KR102221040B1 - L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산을 생산하는 방법 - Google Patents

L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산을 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 미생물, 상기 미생물을 이용한 L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산을 생산하는 방법 {Microorganism producing L-amino acid and method of producing Method of L-amino acid using thereof}
본 출원은 L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 미생물, 상기 미생물을 이용한 L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-아미노산은 단백질의 기본 구성단위로서, 약품 원료와 식품첨가제, 동물 사료, 영양제, 살충제, 살균제 등의 중요 소재로 사용된다. 상기 L-아미노산 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를들어, L-라이신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다 (대한민국 등록특허 제10-0838038호).
한편, 코리네박테리움 속 균주(Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 상기 아미노산의 생산을 위해 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를 들어, 코리네박테리움 속 균주에서 아미노산 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 아미노산 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적인 접근 방법이 주로 이용되고 있다(한국 등록특허공보 제10-0924065호, 제10-1208480호,). 또한, 이러한 방법 이외에 아미노산 생산에 관여하지 않는 유전자를 제거하는 방법, 아미노산 생산에 있어 구체적으로 기능이 알려지지 않은 유전자를 제거하는 방법 또한 활용되고 있다. 그러나, 여전히 효율적으로 고수율로 L-아미노산을 생산할 수 있는 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 L-아미노산을 고효율로 생산할 수 있는 미생물을 개발하고자 예의 연구한 결과, 다른 유래의 단백질을 도입하는 경우 L-아미노산의 생산 수율이 증가한다는 사실을 확인하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 단백질이 발현되도록 변형된, L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은, 상기 서열번호 1 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단백질이 발현된도록 변형된, L-아미노산 또는 이의 전구체 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 L-아미노산 또는 이의 전구체를 회수하는 단계를 포함하는 L-아미노산 또는 이의 전구체의 생산방법을 제공하는 것이다.
이하에서는, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 단백질을 발현하도록 변형된, L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
상기 서열번호 1 아미노산 서열 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 단백질은, D-3-포스포글리세레이트 디하이드로게네이즈(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)활성을 갖는 단백질일 수 있다.
본 출원에서 "D-3-포스포글리세레이트 디하이드로게네이즈(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)"는 주로 하기와 같은 화학반응을 촉매하는 효소이다.
3-phospho-D-glycerate + NAD+ ↔ 3-phosphonooxypyruvate + NADH + H+
2-hydroxyglutarate + NAD+ ↔ 2-oxoglutarate + NADH + H+
본 출원의 목적상 상기 D-3-포스포글리세레이트 디하이드로게네이즈는 SerA일 수 있고, 이의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank에서 확인할 수 있다. 또한 이에 상응하는 활성을 가지면서, 상기 단백질이 포함되는 L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 미생물과는 다른 유래인 단백질이라면 제한없이 포함될 수 있다. 구체적으로는, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 혼용되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질은 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, D-3-포스포글리세레이트 디하이드로게네이즈 활성을 갖는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 본 출원의 목적상 상기 단백질은 상기 단백질이 포함되는 L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 미생물과는 다른 유래인 것에 특징이 있으며, 구체적으로 아조토박터(Azotobacter) 속 유래, 또는 아조토박터 속 유래의 단백질과 동일한 단백질일 수 있으나, L-아미노산 또는 이의 전구체의 생산을 증가시킬 수 있는 것이라면 이에 제한되지 않는다. 상기 아조토박터(Azotobacter) 속 미생물은 더욱 구체적으로, 아조토박터 아질리스(Azotobacter agilis), 아조토박터 아르메니아쿠스(Azotobacter armeniacus), 아조토박터 베이저린키(Azotobacter beijerinckii), 아조토박터 크로오코쿰(Azotobacter chroococcum), 아조토박터 속 DCU26(Azotobacter sp. DCU26), 아조토박터 속 FA8(Azotobacter sp. FA8), 아조토박터 니그리칸스(Azotobacter nigricans), 아조토박터 파스팔리(Azotobacter paspali), 아조토박터 살리네스트리스(Azotobacter salinestris), 아조토박터 트로피칼리스(Azotobacter tropicalis), 또는 아조토박터 비넬란디(Azotobacter vinelandii)일 수 있으며, 본 출원의 일 예로 아조토박터 비넬란디(Azotobacter vinelandii) 유래 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어, "기능적 단편"은 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열을 의미하는 것으로서, 상기 단백질의 아미노산 서열의 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 상기 단백질과 상응하는 활성을 갖는다면, 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하며, 이는 본 출원의 목적상 기능적 단편이라고 할 수 있다.
본 출원에서 ‘특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드’, ‘특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩타이드’ 또는 ‘특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드’라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 “보존적 치환(conservative substitution)”은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다.
또 하나의 양태로서, 상기 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 출원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990) 참조).
상기 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 아조토박터 비넬란디(Azotobacter vinelandii) 유래의 D-3-포스포글리세레이트 디하이드로게네이즈활성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 L-아미노산 또는 이의 전구체의 생산을 증가시킬 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 서열번호1의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 1과 70% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 95 또는 서열번호 95의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 서열번호 1 또는 서열번호 1과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 “엄격한 조건”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 70% 이상, 80% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, “상보적”은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상동성(homology) 및 동일성(identity)은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원에서 용어, 단백질이 "발현되도록/되는"은 목적 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물내 존재하는 단백질인 경우 내재적 또는 변형전에 비하여 그 활성이 강화된 상태를 의미한다.
구체적으로, "단백질의 도입" 은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단편 또는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다. "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.
본 출원의 용어 "아미노산 또는 이의 전구체"란 상기 단백질을 이용하여 생산할 수 있는 아미노산 또는 이의 전구체로서, 세린, 트립토판, 히스티딘, 메티오닌, 시스테인, L-시스타치오닌, L-호모시스테인, O--아세틸호모세린, O-숙시닐 호모세린, L-호모세린 및/또는O-포스포세린을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원에서 상기 아미노산은 L-아미노산일 수 있고, 미생물이 각종 탄소원으로부터 대사과정을 거쳐 생산될 수 있는 모든 L-아미노산을 포함하나, 구체적으로 L-세린, L-트립토판, L-히스티딘, L-메티오닌, 또는L-시스테인 일 수 있으며, 전구체는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 에 의해 메티오닌으로 전환되는 전구체(KR10-1048593)인 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린 (O-succinylhomoserine), 메티오닌의 전구체인 L-호모세린(L-homoserine), L-호모시스테인(L-homocysteine), L-시스타치오닌(L-cystathionine), L-시스테인의 전구체인 아세틸세린(acetyl-serine), 및/또는O-포스포세린 설피드릴라제(OPhosphoserine sulfhydrylase, OPSS)에 의해 시스테인으로 전환되는 전구체 인 O-포스포세린일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 아미노산 또는 이의 전구체는, 보다 구체적으로, L-세린, L-트립토판, L-히스티딘, L-메티오닌, O-포스포세린, 또는L-시스테인일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 L-아미노산 또는 이의 전구체의 생합성을 강화하기 위하여, 본 출원의 서열번호 1 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단백질을 이용할 수 있다. 예를 들어, L-세린, L-트립토판, L-히스티딘, L-메티오닌 L-시스테인, L-호모시스테인, L-시스타치오닌, 아세틸세린, O-아세틸호모세린, O-숙시닐호모세린, L-호모세린 및/또는 O-포스포세린의 생합성을 강화하기 위하여 본 출원의 서열번호 1 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단백질이 발현되도록 변형할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 서열번호1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 도입하거나 이의 활성을 강화할 수 있다. 또한, 추가적으로, 특정 단백질의 활성을 도입 또는 강화하거나, 특정 단백질의 활성을 불활성화함으로써 L-아미노산 또는 이의 전구체의 생산능을 보다 더 향상시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 미생물은 ⅰ) 약화된 활성의 포스포세린 포스파타아제, ⅱ) 강화된 활성의 3-포스포세린 아미노트랜스퍼레이즈 또는 ⅲ) 약화된 활성의 포스포세린 포스파타아제 및 강화된 활성의 3-포스포세린 아미노트랜스퍼레이즈 를 추가로 포함하여 L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물은 추가로 trp 오페론 강화, 트립토파나제(Tryptophanase; TnaA) 불활성화, Mtr 막단백질(Mtr membrane protein; Mtr) 불활성화 또는 이들의 조합으로 변형된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 미생물은 추가로 L-트립토판 생산에 관여하는 L-트립토판 생합성 유전자들의 (trpEDCBA) 발현을 억제하는 TrpR을 불활성 시킴으로써 trp 오페론을 강화 하였으며, 세포 외부의 L-트립토판을 세포 내로 유입하는데 역할을 하는 트립토파나제(Tryptophanase; TnaA) 및 세포 내의 L-트립토판과 물분자를 인돌 (Indole), 피루브산 (pyruvate), 암모니아 (NH3) 로 분해하는 역할을 하는 Mtr 막단백질을 불활성하였으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 목적상 상기 미생물은 추가로 his 오페론이 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 미생물은 L-히스티딘 생합성 경로 강화를 위해, 총 4개의 오페론(operon)으로 분리되어 있는 생합성 유전자들을 프로모터가 치환된 형태의 cluster로 도입하였으며, 상기 L-히스티딘 생합성 cluster는 총 4개의 오페론(operon)(hisE-hisG, hisA-impA-hisF-hisI, hisD-hisC-hisB, cg0911-hisN)으로 분리되어 있으며, 상기 생합성 유전자들을 한번에 미생물내로 도입하는 벡터를 사용하여 his 오페론 강화하였으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 목적상 상기 미생물은 추가로 McbR(Transcriptional regulator; mcbR) 불활성화, 메티오닌 신타아제(Methionine synthase; meth)강화, 설파이트 리덕타제 [NADPH] 호모단백질 베타-컨포넌트 (Sulfite reductase [NADPH] hemoprotein beta-component; cysI)강화 또는 이들의 조합으로 변형된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 미생물은 추가로 메티오닌 시스테인 전사 조절인자 단백질인 McbR를 불활성화시키고, 메치오닌 합성 효소인 메티오닌 신타아제(Methionine synthase; Meth)을 강화시키고, 설파이트 리덕타제 [NADPH] 호모단백질 베타-컨포넌트 (Sulfite reductase [NADPH] hemoprotein beta-component; cysI)를 강화시키거나 또는 이들의 조합으로 변형된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 특정 단백질 및/또는 유전자의 활성을 도입, 강화, 불활성화 하는 방법은 미생물이 가진 특징에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 출원에서 용어, 단백질의 활성의 "강화"는 상기 단백질의 활성이 도입되거나, 또는 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 활성의 "도입"은, 자연적 혹은 인위적으로 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 폴리펩타이드의 활성이 나타나게 되는 것을 의미한다.
