서열(5'-3')
23	TCGAGCTCGGTACCCCCCGGCGGTATCGAGGTAGT
24	GACAAGTTTAGTACTTTAATCACCCGCGGGGACCC
25	GGTGATTAAAGTACTAAACTTGTCCCGAGGGTGAG
26	CTCTAGAGGATCCCCTATCAGTCACTTCCCTGAGA
27	GCGGGTGATTAAAGTGAGGCCTAAAAACGACCGAG
28	GTTCTGATAATTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGAT
29	ATGAATTATCAGAACGACGA
30	CGGGACAAGTTTAGTTTACCCGCGACGCGCTTTTA

제작된 pDZ-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm 벡터를 CM06-0002 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 gapA 프로모터를 포함하는 대장균 유래 피드백 해제 변이형 aroG 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 31과 서열번호 32의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0003로 명명하였다.

서열번호	서열(5'-3')
31	TTGATATGACCGCAGCCTGA
32	CTGCATTCTCATCGATCTTG

방향족 공통 생산 경로를 강화하였을 때, 늘어난 코리스메이트 pool에서 경쟁경로인 L-페닐알라닌을 생산을 최소화 할 때 가장 L-타이로신과 L-트립토판의 생산이 증가할 것으로 예상할 수 있다. 하지만 경쟁경로의 pheA 유전자를 결손하게 되면 L-페닐알라닌 생산이 불가능해지면서 L-페일알라닌에 대한 요구성이 부여되기 때문에 낮은 농도로 유지하면서 균체의 성장에 영향이 없도록 L-트립토판 조절 기작을 이용하기로 하였다.

L-트립토판은 배양시에 항시 낮은 농도로 유지되면서도 균체의 성장에는 지장이 없도록 정교하게 조절 받는 것으로 예측할 수 있다. 공지된 문헌에서도 L-트립토판의 생산은 L-트립토판 농도에 따른 억제자와 촉진자의 동시 조절을 받는 것으로 알려져 있다 (Appl Environ Microbiol 59 791, 1993).

따라서, L-트립토판의 조절 기작을 L-페닐알라닌 생산 유전자 pheA 에 적용하여 L-트립토판 농도에 따라 pheA 유전자가 조절을 받도록 하였다.

pheA의 유전자를 trpE의 프로모터에 조절 받도록 하기 위하여 삽입하려는 지역의 업스트림 (Upstream) 과 trpE의 프로모터 지역과 삽입하려는 지역의 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 33과 서열번호 34의 프라이머를 이용하여 삽입하고자 하는 지역의 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 35와 서열번호 36의 프라이머를 이용하여 trpE의 프로모터 지역을, 서열번호 37과 서열번호 38의 프라이머를 이용하여 삽입하고자 하는 지역의 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

증폭된 삽입하고자 하는 지역의 업스트림과 다운스트림 지역, trpE 프로모터 지역, SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔPpheA::PtrpE 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.

제작된 pDZ-ΔPpheA::PtrpE 벡터를 CM06-0003 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 pheA의 유전자가 trpE 의 프로모터로 조절 받도록 만든 균주를 얻었다. 해당 프로모터가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 39와 서열번호 40의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다. pheA의 유전자 앞에 trpE의 프로모터를 삽입한 균주는 CM06-0005으로 명명하였다.

상기 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 7에 나타낸 바와 같다.

서열번호	서열(5'-3')
33	TTCGAGCTCGGTACCCGGAGGGGTTTCCACCTCG
34	TGGGAAGCTTGTCTCAATTATGTCTGTTGCTCAATTAGCG
35	CTAATTGAGCAACAGACATAATTGAGACAAGCTTCCCA
36	AATTGGTGCGTCGCTCATGGGGCACCTACCGAGGAA
37	TTCCTCGGTAGGTGCCCCATGAGCGACGCACCAATTGTTG
38	CGACTCTAGAGGATCCCCCCGAAGAGTTCGGCTGCG
39	CCAGCGATGATCGCGCCG
40	ATCGCCGTGGAGCCAGCC

L-타이로신의 생산은 PEP와 E4P를 전구 물질로 시작되기 때문에 non-PTS (Phosphotransferase system)를 사용 할 경우 PEP 공급을 보다 원할하게 하여 높은 생산을 기대할 수 있다 (Nature biotechnol 14 620, 1996). 따라서, 균주의 PTS 유전자인 ptsG를 제거하고 non-PTS 유전자인 Zymomonas mobilis ATCC 10988 유래의 glf를 도입하였다.

