CN114269931A - 生产l-氨基酸的微生物和利用其生产l-氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了生产L‑氨基酸或其前体的微生物，以及利用该微生物生产L‑氨基酸或其前体的方法。

Description

生产L-氨基酸的微生物和利用其生产L-氨基酸的方法
技术领域
本公开涉及生产L-氨基酸或其前体的微生物以及利用该微生物生产L-氨基酸或其前体的方法。
背景技术
L-氨基酸——蛋白质的基本构成单位——已被用作药物、食品添加剂、动物饲料、营养补充剂、杀虫剂、杀菌剂等的主要原料。已进行广泛的研究来开发用于以高产率生产L-氨基酸和其它有益物质的微生物和发酵方法。例如，已主要使用目标针对性方法，如增加编码参与L-赖氨酸生物合成的酶的基因的表达的方法和去除生物合成不需要的基因的方法(韩国专利号10-0838038)。
同时，棒状杆菌属的菌株，具体地谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，是广泛地用于生产L-氨基酸和其它有益物质的革兰氏阳性微生物。已进行深入研究来开发以高产率生产氨基酸的微生物和发酵方法。例如，已广泛使用目标针对性方法，如增加编码参与氨基酸生物合成的酶的基因的表达的方法或去除在棒状杆菌属菌株中生物合成不需要的基因的方法(韩国专利公开号10-0924065和10-1208480)。除这些方法外，还已使用了去除不参与氨基酸生产的基因的方法和去除具体功能不知与氨基酸生产有关的基因的方法。然而，仍需要研究以高产率有效生产L-氨基酸的方法。
发明内容
技术问题
本发明人已进行大量工作以开发能够以高产率生产L-氨基酸的微生物，并且已发现可以通过向其中引入源自另一种微生物的蛋白质来提高L-氨基酸的生产力，从而完成本公开。
解决方案
本公开的一个目的是提供生产L-氨基酸或其前体的微生物，其中所述微生物经修饰以表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质。
本公开的另一目的是提供用于生产L-氨基酸或其前体的组合物，其中所述组合物包含经修饰以表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质的微生物；或该蛋白质。
本公开的再另一目的是提供生产L-氨基酸或其前体的方法，该方法包括：在培养基中培养微生物；和从培养的微生物或培养基中回收L-氨基酸或其前体。
本公开的再另一目的是提供包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质用于增加L-氨基酸或其前体的生产的用途。
本公开的有利效果
根据本公开的生产L-氨基酸或其前体的微生物——其中所述微生物经修饰以表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质——可以生产L-丝氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、和/或O-磷酸丝氨酸。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本公开。
同时，本公开中公开的各描述和实施方式可以在此用于描述不同的描述和实施方式。换言之，本公开中公开的各种组分的所有组合都被包括在本公开的范围内。此外，本公开的范围不应受以下提供的详细描述限制。
另外，本领域技术人员将能够利用常规实验而认识到或确认本公开的具体方面的多种等同形式。这种等同形式意图被包括在本公开的范围内。
为实现以上目的，本公开的一方面提供了生产L-氨基酸或其前体的微生物，其中所述微生物经修饰以表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质。
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质可以是具有D-3-磷酸甘油酸脱氢酶活性的蛋白质。
在本公开中，“D-3-磷酸甘油酸脱氢酶”是主要催化以下化学反应的酶。
Figure BDA0003318166620000021
Figure BDA0003318166620000022
出于本公开的目的，D-3-磷酸甘油酸脱氢酶可以是SerA，并且其序列可以由NCBIGenbank的已知数据库确定。另外，还可以无限制地使用与其具有等同活性并且源自与上述生产L-氨基酸或其前体并且包括所述蛋白质的微生物不同的微生物的任何其它蛋白质。具体地，蛋白质可以是包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，并且可以与由SEQ ID NO:1的氨基酸序列构成的蛋白质、由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质、或具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的蛋白质被可互换地使用，而不限于此。
蛋白质可以具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或同一性。另外，将显而易见的是，具有包括一个或若干氨基酸的缺失(删除，deletion)、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何辅助蛋白均在本公开的范围内，只要该氨基酸序列保留上述同源性或同一性并具有与该蛋白质等同的效果。
另外，也可以无限制地使用任何如下多肽：具有D-3-磷酸甘油酸脱氢酶活性并且由在严格条件下与利用已知的基因序列构建的探针(例如，与编码所述多肽的核苷酸序列完全或部分互补的核苷酸序列)杂交的多核苷酸编码。
另外，出于本公开的目的，所述蛋白质可以源自与上述生产L-氨基酸或其前体并且包括所述蛋白质的微生物不同的其它微生物，并且所述蛋白质可以具体地是源自固氮菌属的蛋白质、与源自固氮菌属的蛋白质相同的蛋白质、或能够增加L-氨基酸或其前体生产的任何蛋白质，但不限于此。更具体地，固氮菌属的微生物可以是敏捷固氮菌(Azotobacteragilis)、亚美尼亚固氮菌(Azotobacter armeniacus)、拜氏固氮菌(Azotobacterbeijerinckii)、褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)、固氮菌种(Azotobacter sp.)DCU26、固氮菌种FA8、黑色固氮菌(Azotobacter nigricans)、雀稗固氮菌(Azotobacterpaspali)、Azotobacter salinestris、Azotobacter tropicalis或棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)，并且在本公开的实施方式中，可以是源自棕色固氮菌的微生物，但微生物不限于此。
如本文所用，术语“功能片段”指代具有与所述蛋白质等同的效果的氨基酸序列，并且将显而易见的是，具有包括一个或若干氨基酸的缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列并且保留与所述蛋白质等同的效果的任何蛋白质均在本公开的范围内，并且出于本公开的目的可以被视为功能片段。
如本文所用，虽然使用了表述“包含具体SEQ ID NO:的氨基酸序列的蛋白质或多肽”、“由具体SEQ ID NO:的氨基酸序列组成的蛋白质或多肽”或“具有具体SEQ ID NO:的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但是显而易见的是，具有包括一个或若干氨基酸的缺失、修饰、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也可以用于本公开中，只要该蛋白质具有与由该具体SEQ ID NO:的氨基酸序列组成的多肽相同或等同的活性。例如，蛋白质可以具有序列添加于该氨基酸序列的N端和/或C端，而不引起其蛋白质功能的改变、天然存在的突变、沉默突变或其保守取代。
术语“保守取代”指代一个氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代。这种氨基酸取代可以总体上基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性而发生。例如，带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷(酸性)的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；以及疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
本公开的另一方面提供了编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”具有包括DNA和RNA分子的综合含义，并且作为多核苷酸中的基本结构单位的核苷酸可以不仅包括天然核苷酸，还包括其中糖或碱基被修饰的类似物(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman and Peyman,Chemical Reviews,90:543-584(1990))。
编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸可以具有能够编码源自棕色固氮菌的、具有D-3-磷酸甘油酸脱氢酶活性的蛋白质的任何序列，但不限于此。可选地，多核苷酸可以具有编码具有增加L-氨基酸或其前体生产的活性的、包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质的任何序列，但不限于此。
多核苷酸可以是例如编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性的多肽的多核苷酸。具体地，例如，编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％同源性或同一性的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸可以是SEQ ID NO:95的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:95的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性或同一性的多核苷酸。
另外，显而易见的是，多核苷酸也可以是可以翻译成如下蛋白质的多核苷酸：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白质或通过密码子简并与其具有同源性或同一性的蛋白质。可选地，多核苷酸可以具有这样的核苷酸序列：可以与利用已知的基因序列构建的探针(例如，在严格条件下与所述核苷酸序列完全或部分互补，以编码包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列，但不限于此)杂交的核苷酸序列。术语“严格条件”指代允许核苷酸之间的特定杂交的条件。这样的条件被详细公开于已知的文件(例如，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratorypress,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)中。例如，严格条件可以包括具有高同源性或同一性(例如，至少70％、80％，具体地85％，具体地90％，更具体地95％，更具体地97％或甚至更具体地99％同源性或同一性)的基因彼此杂交，同时具有低于上述那些的同源性或同一性的基因不彼此杂交的条件；或在相应于60℃、1×SSC、0.1％SDS，具体地60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，以及更具体地68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下，在Southern杂交的常规洗涤条件下进行1次以及具体2次或3次洗涤的条件。杂交需要两个多核苷酸具有互补序列，尽管碱基可能因杂交的严格条件而错配。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸的碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开可以不仅包括基本上相似的多核苷酸序列，还包括其分离的与整个序列互补的多核苷酸片段。
具体地，可以利用上述杂交条件，包括采用55℃的Tm值的杂交过程，来检测具有同源性或同一性的多核苷酸。另外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据其目的适当调整。
“同源性”和“同一性”指代两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度并且可以以百分比表示。
术语同源性和同一性通常可以被可互换地使用。
保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且由程序建立的默认空位罚分可以与其联用。在中等或高度严格的条件下，基本上同源或同一的序列可以总体上经整个序列或整个序列的至少约50％、60％、70％、80％或90％彼此杂交。在杂交的多核苷酸中，还可以考虑包括简并密码子代替密码子的多核苷酸。