본 출원에서 용어, 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "증가"한다는 것은, 미생물이 가진 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다. 변형 전 활성으로 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 활성 증가는, 외래의 단백질을 도입하는 것과, 내재적인 단백질의 활성 강화를 모두 포함할 수 있다. 상기 단백질의 활성 증가/강화는, 유전자의 발현 증가/강화에 의해 달성될 수 있다.
구체적으로, 본 출원에서 활성 증가는,
1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,
3) 상기 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형,
4) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
5) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터에 본원의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.
다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 cj1 내지 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제0620092호 및 WO2006/065095), lysCP1 프로모터(WO2009/096689), EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL1, SPL7, SPL13 프로모터 (대한민국 등록특허 제 10-1783170호), 또는 O2 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1632642) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
또한, 4) 외래 폴리뉴클레오티드 서열의 도입은, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
마지막으로, 5) 상기 1) 내지 4)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
본 출원에서 용어, 단백질 활성의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다.
이러한 단백질 활성의 약화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 단백질의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법(예컨대, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로 교체하는 방법); 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이의 일례로 상동재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기에서 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하고, 당업자가 적절히 결정할 수 있으나, 구체적으로는 1 내지 300개, 보다 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 발현 조절서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 사용되는 용어 "L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 미생물"이란, 배지 중의 탄소원으로부터 L-아미노산 또는 이의 전구체를 야생형이나 비변형 미생물과 비교하여 과량으로 생산할 수 있는 미생물을 의미할 수 있다. 또는, 상기 미생물은 자연적으로 L-아미노산 또는 이의 전구체의 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-아미노산 또는 이의 전구체의 생산능이 없는 모균주에 L-아미노산 또는 이의 전구체의 생산능이 부여된 미생물을 의미할 수 있다. 구체적으로 상기 미생물은 서열번호 1 의 아미노산 서열또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단백질을 발현하도록 변형된 L-아미노산 또는 이의 전구체 생산용 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 "L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 L-아미노산 또는 이의 전구체 생산을 위하여 유전적 변형이 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물 일 수 있다. 구체적으로 상기 미생물은 구체적으로 L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있다. 보다 구체적으로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 상기 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 더욱 구체적으로는 에스케리키아속(Escherichia) 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있으며, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 목적상 상기 미생물은 상기 단백질을 포함하여 L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다.
본 출원에서 상기 "L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산할 수 있는 미생물"은 "L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 미생물", "L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산능을 갖는 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 서열번호 1 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단백질이 발현된도록 변형된, L-아미노산 또는 이의 전구체 생산용 조성물을 제공한다.
상기 L-아미노산 또는 이의 전구체 생산용 조성물은 본 출원의 단백질에 의해 L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산할 수 있는 조성물을 의미한다. 상기 조성물은 상기 단백질 또는 상기 단백질을 작동시킬 수 있는 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 상기 단백질은 도입된 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있게 벡터내에 포함된 형태일 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계 및 상기의 배지 또는 이의 배양물에서 L- 아미노산 또는 이의 전구체를 회수하는 단계를 포함하는 L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 ℃, 구체적으로는 25 내지 40 ℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 아미노산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 아미노산을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집(collect)할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 아미노산을 회수 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 아미노산은 정제된 형태 또는 아미노산을 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
또한, 본 출원의 목적상 상기 아조토박터(Azotobacter) 속 미생물 유래 D-3-포스포글리세레이트 디하이드로게네이즈가 발현되도록 변형된 미생물의 경우, 세린, 트립토판, 히스티딘, 메티오닌, 또는 O-포스포세린을 포함하는 L-아미노산 또는 이의 전구체 생산량이 증가하는 것을 특징으로 한다. 이는 야생형 코리네박테리움속 균주가 L-아미노산 또는 이의 전구체를 아주 극미량으로 생산할 수 있거나 생산하지 못하는 것에 비해, L-아미노산 또는 이의 전구체 생산량을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있다.
본 출원의 서열번호 1 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 단백질을 발현하도록 변형된, L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 미생물은 L-세린, L-트립토판, L-히스티딘, L-메티오닌, L-시스테인, 및/또는 O-포스포세린을 고효율로 생산할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1: 아조토박터(Azotobacter) 유래 3-포스포글리세레이트 디하드로제네이즈(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, serA(Avn)) 과발현 벡터 제작
아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii) 유래 D-3-포스포글리세레이트 디하드로제네이즈(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, 이하 'SerA(Avn)'로 지칭함)를 강화시켜 주었을 경우 세린 및 OPS 생산능이 향상되는지 확인하기 위하여 발현 벡터를 제작하였다.
SerA(Avn)을 코딩하는 유전자 serA(Avn)(서열번호1)의 발현을 위해서 pCL1920 벡터(GenBank No AB236930)를 사용하였고 발현 프로모터는 trc 프로모터(Ptrc)를 사용하여 pCL-Ptrc-serA(Avn) 형태의 벡터를 제작하였다.
대조군으로는, 세린에 대한 피드백이 해제된 대장균 유래의 3-포스포글리세레이트 디하드로제네이즈를 포함하는 벡터를 제작하였으며 pCL-Ptrc-serA*(G336V)로 명명하였다. 상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
유전자 프라이머(5'->3') 서열번호 벡터
Ptrc AGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGCTTGCTGCAACTCTCT 2 pCL-Ptrc-serA(Avn), pCL-Ptrc-serA*(G336V)
GATATCTTTCCTGTGTGA 3
serA
(Avn)		 AATTTCACACAGGAAAGATATCATGAGTAAGACCTCCCTG 4 pCL-Ptrc-serA(Avn)
GTGAATTCGAGCTCGGTACCCTCAGAACAGAACCCGTGAG 5
serA*
(G336V)		 AATTTCACACAGGAAAGATATCATGGCAAAGGTATCGCTG 6 pCL-Ptrc-serA*(G336V)
GTGAATTCGAGCTCGGTACCCTTAGTACAGCAGACGGGCG 7
두 벡터의 제작에 공통적으로 사용되는 Ptrc PCR은 서열번호 2 및 3인 프라이머를 이용하였다. 구체적으로, 외래 serA(Avn) PCR은 서열번호 4 및 5인 프라이머를, serA*(G336V) PCR은 서열번호 6 및 7인 프라이머를 이용하였다. 증폭된 Ptrc 및 각 유전자의 단편 serA(Avn), serA*(G336V)는 각각 smaI의 제한효소로 처리된 pCL1920 벡터와 깁슨어셈블리 방법으로 클로닝 하였고, pCL-Ptrc-serA(Avn)와 pCL-Ptrc-serA*(G336V)를 제작하였다.
실시예 2: 대장균 야생형 균주에 아조토박터 유래 serA(Avn) 도입된 균주 제작 및 세린 생산능 평가
기반 균주는 대장균 야생형 균주인 W3110 를 이용하였고, 실시예 1에서 제작된 2종의 플라스미드를 각각 W3110에 도입한 균주를 제작하여 세린의 생산능을 평가하였다.
각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 하기 표 2의 25 mL 역가 배지에 접종한 다음, 이를 34.5℃, 200 rpm의 배양기에서 40 시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 3에 나타내었다.
조성물 농도 (리터당)
포도당 40 g
KH2PO4 4 g
(NH4)2SO4 17 g
MgSO4·7H2O 1 g
FeSO4·7H2O 10 mg
MnSO4·4H2O 10 mg
효모액기스 2 g
탄산칼슘 30 g
pH 6.8
균주명 OD562nm 소모당(g/L) L-세린(g/L)
E.coli w3110 19.5 40.0 0.05
W3110/pCL-Ptrc-serA*(G336V) 18.2 38.2 0.08
W3110/pCL-Ptrc-serA(Avn) 18.1 37.6 0.13
상기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 세린에 대한 피드백 저해가 해제되고 활성도 강화된serA를 포함하는 W3110/pCL-Ptrc-serA*(G336V) 균주는 야생형 대비 세린의 생산량이 60%나 증가되었다. 이에 비해, 아조토박터 유래 serA(Avn)를 포함하는 W3110/pCL-Ptrc-serA(Avn)의 세린 생산량은 W3110 대비 160%가 증가하였으며, W3110/pCL-Ptrc-serA*(G336V)보다도 62.5%나이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: serB 약화 및 외래 아조토박터 유래 serA(Avn)가 도입된 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
대장균 야생형 균주인 W3110에서 내재적 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 약화된 O-포스포세린(OPS) 생산 미생물, KCCM11212P('CA07-0012'로도 명명, 한국등록특허 제10-1381048호; 미국공개특허 제2012-0190081호)를 준비하였다.