ptsG를 결손하며 glf를 삽입하기 위해 우선 Zymomonas mobilis 유래 glf 유전자를 삽입할 업스트림 (Upstream) 과 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 41과 서열번호 42의 프라이머를 이용하여 ptsG 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 43와 서열번호 44의 프라이머를 이용하여 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

또한, 기공지된 cj7 프로모터 (서열번호 45, 특허등록 제10-0620092호)를 포함한 glf 유전자를 확보하기 위해서 합성 cj7 프로모터 DNA를 주형으로 하여 서열번호 46와 서열번호 47의 프라이머를 이용하여 cj7 프로모터 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였고, Zymomonas mobilis ATCC10988 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 48와 서열번호 49의 프라이머를 이용하여 glf 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 Solg^TM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

증폭된 ptsG 업스트림과 다운스트림 유전자 단편, cj7 프로모터를 포함하는 glf 유전자 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ 는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔptsG::pcj7-glf 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.

본 참고예에서 사용한 프라이머의 서열은 표 8에 나타낸 바와 같다.

서열번호	서열(5'->3')
41	TTCGAGCTCGGTACCCGAGGGCTCACTGACGTTGA
42	CGCTGGGATGTTTCTACCGGATTCGATTCCTCAG
43	CGCTCCCAGAAGTAGGCTCAAACCTTGCCCATAAC
44	CTCTAGAGGATCCCCCTCCCCCAAACCACGCTTTT
46	GGAATCGAATCCGGTAGAAACATCCCAGCGCTACT
47	TACTTTCAGAACTCATGAGTGTTTCCTTTCGTTGG
48	ACGAAAGGAAACACTCATGAGTTCTGAAAGTAGTC
49	GGGCAAGGTTTGAGCCTACTTCTGGGAGCGCCACA

제작된 pDZ-ΔptsG::pcj7-glf 벡터를 CM06-0005 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 cj7 프로모터를 포함하는 Zymomonas mobilis 유래 glf 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 50과 서열번호 51의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0010로 명명하였다.

서열번호	서열(5'-3')
50	ACATTAAGTGGTAGGCGCTGA
51	CATAACAGGGCAGAACAAAC

참고예 2: L-타이로신 생산 균주의 생산능 평가

상기 참고예 1에서 제작한 균주의 L-타이로신 생산능을 확인하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 평가하였다. 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-타이로신, L-페닐알라닌, L-트립토판의 생산량을 측정하였다.

< 종배지 (pH 7.0) >

포도당 20g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

< 생산배지 (pH 7.0) >

포도당 30g, (NH4)2SO4 15 g, MgSO4 7H2O 1.2 g, KH2PO4 1 g, 효모추출물 5 g, 바이오틴 900 ㎍, 티아민 염산염 4500 ㎍, 칼슘-판토텐산 4500 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 유래 L-타이로신 생산균주의 생산능 평가

균주 번호	형질	사용한 포도당 (g/L)	L-타이로신 생산량 (g/L)	L-페닐알라닌 생산량 (g/L)	L-트립토판 생산량 (g/L)
ATCC 13869	야생형	30	0.00	0.00	0.00
CM06-0001	ATCC 13869 ΔaroP::Pn-tkt	30	0.00	0.00	0.00
CM06-0002	CM06-0001 ΔtyrA::PgapA-tyrAm	30	0.00	0.00	0.00
CM06-0003	CM06-0002 Δ BBD29_14470::PgapA-aroGm	30	0.38	1.11	0.02
CM06-0005	CM06-0003 ΔPpheA::PtrpE	30	1.61	0.03	0.02
CM06-0010	CM06-0005 ΔptsG::pcj7-glf	30	2.12	0.03	0.02

야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869, CM06-0001, CM06-0002, CM06-0003, CM06-0005, CM06-0010에 대한 배양물 중의 L-타이로신, L-페닐알라닌, L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 10과 같다.

야생형 균주에 방향족 아미노산 유입 유전자를 결손하고, 전구체인 E4P 공급을 강화시킨 균주 CM06-0001에서는 L-타이로신이 생산되지 않았고, 이 균주에 추가적으로 tyrA 피드백 제한을 해제한 CM06-0002 에서도 L-타이로신이 검출되지 않았다.