多肽或多核苷酸序列之间的同源性或同一性可以利用本领域已知的任何算法来确定，例如，BLAST(参见：Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873,(1993))或Pearson带来的FASTA(参见：Methods Enzymol.,183,63,1990)。基于算法BLAST，已开发了被称为BLASTN或BLASTX的程序(参见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。另外，氨基酸或多核苷酸序列之间同源性、相似性或同一性的存在可以通过在限定的严格条件下通过southern杂交实验比较这些序列来确认，并且限定的严格杂交条件在主题技术的范围内，并且可以通过本领域普通技术人员已知的方法确定(例如，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratorypress,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。
如本文所用，关于蛋白质的术语“将被表达/被表达”意为这样的状态：目标蛋白质被引入微生物中，或者在所述蛋白质在微生物中存在的情况下，所述蛋白质的活性与其内源活性或其修饰前活性相比增强。
具体地，术语“蛋白质的引入”指代将具体蛋白质的活性提供给原本不具有该蛋白质的微生物，或者使蛋白质的活性与其内源活性或其修饰前活性相比增强。例如，蛋白质的引入可以指代将编码具体蛋白质的多核苷酸引入染色体或者将包括编码具体蛋白质的多核苷酸的片段或载体引入微生物，从而能够表达蛋白质的活性。“内源活性”指代当通过天然或人工因素引起的遗传修饰来转化微生物时，微生物的亲本菌株在转化前所原本具有的蛋白质活性。
如本文所用，术语“氨基酸或其前体”指代可以通过利用蛋白质而生产的氨基酸或前体，并且其可以包括丝氨酸、色氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、L-胱硫醚、L-高半胱氨酸、O-乙酰高丝氨酸、O-琥珀酰高丝氨酸、L-高丝氨酸、和/或O-磷酸丝氨酸，但不限于此。在本公开中，氨基酸可以是L-氨基酸，具体地，L-丝氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸或L-半胱氨酸，但可以包括微生物通过代谢过程由各种碳源生产的所有L-氨基酸。前体可以是O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸，其是通过O-乙酰高丝氨酸巯基化酶(KR10-1048593)转化为甲硫氨酸的前体；L-高丝氨酸、L-高半胱氨酸或L-胱硫醚，其是甲硫氨酸前体；和乙酰丝氨酸，其是L-半胱氨酸前体；和/或O-磷酸丝氨酸，其是通过O-磷酸丝氨酸巯基化酶转化为半胱氨酸的前体，但不限于此。更具体地，氨基酸或其前体可以是L-丝氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、O-磷酸丝氨酸或L-半胱氨酸，但不限于此。
为增强L-氨基酸或其前体的生物合成，可以使用根据本公开的包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质。例如，为增强L-丝氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-高半胱氨酸、L-胱硫醚、乙酰丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、O-琥珀酰高丝氨酸、L-高丝氨酸、和/或O-磷酸丝氨酸的生物合成，微生物可以经修饰以表达根据本公开的包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质。作为具体实例，可以引入包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或者可以增强该蛋白质的活性。另外，通过另外引入或增强具体蛋白质的活性或灭活具体蛋白质的活性可以进一步增强生产L-氨基酸或其前体的能力。
具体地，微生物可以通过进一步包括i)具有减弱的活性的磷酸丝氨酸磷酸酶，ii)具有增强的活性的3-磷酸丝氨酸转氨酶，或iii)具有减弱的活性的磷酸丝氨酸磷酸酶和具有增强的活性的3-磷酸丝氨酸转氨酶，来生产L-氨基酸或其前体，但不限于此。
可以通过增强trp操纵子、灭活色氨酸酶(TnaA)、灭活Mtr膜蛋白(Mtr)或其任何组合，来进一步修饰微生物，但不限于此。
具体地，可以通过增强trp操纵子——通过灭活TrpR(其抑制与L-色氨酸生产涉及的L-色氨酸生物合成相关的基因(trpEDCBA)的表达)，通过灭活在将胞外L-色氨酸引入细胞的方面起作用的色氨酸酶(TnaA)，和通过灭活在将胞内L-色氨酸和水分子分解成吲哚、丙酮酸和氨(NH3)的方面起作用的Mtr膜蛋白，来进一步修饰微生物，但不限于此。
另外，出于本公开的目的，可以通过增强his操纵子来进一步修饰微生物，但不限于此。
具体地，可以将总共分成4个操纵子的生物合成基因以簇形式(其中启动子被取代)引入微生物中，以增强L-组氨酸生物合成途径，并且L-组氨酸生物合成簇被分成总共4个操纵子(hisE-hisG、hisA-impA-hisF-hisI、hisD-hisC-hisB和cg0911-hisN)。可以通过使用可以将生物合成基因同时引入微生物中的载体来增强his操纵子，但不限于此。
另外，出于本公开的目的，可以通过灭活转录调节子(McbR)、增强甲硫氨酸合酶(meth)、增强亚硫酸还原酶[NADPH]血红蛋白β-组分(cysI)或其任何组合，来进一步修饰微生物，但不限于此。
具体地，可以通过灭活McbR——即甲硫氨酸/半胱氨酸转录调节子、增强甲硫氨酸合酶(Meth)、增强亚硫酸还原酶[NADPH]血红蛋白β-组分或其任何组合，来进一步修饰微生物，但不限于此。
具体蛋白质和/或基因的活性的引入、增强和灭活可以利用本领域已知的任何适当方法进行。
如本文所用，术语蛋白质活性的“增强”意为蛋白质活性被引入或与其内源活性相比增加。活性的“引入”意为微生物获得该微生物还不天然或人工具有的具体多肽的活性。
如本文所用，术语蛋白质活性相对于其内源活性的“增加”意为微生物中包含的蛋白质的活性与该蛋白质的内源活性或修饰前活性相比增强。术语“内源活性”指代当通过由天然或人工因素引起的遗传修饰转化微生物时，微生物亲本菌株或未修饰微生物在转化前原本具有的蛋白质活性。内源活性也可以与修饰前活性被可互换地使用。活性的增加可以包括引入外源蛋白质和增强蛋白质的内源活性。蛋白质活性的增加/增强可以通过基因表达的增加/增强来实现。
具体地，根据本公开的蛋白质活性增加可以通过以下方法之一实现，但不限于此：
(1)增加编码该蛋白质的多核苷酸的拷贝数的方法，
(2)修饰表达控制序列以增加该多核苷酸的表达的方法，
(3)修饰染色体上的多核苷酸序列以增强蛋白质活性的方法，
(4)引入具有该蛋白质活性的外源多核苷酸或具有该蛋白质活性的密码子优化的修饰多核苷酸的方法，或
(5)通过其任何组合增强活性的方法。
以上(1)中描述的增加多核苷酸的拷贝数的方法没有具体限制，但是可以以与载体可操作地连接的形式或以整合到宿主细胞染色体中的形式进行。具体地，此方法可以通过以下来进行：向宿主细胞中引入与宿主无关地复制和工作并且与本公开的编码蛋白质的多核苷酸可操作地连接的载体；或通过向宿主细胞中引入将所述多核苷酸插入宿主细胞的染色体中并且与所述多核苷酸可操作地连接的载体，从而增加宿主细胞的染色体中的所述多核苷酸的拷贝数。
接下来，以上(2)中描述的修饰表达控制序列以增加多核苷酸的表达的方法可以通过以下来进行：通过缺失、插入、非保守取代、保守取代或其任何组合而在核苷酸序列中引起修饰以进一步增强表达控制序列的活性；或将核苷酸序列替换成具有更强活性的核苷酸序列，但不限于此。表达控制序列可以包括启动子、操纵子序列、核糖体结合位点编码序列和用于调控转录和翻译终止的序列，但不限于此。
可以在多核苷酸表达单元的上游连接异源强启动子而代替固有启动子，并且强启动子的实例可以包括CJ1至CJ7启动子(韩国专利号0620092和国际公开号WO2006/065095)、lysCP1启动子(国际公开号WO2009/096689)、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA启动子、aceB启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL1、SPL7或SPL13启动子(韩国专利号10-1783170)或O2启动子(韩国专利号10-1632642)，但不限于此。另外，以上(3)中描述的修饰染色体上的多核苷酸序列的方法可以通过以下来进行：通过缺失、插入、非保守取代、保守取代或其任何组合而在表达调控序列中引起变异以进一步增强多核苷酸序列的活性；或将核苷酸序列替换成经修饰以具有更强活性的核苷酸序列，但不限于此。
另外，以上(4)中描述的引入外源多核苷酸序列的方法可以通过以下来进行：将编码与所述蛋白质具有相同/相似活性的蛋白质的外源多核苷酸或其密码子优化的变体多核苷酸引入宿主细胞中。外源多核苷酸可以是具有与所述蛋白质相同/相似的活性的任何多核苷酸，但不限于此。另外，可以将其优化的密码子引入宿主细胞中，以在宿主细胞中对引入的外源多核苷酸进行优化转录和翻译。引入可以通过本领域普通技术人员适当选择的任何已知的转化方法进行。当引入的多核苷酸在宿主细胞中被表达时，产生蛋白质并且可以增加其活性。
最后，以上(5)中描述的通过方法(1)至(4)的任何组合增强活性的方法可以通过组合以下方法中的至少一种来进行：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、修饰表达控制序列以增加其表达、修饰染色体上的多核苷酸序列、引入具有蛋白质活性的外源多核苷酸或其密码子优化的变体多核苷酸。
如本文所用，术语蛋白质活性的“减弱”是包括使活性与内源活性相比降低和消除的概念。
蛋白质活性的减弱可以通过本领域公知的多种方法实现。方法的实例可以包括：删除染色体上编码蛋白质的基因的部分或全部的方法，包括活性被消除时的情况；用经突变以降低蛋白质活性的基因取代染色体上编码蛋白质的基因的方法；将突变引入染色体上编码蛋白质的基因的表达控制序列中的方法；用活性较弱或无活性的序列取代编码蛋白质的基因的表达控制序列(例如，用较弱的启动子替换基因的内源启动子)；删除染色体上编码蛋白质的基因的部分或全部的方法；引入反义寡核苷酸(例如，反义RNA)的方法，所述反义寡核苷酸与染色体上基因的转录物互补地结合以抑制从mRNA翻译成蛋白质；在编码蛋白质的基因的SD序列上游人工添加与SD序列互补的序列以形成二级结构从而抑制核糖体与其结合的方法，以及将启动子并入开放阅读框(ORF)的3'端以引起逆转录(逆转录工程(RTE))的方法，或其任何组合，但不限于此。
具体地，删除编码蛋白质的基因的部分或全部的方法可以通过以下来进行：利用用于在微生物中进行染色体插入的载体，用核酸序列具有部分缺失的多核苷酸或标记基因替换染色体内编码内源性目标蛋白的多核苷酸。例如，可以利用通过同源重组来删除基因的部分或全部的方法，但不限于此。另外，术语“部分”指代1个核苷酸至300个核苷酸，具体地1个核苷酸至100个核苷酸，和更具体地1个核苷酸至50个核苷酸，非限于此，但其可以根据多核苷酸的类型而变化并且可以由本领域普通技术人员适当地确定。
另外，修饰表达控制序列的方法可以通过以下进行：经由缺失、插入、保守取代或非保守取代或其任何组合在表达控制序列中而引起修饰，以进一步减弱表达控制序列的活性；或通过以下进行：用具有较弱活性的核酸序列取代表达控制序列。表达控制序列可以包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列和用于调控转录和翻译终止的序列，但不限于此。
另外，修饰染色体上的基因序列的方法可以通过以下进行：经由缺失、插入、保守取代或非保守取代或其任何组合而引起修饰，以进一步减弱序列中的蛋白质活性，或通过以下进行：用将基因序列用经修饰以具有较弱活性或无活性的基因序列取代，但不限于此。
如本文所用，表述“生产L-氨基酸或其前体的微生物”指代与野生型或未修饰的微生物相比，能够由培养基中包含的碳源大量生产L-氨基酸或其前体的微生物。另外，该微生物可以指代天然具有生产L-氨基酸或其前体的能力的微生物，或通过向不能生产L-氨基酸或其前体的微生物的亲本菌株提供生产L-氨基酸或其前体的能力而制备的微生物。具体地，该微生物可以是经修饰以表达包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质以生产L-氨基酸或其前体的微生物，但不限于此。
另外，“生产L-氨基酸或其前体的微生物”包括野生型微生物和已发生天然或人工遗传修饰的微生物，如其中具体机制通过外源基因的引入、内源基因的增强或灭活等而被减弱或增强的微生物，以及其中遗传修饰已发生或活性已增强以生产目标L-氨基酸或其前体的微生物。具体地，微生物的类型没有具体限制，只要微生物能够生产L-氨基酸或其前体，但微生物可以属于肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗威登斯菌属(Providencia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)。更具体地，微生物可以是属于棒状杆菌属或埃希氏菌属的任何微生物。棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、产热棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)等，但不限于此。更具体地，埃希氏菌属的微生物可以是大肠杆菌(Escherichia coli)，并且棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。
出于本公开的目的，微生物可以是包括所述蛋白质的任何微生物，并且因此能够生产L-氨基酸及其前体。
如本文所用，表述“能够生产L-氨基酸或其前体的微生物”可以与表述“生产L-氨基酸或其前体的微生物”以及“具有生产L-氨基酸或其前体的能力的微生物”被可互换地使用。
本公开的另一方面提供了用于生产L-氨基酸或其前体的组合物，其中组合物包括经修饰以表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质的微生物或该蛋白质。
用于生产L-氨基酸或其前体的组合物指代通过根据本公开的蛋白质能够生产L-氨基酸或其前体的组合物。组合物可以包括蛋白质、其功能性片段或用于操作该蛋白质的任何组分，但不限于此。