실시예 1에서 제작된 2종의 플라스미드를 각각 상기 CA07-0012에 도입한 균주를 제작하여 OPS의 생산능을 평가하였다.
각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 하기 표 4의 25 mL 역가 배지에 접종한 다음, 이를 34.5℃, 200 rpm의 배양기에서 40 시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 5에 나타내었다.
조성물 농도 (리터당)
포도당 40 g
KH2PO4 4 g
(NH4)2SO4 17 g
MgSO4·7H2O 1 g
FeSO4·7H2O 10 mg
MnSO4·4H2O 10 mg
L-글리신 2.5 g
효모액기스 2 g
탄산칼슘 30 g
pH 6.8
균주명 OD562nm 소모당(g/L) O-포스포세린(g/L)
CA07-0012 21.1 40.0 1.4
CA07-0012/pCL-Ptrc-serA*(G336V) 20.5 38.6 2.2
CA07-0012/pCL-Ptrc-serA(Avn) 20.0 37.8 2.9
상기 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 세린에 대한 피드백 저해가 해제되고 활성도 강화된serA를 포함하는 CA07-0012/pCL-Ptrc-serA*(G336V)균주는 OPS생산량이 야생형 대비 57% 증가하였다. 아조토박터 유래 serA(Avn)를 포함하는 CA07-0012/pCL-Ptrc-serA(Avn)는 OPS생산량이 야생형 대비 107% 증가하였으며, CA07-0012/pCL-Ptrc-serA*(G336V)보다도 32%나 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 아조토박터(Azotobacter) 유래 serA(Avn) 및 대장균 유래 serC 동시 과발현 벡터 제작
대장균 유래의 3-포스포세린 아미노트랜스퍼레이즈(3-phosphoserine aminotransferase, serC)가 과발현된 균주에 serA(Avn)가 도입되었을 경우 세린 및 OPS 생산능이 추가적으로 향상되는지 확인하기 위하여, serA(Avn)와 serC가 오페론 형태로 발현될 수 있는 pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC 형태의 백터를 제작하였다.
이에 대한 양성 대조군으로서, 대장균 유래의 serA*(G336V)와 serC가 함께 발현되는 미생물을 제조하기 위하여, pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC 벡터를 제작하였다. 상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 6에서 나타낸 바와 같다.
유전자 서열(5'->3') 서열
번호		 벡터
Ptrc_serA(Avn) CCTCACCACGTTGCGTCTCGAGTCAGAACAGAACCCGTGA 8 pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC
(RBS)serC CTCGAGACGCAACGTGGTGA 9 pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC,
pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC
AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCTTAACCGTGACGGCGTTC 10
Ptrc_serA*
(G336V)		 CTCACCACGTTGCGTCTCGAGTTAGTACAGCAGACGGGCG 11 pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC
Ptrc_serA(Avn) PCR은 실시예1 에서 제작한 pCL-Ptrc-serA(Avn)를 주형으로 하여 서열번호 2 및 8 인 프라이머를, Ptrc_serA*(G336V) PCR은 pCL-Ptrc-serA*(G336V)를 주형으로 하여 서열번호 2 및 11 인 프라이머를 이용하였다. 두 벡터의 제작에 공통적으로 사용되는 대장균 유래 (RBS)serC는 w3110 게노믹 DNA을 주형으로 서열번호 9 및 10인 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 획득하였다.
증폭된 Ptrc_serA(Avn)와 (RBS)serC의 단편, Ptrc_serA*(G336V)와 (RBS)serC의 단편은 각각 smaI의 제한효소로 처리된 pCL1920 벡터와 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝 하였고, pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC와 pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC 를 제작하였다.
실시예 5: serC 강화 및 아조토박터 유래 serA(Avn) 도입된 균주 제작 및 세린 생산능 평가
serC가 과발현된 균주에 아조토박터 유래 serA(Avn)가 도입된 경우, 세린의 생산능을 평가하기 위하여, 실시예 4에서 제작된 2종의 플라스미드를 각각 W3110에 도입하였다.
각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 하기 표 7의 25 mL 역가 배지에 접종한 다음, 이를 34.5℃, 200 rpm의 배양기에서 40 시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 8에 나타내었다.
조성물 농도 (리터당)
포도당 40 g
KH2PO4 4 g
(NH4)2SO4 17 g
MgSO4·7H2O 1 g
FeSO4·7H2O 10 mg
MnSO4·4H2O 10 mg
효모액기스 2 g
탄산칼슘 30 g
pH 6.8
균주명 OD562nm 소모당(g/L) L-세린(g/L)
E.coli w3110 19.5 40.0 0.05
w3110/pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC 19.0 39.2 0.21
w3110/pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC 18.1 38.1 0.29
상기 표 8에서 볼 수 있는 바와 같이, serA*(G336V)를 포함하는 w3110/pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC 균주에 비해 아조토박터 유래 serA(Avn)를 포함하는 w3110/pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC의 L-세린의 생산량이 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 즉, L-세린 생산능이 증가된 균주에서도 아조토박터 유래 serA(Avn)를 포함하는 경우 L-세린 생산능을 더욱 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
상기 w3110/pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC 균주는 CA07-4383으로 명명하여, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여, 2018.11.09.일자로 기탁번호 KCCM12381P를 부여받았다.
실시예 6: serB 약화, serC 강화, 및 아조토박터 유래 serA(Avn) 도입된 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
serB의 활성이 약화되고 serC가 과발현된 균주에 아조토박터 유래 serA(Avn)가 도입된 경우, 세린의 생산능을 평가하기 위하여, 실시예 4에서 제작된 2종의 플라스미드를 각각 CA07-0012에 도입한 균주를 제작하여 OPS의 생산능을 평가하였다.
각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 하기 표 9의 25 mL 역가 배지에 접종한 다음, 이를 34.5℃, 200 rpm의 배양기에서 40 시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 10에 나타내었다.
조성물 농도 (리터당)
포도당 40 g
KH2PO4 4 g
(NH4)2SO4 17 g
MgSO4·7H2O 1 g
FeSO4·7H2O 10 mg
MnSO4·4H2O 10 mg
L-글리신 2.5 g
효모액기스 2 g
탄산칼슘 30 g
pH 6.8
균주명 OD562nm 소모당(g/L) O-포스포세린(g/L)
CA07-0012 21.1 40.0 1.4
CA07-0012/pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC 20.5 38.3 2.5
CA07-0012/pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC 19.8 37.5 3.3
상기 표 10에서 볼 수 있는 바와 같이, serA*(G336V)를 포함하는 CA07-0012/pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC 균주에 비해 아조토박터 유래 serA(Avn)를 포함하는 CA07-0012/ pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC의 OPS 생산량이 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 즉, L-세린 생산능이 증가된 균주에서도 아조토박터 유래 serA(Avn)를 포함하는 경우 L-세린 생산능을 더욱 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 7: 아조토박터 유래 serA(Avn) 도입된 에스케리키아속 균주 제작 및 트립토판 생산능 평가
실시예 7-1: L-트립토판을 생산하는 에스케리키아 속 미생물 제작
에스케리키아속 L-트립토판 생산 균주는 야생형의 대장균 W3110 으로부터 개발되었다. L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질이 발현되도록 변형됨에 따라 L-트립토판의 생산량이 획기적으로 증가하는지 확인하기 위하여, L-트립토판을 생산하도록 제작된 균주를 모균주로 이용하였다. 구체적으로, 코리스메이트 (Chorismate)로부터 L-트립토판 생산에 관여하는 L-트립토판 생합성 유전자들의 (trpEDCBA) 발현은 TrpR에 의해 억제된다. 이에 따라 이를 암호화하는 trpR 유전자를 제거하였다. 또한 L-트립토판 생산 향상에 따른 TrpE 폴리펩티드의 피드백 제한 (feedback inhibition) 해소를 위해 TrpE 의 N-말단으로부터 21번 아미노산인 프롤린(Proline)을 세린(Serine)으로 치환하였다 (J. Biochem. Mol. Biol. 32, 20-24 (1999)).
Mtr 막단백질은 세포 외부의 L-트립토판을 세포 내로 유입하는데 역할을 하며, TnaA 단백질은 세포 내의 L-트립토판과 물분자를 인돌 (Indole), 피루브산 (pyruvate), 암모니아 (NH3) 로 분해하는 역할을 한다. 따라서 L-트립토판 생산을 저해하고 분해하는 mtr 유전자와 tnaA 유전자를 제거하였다.
이러한 유전자 제거를 위해 람다 레드 재조합 (λ-red recombination, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K- 12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6;97(12):6640-5) 방법을 이용하였다. mtr 유전자 제거를 위해 pKD4 벡터를 주형으로 하고 서열번호 12과 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 FRT-kanamycin-FRT cassette와 염색체상 상동재조합이 발생하는 mtr 유전자 양 옆의 상동한 50 bp의 염기쌍이 결합된 유전자 단편을 (1580 bp) PCR 수행을 통해 수득하였다. pKD4 벡터의 카나마이신 항생제 마커는 타켓 유전자의 제거 및 항생제 유전자 삽입 확인을 위해 사용하였고, FRT 지역은 목표 유전자가 제거된 후 항생제 마커를 제거해 주는 역할을 한다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열
번호		 프라이머명 서열(5'-3')
12 △mtr cassette - 1 TGCAATGCATAACAACGCAGTCGCACTATTTTTCACTGGAGAGAAGCCCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
13 △mtr cassette - 2 TGCAATGCATAACAACGCAGTCGCACTATTTTTCACTGGAGAGAAGCCCTGTCCATATGAATATCCTCCT
람다 레드 리콤비네이즈 (gam, bet, exo)를 발현하는 pKD46 벡터를 대장균 W3110 균주에 전기천공법으로 형질전환 하였고, 50 mg/L 의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. pKD46 벡터의 형질전환이 확인된 대장균 W3110 균주는 30 ℃ 에서 OD600이 약 0.1 이 되었을 때 10mM의 L-아라비노즈 (L-arabinose) 첨가를 통해 재조합 효소 발현을 유도하였으며, OD600이 약 0.6 이 되었을 때 컴피턴트 세포로 준비된 후 상기 과정에서 수득된 FRT-kanamycin-FRT cassette 과 mtr 유전자 양 옆의 상동한 50 bp의 염기쌍이 결합된 선형 유전자 단편을 전기 천공법을 통해 형질전환하였다. 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에서 자란 콜로니는 서열번호 14와 서열번호 15를 이용하여 콜로니 PCR을 진행하였고, 782 bp 의 유전자 단편이 제작되는 콜로니를 선택하였다.