CM06-0002 균주에 추가적으로 aroG의 피드백 제한을 해제하여 방향족 공통 생산 경로를 강화한 CM06-0003 균주에서는 L-타이로신, L-페닐알라닌의 생산을 확인하였다. L-타이로신, L-페닐알라닌은 이전 균주에 비해 큰 폭으로 생산이 증가하였으나, L-트립토판은 크게 변화가 없었다. L-페닐알라닌 경로를 L-트립토판 농도에 조절 받도록 한 CM06-0005 균주의 경우 5.37 % 수율로 L-타이로신을 생산하였다. CM06-0005의 L-타이로신 생산량은 모균주인 CM06-0003 대비 283% 향상되었다. 상기 결과로부터 pheA를 L-트립토판 농도에 따라 조절 받도록 할 경우 L-타이로신 생산이 대폭 증가함을 확인할 수 있다.

또한, 예상했던대로 PTS 균주인 CM06-0005에 비해서 PEP 공급을 원활히 할 수 있는 non-PTS 균주인 CM06-0010에서 L-타이로신 생산이 증가함을 확인하였다. CM06-0010 균주는 향상된 7.06 % 수율로 L-타이로신을 생산하였다.

실시예 1: L-타이로신 생산 균주의 L-트립토판 배출단백질 도입된 균주의 제작

상기 참고예 1에서 제작한 L-타이로신 생산균주 CM06-0010 균주에 L-트립토판 신규 배출단백질 (WO2019164348A1) 를 도입하여 타이로신 배출능을 확인해 보았다.

L-트립토판 신규 배출단백질은 허바스필리움 리조스페레 유래의 막 단백질로 서열번호 52로 기재되는 아미노산 서열을 가진다. 특허 WO2019164348A1 에서 사용된 형질전환용 벡터는 pDZTn-PgapA-Hrh로 동일한 벡터를 L-타이로신 생산균주 CM06-0010 균주에 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 PgapA-Hrh 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 상기의 PgapA-Hrh 유전자 발현된 단백질은 Wex라 명명하였고 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 53과 서열번호 54의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.

서열번호	서열(5'-3')
53	CGGATTATGCCAATGATGTG
54	CACGATCACCAACATTCAGG

이렇게 수득한 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CM06-0111 로 명명하였다

실시예 2: L-트립토판 배출단백질 Wex가 도입된 L-타이로신 생산 균주의 생산능 평가

상기 실시예 1에서 제작한 균주의 L-타이로신 생산능을 확인하고자 참고예 2에서 서술한 방법 및 배지 조성을 이용하여 균주를 배양하였다.

PgapA-Hrh 형질이 도입된 균주의 생산 배지에서의 생산능 평가

균주 번호	형질	사용한 포도당 (g/L)	L-타이로신 생산량 (g/L)	L-타이로신 수율 (%)	L-페닐알라닌 생산량 (g/L)	L-트립토판 생산량 (g/L)
CM06-0010	CM06-0005 ΔptsG::pcj7-glf	30	2.2	7.3	0.05	0.02
CM06-0111	CM06-0010-PgapA_Hrh	30	2.1	7.1	0.06	0.02

L-타이로신 생산균주인 CM06-0010, CM06-0111에 대한 배양물 중의 L-타이로신, L-페닐알라닌, L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 12과 같다.

L-트립토판 배출자 Wex 막단백질 도입된 균주는 L-타이로신 배출능이 보이지 않았고 L-트립토판 역시 너무 소량이라 증가여부를 확인할 수 없었다. 이에 Wex 막단백질에 변이를 도입하여 L-타이로신에 대한 기질 특이성을 부여하고자 하였다.

실시예 3: L-타이로신 생산 균주내 Wex 서열의 79번 아미노산, 류신(Leucine)의 타 아미노산으로의 치환.

Wex 막단백질의 L-타이로신에 대한 기질 특이성을 부여하기 위해 79번째 아미노산인 류신(이하 79번 류신 또는 79번으로 기재)을 다른 아미노산으로 치환을 통해 L-타이로신 배출하는 변이형을 찾고자 하였다. 류신 이외 다른 아미노산으로 변이를 주기 위해서 상기 실시예 1에서 사용된 pDZTn-PgapA-Hrh를 주형으로 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다. Site-Directed mutagenesis는 아래의 방법으로 수행되었다.