本公开的另一方面提供了生产L-氨基酸或其前体的方法，其中所述方法包括在培养基中培养微生物。
方法可以进一步包括从培养基或其培养物回收L-氨基酸或其前体。
在以上方法中，微生物的培养可以通过但不限于以下进行：分批培养、连续培养、补料分批或本领域已知的类似方法。在这方面，培养条件没有特别限制，但是可以通过使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)来保持最佳pH(例如，pH 5至9，具体地pH 6至8，以及最具体地pH 6.8)。另外，可以通过向培养物添加氧气或含氧气体混合物来保持有氧条件。培养温度可以保持在20℃至45℃，具体地25℃至40℃，并且培养可进行约10小时至约160小时，但不限于此。培养期间产生的氨基酸可以被释放至培养基中或保留在细胞中。
培养基中将包含的碳源的实例可以包括糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)和有机酸(乙酸)(其可以单独或组合使用)等，但不限于此。培养基中将包含的氮源的实例可以是含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(corn steep liquor)、大豆粉和尿素)、无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)(其可以单独或组合使用)等，但不限于此。作为磷源，可以单独或组合使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和其相应的含钠盐，但不限于此。另外，培养基可以包括必需的生长促进物质，如金属盐(例如，硫酸镁和硫酸铁)、氨基酸和维生素，但不限于此。
可以通过利用根据培养方法所选择的任何已知的方法从培养溶液收集目标氨基酸，来回收在本公开的上述培养步骤中生产的氨基酸。例如，可以利用离心、过滤、阴离子交换层析、结晶和高效液相色谱(HPLC)，并且可以利用本领域的任何适当方法从培养基或微生物回收目标氨基酸，但不限于此。
另外，回收步骤可以包括纯化过程，其可以利用本领域公知的适当方法进行。因此，回收的氨基酸可以是纯化的氨基酸或包含氨基酸的微生物的发酵液(Introduction toBiotechnology and Genetic Engineering,A.J.Nair.,2008)。
另外，出于本公开的目的，在微生物经修饰以表达源自固氮菌属的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的情况下，L-氨基酸及其前体——包括丝氨酸、色氨酸、组氨酸、甲硫氨酸和O-磷酸丝氨酸——的产率增加。重要的是，在棒状杆菌属的野生型菌株不能生产或能够生产非常少量的L-氨基酸或其前体时，经修饰的微生物增加了L-氨基酸及其前体的产率。
本公开的再另一方面提供了利用该组合物生产L-氨基酸或其前体的方法，所述组合物包含经修饰以表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质的微生物或该蛋白质。
经修饰以表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质的微生物和包含其的微生物如上所述。
本公开的再另一方面提供了包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能片段的蛋白质用于增加L-氨基酸或其前体的生产的用途。
SEQ ID NO:1或其功能片段、L-氨基酸及其前体如上所述。
实施例
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅出于示例目的，而不旨在限制本公开的范围。同时，本说明书中未描述的技术事项可以由本申请技术领域或其类似技术领域的技术人员充分理解和容易进行。
实施例1：制备固氮菌源D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA(Avn))过表达载体
为确定生产丝氨酸和OPS的能力是否通过增强棕色固氮菌源D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(在下文中称为‘SerA(Avn)’)而提高，制备表达载体。
pCL1920载体(GenBank No.AB236930)被用于表达编码SerA(Avn)的serA(Avn)基因(SEQ ID NO:1)，并且trc启动子(Ptrc)被用作表达启动子，从而构建pCL-Ptrc-serA(Avn)形式的载体。
作为对照，制备包含源自大肠杆菌(其中丝氨酸的反馈抑制被释放)的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的载体并命名为pCL-Ptrc-serA*(G336V)。用于制备载体的引物的序列显示于下表1中。
表1
Figure BDA0003318166620000101
Figure BDA0003318166620000111
利用SEQ ID NO:2和3的引物，进行用于制备两种载体的Ptrc进行PCR。具体地，利用SEQ ID NO:4和5的引物进行外源serA(Avn)的PCR，并利用SEQ ID NO:6和7的引物进行serA*(G336V)的PCR。通过Gibson组装分别将扩增的Ptrc和对应基因的serA(Avn)和serA*(G336V)片段克隆到用限制酶Smal处理的pCL1920载体中，从而构建pCL-Ptrc-serA(Avn)和pCL-Ptrc-serA*(G336V)。
实施例2：通过将固氮菌源serA(Avn)引入野生型大肠杆菌来制备菌株并评价丝氨 酸生产能力
通过利用野生型大肠杆菌菌株W3110作为平台菌株，通过将实施例1中制备的两种质粒类型中的每一种引入W3110菌株中来制备菌株，然后评价这些菌株的丝氨酸生产能力。
将所述菌株中的每一种平铺在LB固体培养基上并在33℃的培养箱中培养过夜。将在LB固体培养基中培养过夜的菌株接种到如下表2中所示的25-mL滴度培养基(titermedium)中，并在34.5℃的培养箱中在200rpm下培养40小时。结果显示于下表3中。
表2
组成 浓度(/L)
葡萄糖 40g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 4g
(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 17g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 1g
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 10mg
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O 10mg
酵母提取物 2g
碳酸钙 30g
pH 6.8
表3
Figure BDA0003318166620000112
Figure BDA0003318166620000121
如表3中所示，其中丝氨酸的反馈抑制被释放并serA活性被增强的W3110/pCL-Ptrc-serA*(G336V)菌株显示丝氨酸生产与野生型菌株相比增加60％。相比之下，确认包含固氮菌源serA(Avn)的W3110/pCL-Ptrc-serA(Avn)菌株显示丝氨酸生产与野生型菌株W3110相比增加160％，并且还显示与菌株W3110/pCL-Ptrc-serA*(G336V)相比增加62.5％。
实施例3：制备其中serB活性减弱并引入外源固氮菌源serA(Avn)的菌株并评价菌 株的OPS生产能力
通过减弱野生型大肠杆菌菌株W3110(还被命名为'CA07-0012'，登录号KCCM11212P，被公开于韩国专利号10-1381048和美国专利申请公开号2012-0190081中)中的内源磷酸丝氨酸脱氢酶(SerB)，来制备生产O-磷酸丝氨酸(OPS)的微生物。
将实施例1中制备的两种类型的质粒中的每一种引入CA07-0012中，并评价制备菌株的OPS生产能力。
将菌株中的每一种平铺在LB固体培养基上并在33℃的培养箱中培养过夜。将在LB固体培养基中培养过夜的菌株接种到下表4所示的25mL滴度培养基中，并在34.5℃的培养箱中在200rpm下培养40小时。结果显示于下表5中。
表4
组成 浓度(/L)
葡萄糖 40g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 4g
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 17g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 1g
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 10mg
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O 10mg
L-甘氨酸 2.5g
酵母提取物 2g
碳酸钙 30g
pH 6.8
表5
Figure BDA0003318166620000122
Figure BDA0003318166620000131
如上表5中所述，其中丝氨酸的反馈抑制被释放并serA活性被增强的CA07-0012/pCL-Ptrc-serA*(G336V)显示OPS生产与野生型菌株相比增加57％。确认包含固氮菌源serA(Avn)的CA07-0012/pCL-Ptrc-serA(Avn)菌株显示OPS生产与野生型菌株相比增加107％，并且还显示与CA07-0012/pCL-Ptrc-serA*(G336V)菌株相比增加32％。
实施例4：制备用于共表达固氮菌源serA(Avn)和大肠杆菌源serC的载体
为确定生产丝氨酸和OPS的能力是否通过将serA(Avn)引入其中大肠杆菌源3-磷酸丝氨酸氨基转移酶(serC)过表达的菌株中而被进一步提高，制备用于表达serA(Avn)和serC作为操纵子的pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC形式的载体。
作为其阳性对照，构建pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC载体以制备共表达源自大肠杆菌的serA*(G336V)和serC的微生物。用于制备载体的引物的序列显示于下表6中。
表6
Figure BDA0003318166620000132
利用实施例1中制备的pCL-Ptrc-serA(Avn)作为模板以及SEQ ID NO:2和8的引物，进行Ptrc_serA(Avn)的PCR，并利用pCL-Ptrc-serA*(G336V)作为模板以及SEQ ID NO:2和11的引物，进行Ptrc_serA*(G336V)的PCR。用于这两种载体的大肠杆菌源(RBS)serC通过利用w3110的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO:9和10的引物进行的PCR而获得。
通过Gibson组装(DG Gibson et al.,NATURE METHODS，第6卷，第5期，2009年5月，NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)，用经SmaI限制酶处理的pCL1920载体分别克隆扩增的Ptrc_serA(Avn)和(RBS)serC片段以及Ptrc_serA*(G336V)和(RBS)serC片段，从而构建pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC和pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC。
实施例5：制备其中serC活性增强并引入固氮菌源serA(Avn)的菌株并评价菌株的 丝氨酸生产能力
为评价当固氮菌源serA(Avn)被引入其中serC过表达的菌株中时的丝氨酸生产能力，将实施例4中制备的两种类型的质粒分别引入W3110中。
将各菌株平铺在LB固体培养基上并在33℃的培养箱中培养过夜。将在LB固体培养基中培养过夜的菌株接种到下表7中所示的25mL滴度培养基中，并在34.5℃的培养箱中在200rpm下培养40小时。结果显示于下表8中。
表7
组成 浓度(/L)
葡萄糖 40g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 4g
(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 17g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 1g
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 10mg
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O 10mg
酵母提取物 2g
碳酸钙 30g
pH 6.8
表8
Figure BDA0003318166620000141
如上表8所示，确认包括固氮菌源serA(Avn)的w3110/pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC菌株显示L-丝氨酸生产与包括serA*(G336V)的w3110/pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC菌株相比增加。即，确认通过在其中L-丝氨酸生产能力提高的菌株中包含固氮菌源serA(Avn)，进一步提高了L-丝氨酸生产能力。