서열
번호		 프라이머 명 서열(5'->3')
14 Confirm_Cassette - 1 GGGCAGGATCTCCTGTCATC
15 Confirm_△mtr - 2 AAATGTCGGATAAGGCACCG
상동재조합이 발생하여 mtr 유전자가 제거된 균주는 카나마이신 항생제 마커 제거를 위해 컨피턴트 세포로 준비된 후 pCP20 벡터로 전기천공법으로 형질전환하였다. pCP20 벡터는 FLP 단백질을 발현하여 카나마이신 항생제 양 옆 FRT 지역을 인식하고 염색체 상 결합됨으로써, FRT 지역 사이의 항생제 마커를 제거한다. 100 mg/L의 엠피실린 (Ampicillin)과 25 mg/L의 클로암페티콜 (Chloramphenicol)이 포함된 LB 고체배지에서 성장한 pCP20 벡터 형질전환 균주를 30 ℃ LB 액체배지에서 1시간 배양 후 42 ℃ 에서 15시간 추가 배양하였고 LB 고체배지에 도말하였다. 자란 콜로니는 100 mg/L의 엠피실린 (Ampicillin)과 25 mg/L의 클로암페티콜 (Chloramphenicol)이 포함된 LB 고체배지, 12.5 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지, 항생제가 포함되지 않은 LB 고체배지에 배양하였으며, 항생제가 포함되지 않은 LB 고체배지에서만 자란 콜로니를 선택하였다. 게놈 시퀀싱을 통해 mtr 유전자 제거를 최종 확인하였으며, 이를 CA04-9300으로 명명하였다.
tnaA 유전자 제거를 위해 상기와 같은 방법으로 유전자 조작을 수행하였다. pKD4 벡터를 주형으로 하고 서열번호 16과 서열번호 17을 이용하여 FRT-kanamycin-FRT cassette 과 염색체상 상동재조합이 발생하는 tnaA 유전자 양 옆의 상동한 50 bp의 염기쌍이 결합된 유전자 단편을 (1580 bp) PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열
번호		 프라이머 명 서열(5'->3')
16 △tnaA cassette - 1 TGTAATATTCACAGGGATCACTGTAATTAAAATAAATGAAGGATTATGTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
17 △tnaA cassette - 2 TGTAGGGTAAGAGAGTGGCTAACATCCTTATAGCCACTCTGTAGTATTAAGTCCATATGAATATCCTCCT
18 Confirm_△tnaA - 2 ACATCCTTATAGCCACTCTG
pKD46 벡터의 형질전환을 확인하였고, 10mM의 L-아라비노즈 첨가를 통해 재조합 효소들이 발현된 CA04-9300 균주는 전기천공법을 통해 상기 과정에서 수득된 FRT-kanamycin-FRT cassette와 tnaA 유전자 양 옆의 상동한 50 bp의 염기쌍이 결합된 선형 유전자 단편을 형질전환하였다. 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에서 자란 콜로니는 서열번호 14와 서열번호 18를 이용하여 콜로니 PCR을 진행하였고, 787 bp 의 유전자 단편이 제작되는 콜로니를 선택하였다.
상동재조합이 발생하여 tnaA 유전자가 제거된 균주는 카나마이신 항생제 마커 제거를 위해 컨피턴트 세포로 준비된 후 pCP20 벡터를 형질전환 하였고, FLP 단백질 발현으로 카나마이신 항상제 마커가 제거된 균주를 제작하였다. 게놈 시퀀싱을 통해 tnaA 유전자 제거를 최종 확인하였으며, 이를 CA04-9301으로 명명하였다.
trpR 유전자 제거를 위해 pKD4 벡터를 주형으로 하고 서열번호 19과 서열번호 20의 프라이머를 이용하여 FRT-kanamycin-FRT cassette와 염색체상 상동재조합이 발생하는 trpR 유전자 양 옆의 상동한 50 bp의 염기쌍이 결합된 유전자 단편을 (1580 bp) PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열
번호		 프라이머 명 서열(5'->3')
19 △trpR cassette - 1 TACAACCGGGGGAGGCATTTTGCTTCCCCCGCTAACAATGGCGACATATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
20 △trpR cassette - 2 GCATTCGGTGCACGATGCCTGATGCGCCACGTCTTATCAGGCCTACAAAAGTCCATATGAATATCCTCCT
21 Confirm_△trpR - 2 AGGACGGATAAGGCGTTCAC
pKD46 벡터의 형질전환을 확인하였고, 10mM의 L-아라비노즈 첨가를 통해 재조합 효소들이 발현된 CA04-9301 균주는 전기천공법을 통해 상기 과정에서 수득된 FRT-kanamycin-FRT cassette와 trpR 유전자 양 옆의 상동한 50 bp의 염기쌍이 결합된 선형 유전자 단편을 형질전환하였다. 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에서 자란 콜로니는 서열번호 14와 서열번호 21의 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 진행하였고, 838 bp 의 유전자 단편이 제작되는 콜로니를 선택하였다.
상동재조합이 발생하여 trpR 유전자가 제거된 균주는 카나마이신 항생제 마커 제거를 위해 컨피턴트 세포로 준비된 후 pCP20 벡터를 형질전환 하였고, FLP 단백질 발현으로 카나마이신 항상제 마커가 제거된 균주를 제작하였다. 게놈 시퀀싱을 통해 trpR 유전자 제거를 최종 확인하였으며, 이를 CA04-9307로 명명하였다.
상기 CA04-9307 균주에서 feedback resistant trpE 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 제한효소 EcoRI이 포함된 서열번호 22, 서열번호 23을 이용하여 EcoRI 서열이 포함된 trpE 유전자 단편을 (1575 bp) PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열
번호		 프라이머 명 서열(5'->3')
22 trpE - 1 GAATTCATGCAAACACAAAAACCGAC
23 trpE - 2 GAATTCTCAGAAAGTCTCCTGTGCA
상기의 방법으로 획득된 trpE 유전자 및 pSG76-C 플라스미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 1997, p. 4426-4428)에 각각 EcoRI 제한효소를 처리하여 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 대장균 DH5α에 전기천공법으로 형질전환 하였고, 클로람페니콜(chlororamphenocol) 25μg/ml를 포함하는 LB 플레이트에서 형질전환된 대장균 DH5α를 선별하여 pSG76-C-trpE 플라스미드를 획득하였다.
상기에서 획득된 pSG76-C-trpE 플라스미드를 이용하여 site directed mutagenesis (Stratagene, 미국) 방법으로 서열번호 24, 서열번호 25 프라이머를 이용하여 pSG76-C-trpE(P21S)를 제작하였다.
서열
번호		 명칭 프라이머(5'->3')
24 trpE(P21S) - 1 CGCTTATCGCGACAATTCCACCGCGCTTTTTCACCAG
25 trpE(P21S) - 2 CTGGTGAAAAAGCGCGGTGGAATTGTCGCGATAAGCG
CA04-9307 균주에 상기의 pSG76-C-trpE(P21S) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질전환체는 pSG76-C-trpE(P21S) 플라스미드가 유전체내의 trpE 부분에 1차로 삽입된 균주이다. 확보된 trpE(P21S) 유전자가 삽입된 균주에 pSG76-C 플라스미드 내에 존재하는 I-SceI 부분을 절단하는 제한 효소 I-SceI를 발현하는 플라스미드인 pAScep(JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 1997, p. 4426-4428)를 형질전환하여 LB-Ap(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicilline 100ug/L)에서 생장하는 균주를 선별하였다. 선별된 균주에서 서열번호 22, 서열번호 23 프라이머를 이용하여 trpE 유전자를 증폭하였고, 증폭된 유전자는 시퀀싱을 통해 trpE(P21S)로 교체되었음을 확인하였다. 이렇게 제작된 균주는 CA04-4303으로 명명하였다.
실시예 7-2: 아조토박터 유래 serA(Avn)가 도입된 에스케리키아 속 미생물 제작 및 트립토판 생산능 평가
상기 실시예 1에서 제작된 pCL-Ptrc-serA(Avn) 벡터와 대조군으로써 pCL1920 벡터를 실시예 1에서 제작된 CA04-4303에 도입하여 CA04-4303/pCL1920, CA04-4303/pCL-Ptrc-serA(Avn) 균주를 제작하였다. 상기 두 균주 CA04-4303/pCL1920 과 CA04-4303/pCL-Ptrc-serA(Avn) 의 L-트립토판 생산량을 확인하고자 50 mg/L의 스펙티노마이신 (Spectinomycin) 이 포함된 LB 액체배지에 12시간 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 초기 OD600 값이 0.01 이 되게 접종하고 37 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
CA04-4303/pCL1920 과 CA04-4303/pCL-Ptrc-serA(Avn) 에 대한 배지 중의 L-트립토판 생산에 대한 결과는 아래 표 17과 같다. CA04-4303/pCL1920 균주는 L-트립토판을 1.2g/L 생산하고 중간 산물인 인돌이 37mg/L 축적되었으나, 상기에서 serA(Avn)을 도입한 균주는 인돌이 축적되지 않고 L-트립토판을 1.7g/L 생산하였다.