Site-Direction Mutagenesis PCR 조성

	단위 (ul)
10X pfu-X Buffer	5
10mM dNTP Mix	1
pfu-X Polymerase	1
Mutagenic forward primer(5pmol)	2
Mutagenic reverse primer(5pmol)	2
pDZTn-PgapA-Hrh (template DNA, 200ng/ul)	1
dH2O	38
Total	50

Site-Direction Mutagenesis PCR cycle

Cycle	Temperature	Time
1	95 ℃	1 min
18	95 ℃	50 sec
	60 ℃	50 sec
	68 ℃	9 min
1	68 ℃	7 min

Wex 아미노산 서열의 79번 아미노산 류신을 다른 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 1), 글리신(G) (서열번호 2), 이소류신(I) (서열번호 77), 메티오닌(M) (서열번호 78), 쓰레오닌(T) (서열번호 79), 타이로신(Y) (서열번호 80), 아스파라긴(N) (서열번호 81), 아르기닌(R) (서열번호 82), 트립토판(W) (서열번호 83), 세린(S) (서열번호 84), 프롤린(P) (서열번호 85)으로 치환하기 위해서 [표 15] 에서 표기한 각각의 mutagenic primer 세트를 이용해서 [표 14]과 같은 PCR mixture를 만들고 [표 15]의 cycle로 PCR 을 수행하였다. PCR이 종료되고 DpnI 제한효소 1㎕를 첨가 후 37℃ 로 1시간 처리하였다. DpnI 처리된 DNA 3㎕ DH5a competent cell에 transformation하여 pDZTn-PgapA-wex 변이형 플라스미드를 확보하였고 시퀀싱을 통해서 [표 15]에 표기한 각각의 변이로 교체되었음을 확인하였다.

Wex 아미노산 서열의 79번 아미노산 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트

변이형 Wex 플라스미드	서열번호	서열(5'-3')
pDZTn-PgapA-wex L79A	55	GTGTCCTACGAACTCTGCGCATCGCTCTCCATCGGTTATG
pDZTn-PgapA-wex L79A	56	CATAACCGATGGAGAGCGATGCGCAGAGTTCGTAGGACAC
pDZTn-PgapA-wex L79I	57	GTGTCCTACGAACTCTGCATCTCGCTCTCCATCGGTTATG
pDZTn-PgapA-wex L79I	58	CATAACCGATGGAGAGCGAGATGCAGAGTTCGTAGGACAC
pDZTn-PgapA-wex L79G	59	GTGTCCTACGAACTCTGCGGCTCGCTCTCCATCGGTT
pDZTn-PgapA-wex L79G	60	CATAACCGATGGAGAGCGAGCCGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79M	61	GTGTCCTACGAACTCTGCATGTCGCTCTCCATCGGTT
pDZTn-PgapA-wex L79M	62	CATAACCGATGGAGAGCGACATGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79T	63	GTGTCCTACGAACTCTGCACCTCGCTCTCCATCGGTT
pDZTn-PgapA-wex L79T	64	CATAACCGATGGAGAGCGAGGTGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79Y	65	GTGTCCTACGAACTCTGCTACTCGCTCTCCATCGGTT
pDZTn-PgapA-wex L79Y	66	CATAACCGATGGAGAGCGAGTAGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79N	67	GTGTCCTACGAACTCTGCAACTCGCTCTCCATCGGTT
pDZTn-PgapA-wex L79N	68	CATAACCGATGGAGAGCGAGTTGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79W	69	GTGTCCTACGAACTCTGCTGGTCGCTCTCCATCGGTT
pDZTn-PgapA-wex L79W	70	CATAACCGATGGAGAGCGACCAGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79R	71	GTGTCCTACGAACTCTGCCGCTCGCTCTCCATCGGTT
pDZTn-PgapA-wex L79R	72	CATAACCGATGGAGAGCGAGCGGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79S	73	GTGTCCTACGAACTCTGCTCCTCGCTCTCCATCGGTT
pDZTn-PgapA-wex L79S	74	CATAACCGATGGAGAGCGAGGAGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79P	75	GTGTCCTACGAACTCTGCCCATCGCTCTCCATCGGTT
pDZTn-PgapA-wex L79P	76	CATAACCGATGGAGAGCGATGGGCAGAGTTCGTAGG