w3110/pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC菌株被命名为CA07-4383，并于2018年11月9日根据布达佩斯条约被保藏在韩国微生物培养中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms)(KCCM)并指定登录号为KCCM12381P。
实施例6：制备其中serB活性减弱、serC活性增强并且引入固氮菌源serA(Avn)的 菌株并评价菌株的OPS生产能力
为评价在将固氮菌源serA(Avn)引入其中serB活性减弱并且serC过表达的菌种中的情况下的丝氨酸生产能力，将实施例4中制备的两种类型的质粒分别引入CA07-0012中，并评价这些菌株的OPS生产能力。
将各菌株平铺在LB固体培养基上并在33℃的培养箱中培养过夜。将在LB固体培养基中培养过夜的菌株接种在下表9中所示的25mL滴度培养基中，并在34.5℃的培养箱中在200rpm下培养40小时。结果显示于下表10中。
表9
组成 浓度(/L)
葡萄糖 40g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 4g
(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 17g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 1g
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 10mg
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O 10mg
L-甘氨酸 2.5g
酵母抽提物 2g
碳酸钙 30g
pH 6.8
表10
Figure BDA0003318166620000151
如上表10所示，确认包括固氮菌源serA(Avn)的CA07-0012/pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC菌株比包括serA*(G336V)的CA07-0012/pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC菌株具有更高的OPS生产。即，确认通过在OPS生产能力增加的菌株中包含固氮菌源serA(Avn)，进一步增强了OPS生产能力。
实施例7：制备引入固氮菌源serA(Avn)的埃希氏菌属的菌株并评价菌株的色氨酸 生产能力
实施例7-1：制备生产L-色氨酸的埃希氏菌属微生物
从野生型大肠杆菌W3110开发埃希氏菌属的生产L-色氨酸的菌株。为确定通过修饰以表达具有输出L-色氨酸的活性的蛋白质是否显著增加L-色氨酸生产，将被制备以生产L-色氨酸的菌株用作亲本菌株。具体地，参与由分支酸生产L-色氨酸的L-色氨酸生物合成基因(trpEDCBA)的表达被TrpR抑制。因此，去除编码TrpR的trpR基因。另外，为了根据增加的L-色氨酸生产而释放TrpE多肽的反馈抑制，用丝氨酸取代TrpE的自N端第21个氨基酸，脯氨酸(J.Biochem.Mol.Biol.32,20-24(1999))。
Mtr膜蛋白在将胞外L-色氨酸运送到细胞的方面起作用，并且TnaA蛋白在将胞内L-色氨酸和水分子降解成吲哚、丙酮酸和氨(NH3)的方面起作用。因此，去除抑制L-色氨酸生产和降解L-色氨酸的mtr和tnaA基因。
为去除这些基因，利用了λ红重组方法(One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12using PCR products,Datsenko KA,Wanner BL.,ProcNatl Acad Sci USA.2000Jun 6；97(12):6640-5)。为去除mtr基因，利用pKD4载体作为模板以及SEQ ID NO:12和13的引物进行PCR以制备其中FRT-卡那霉素-FRT盒和mtr基因侧翼50bp同源碱基对(发生染色体同源重组之处)结合的基因片段(1,580bp)。利用pKD4载体的卡那霉素抗生素标记以确认目标基因的去除和抗生素基因的插入，并且FRT区在去除目标基因后去除抗生素标记的方面起作用。SolgTMTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶使用，并在以下扩增条件下进行PCR：在95℃下变性2分钟；27个循环的在95℃下变性20秒，在62℃下退火40秒，和在72℃下聚合1分钟；以及在72℃下聚合5分钟。
表11
Figure BDA0003318166620000161
通过电穿孔用表达λ红重组酶(gam、bet和exo)的pKD46载体转化大肠杆菌菌株W3110，并将其平铺在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。在被确认已转化有pKD46载体的大肠杆菌菌株W3110中，当OD600在30℃下达到约0.1时，通过向其中添加10mM L-阿拉伯糖来引起重组酶的表达。当OD600达到约0.6时，将菌株制备成感受态细胞并通过电穿孔用以上过程中获得的线性基因片段转化，其中FRT-卡那霉素-FRT盒和mtr基因侧翼50bp同源碱基对结合。对于在含有25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上生长的集落，利用SEQ IDNO:14和15的引物进行集落PCR，并选择其中制备出782-bp基因片段的集落。
表12
SEQ ID NO 引物 序列(5'->3')
14 Confirm_盒-1 GGGCAGGATCTCCTGTCATC
15 Confirm_△mtr-2 AAATGTCGGATAAGGCACCG
将其中通过同源重组去除了mtr基因的菌株制备为感受态细胞以去除卡那霉素抗生素标记，然后通过电穿孔用pCP20载体转化。pCP20载体识别卡那霉素抗生素侧翼的FRT位点并且通过表达FLP蛋白在染色体上与其结合，从而去除FRT位点之间的抗生素标记。将用pCP20载体转化的并在含有100mg/L氨苄青霉素和25mg/L氯霉素的LB固体培养基上生长的菌株在LB液体培养基中在30℃下培养1小时，进一步在42℃下培养15小时，并平铺在LB固体培养基上。将生长的集落在含有100mg/L氨苄青霉素和25mg/L氯霉素的LB固体培养基、含有12.5mg/L卡那霉素的LB固体培养基和不含抗生素的LB固体培养基中培养。仅选择在不含抗生素的LB固体培养基中生长的集落。通过基因组测序最终确认mtr基因的去除，并将菌株命名为CA04-9300。
通过上述方法进行遗传操纵以去除tnaA基因。利用pKD4载体作为模板以及SEQ IDNO:16和17的引物进行PCR以制备其中FRT-卡那霉素-FRT盒和tnaA基因侧翼50bp同源碱基对(发生染色体同源重组之处)结合的基因片段(1,580bp)。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶使用，并在以下扩增条件下进行PCR：在95℃下变性2分钟；27个循环的在95℃下变性20秒，在62℃下退火40秒，和在72℃下聚合1分钟；以及在72℃下聚合5分钟。
表13
Figure BDA0003318166620000171
确认pKD46载体的转化，并将其中通过添加10mM L-阿拉伯糖而表达重组酶的CA04-9300菌株通过电穿孔用其中FRT-卡那霉素-FRT盒和tnaA基因侧翼50bp同源碱基对结合的线性基因片段转化。对于在含有25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上生长的集落，利用SEQ ID NO:14和18的引物进行集落PCR，并选择其中制备出787-bp基因片段的集落。
将其中通过同源重组去除了tnaA基因的菌株制备为感受态细胞，并用pCP20载体转化以去除卡那霉素抗生素标记，并通过FLP蛋白的表达制备其中去除了卡那霉素抗生素标记的菌株。通过基因组测序最终确认tnaA基因的去除，并将菌株被命名为CA04-9301。
为去除trpR基因，利用pKD4载体作为模板以及SEQ ID NO:19和20的引物进行PCR，以制备其中FRT-卡那霉素-FRT盒和trpR基因侧翼50bp同源对(发生染色体同源重组之处)结合的基因片段(1,580bp)。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶使用，并在以下扩增条件下进行PCR：在95℃下变性2分钟；27个循环的在95℃下变性20秒，在62℃下退火40秒，在72℃下聚合1分钟；以及在72℃下聚合5分钟。
表14
Figure BDA0003318166620000181
确认pKD46载体的转化，并将其中通过添加10mM L-阿拉伯糖而表达重组酶的CA04-9301菌株通过电穿孔用上述过程中获得的线性基因片段(其中FRT-卡那霉素-FRT盒和trpR基因侧翼50bp同源碱基对结合)转化。对于在含有25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上生长的集落，利用SEQ ID NO:14和21的引物进行集落PCR，并选择其中制备出838-bp基因片段的集落。
将其中通过同源重组去除了trpR基因的菌株制备为感受态细胞，然后用pCP20载体转化以去除卡那霉素抗生素标记，并制备通过FLP蛋白的表达而去除卡那霉素抗生素标记的菌株。通过基因组测序最终确认trpR基因的去除，并将菌株命名为CA04-9307。
为提供具有反馈抗性trpE性状的菌株CA04-9307，利用大肠杆菌W3110的gDNA作为模板以及含有EcoRI限制酶位点的SEQ ID NO:22和23的引物，进行PCR，从而获得含有EcoRI序列的trpE基因片段(1,575bp)。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶使用，并在以下扩增条件下进行PCR：在95℃下变性2分钟；27个循环的在95℃下变性20秒，在62℃下退火1分钟，和在72℃下聚合1分钟；以及在72℃下聚合5分钟。
表15
SEQ ID NO 引物 序列(5'->3')
22 trpE-1 GAATTCATGCAAACACAAAAACCGAC
23 trpE-2 GAATTCTCAGAAAGTCTCCTGTGCA
将通过上述方法获得的trpE基因和pSG76-C质粒(JOURNAL OF BACTERIOLOGY，1997年7月，第4426–4428页)用EcoRI限制酶处理并克隆。将大肠杆菌DH5α通过电穿孔用克隆的质粒转化，并从含有25μg/mL氯霉素的LB板中选择转化的大肠杆菌DH5α，以获得pSG76-C-trpE质粒。
利用获得的pSG76-C-trpE质粒以及SEQ ID NO:24和25的引物进行定点诱变(Stratagene，USA)，以制备pSG76-C-trpE(P21S)。
表16
Figure BDA0003318166620000191
将菌株CA04-9307用pSG76-C-trpE(P21S)质粒转化并在LB-Cm培养基(10g/L酵母提取物、5g/L NaCl、10g/L胰蛋白胨和25μg/L氯霉素)中培养，并选择对氯霉素具有抗性的集落。选择的转化体是其中pSG76-C-trpE(P21S)质粒通过第一次插入被整合到基因组的trpE区中的菌株。将其中插入有所得trpE(P21S)基因的菌株用pAScep质粒转化(Journalof Bacteriology，1997年7月，第4426至4428页)，该pAScep质粒表达限制酶I-SceI，限制酶I-SceI切割pSG76-C质粒中存在的I-SceI区；并选择在LB-Ap培养基(10g/L酵母提取物、5g/L NaCl、10g/L胰蛋白胨和100μg/L氨苄青霉素)中生长的菌株。利用SEQ ID NO:22和23的引物扩增所选菌株中的trpE基因，并通过测序确认用trpE(P21S)基因所进行的取代。制备的菌株被命名为CA04-4303。
实施例7-2：制备其中引入了固氮菌源serA(Avn)的埃希氏菌属微生物并评价微生物的色氨酸生产能力
将实施例1中制备的pCL-Ptrc-serA(Avn)载体和作为对照的pCL1920载体分别引入实施例1制备的CA04-4303中，以制备CA04-4303/pCL1920和CA04-4303/pCL-Ptrc-serA(Avn)菌株。为检查CA04-4303/pCL1920和CA04-4303/pCL-Ptrc-serA(Avn)菌株的L-色氨酸产量，将这两种菌株在含有50mg/L壮观霉素的LB液体培养基中培养12小时。随后，将各菌株接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶(corner-baffle flask)中，使得初始OD600值达到0.01，并在振荡的同时在37℃、200rpm下培养48小时。培养完成后，通过HPLC测量L-色氨酸产量。
CA04-4303/pCL1920和CA04-4303/pCL-Ptrc-serA(Avn)菌株在培养基中的L-色氨酸生产结果显示于下表17中。CA04-4303/pCL1920菌株显示1.2g/L的L-色氨酸生产，并且中间产物吲哚的积累为37mg/L。然而，引入有serA(Avn)的菌株显示1.7g/L的L-色氨酸生产，无吲哚积累。
<生产培养基(pH 7.0)>
70g葡萄糖、20g(NH4)2SO4、1g MgSO4·7H2O、2g KH2PO4、2.5g酵母提取物、5g柠檬酸钠、1g NaCl和40g CaCO3(基于1L蒸馏水)。
表17含有serA(Avn)的L-色氨酸生产的确认
Figure BDA0003318166620000201
从以上结果可见，估计通过引入serA(Avn)，L-丝氨酸的供应是充足的，并且确认L-色氨酸的产率增加，而没有积累吲哚，即L-色氨酸生物合成最后一步中的中间产物。
实施例7-3：制备其中引入了外源固氮菌源serA(Avn)的生产色氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株