< 생산배지 (pH 7.0)>
포도당 70g, (NH4)2SO4 20 g, MgSO4 7H2O 1 g, KH2PO4 2 g, 효모추출물 2.5 g, Na-citrate 5 g, NaCl 1 g, CaCO3 40 g (증류수 1리터 기준).
serA(Avn) 포함된 L-트립토판 생산량 확인
균주 OD L-트립토판
(g/L)		 인돌
(mg/L)
CA04-4303/pCL1920 37.9 1.2 37
CA04-4303/pCL-Ptrc-serA(Avn) 38.4 1.7 0
상기의 결과에서 알 수 있듯이 serA(Avn) 도입에 의하여 L-세린 공급이 원활해졌을 것으로 추측되며, L-트립토판 생합성 마지막 단계의 중간 산물인 인돌도 축적되지 않고, L-트립토판 수율도 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 7-3: 외래 아조토박터 유래 serA(Avn)가 도입된 트립토판 을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 제작
상기의 아조토박터 유래 serA(Avn) 유전자의 효과를 코리네 박테리움 속 트립토판 생산균주에서도 확인하기 위하여 L-트립토판을 생산하는 코리네 박테리움 속 균주로써 KCCM12218P(대한민국특허 공개번호 제2018-0089329 호)가 사용되었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 serA(이하, serA(Cgl))유전자를 아조토박터 유래 serA(Avn) 유전자로 교체하고, gapA 프로모터에 의해 발현되도록 균주를 제작하였다.
이러한 유전자 조작을 위해 우선 염색체상 상동재조합 (Homologous recombination)이 발생하는 serA(Cgl)유전자의 프로모터 업스트림 (Upstream)과 serA(Cgl) 유전자 ORF의 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 26과 서열번호 27의 프라이머를 이용하여 프로모터 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 28과 서열번호 29의 프라이머를 이용하여 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다. 또한, gapA 프로모터 지역도 코리네 박테리움 글루타미쿰 염색체 DNA 를 주형으로 하여 서열번호 30과와 서열번호 31의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 58℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
아조토박터 유래 serA(Avn) 유전자 부분은 실시예 1에서 제작된 pCL-Ptrc_-serA(Avn) 벡터를 주형으로 하여 서열번호 32와 서열번호 33의 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행하였다
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 58℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 증폭된 업스트림 지역과 다운스트림 지역, gapA 프로모터, 아조토박터 유래 serA(Avn) 유전자, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-PgapA- serA(Avn) 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZ-PgapA-serA(Avn) 벡터를 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM12218P 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 serA(cgl) 유전자가 gapA프로모터에 의해 발현되는 아조토박터 serA 유전자로 교체된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 34와 서열번호 35 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 KCCM12218P-PgapA-serA(Avn) 로 명명하였다.
본 실시예서 사용한 프라이머의 서열은 표 18에 나타낸 바와 같다.
서열번호 프라이머 명 서열(5'->3')
26 SerA(Cgl)-up-F TCGAGCTCGGTACCCGGAAGATCTAGTCGGATACG
27 SerA(Cgl)-up-R TCGTTTTTAGGCCTCCGACTACTTTGGGCAATCCT
28 SerA(Cgl)-down-F TCTGTTCTGATTAGAGATCCATTTGCTTGAAC
29 SerA(Cgl)-down-R CTCTAGAGGATCCCCTCACCCAGCTCAAAGCTGAT
30 PgapA-F TGCCCAAAGTAGTCGGAGGCCTAAAAACGACCGAG
31 PgapA-R TCTTACTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAG
32 serA(Avn)-F GAGACACAACATGAGTAAGACCTCCCTG
33 serA(Avn)-R GGATCTCTAATCAGAACAGAACCCGTGAG
34 Confirm-serA-F ACCAAGAGTTCGAAGACCAG
35 Confirm-serA-R TTCAGTGGCTTCCACATCGC
실시예 7-4: 아조토박터 유래 serA(Avn)가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 트립토판 생산능 평가
상기 실시예 7-3에서 제작된 KCCM12218P-PgapA-serA(Avn) 균주와 모균주 KCCM12218P 의 트립토판 생산량을 확인하고자 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
< 종배지 (pH 7.0) >
포도당 20g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
< 생산배지 (pH 7.0) >
포도당 30g, (NH4)2SO4 15 g, MgSO4 7H2O 1.2 g, KH2PO4 1 g, 효모추출물 5 g, 바이오틴 900 ㎍, 티아민 염산염 4500 ㎍, 칼슘-판토텐산 4500 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
외래 아조토박터 유래 serA(Avn)이 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 트립토판 생산량 확인
OD 사용한
포도당
(g/L)		 트립토판 생산량 (g/L) 인돌
(mg/L)
KCCM12218P 43.6 30 2.5 59
KCCM12218P-PgapA-serA(Avn) 42.3 30 3.1 0
KCCM12218P, KCCM12218P-PgapA-serA(Avn) 에 대한 배양물 중의 L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 19와 같다.
모균주 KCCM12218P 균주는 L-트립토판을 2.5g/L 생산하고 중간 산물인 인돌이 59mg/L 축적되었으나, 상기에서 serA(Avn)을 도입한 균주는 인돌이 축적되지 않고 L-트립토판을 3.1g/L 생산하였다.
상기의 결과로부터 아조토박터 유래의 serA(Avn) 도입에 의하여 L-트립토판을 생산하는 코리네 박테리움 글루타미쿰 균주에서도 L-세린 공급이 원활해졌을 것으로 추측되며, 이로부터 L-트립토판 생합성 마지막 단계의 중간 산물인 인돌도 축적되지 않고 L-트립토판 수율도 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 이와 같이 전구체 향상이 함께 할 때 트립토판 생산에 시너지 효과가 크다는 것을 알 수 있다.
상기 KCCM12218P-PgapA-serA(Avn)균주는 CM05-8935로 명명하였으며, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여, 2018.11.27일자로 기탁번호 KCCM 12414P를 부여받았다.
실시예 8: 아조토박터 유래 serA(Avn)가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 제작 및 히스티딘 생산능 평가
실시예 8-1: 히스티딘 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 L-히스티딘 생산균주는 야생형의 ATCC13032 균주로부터 개발되었다. L-히스티딘 생합성 경로의 첫번째 효소인 HisG 폴리펩디드의 피드백 제한(Feedback inhibition)을 해소하기 위해 HisG의 N-말단으로부터 233번째와 235번째 아미노산을 각각 글라이신(Glycine)에서 히스티딘(histidine), 쓰레오닌(Threonine)에서 글루타민(Glutamine) 으로 동시에 치환하였다 (서열번호 88) (ACS Synth. Biol., 2014, 3 (1), pp 21-29). 또한 L-히스티딘 생합성 경로 강화를 위해, 총 4개의 오페론(operon)으로 분리되어 있는 생합성 유전자들(hisD-hisC-hisB-hisN)을 프로모터가 치환된 형태의 cluster로 제작하여 도입하였다(서열번호89).
이러한 유전자 조작을 위해 우선 염색체상 상동재조합 (Homologous recombination)이 발생하는 hisG 233번, 235번 변이 업스트림 (Upstream) 과 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 36과 서열번호 37의 프라이머를 이용하여 hisG 233번, 235번 변이 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 38과 서열번호 39의 프라이머를 이용하여 hisG 233번, 235번 변이 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다.
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 hisG 233번, 235번 변이 업스트림과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ(특허등록 제10-0924065호) 는 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-hisG(G233H, T235Q) 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZ-hisG(G233H, T235Q) 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 HisG 233번, 235번 아미노산이 각각 글라이신에서 히스티딘, 쓰레오닌에서 글루타민으로 교체(서열번호 88)된 균주를 얻었다. 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 40과 서열번호 41을이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 CA14-0011 로 명명하였다.
본 실시예서 사용한 프라이머의 서열은 표 20에 나타낸 바와 같다.
서열번호 프라이머 명 서열(5'->3')
36 (hisG(G233H, T235Q) F-1) TCGAGCTCGGTACCCATCGCCATCTACGTTGCTGG
37 (hisG(G233H, T235Q) R-1) GTGCCAGTGGGGATACCtgTGGGtgGGATAAGCCTGGGGTTACTG
38 (hisG(G233H, T235Q) F-2) AACCCCAGGCTTATCCcaCCCAcaGGTATCCCCACTGGCACGCGA
39 (hisG(G233H, T235Q) R-2) CTCTAGAGGATCCCCGGGACGTGGTTGATGGTGGT
40 (hisG CF) ATGGAAATCCTCGCCGAAGC
41 (hisG CR) ATCGATGGGGAACTGATCCA
또한 L-히스티딘 생합성 경로 강화를 위해, 총 4개의 오페론(operon)으로 분리되어 있는 생합성 유전자들을 프로모터가 치환된 형태의 cluster로 제작하여 도입하고자 하였다. 구체적으로, 상기 L-히스티딘 생합성 cluster는 총 4개의 오페론(operon)(hisE-hisG, hisA-impA-hisF-hisI, hisD-hisC-hisB, cg0911-hisN)으로 분리되어 있으며, 상기 생합성 유전자들을 한번에 미생물내로 도입하는 벡터를 제작하였다.