상기 [표15]과 같이 제작된 pDZTn-PgapA-wex L79A, pDZTn-PgapA-wex L79I, pDZTn-PgapA-wex L79G, pDZTn-PgapA-wex L79M, pDZTn-PgapA-wex L79S, pDZTn-PgapA-wex L79P, pDZTn-PgapA-wex L79T, pDZTn-PgapA-wex L79Y, pDZTn-PgapA-wex L79N, pDZTn-PgapA-wex L79W, pDZTn-PgapA-wex L79R 벡터를 상기 실시예 2 에서 제작된 CM06-0111 에 각각 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 변이형 wex 유전자가 삽입된 19종의 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 53과 서열번호 54의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.

이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 CM06-0112 (wex L79A), CM06-0114 (wex L79I), CM06-0115 (wex L79G), CM06-0117 (wex L79M), CM06-0118 (wex L79S), CM06-0119 (wex L79P), CM06-0120 (wex L79T), CM06-0121 (wex L79Y), CM06-0124 (wex L79N), CM06-0128 (wex L79W), CM06-0129 (wex L79R) 로 명명하였다.

CM06-0112 (wex L79A), CM06-0114 (wex L79I), CM06-0115 (wex L79G), CM06-0117 (wex L79M), CM06-0118 (wex L79S), CM06-0119 (wex L79P), CM06-0120 (wex L79T), CM06-0121 (wex L79Y), CM06-0124 (wex L79N), CM06-0128 (wex L79W), CM06-0129 (wex L79R) 균주의 타이로신 생산량을 확인하고자 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용해 L-타이로신의 생산량을 측정하였다.

Wex 아미노산 서열의 79번 아미노산이 변이형으로 교체된 L-타이로신 생산균주의 생산능 평가

균주 번호	형질	사용한 포도당 (g/L)	L-타이로신 생산량 (g/L)	L-타이로신 수율 (%)
CM06-0010	CM06-0005 ΔptsG::pcj7-glf	30	2.18	7.27
CM06-0111	CM06-0010-PgapA_Hrh (Wex)	30	2.16	7.20
CM06-0112	CM06-0010-PgapA_wex L79A	30	2.92	9.73
CM06-0114	CM06-0010-PgapA_wex L79I	30	2.23	7.43
CM06-0115	CM06-0010-PgapA_wex L79G	30	2.88	9.60
CM06-0117	CM06-0010-PgapA_wex L79M	30	2.32	7.73
CM06-0118	CM06-0010-PgapA_wex L79S	30	2.17	7.23
CM06-0119	CM06-0010-PgapA_wex L79P	30	2.17	7.23
CM06-0120	CM06-0010-PgapA_wex L79T	30	2.33	7.77
CM06-0121	CM06-0010-PgapA_wex L79Y	30	2.24	7.47
CM06-0124	CM06-0010-PgapA_wex L79N	30	2.29	7.63
CM06-0128	CM06-0010-PgapA_wex L79W	30	2.19	7.30

Wex 막단백질의 야생형을 도입한 균주는 효과가 미미한데 비해 Wex L79A 변이가 도입된 CM06-0112 균주는 플라스크 배양에서 L-타이로신 농도가 2.92g/L 로 대조군 CM06-0111 대비 수율이 약 2.5%p 향상하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, Wex L79G 변이가 도입된 CM06-0115 균주도 2.4%p 향상됨을 확인하여, Wex L79A변이와 L79G 변이는 L-타이로신을 특이적으로 배출함을 확인하였다.

상기 균주, CM06-0112는 2020년 4월 27일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12708P로 기탁번호를 부여받았다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12708P