为确定固氮菌源serA(Avn)基因对生产色氨酸的棒状杆菌属菌株的影响，将KCCM12218P(韩国专利申请公开号2018-0089329)用作生产L-色氨酸的棒状杆菌属菌株。
菌株通过用通过gapA启动子表达的固氮菌源serA(Avn)基因取代谷氨酸棒状杆菌serA(下文中称为serA(Cgl))基因来制备。
对于此遗传操纵，首先，获得发生染色体同源重组的启动子的上游区域和serA(Cgl)基因的OFR的下游区域。具体地，通过利用谷氨酸棒状杆菌的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:26和27的引物进行PCR而获得启动子上游区域的基因片段，并通过利用SEQ IDNO:28和29的引物进行PCR而获得下游区域的基因片段。另外，通过利用谷氨酸棒状杆菌的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:30和31的引物进行PCR而获得gapA启动子区。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶使用，并在以下扩增条件下进行PCR：在95℃下变性5分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在58℃下退火30秒，和在72℃下聚合60秒；以及在72℃下聚合5分钟。
通过利用实施例1中制备的pCL-Ptrc_-serA(Avn)载体作为模板以及SEQ ID NO:32和33的引物进行PCR，获得固氮菌源serA(Avn)基因区域。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶使用，并在以下扩增条件下进行PCR：在95℃下变性5分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在58℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒；以及在72℃下聚合5分钟。
利用用于染色体同源重组的扩增上游和下游区域、gapA启动子、固氮菌源serA(Avn)基因和通过SmaI限制酶切割的用于染色体转化的pDZ载体，通过Gibson组装经由克隆获得重组质粒，并命名为pDZ-PgapA-serA(Avn)。克隆通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和各基因片段，然后在50℃下培育1小时而进行。
通过电穿孔用制备的pDZ-PgapA-serA(Avn)载体转化生产L-色氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株KCCM12218P，并进行第二次交叉(交换，corssover)过程，以获得其中serA(cgl)基因被通过gapA启动子表达的固氮菌serA基因取代的菌株。通过分别利用引物SEQ ID NO:34和35进行PCR和基因组测序，扩增其中插入了所述基因的同源重组的上游和下游区域的外部区域，来确认此遗传操纵，并将所得菌株命名为KCCM12218P-PgapA-serA(Avn)。
此实施例中使用的引物的序列显示于下表18中。
表18
Figure BDA0003318166620000211
实施例7-4：评价其中引入固氮菌源serA(Avn)的谷氨酸棒状杆菌菌株的色氨酸生产能力
根据以下方法培养实施例7-3中制备的KCCM12218P-PgapA-serA(Avn)菌株和亲本菌株KCCM12218P，以鉴定其色氨酸生产。将各菌株接种到含有25ml种子培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃、200rpm下在振荡的同时培养20小时。然后，将1ml种子培养基接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃、200rpm下在振荡的同时培养24小时。培养完成后，通过HPLC测量各菌株的L-色氨酸生产。
<种子培养基(pH 7.0)>
20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5gMgSO4·7H2O、100μg生物素、1,000μg盐酸硫胺素、2,000μg泛酸钙、和2,000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)。
<生产培养基(pH 7.0)>
30g葡萄糖、15g(NH4)2SO4、1.2g MgSO4·7H2O、1g KH2PO4、5g酵母提取物、900μg生物素、4,500μg盐酸硫胺素、4,500μg泛酸钙、和30g CaCO3(基于1L蒸馏水)
表19
确认引入有外源固氮菌源serA(Avn)的谷氨酸棒状杆菌菌株的色氨酸生产
Figure BDA0003318166620000221
KCCM12218P和KCCM12218P-PgapA-serA(Avn)菌株的L-色氨酸生产的评价结果显示于上表19中。
尽管亲本菌株KCCM12218P显示2.5g/L的L-色氨酸生产，并且中间产物吲哚的积累量为59mg/L，但是引入有serA(Avn)的菌株显示3.1g/L的L-色氨酸生产，而没有吲哚积累。
基于该结果，估计通过将固氮菌源serA(Avn)引入生产L-色氨酸的谷氨酸棒状杆菌中，L-丝氨酸的供应也是充足的，并且确认L-色氨酸的产率也增加，而没有积累吲哚，即L-色氨酸生物合成最后一步中的中间产物。因此，可以看出，当前体的生产一起提高时，对色氨酸生产的协同效果提高。
菌株KCCM12218P-PgapA-serA(Avn)被命名为CM05-8935，并于2018年11月27日根据布达佩斯条约被保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)，并指定登录号为KCCM12414P。
实施例8：制备引入有固氮菌源serA(Avn)的谷氨酸棒状杆菌菌株并评价该菌株的 组氨酸生产能力
实施例8-1：制备生产组氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株
由野生型菌株ATCC13032开发生产L-组氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株。为释放HisG多肽(L-组氨酸生物合成途径的第一个酶)的反馈抑制，用组氨酸取代HisG的自N端第233位的甘氨酸，同时用谷氨酰胺取代自N端第235位的苏氨酸(SEQ ID NO:88)(ACSSynth.Biol.,2014,3(1)，第21–29页)。另外，为增强L-组氨酸生物合成途径，以簇形式制备总共分成4个操纵子的生物合成基因(hisD-hisC-hisB-hisN)，其中启动子被取代并引入菌株(SEQ ID NO:89)中。
对于此遗传操纵，首先，获得发生染色体同源重组的hisG的第233和第235个氨基酸的修饰的上游和下游区域。具体地，通过利用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:36和37的引物进行PCR，获得hisG的第233和235个氨基酸的修饰的上游和下游区域的基因片段，并通过利用SEQ ID NO:38和39的引物进行PCR，获得hisG的第233和235个氨基酸的修饰的上游和下游区域的基因片段。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶使用，并通过以下扩增条件进行PCR：在95℃下变性5分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合60秒；以及在72℃下聚合5分钟。
利用hisG的第233和235个氨基酸的修饰的扩增上游和下游区域和通过SmaI限制酶切割的用于染色体转化的pDZ载体(韩国专利号10-0924065)，通过Gibson组装(DGGibson et al.,NATURE METHODS，第6卷，第5期，2009年5月，NEBuilder HiFi DNAAssembly Master Mix)经由克隆获得重组质粒，并命名为pDZ-hisG(G233H，T235Q)。克隆通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和各基因片段，然后在50℃下培育1小时而进行。
通过电穿孔用制备的pDZ-hisG(G233H，T235Q)载体转化野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株，并进行第二次交叉过程，以获得具有在染色体上第233位由甘氨酸取代为组氨酸并且第235位由苏氨酸取代为谷氨酰胺(SEQ ID NO:88)的HisG氨基酸取代的菌株。此遗传操纵通过分别利用引物SEQ ID NO:40和41进行PCR和基因组测序，扩增其中插入了所述基因的同源重组的上游和下游区域的外部区域来确认，并且所得菌株被命名为CA14-0011。
此实施例中使用的引物的序列显示于下表20中。
表20
Figure BDA0003318166620000231
另外，为增强L-组氨酸生物合成途径，以簇形式(其中启动子被取代)引入总共分成4个操纵子的生物合成基因。具体地，L-组氨酸生物合成簇共分成4个操纵子(hisE-hisG、hisA-impA-hisF-hisI、hisD-hisC-hisB和cg0911-hisN)，并制备将生物合成基因同时引入微生物中的载体。
另外，编码γ-氨基丁酸渗透酶的Ncgl1108基因(Microb Biotechnol.2014Jan；7(1):5-25))被用作生物合成簇的插入位点。
对于此遗传操纵，首先，获得发生染色体同源重组的Ncgl1108基因的上游和下游区域。具体地，通过利用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:42和43的引物进行PCR，获得Ncgl1108基因的上游区域的基因片段，并通过利用SEQ ID NO:44和45的引物进行PCR，获得Ncgl1108基因的下游区域的基因片段。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶使用，并在以下扩增条件下进行PCR：在95℃下变性5分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合60秒；以及在72℃下聚合5分钟。
利用NCgl1108基因的扩增上游和下游区域和通过SmaI限制酶切割的用于染色体转化的pDZ载体(韩国专利号10-0924065)，通过Gibson组装(DG Gibson et al.,NATUREMETHODS，第6卷，第5期，2009年5月，NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)经由克隆获得重组质粒，并命名为pDZ-△Ncgl1108。克隆通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和基因片段，然后在50℃下培育1小时而进行。
通过电穿孔用制备的pDZ-△Ncgl1108载体转化CA14-0011菌株，并进行第二次交叉过程，以获得其中Ncgl1108基因被破坏的菌株。此遗传操纵通过分别利用引物SEQ IDNO:46和47进行PCR和基因组测序，扩增基因被破坏的同源重组的上游和下游区域的外部区域来确认，并且所得菌株被命名为CA14-0736。
此实施例中使用的引物的序列显示于下表21中。
表21
Figure BDA0003318166620000241
另外，为增强生物合成簇，获得将被一组4个操纵子基因取代的启动子区。获得增强的lysC启动子(下文称为lysCP1，韩国专利号10-0930203)区和hisE-hisG区、gapA启动子区和hisA-impA-hisF-hisI区、SPL13合成启动子(韩国专利号10-1783170)区和hisD-hisC-hisB区、以及CJ7合成启动子(韩国专利号10-0620092和WO2006/065095)区和cg0911-hisN区。具体地，利用KCCM10919P菌株(韩国专利号10-0930203)的染色体作为模板以及SEQ IDNO:48和49的引物进行PCR。PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为PCR聚合酶使用，并且将从而扩增的PCR产物通过利用QIAGEN制造的PCR纯化试剂盒进行纯化，以获得lysCP1启动子区。通过利用谷氨酸棒状杆菌CA14-0011的染色体DNA作为模板以及SEQ IDNO:50和51的引物进行PCR，获得hisE-hisG区的基因片段。通过利用SEQ ID NO:52和53的引物进行PCR，获得gapA启动子区的基因片段，并通过利用SEQ ID NO:54和55的引物进行PCR，获得hisA-impA-hisF-hisI区的基因片段。另外，利用SPL13合成的启动子作为模板以及SEQID NO:56和57的引物进行PCR，并通过利用谷氨酸棒状杆菌CA14-0011的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:58和59的引物进行PCR，获得hisD-hisC-hisB区的基因片段。然后，利用CJ7合成启动子作为模板以及SEQ ID NO:60和61的引物进行PCR，并通过利用谷氨酸棒状杆菌CA14-0011的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:62和63的引物进行PCR，获得cg0911-hisN区的基因片段。
此实施例中使用的引物的序列显示于下表22中。
表22
Figure BDA0003318166620000251
Figure BDA0003318166620000261
SolgTMTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶使用，并在以下扩增条件下进行PCR：在95℃下变性5分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下聚合180秒；以及在72℃下聚合5分钟。