또한 상기 생합성 cluster의 삽입부위는 감마-아미노부티레이트 퍼미아제를 코딩하는 Ncgl1108 유전자(Microb Biotechnol. 2014 Jan;7(1):5-25)를 사용하였다.
이러한 유전자 조작을 위해 우선 염색체상 상동재조합 (Homologous recombination)이 발생하는 Ncgl1108 업스트림 (Upstream) 과 다운스트림(Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 42와 서열번호 43의 프라이머를 이용하여 Ncgl1108 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 44와 서열번호 45의 프라이머를 이용하여 Ncgl1108 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다.
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 NCgl1108 업스트림과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ(특허등록 제10-0924065호) 는 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-△Ncgl1108 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZ-△Ncgl1108 벡터를 CA14-0011 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 Ncgl1108 유전자가 파쇄된 균주를 얻었다. 유전자가 파쇄된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 46과 서열번호 47을 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 CA14-0736 로 명명하였다.
본 실시예서 사용한 프라이머의 서열은 표 21에 나타낸 바와 같다.
서열번호 프라이머 명 서열(5'->3')
42 (KO Ncgl1108 F-1) TCGAGCTCGGTACCCATCGCCATCTACGTTGCTGG
43
(KO Ncgl1108 R-1)		 GAGTCTAGAAGTACTCGAGATGCTGACCTCGTTTC
44 (KO Ncgl1108 F-2) AGCATCTCGAGTACTTCTAGACTCGCACGAAAAAG
45 (KO Ncgl1108 R-2) CTCTAGAGGATCCCCTTTGGGCAGAGCTCAAATTC
46 (KO hisG CF) AGTTTCGTAACCCACCTTGC
47 (KO hisG CR) CGCTTCTCAATCTGATGAGA
또한 생합성 cluster 강화를 위해 4개의 오페론 유전자군과 치환할 프로모터 부분을 확보하고자 하였다. 개량형 lysC 프로모터(이하, lysCP1, 대한민국 등록특허 제10-0930203호) 지역과 hisE-hisG 지역, gapA 프로모터 지역과 hisA-impA-hisF-hisI 지역, SPL13 합성 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1783170호) 지역과 hisD-hisC-hisB 지역, CJ7 합성프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호 및 WO2006/065095) 지역과 cg0911-hisN 지역을 수득하였다. 구체적으로 KCCM10919P 균주(대한민국 등록특허 제10-0930203호)의 염색체를 주형으로 하고, 서열번호 48과 서열번호 49의 프라이머를 이용하여 PCR을실시하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 lysCP1프로모터 지역을 수득하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 CA14-0011 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 50과 서열번호 51의 프라이머를 이용하여 hisE-hisG 지역의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다. 서열번호 52와 서열번호 53의 프라이머를 이용하여 gapA 프로모터 지역을, 서열번호 54와 서열번호 55의 프라이머를 이용하여 hisA-impA-hisF-hisI 지역의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다. 또한 합성 제작한 프로모터 SPL13을 주형으로 서열번호 56과 서열번호 57의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 코리네박테리움 글루타미쿰 CA14-0011 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 58과 서열번호 59의 프라이머를 이용하여 hisD-hisC-hisB 지역의 유전자 단편을 PCR을 통해 수득하였다. 그리고 합성 제작한 프로모터 CJ7을 주형으로 서열번호 60과 서열번호 61의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 코리네박테리움 글루타미쿰 CA14-0011 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 62와 서열번호 63의 프라이머를 이용하여 cg0911-hisN 지역의 유전자 단편을 PCR을 통해 수득하였다.
본 실시예서 사용한 프라이머의 서열은 표 22에 나타낸 바와 같다.
서열번호 프라이머 명 서열(5'->3')
48 (his cluster F-1) GTCAGCATCTCGAGTGCTCCTTAGGGAGCCATCTT
49 (his cluster R-1) GTCAAATGTCTTCACATGTGTGCACCTTTCGATCT
50 (his cluster F-2) GAAAGGTGCACACATGTGAAGACATTTGACTCGCT
51 (his cluster R-2) TCGTTTTTAGGCCTCCTAGATGCGGGCGATGCGGA
52 (his cluster F-3) ATCGCCCGCATCTAGGAGGCCTAAAAACGACCGAG
53 (his cluster R-3) GACAGTTTTGGTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGAT
54 (his cluster F-4) TAGAGGAGACACAACATGACCAAAACTGTCGCCCT
55 (his cluster R-4) TGAAGCGCCGGTACCGCTTACAGCAAAACGTCATT
56 (his cluster F-5) CGTTTTGCTGTAAGCGGTACCGGCGCTTCATGTCA
57 (his cluster R-5) AGTGACATTCAACATTGTTTTGATCTCCTCCAATA
58 (his cluster F-6) GAGGAGATCAAAACAATGTTGAATGTCACTGACCT
59 (his cluster R-6) CGCTGGGATGTTTCTCTAGAGCGCTCCCTTAGTGG
60 (his cluster F-7) AAGGGAGCGCTCTAGAGAAACATCCCAGCGCTACT
61 (his cluster R-7) AGTCATGCCTTCCATGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG
62 (his cluster F-8) CGAAAGGAAACACTCATGGAAGGCATGACTAATCC
63 (his cluster R-8) CGAGTCTAGAAGTGCCTATTTTAAACGATCCAGCG
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 180초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 lysCP1지역과 hisE-hisG 지역, gapA 프로모터 지역과 hisA-impA-hisF-hisI 지역, SPL13 합성 프로모터 지역과 hisD-hisC-hisB 지역, CJ7 합성프로모터 지역과 cg0911-hisN 지역, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ-△NCgl1108 는 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-△NCgl1108::lysCP1_hisEG-PgapA_hisA-impA-hisFI-SPL13_HisDCB-CJ7_cg0911-hisN 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZ-△Ncgl1108::PlysCm1_hisEG-PgapA_hisA-impA-hisFI-SPL13_HisDCB-CJ7_cg0911-hisN 벡터를 CA14-0011 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 생합성 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 46과 서열번호 47을 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 CA14-0737 로 명명하였다.
상기 CA14-0737 균주는 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여, 2018.11.27일자로 기탁번호 KCCM 12411P를 부여받았다.
실시예 8-2: 외래 아조토박터 유래 serA(Avn)가 도입된 His 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 균주 제작
상기의 아조토박터 유래 serA(Avn) 유전자의 L-히스티딘 생산능 증가 효과를 확인하기 위하여 CA14-0737 균주가 실시예에 사용되었다.
상기 실시예 7-3에서 제작된 pDZ-PgapA- serA(Avn)를 사용하여 serA(Cgl))유전자를 아조토박터 유래 serA(Avn) 유전자로 교체하고, gapA 프로모터에 의해 발현되도록 균주를 제작하였다.
pDZ-PgapA-serA(Avn) 벡터를 L-히스티딘을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 CA14-0737 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 serA(Cgl) 유전자가 강한 프로모터인 gapA 프로모터에 의해 발현되는 아조토박터 serA 유전자로 교체된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 34와 서열번호 35 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 CA14-0738 로 명명하였다
실시예 8-3: 아조토박터 유래 serA(Avn)가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 L-히스티딘 생산능 평가
상기 실시예 8-1, 8-2에서 제작된 CA14-0011 균주, CA14-0736균주, CA14-0737균주, CA14-0738균주의 L-histidine 생산능을 확인하고자 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-히스티딘의 생산량을 측정하였다.
< 종배지 (pH 7.0) >
포도당 20g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
< 생산배지 (pH 7.0) >
포도당 100g, (NH4)2SO4 40 g, 효모추출물 3 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4 7H2O 0.4 g, MnSO4 H2O 0.01 g, FeSO4 7H2O 0.01 g, 바이오틴 50 ㎍, 티아민 100 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
외래 아조토박터 유래 serA(Avn)이 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 L-히스티딘 생산량 확인
OD 사용한
포도당
(g/L)		 히스티딘 생산량 (g/L)
CA14-0011 113.6 100 0.51
CA14-0736 115.1 100 0.50
CA14-0737 88.9 100 4.09
CA14-0738 84.7 100 5.07
코리네박테리움 글루타미쿰 L-히스티딘 생산균주의 배양물 중의 L-히스티딘 생산에 대한 결과는 상기 표 24와 같다.
히스티딘 생산능을 증가시킨 모균주 CA14-0737 균주는 L-히스티딘을 4.09 g/L 생산하였으나, 상기에서 serA(Avn)을 도입한 CA14-0738 균주는 상기 CA14-0737 대비 20%나 더 증가한 L-히스티딘을 5.07 g/L 생산하였다.
상기의 결과로부터 아조토박터 유래의 serA(Avn) 도입에 의하여 L-히스티딘 생산능을 향상시킬 수 있음을확인하였다. 상기 CA14-0738균주는 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여, 2018.11.27일자로 기탁번호 KCCM 12412P를 부여받았다.
실시예 9: 아조토박터 serA가 도입된 메티오닌(Met) 생산 균주 제작 및 평가
실시예 9-1: mcbR 유전자 결손을 위한 재조합 벡터 제작
본 실시예에서는 메티오닌 생산 균주를 제작하기 위해, ATCC13032 균주를 가지고, 기 공지된 메티오닌 시스테인 전사 조절인자 단백질를 코딩하는 mcbR (J. Biotechnol. 103:51-65, 2003) 의 불활성화를 위해 벡터를 제작하였다.
구체적으로, mcbR 유전자를 코리네박테리움 ATCC13032 염색체 상에서 결손시키기 위하여 하기의 방법으로 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다. 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 mcbR 유전자 및 주변서열(서열번호 101)을 확보하였다.