20200427

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel L-tyrosine exporter variant and the method of producing L-tyrosine using the same <130> KPA200363-KR <160> 85 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wex L79A <400> 1 Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu 1 5 10 15 Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly 20 25 30 Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu 35 40 45 Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr 50 55 60 Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Ala Ser 65 70 75 80 Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser 85 90 95 Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala 100 105 110 Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu 115 120 125 Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp 130 135 140 Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly 145 150 155 160 Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr 165 170 175 Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu 180 185 190 Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro 195 200 205 Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala 210 215 220 Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly 225 230 235 240 Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser 245 250 255 Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe 260 265 270 Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu 275 280 285 Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala 290 295 300 Asp Cys Leu 305 <210> 2 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wex L79G <400> 2 Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu 1 5 10 15 Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly 20 25 30 Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu 35 40 45 Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr 50 55 60 Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Gly Ser 65 70 75 80 Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser 85 90 95 Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala 100 105 110 Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu 115 120 125 Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp 130 135 140 Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly 145 150 155 160 Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr 165 170 175 Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu 180 185 190 Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro 195 200 205 Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala 210 215 220 Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly 225 230 235 240 Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser 245 250 255 Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe 260 265 270 Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu 275 280 285 Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala 290 295 300 Asp Cys Leu 305 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcgagctcgg taccctggga acttgtcgac gctat 35 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgttcggcaa gcattgtggt gtgggcaatg atcac 35 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 attaacggtt aaagtactca ttgtgaggtg gcggg 35 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctctagagga tccccggagc tgctgtccaa cgtgg 35 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ccacaccaca atgcttgccg aacatttttc ttttc 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cacaatgagt actttaaccg ttaatggagt ccttg 35 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 acgcgccaag tcggacg 17 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgcacgatgt ttacctgcg 19 <210> 11 <211> 1122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E.coli tyrA_M53I_A354V <400> 11 atggttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg 60 aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt 120 ggactgccta tttatgttcc ggagcgcgag gcatctattt tggcctcgcg tcgtgcagag 180 gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt 240 gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacac tttgtccgtc actgcgtccg 300 gtggttatcg tcggcggtgg cggtcagatg ggacgcctgt tcgagaagat gctgaccctc 360 tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt 420 gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca agttattggc 480 aaattaccgc ctttaccgaa agattgtatt ctggtcgatc tggcatcagt gaaaaatggg 540 ccattacagg ccatgctggt ggcgcatgat ggtccggtgc tggggctaca cccgatgttc 600 ggtccggaca gcggtagcct ggcaaagcaa gttgtggtct ggtgtgatgg acgtaaaccg 660 gaagcatacc aatggtttct ggagcaaatt caggtctggg gcgctcggct gcatcgtatt 720 agcgccgtcg agcacgatca gaatatggcg tttattcagg cactgcgcca ctttgctact 780 tttgcttacg ggctgcacct ggcagaagaa aatgttcagc ttgagcaact tctggcgctc 840 tcttcgccga tttaccgcct tgagctggcg atggtcgggc gactgtttgc tcaggatccg 900 cagctttatg ccgacatcat tatgtcgtca gagcgtaatc tggcgttaat caaacgttac 960 tataagcgtt tcggcgaggc gattgagttg ctggagcagg gcgataagca ggcgtttatt 1020 gacagtttcc gcaaggtgga gcactggttc ggcgattacg tgcagcgttt tcagagtgaa 1080 agccgcgtgt tattgcgtca ggcgaatgac aatcgccagt aa 1122 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ttcgagctcg gtaccctatc aaaaccgagt tcttcc 36 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtcgttttta ggcctcctga caagtgtggc acatac 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tgacaatcgc cagtaatttt atcggctgat gattct 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 actctagagg atccccaacg cgattgcatt cggctc 36 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gtgccacact tgtcaggagg cctaaaaacg accgag 36 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tcaattcagc aaccatgttg tgtctcctct aaagat 36 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ttagaggaga cacaacatgg ttgctgaatt gaccgc 36 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tcatcagccg ataaaattac tggcgattgt cattcg 36 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gcccactagt cgaatccc 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ctgtccgcaa cctgtgcg 18 <210> 22 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E.coli aroG_P150L <400> 22 atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60 gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120 aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180 tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240 gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300 acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360 gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420 gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480 gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540 tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600 aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660 gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720 tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780 caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840 gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900 gtggaaagcc atctggtgga 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Claims

서열번호 52의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 알라닌 또는 글리신으로 치환된 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 하나 이상을 포함하는, L-타이로신을 생산하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물인, L-타이로신을 생산하는 미생물.
서열번호 52의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 알라닌 또는 글리신으로 치환된 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 하나 이상을 포함하는, L-타이로신을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-타이로신 생산방법.
제3항에 있어서, 생산된 타이로신을 회수하는 단계를 포함하는, L-타이로신 생산방법.
제3항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물인, L-타이로신 생산방법.
서열번호 52의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 알라닌 또는 글리신으로 치환된, L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체.
제6항의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.