利用扩增的lysCP1区和hisE-hisG区、gapA启动子区和hisA-impA-hisF-hisI区、SPL13合成启动子区和hisD-hisC-hisB区、CJ7合成启动子区和cg0911-hisN区、和通过ScaI限制酶切割的用于染色体转化的pDZ载体-△NCgl1108载体，通过Gibson组装(DG Gibsonet al.,NATURE METHODS，第6卷，第5期，2009年5月，NEBuilder HiFi DNA AssemblyMaster Mix)经由克隆获得重组质粒，并命名为pDZ-△NCgl1108::lysCP1_hisEG-PgapA_hisA-impA-hisFI-SPL13_HisDCB-CJ7_cg0911-hisN。克隆通过以计算的摩尔数混合Gibson组装试剂和各基因片段，然后在50℃下培育1小时来进行。
通过电穿孔用制备的pDZ-△Ncgl1108::PlysCm1_hisEG-PgapA_hisA-impA-hisFI-SPL13_HisDCB-CJ7_cg0911-hisN载体转化CA14-0011菌株，并进行第二次交叉过程，以获得其中插入了生物合成基因的菌株。此遗传操纵通过分别利用引物SEQ ID NO:46和47进行PCR和基因组测序，扩增其中插入了基因的同源重组的上游和下游区域的外部区域来确认，并将转化的菌株命名为CA14-0737。
CA14-0737菌株于2018年11月27日根据布达佩斯条约被保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)，并指定登录号为KCCM 12411P。
实施例8-2：制备引入有外源固氮菌源serA(Avn)的生产His的谷氨酸棒状杆菌菌株
为确定固氮菌源serA(Avn)基因对L-组氨酸生产增加的作用，使用CA14-0737菌株。
利用实施例7-3制备的pDZ-PgapA-serA(Avn)，用将通过gapA启动子表达的固氮菌源serA(Avn)基因取代serA(Cgl)基因，来制备菌株。
通过电穿孔用pDZ-PgapA-serA(Avn)载体转化生产L-组氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株CA14-0737，并进行第二次交叉过程，以获得其中serA(Cgl)基因通过强启动子gapA启动子而表达的固氮菌serA基因取代的菌株。此遗传操纵通过分别利用引物SEQ ID NO:34和35进行PCR和基因组测序，扩增其中插入了基因的同源重组的上游和下游区域的外部区域来确认，并将所得菌株命名为CA14-0738。
实施例8-3：评价引入有固氮菌源serA(Avn)的生产L-组氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株
按照以下方法培养以上实施例8-1和8-2中制备的CA14-0011、CA14-0736、CA14-0737和CA14-0738菌株，以确定L-组氨酸生产能力。将各菌株接种到含有25ml种子培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃、200rpm下在振荡的同时培养20小时。然后，将1ml种子培养基接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃、200rpm下在振荡的同时培养24小时。培养完成后，通过HPLC测量L-组氨酸生产。
<种子培养基(pH 7.0)>
20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5gMgSO4·7H2O、100μg生物素、1,000μg盐酸硫胺素、2,000μg泛酸钙和2,000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)。
<生产培养基(pH 7.0)>
100g葡萄糖、40g(NH4)2SO4、3g酵母提取物、1g KH2PO4、0.4g MgSO4·7H2O、0.01gFeSO4·7H2O、50μg生物素、100μg硫胺素和30g CaCO3(基于1L蒸馏水)
表23
确认引入有外源固氮菌源serA(Avn)的谷氨酸棒状杆菌菌株的L-组氨酸生产
Figure BDA0003318166620000271
生产L-组氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株的L-组氨酸生产的评价结果显示于上表24中。
尽管具有增强的组氨酸生产能力的亲本菌株CA14-0737显示4.09g/L的L-组氨酸生产，但引入有serA(Avn)的CA14-0738菌株显示5.07g/L的L-组氨酸生产，表明与亲本菌株CA14-0737相比，L-组氨酸生产增加20％。
基于该结果，确认通过引入固氮菌源serA(Avn)增强了生产L-组氨酸的能力。CA14-0738菌株于2018年11月27日根据布达佩斯条约被保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)，并指定登录号为KCCM 12412P。
实施例9：制备和评价引入有固氮菌serA的生产甲硫氨酸(Met)的菌株
实施例9-1：制备mcbR基因缺失的重组载体
为制备生产甲硫氨酸的菌株，利用ATCC13032菌株制备用于灭活编码甲硫氨酸/半胱氨酸转录调节子(J.Biotechnol.103:51–65,2003)的mcbR基因的载体。
具体地，为了从谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032的染色体删除mcbR基因，根据以下方法制备重组质粒载体。基于保存在美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes ofHealth，NIH)GenBank的核苷酸序列，获得谷氨酸棒状杆菌的mcbR基因和侧翼序列(SEQ IDNO:91)。
为获得缺失的mcbR基因，利用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:64、65、66和67的引物进行PCR。PCR在以下扩增条件下进行：在95℃下变性5分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在53℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒；以及在72℃下聚合7分钟。结果是，分别获得700bp的DNA片段。
用限制酶SmaI处理不能在谷氨酸棒状杆菌中复制的pDZ载体(韩国专利号10-0924065)和扩增的mcbR基因片段，以在染色体中进行引入，并利用DNA连接酶连接。用该载体转化大肠杆菌DH5α，并平铺在含有25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。选择被其中插入了具有目标基因缺失的片段的载体转化的集落。然后，通过质粒提取方法获得质粒，并命名为pDZ-△mcbR。
此实施例中利用的引物的序列显示于下表24中。
表24
Figure BDA0003318166620000281
实施例9-2：制备其中metH和cysI同时被增强的重组载体
为制备生产甲硫氨酸的菌株，利用ATCC13032菌株制备这样的载体：其中本领域公知的编码甲硫氨酸合酶的metH基因(Ncgl1450)和编码亚硫酸还原酶的cysI基因(Ncgl2718)均被增强。
具体地，为了另外将metH和cysI基因插入谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032的染色体，按照以下方法制备重组质粒载体。基于保存于美国国立卫生研究院(NIH)GenBank的核苷酸系列，获得谷氨酸棒状杆菌的metH基因和侧翼序列(SEQ ID NO:92)以及cysI基因和侧翼序列(SEQ ID NO:93)。
首先，制备用于去除Ncgl1021(转座酶)的载体以插入这些基因。基于保存于美国国立卫生研究院(NIH)GenBank的核苷酸序列，获得谷氨酸棒状杆菌的Ncgl1021和侧翼序列(SEQ ID NO:94)。为获得缺失的Ncgl1021基因，利用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:68、69、70和71的引物进行PCR。PCR在以下扩增条件下进行：在95℃下变性5分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在53℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒；以及在72℃下聚合7分钟。结果是，获得了DNA片段。用限制酶xbaI处理不能在谷氨酸棒状杆菌中复制的pDZ载体(韩国专利号10-0924065)和扩增的Ncgl1021基因片段，以在染色体中进行引入，并通过Gibson组装进行克隆。将大肠杆菌DH5α用该载体转化，并平铺在含有25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。选择被其中插入了具有目标基因缺失的片段的载体转化的集落。然后，通过质粒提取方法获得质粒，并命名为pDZ-△Ncgl1021。
随后，为获得metH和cysI基因，利用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:72、73、74和75的引物进行PCR。另外，利用Pcj7启动子增强metH基因的表达，并且利用Pspl1启动子增强cysI基因的表达。为获得这些基因，首先，通过利用产氨棒状杆菌ATCC 6872的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:76和77的引物进行PCR，获得Pcj7启动子，并通过利用本领域已知的spl1-GFP载体(韩国专利号10-1783170)的DNA作为模板以及SEQ ID NO:78和79的引物进行PCR，获得Pspl1启动子。在以下扩增条件下进行PCR：在95℃下变性5分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在53℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒；以及在72℃下聚合7分钟。结果是，获得metH基因、cysI基因、Pcj7启动子和Psp11启动子的DNA片段。
在将不能在谷氨酸棒状杆菌中复制的pDZ-△Ncgl1021载体用限制酶Scal处理后，用限制酶ScaI处理扩增的4个DNA片段并通过Gibson组装克隆。将大肠杆菌DH5α用该载体转化，并平铺在含有25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。选择被其中插入了具有目标基因缺失的片段的载体转化的集落。然后，通过质粒提取方法获得质粒并命名为pDZ-△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI。
此实施例中使用的引物的序列显示于下表25中。
表25
Figure BDA0003318166620000291
Figure BDA0003318166620000301
实施例9-3：L-甲硫氨酸生产菌株的开发和利用该菌株的L-甲硫氨酸生产
用上述制备的pDC-△mcBR、pDZ-△Ncgl1021和pDZ-△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI载体中的每一种通过电穿孔经由染色体同源重组(van der Rest et al.,ApplMicrobiol Biotechnol 52:541-545,1999)转化ATCC13032菌株。然后，在含有蔗糖的固体培养基中进行第二次重组。在完成第二次重组后，通过利用SEQ ID NO:80和81的引物进行PCR，确定具有mcBR基因缺失的转化的谷氨酸棒状杆菌菌株，并通过利用SEQ ID NO:82和83的引物进行PCR，确定具有Ncgl1021基因缺失以及Pcj7-metH-Pspl1cysI基因插入Ncgl1021位点的转化菌株。重组菌株各自被命名为谷氨酸棒状杆菌13032/ΔmcbR、13032/ΔNcgl1021和13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI。
此实施例中使用的引物的序列显示在下表26中。
表26
Figure BDA0003318166620000302
Figure BDA0003318166620000311
为了评价制备的13032/ΔmcbR、13032/ΔNcgl1021和CJP13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI菌株的L-甲硫氨酸生产能力，根据以下方法培养这些菌株和亲本菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032。
将本发明的谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032和谷氨酸棒状杆菌菌株13032/ΔmcbR、13032/ΔNcgl1021和13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI中的每一种接种到含有25ml以下种子培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃、200rpm下在振荡的同时培养20小时。然后，将1ml种子培养物接种到含有24ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃、200rpm下在振荡的同时培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。