결손된 mcbR 유전자를 획득하기 위한 목적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 64 및 서열번호 65, 서열번호 66 및 서열번호 67의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 700bp DNA 단편들을 수득하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제10-0924065호)와 상기 증폭한 mcbR 유전자 단편들을 염색체 도입용 제한효소 smaI 으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자들의 결손된 단편이 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 pDZ-△mcbR 이라 명명하였다.
본 실시예서 사용한 프라이머의 서열은 표 24에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'->3')
64 TCGAGCTCGGTACCCCTGCCTGGTTTGTCTTGTA
65 CGGAAAATGAAGAAAGTTCGGCCACGTCCTTTCGG
66 AGGACGTGGCCGAACTTTCTTCATTTTCCGAAGGG
67 CTCTAGAGGATCCCCGTTTCGATGCCCACTGAGCA
실시예 9-2: metH, cysI를 동시에 강화하는 재조합 벡터 제작.
본 실시예에서는 메티오닌 생산 균주를 제작하기 위해, ATCC13032 균주를 가지고, 기 공지된 메치오닌 합성 효소를 코딩하는 metH (Ncgl1450), 설파이트 환원 효소를 코딩하는 cysI (Ncgl2718)를 동시에 강화하기 위해 벡터를 제작하였다.
구체적으로, metH 및 cysI 유전자를 코리네박테리움 ATCC13032 염색체 상에서 추가 삽입시키기 위하여 하기의 방법으로 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다. 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 metH 유전자 및 주변서열(서열번호 102)과 cysI 유전자 및 주변서열(서열번호 103)을 확보하였다.
먼저 이들을 삽입하기 위해 Ncgl1021 (Transposase)를 제거하기 위한 벡터를 제작하였다. 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 Ncgl1021 및 주변 서열 (서열변호 104)을 확보하였다. 결손된 Ncgl1021 유전자를 획득하기 위한 목적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 68 및 서열번호 69, 서열번호 70 및 서열번호 71의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 DNA 단편들을 수득하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제10-0924065호)와 상기 증폭한 Ncgl1021 유전자 단편들을 염색체 도입용 제한효소 xbaI 으로 처리한 뒤, 깁슨어셈블리 방법으로 클로닝 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자들의 결손된 단편이 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 pDZ-△Ncgl1021 이라 명명하였다.
다음 metH 및 cysI 유전자를 획득하기 위한 목적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 72 및 서열번호 73, 서열번호 74 및 서열번호 75의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 또한 metH 유전자의 발현 강화를 위해 Pcj7 프로모터 및 cysI 유전자의 발현 강화를 위해 Pspl1 프로모터를 사용하였으며, 이를 획득하기 위한 목적으로 먼저 Pcj7의 경우 코리네박테리움 암모니아게세스 ATCC 6872 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 76, 77을 이용하여 PCR을 수행하였고, Pspl1은 기 공지된 spl1-GFP (대한민국특허 등록번호 제10-1783170호) 벡터 DNA를 주형으로 하여 서열번호 78, 79를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 metH 유전자 및 cysI, Pcj7 프로모터 및 Pspl1 프로모터 DNA 단편을 확보하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ-△Ncgl1021 벡터를 제한효소 scaI 으로 처리한 뒤, 상기 증폭한 4개의 DNA 단편들을 염색체 도입용 제한효소 scaI 으로 처리한 뒤, 깁슨어셈블리 방법으로 클로닝 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자들의 결손된 단편이 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 pDZ-△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 라 명명하였다.
본 실시예서 사용한 프라이머의 서열은 표 25에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'->3')
68 ACCCGGGGATCCTCTAGAATGTTTGTGATGCGCAG
69 GTCAGAGAGTACTTACGCTGATCGGGAGGGAAAGC
70 ATCAGCGTAAGTACTCTCTGACTAGCGTCACCCTC
71 CTGCAGGTCGACTCTAGAAAAGGGATTGGAGTGTT
72 CAACGAAAGGAAACAATGTCTACTTCAGTTACTTC
73 TCGAGCTCGGTACCCCTGCGACAGCATGGAACTC
74 ATCAAAACAGATATCATGACAACAACCACCGGAAG
75 CGCTAGTCAGAGAGTTCACACCAAATCTTCCTCAG
76 CCGATCAGCGTAAGTAGAAACATCCCAGCGCTACT
77 AACTGAAGTAGACATTGTTTCCTTTCGTTGGGTAC
78 TACTTTAACGTCTAAGGTACCGGCGCTTCATGTCA
79 GGTGGTTGTTGTCATGATATCTGTTTTGATCTCCT
실시예 9-3: L-methionine 생산주 균주 개발 및 이를 이용한 L-methionine 생산
상기에서 제작된 pDC-△mcBR, pDZ-△Ncgl1021 및 pDZ-△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 벡터를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 ATCC13032 균주에 각각 전기천공법으로 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 그 후, 수크로오즈를 포함하고 있는 고체배지에서 2차 재조합을 하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주를 대상으로 서열번호 80, 81의 프라이머를 이용하여 PCR법을 통하여 mcBR 유전자가 결손된 균주를 확인하였고, 또한 서열번호 82, 83의 프라이머를 이용하여 Ncgl1021 유전자가 결손된 균주 및 Ncgl1021 자리에 Pcj7-metH-Pspl1cysI 유전자가 잘 삽입됐는지 확인하였다. 본 재조합 균주들은 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 13032/△mcbR, 13032/△Ncgl1021, 13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 이라 명명하였다.
본 실시예서 사용한 프라이머의 서열은 표 26에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'->3')
80 AATCTGGATTTCCGCCAGGT
81 CTTCCTAACTCCTGAGGAAG
82 ATCCCCATCGGCATCTTTAT
83 CGATCACACTGGGCTGATCT
상기 제작된 13032/△mcbR, 13032/△Ncgl1021, CJP13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 균주의 L-메티오닌 생산능을 분석하기 위해 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주와 함께 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032과 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 13032/△mcbR, 13032/△Ncgl1021, 13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 를 접종하고, 30℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
< 종배지 (pH 7.0) >
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
< 생산배지 (pH 8.0) >
포도당 50 g, (NH4)2S2O3 12 g, Yeast extract 5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 1.2 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
상기 배양 방법으로 배양하여 배양액의 중의 L-메티오닌 농도를 분석하여 표 27에 나타내었다.
제작된 균주 평가
균주 L-메티오닌(g/L)
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (야생형) 0.00
13032/ΔmcbR 0.12
13032/ΔNcgl1021 0.00
13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 0.18
그 결과, mcbR 단독 제거 균주에서 대조군 균주 대비 L-메티오닌 생산능이 0.12g/L 향상되었음을 확인할 수 있었다. 또한, mcBR이 결손되지 않고, metH 및 cysI이 과발현된 균주는 대조군 균주 대비 L-메티오닌 생산능이 0.18 g/l 향상되었음을 확인 할 수 있었다.
실시예 9-4: 아조토박터(Azotobacter) 유래 3-포스포글리세레이트 디하드로제네이즈(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, serA(Avn)) 과발현 벡터 제작
아조토박터 유래 3-포스포글리세레이트 디하드로제네이즈(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, 이하 'serA(Avn)'로 지칭함)를 강화시켜 주었을 경우 메치오닌 생산능이 향상되는지 확인하기 위하여 발현 벡터를 제작하였다.
SerA(Avn)을 코딩하는 유전자 serA(Avn)(서열번호 1)의 발현을 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰으로의 형질전환에 사용 가능한 셔틀벡터인 pECCG117(Biotechnology letters vol 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)을 이용하였다. 발현 프로모터는 spl1 프로모터(이하, Pspl1)를 사용하여 pECCG117-Pspl1-serA(Avn) 형태의 벡터를 제작하였다. Pspl1 프로모터 PCR은 서열번호 84 및 85를 이용하였고, 외래 serA(Avn) PCR은 서열번호 86 및 87인 프라이머를 이용하였다. 증폭된 Pspl1 및 serA(Avn) 유전자 단편을 EcoRV의 제한효소로 처리된 pECCG117 벡터와 깁슨어셈블리 방법을 이용하여 클로닝 하였고, 그리하여 pECCG117-Pspl1-serA(Avn)을 제작하였다.
본 실시예서 사용한 프라이머의 서열은 표 28에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'->3')
84 ATCGATAAGCTTGATGGTACCGGCGCTTCATGTCA
85 GGAGGTCTTACTCATGATATCTGTTTTGATCTCCT
86 ATCAAAACAGATATCATGAGTAAGACCTCCCTGGA
87 CTGCAGGAATTCGATTCAGAACAGAACCCGTGAGC
실시예 9-5: L-methionine 생산주에 대장균 야생형 균주를 이용한 아조토박터 유래 serA(Avn) 도입된 균주 제작 및 L-methionine 생산능 평가
상기에서 제작된 pECCG117-Pspl1-serA(Avn) 벡터를 13032/△mcbR 및 13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 균주에 각각 전기천공법으로 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 본 재조합 균주들은 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 13032/△mcbR (pECCG117-Pspl1-serA(Avn)) 및 13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI (pECCG117-Pspl1-serA(Avn)) 이라 명명하였다.
상기 제작된 13032/△mcbR (pECCG117-Pspl1-serA(Avn)) 및 13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI (pECCG117-Pspl1-serA(Avn)) 균주의 L-메티오닌 생산능을 분석하기 위해 모균주인 13032/△mcbR 및 13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 균주와 함께 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032과 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 13032/△mcbR, 13032/△Ncgl1021, 13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 를 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 특히 벡터가 들어있는 균주는 카나마이신(25mg/ℓ)을 추가로 넣고 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
< 종배지 (pH 7.0) >
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
< 생산배지 (pH 8.0) >
포도당 50 g, (NH4)2S2O3 12 g, Yeast extract 5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 1.2 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
상기 배양 방법으로 배양하여 배양액의 중의 L-메티오닌 농도를 분석하여 표 29에 나타내었다.
제작된 균주 평가
균주 L-메티오닌(g/L)
13032/ΔmcbR 0.12
13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 0.18
13032/ΔmcbR (pECCG117-Pspl1-serA(Avn)) 0.22
13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI (pECCG117-Pspl1-serA(Avn)) 0.32
그 결과 pECCG117-Pspl1-serA(Avn)로 형질전환된 균주 2종 모두 메치오닌 생산능이 증가된 대조군보다도 메치오닌 생산능이 증가하였다. 13032/ΔmcbR (pECCG117-Pspl1-serA(Avn))는 대조군 대비 83%나 증가하였으며, 13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI pECCG117-Pspl1-serA(Avn))는 대조군 대비 78%나 증가하였다. 따라서, 본 실시예로부터, 아조토박터 유래 serA(Avn)을 도입하는 경우, 미생물의 L-메치오닌 생산능 증가 효과가 있음을 확인하였다.
상기 13032/ΔmcbR 균주는 CM02-0618로 명명하였으며, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여, 2019.01.04일자로 기탁번호 KCCM 12425P를 부여받았다. 또한 상기 13032/ΔmcbR (pECCG117-Pspl1-serA(Avn)) 균주는 CM02-0693로 명명하였으며, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여, 2018.11.27일자로 기탁번호 KCCM 12413P를 부여받았다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12381P 20181109 한국미생물보존센터(국외) KCCM12411P 20181127 한국미생물보존센터(국외) KCCM12412P 20181127 한국미생물보존센터(국외) KCCM12413P 20181127 한국미생물보존센터(국외) KCCM12414P 20181127 한국미생물보존센터(국외) KCCM12425P 20190104
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Microorganism producing L-amino acid and method of producing Method of L-amino acid using thereof <130> KPA181342-KR <160> 95 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 409 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> polypeptide <400> 1 Met Ser Lys Thr Ser Leu Asp Lys Ser Lys Ile Arg Phe Leu Leu Leu 1 5 10 15 Glu Gly Val His Gln Thr Ala Leu Asp Thr Leu Lys Ala Ala Gly Tyr 20 25 30 Thr Asn Ile Glu Tyr Leu Thr Gly Ser Leu Pro Glu Glu Gln Leu Lys 35 40 45 Glu Lys Ile Ala Asp Ala His Phe Ile Gly Ile Arg Ser Arg Thr Gln 50 55 60 Leu Thr Glu Glu Val Phe Asp Arg Ala Lys Lys Leu Val Ala Val Gly 65 70 75 80 Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Glu Ala Ala Arg Glu 85 90 95 Arg Gly Ile Ala Val Phe Asn Ala Pro Tyr Ser Asn Thr Arg Ser Val 100 105 110 Ala Glu Leu Val Leu Ala Glu Ala Ile Leu Leu Leu Arg Gly Ile Pro 115 120 125 Glu Lys Asn Ala Ala Ser His Arg Gly Gly Trp Leu Lys Ser Ala Ser 130 135 140 Asn Ser Tyr Glu Ile Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly 145 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tgtgttgtac taaaagtaca gcgcacagcc gttcgtgctt gatcctcctc 2460 aagccccaac gccagcaaca catgggatac ctctccggaa ccacaggcag aaccagggga 2520 gcacacaatg ccttggcgtt ccaattccag aagaacagtt tcagatccta tgctgtcgaa 2580 gagaaaagat gcgtgtccat caatgcgcat cctaggatgt ccagtcaggt gtgctcccgg 2640 gatagtgaga acttcctcga tgaattcgcc aagatctgga taggattccg ccctggccaa 2700 ttccaaggca gtggcaaagg cgatagcccc cgcaacgttt tccgtgccac tacgccgccc 2760 tttttcctgg ccgccgccat ggattaccgg ctccagggga agctttgacc ataacactcc 2820 aatcccttta ggcgcaccga atttatgacc cgacaaactt aacgcgtcaa ctcccaagtc 2880 aaaggttaaa tgtgcagctt gcactgcatc ggtgtgaaaa ggcgtactgc ttaccgccgc 2940 caactcagct atcggctgaa tggttcccac ctcattgttg gcataaccaa tgctgatcaa 3000 tgtggtgtcc ggcctgactg ctttgcggag accctccggg gagatcagcc cagtgtgatc 3060 gggggatagg taggtgatct cgaaatcatg aaacctttca agataagcag cagtttctag 3120 gacactgtca tgctcgatcg gggtggtgat gaggtgccgg ccacgaggat tagctaagca 3180 cgctcctttg atagcgaggt tgttggcttc tgatccaccc gacgtaaacg tcacctgtgt 3240 ggggcgtcct ccgataatgc gggccacccg agttcgagca tcctccagcc ccgcagaggc 3300 gagtcttccc a 3311 <210> 95 <211> 1230 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> polynucleotide <400> 95 atgagcaaga cctctctcga caagagcaag atccgcttcc ttctgctgga aggcgtccac 60 cagaccgcac tggatacgct caaggctgcc ggctacacca acatcgagta cctgaccggc 120 tcgctgcccg aggaacagtt gaaagagaag atcgccgacg cccacttcat cggcatccgc 180 tcgcgcaccc aactgaccga ggaggtcttc gaccgcgcga agaagctggt cgcggtcggc 240 tgtttctgca tcggcaccaa ccaggtcgac ctggaggccg ctcgcgagcg cggcatcgcg 300 gtgttcaacg ccccctactc gaacacccgc tcggtggccg agctggtgct cgccgaggcg 360 atcctgctgc tgcgcggcat tcccgagaag aacgcggcca gccaccgcgg cggctggctg 420 aagagcgcca gcaactccta cgagatccgc ggcaagaagc tcggcatcat cggctatggc 480 tcgatcggta cccagctctc ggtgctggcc gaaagcctgg gcatgcaggt gctgttctac 540 gacgtggtga ccaagctgcc gctgggcaac gccgcccagg tgggcaacct ctacgacttg 600 ctcggccagg ccgacatcgt caccctgcac gtgccggaaa ccgccgcgac caagtggatg 660 atcggcgaga aggaaatccg cgccatgaag aaaggcgcca tcctgctcaa cgccgcccgc 720 ggcaccgtgg tggacatcga cgcgctggcc gccgccctcc gcgacaagca cctcaacggc 780 gcggccatcg acgtgttccc ggtggaaccg cgctccaaca acgacgagtt cgtcagcccg 840 ctgcgcgagt tcgacaacgt catcctcacc ccgcacgtcg gcggctcgac catggaggcc 900 caggccaaca tcggttcgga agtggccgag aagctggtca agtacagcga caacggcacc 960 tcggtgtcct cggtcaactt cccggaagtg gccctgccct cccacccggg caagcaccgc 1020 ctgctgcaca tccacaagaa catccccgga gtgatgagcg agatcaacaa ggtcttcgcc 1080 gagaacggca tcaacatttc cggccagttc ctgcagacca acgagacggt cggctacgtg 1140 gtgatcgatg tcgatgccga gtactcggaa atggccctgg agaaactgca gcaggtgaac 1200 ggcaccatcc gcagccgcgt gctgttctga 1230

Claims (11)

  1. 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 발현되도록 변형된, L-아미노산 또는 이의 전구체를 생산하는 코리네박테리움 속 또는 에스케리키아 속 미생물로서,
    상기 단백질은 아조토박터 비넬란디(Azotobacter vinelandii) 유래이며,
    상기 L-아미노산 또는 이의 전구체는 L-세린, L-트립토판, L-히스티딘, L-메티오닌, L-시스테인, O-숙시닐호모세린, O-아세틸호모세린, L-호모세린, 아세틸세린, L-시스타치오닌, L-호모시스테인 및 O-포스포세린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것인, 미생물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 ⅰ) 약화된 활성의 포스포세린 포스파타아제, ⅱ) 강화된 활성의 3-포스포세린 아미노트랜스퍼레이즈 또는 ⅲ) 약화된 활성의 포스포세린 포스파타아제 및 강화된 활성의 3-포스포세린 아미노트랜스퍼레이즈 를 갖는, 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 trp 오페론 강화, 트립토파나제(Tryptophanase; TnaA) 불활성화, Mtr막단백질(Mtr membrane protein; Mtr) 불활성화 또는 이들의 조합으로 변형된, 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 his 오페론 강화된, 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 McbR(Transcriptional regulator; mcbR) 불활성화, 메티오닌 신타아제(Methionine synthase; meth)강화, 설파이트 리덕타제 [NADPH] 호모단백질 베타-컨포넌트 (Sulfite reductase [NADPH] hemoprotein beta-component; cysI)강화 또는 이들의 조합으로 변형된, 미생물.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 에스케리키아 콜라이인, 미생물.
  9. 삭제
  10. 제1항, 제3항 내지 제6항, 및 제8항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 L-아미노산 또는 이의 전구체를 회수하는 단계를 포함하는 L-아미노산 또는 이의 전구체의 생산방법으로서,
    상기 L-아미노산 또는 이의 전구체는 세린, 트립토판, 히스티딘, 메티오닌, L-시스테인, O-숙시닐호모세린, O-아세틸호모세린, L-호모세린, 아세틸세린, L-시스타치오닌, L-호모시스테인 및 O-포스포세린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것인, 생산방법.
  11. 삭제
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