<种子培养基(pH 7.0)>
20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5gMgSO4·7H2O、100μg生物素、1,000μg盐酸硫胺素、2,000μg泛酸钙、和2,000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)。
<生产培养基(pH 8.0)>
50g葡萄糖、12g(NH4)2S2O3、5g酵母提取物、1g KH2PO4、1.2g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1,000μg盐酸硫胺素、2,000μg泛酸钙、3,000μg烟酰胺和30g CaCO3(基于1L蒸馏水)。
分析通过按照上述方法培养菌株而获得的培养物中所含的L-甲硫氨酸的浓度并显示于下表27中。
表27
制备菌株的评价
菌株 L-甲硫氨酸(g/L)
谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(野生型) 0.00
13032/ΔmcbR 0.12
13032/ΔNcgl1021 0.00
13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 0.18
结果是，确认其中仅缺失mcbR基因的菌株显示0.12g/L的L-甲硫氨酸生产，表明与对照菌株相比增加。另外，其中metH和cysI基因过表达而没有mcBR缺失的菌株显示0.18g/L的L-甲硫氨酸生产，表明与对照菌株相比增加。
实施例9-4：制备固氮菌源D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA(Avn))过表达载体
制备表达载体以确定甲硫氨酸生产能力是否通过增强固氮菌源D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(下文称为serA(Avn))而提高。
为了表达编码SerA(Avn)的serA(Avn)基因(SEQ ID NO:1)，利用在谷氨酸棒状杆菌的转化中可用的穿梭载体pECCG117(Biotechnology letters，第13卷，第10期，第721-726页，1991或韩国专利公开号92-7401)。作为表达启动子，利用spl1启动子(下文称Pspl1)制备pECCG117-Pspl1-serA(Avn)载体。利用SEQ ID NO:84和85的引物，进行Pspl1的PCR，并利用SEQ ID NO:86和87的引物，进行外源serA(Avn)的PCR。利用用限制酶EcoRV处理的pECCG117载体，通过Gibson组装，克隆扩增的Pspl1和serA(Avn)基因片段，从而制备pECCG117-Pspl1-serA(Avn)。
此实施例中使用的引物的序列显示于下表28中。
表28
Figure BDA0003318166620000321
实施例9-5：利用野生型大肠杆菌菌株制备引入有固氮菌源serA(Avn)的L-甲硫氨酸生产菌株并评价L-甲硫氨酸生产能力
分别用上述pECCG117-Pspl1-serA(Avn)载体通过电穿孔转化13032/ΔmcbR和13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI菌株(van der Rest et al.,Appl MicrobiolBiotechnol 52:541-545,1999)。重组菌株分别被命名为谷氨酸棒状杆菌13032/ΔmcbR(pECCG117-Pspl1-serA(Avn))和13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI(pECCG117-Pspl1-serA(Avn))。
为评价所制备的13032/ΔmcbR(pECCG117-Pspl1-serA(Avn))和13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI(pECCG117-Pspl1-serA(Avn))重组菌株的L-甲硫氨酸生产能力，按照以下方法培养这些菌株及其亲本菌株(13032/ΔmcbR和13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI)。
将谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和根据本公开所制备的谷氨酸棒状杆菌菌株13032/ΔmcbR、13032/ΔNcgl1021、13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI中的每一种接种到含有25ml以下种子培养基的250ml角挡板烧瓶，并在30℃、200rpm下在振荡的同时培养20小时。然后，将1ml的种子培养物接种到含有24ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃、200rpm下在振荡的同时培养48小时。具体地，在另外添加卡那霉素(25mg/l)之后，培养包含所述载体的菌株。种子培养基和生产培养基的组成如下。
<种子培养基(pH 7.0)>
20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5gMgSO4·7H2O、100μg生物素、1,000μg盐酸硫胺素、2,000μg泛酸钙、和2,000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)。
<生产培养基(pH 8.0)>
50g葡萄糖、12g(NH4)2S2O3、5g酵母提取物、1g KH2PO4、1.2g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1,000μg盐酸硫胺素、2,000μg泛酸钙、3,000μg烟酰胺和30g CaCO3(基于1L蒸馏水)。
分析了通过按照上述方法培养菌株而获得的培养物中所含的L-甲硫氨酸的浓度并显示于下表29中。
表29制备菌株的评价
Figure BDA0003318166620000331
结果是，确认用pECCG117-Pspl1-serA(Avn)转化的两种菌株均显示L-甲硫氨酸生产与对照菌株相比增加。另外，13032/ΔmcbR(pECCG117-Pspl1-serA(Avn))菌株显示L-甲硫氨酸生产与对照菌株相比增加83％，并且13032/ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysIpECCG117-Pspl1-serA(Avn))菌株显示L-甲硫氨酸生产与对照菌株相比增加78％。因此，根据此实施例，确认微生物的L-甲硫氨酸生产能力通过向其中引入固氮菌源serA(Avn)而得到提高。
13032/ΔmcbR菌株被命名为CM02-0618，并于2019年1月4日根据布达佩斯条约被保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)，并指定登录号为KCCM12425P。另外，13032/ΔmcbR(pECCG117-Pspl1-serA(Avn))菌株被命名为CM02-0693，并于2018年11月27日根据布达佩斯条约被保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)，并指定登录号为KCCM12413P。
尽管已参考具体示例性实施方式描述了本公开，但是本公开所属领域的技术人员将理解，本公开可以以其它具体形式实施而不背离本公开的技术精神或基本特征，因此，上述实施方式在所有方面被视为是示例性的而非限制性的。此外，本公开的范围应由所附权利要求而不是详细描述限定，并且应理解，所有衍生自本公开的含义和范围的修改或变化及其等同形式均被包括在本公开的范围内。
Figure BDA0003318166620000341
Figure BDA0003318166620000351
Figure BDA0003318166620000361
Figure BDA0003318166620000371
Figure BDA0003318166620000381
Figure BDA0003318166620000391
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 生产L-氨基酸的微生物和利用其生产L-氨基酸的方法
<130> OPA19298
<150> KR 10-2019-0054430
<151> 2019-05-09
<160> 95
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 409
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 多肽
<400> 1
Met Ser Lys Thr Ser Leu Asp Lys Ser Lys Ile Arg Phe Leu Leu Leu
1 5 10 15
Glu Gly Val His Gln Thr Ala Leu Asp Thr Leu Lys Ala Ala Gly Tyr
20 25 30
Thr Asn Ile Glu Tyr Leu Thr Gly Ser Leu Pro Glu Glu Gln Leu Lys
35 40 45
Glu Lys Ile Ala Asp Ala His Phe Ile Gly Ile Arg Ser Arg Thr Gln
50 55 60
Leu Thr Glu Glu Val Phe Asp Arg Ala Lys Lys Leu Val Ala Val Gly
65 70 75 80
Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Glu Ala Ala Arg Glu
85 90 95
Arg Gly Ile Ala Val Phe Asn Ala Pro Tyr Ser Asn Thr Arg Ser Val
100 105 110
Ala Glu Leu Val Leu Ala Glu Ala Ile Leu Leu Leu Arg Gly Ile Pro
115 120 125
Glu Lys Asn Ala Ala Ser His Arg Gly Gly Trp Leu Lys Ser Ala Ser
130 135 140
Asn Ser Tyr Glu Ile Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly
145 150 155 160
Ser Ile Gly Thr Gln Leu Ser Val Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Gln
165 170 175
Val Leu Phe Tyr Asp Val Val Thr Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Ala
180 185 190
Gln Val Gly Asn Leu Tyr Asp Leu Leu Gly Gln Ala Asp Ile Val Thr
195 200 205
Leu His Val Pro Glu Thr Ala Ala Thr Lys Trp Met Ile Gly Glu Lys
210 215 220
Glu Ile Arg Ala Met Lys Lys Gly Ala Ile Leu Leu Asn Ala Ala Arg
225 230 235 240
Gly Thr Val Val Asp Ile Asp Ala Leu Ala Ala Ala Leu Arg Asp Lys
245 250 255
His Leu Asn Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Val Glu Pro Arg Ser
260 265 270
Asn Asn Asp Glu Phe Val Ser Pro Leu Arg Glu Phe Asp Asn Val Ile
275 280 285
Leu Thr Pro His Val Gly Gly Ser Thr Met Glu Ala Gln Ala Asn Ile
290 295 300
Gly Ser Glu Val Ala Glu Lys Leu Val Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Thr
305 310 315 320
Ser Val Ser Ser Val Asn Phe Pro Glu Val Ala Leu Pro Ser His Pro
325 330 335
Gly Lys His Arg Leu Leu His Ile His Lys Asn Ile Pro Gly Val Met
340 345 350
Ser Glu Ile Asn Lys Val Phe Ala Glu Asn Gly Ile Asn Ile Ser Gly
355 360 365
Gln Phe Leu Gln Thr Asn Glu Thr Val Gly Tyr Val Val Ile Asp Val
370 375 380
Asp Ala Glu Tyr Ser Glu Met Ala Leu Glu Lys Leu Gln Gln Val Asn
385 390 395 400
Gly Thr Ile Arg Ser Arg Val Leu Phe
405
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
aggtcgactc tagaggatcc cccgcttgct gcaactctct 40
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
gatatctttc ctgtgtga 18
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
aatttcacac aggaaagata tcatgagtaa gacctccctg 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
gtgaattcga gctcggtacc ctcagaacag aacccgtgag 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
aatttcacac aggaaagata tcatggcaaa ggtatcgctg 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
gtgaattcga gctcggtacc cttagtacag cagacgggcg 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
cctcaccacg ttgcgtctcg agtcagaaca gaacccgtga 40
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
ctcgagacgc aacgtggtga 20
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
agtgaattcg agctcggtac ccttaaccgt gacggcgttc 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
ctcaccacgt tgcgtctcga gttagtacag cagacgggcg 40
<210> 12
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
tgcaatgcat aacaacgcag tcgcactatt tttcactgga gagaagccct gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 13
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
tgcaatgcat aacaacgcag tcgcactatt tttcactgga gagaagccct gtccatatga 60
atatcctcct 70
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
gggcaggatc tcctgtcatc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
aaatgtcgga taaggcaccg 20
<210> 16
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
tgtaatattc acagggatca ctgtaattaa aataaatgaa ggattatgta gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 17
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
tgtagggtaa gagagtggct aacatcctta tagccactct gtagtattaa gtccatatga 60
atatcctcct 70
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
acatccttat agccactctg 20
<210> 19
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
tacaaccggg ggaggcattt tgcttccccc gctaacaatg gcgacatatt gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 20
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
gcattcggtg cacgatgcct gatgcgccac gtcttatcag gcctacaaaa gtccatatga 60
atatcctcct 70
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
aggacggata aggcgttcac 20
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
gaattcatgc aaacacaaaa accgac 26
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
gaattctcag aaagtctcct gtgca 25
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
cgcttatcgc gacaattcca ccgcgctttt tcaccag 37
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
ctggtgaaaa agcgcggtgg aattgtcgcg ataagcg 37
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
tcgagctcgg tacccggaag atctagtcgg atacg 35
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
tcgtttttag gcctccgact actttgggca atcct 35
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
tctgttctga ttagagatcc atttgcttga ac 32
<210> 29
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
ctctagagga tcccctcacc cagctcaaag ctgat 35
<210> 30
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
tgcccaaagt agtcggaggc ctaaaaacga ccgag 35
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
tcttactcat gttgtgtctc ctctaaag 28
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
gagacacaac atgagtaaga cctccctg 28
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
ggatctctaa tcagaacaga acccgtgag 29
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
accaagagtt cgaagaccag 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
ttcagtggct tccacatcgc 20
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
tcgagctcgg tacccatcgc catctacgtt gctgg 35
<210> 37
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
gtgccagtgg ggatacctgt gggtgggata agcctggggt tactg 45
<210> 38
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
aaccccaggc ttatcccacc cacaggtatc cccactggca cgcga 45
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
ctctagagga tccccgggac gtggttgatg gtggt 35
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
atggaaatcc tcgccgaagc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
atcgatgggg aactgatcca 20
<210> 42
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
tcgagctcgg tacccatcgc catctacgtt gctgg 35
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
gagtctagaa gtactcgaga tgctgacctc gtttc 35
<210> 44
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
agcatctcga gtacttctag actcgcacga aaaag 35
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
ctctagagga tcccctttgg gcagagctca aattc 35
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
agtttcgtaa cccaccttgc 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
cgcttctcaa tctgatgaga 20
<210> 48
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
gtcagcatct cgagtgctcc ttagggagcc atctt 35
<210> 49
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
gtcaaatgtc ttcacatgtg tgcacctttc gatct 35
<210> 50
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
gaaaggtgca cacatgtgaa gacatttgac tcgct 35
<210> 51
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
tcgtttttag gcctcctaga tgcgggcgat gcgga 35
<210> 52
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
atcgcccgca tctaggaggc ctaaaaacga ccgag 35
<210> 53
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
gacagttttg gtcatgttgt gtctcctcta aagat 35
<210> 54
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
tagaggagac acaacatgac caaaactgtc gccct 35
<210> 55
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
tgaagcgccg gtaccgctta cagcaaaacg tcatt 35
<210> 56
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
cgttttgctg taagcggtac cggcgcttca tgtca 35
<210> 57
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
agtgacattc aacattgttt tgatctcctc caata 35
<210> 58
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
gaggagatca aaacaatgtt gaatgtcact gacct 35
<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
cgctgggatg tttctctaga gcgctccctt agtgg 35
<210> 60
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
aagggagcgc tctagagaaa catcccagcg ctact 35
<210> 61
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
agtcatgcct tccatgagtg tttcctttcg ttggg 35
<210> 62
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
cgaaaggaaa cactcatgga aggcatgact aatcc 35
<210> 63
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
cgagtctaga agtgcctatt ttaaacgatc cagcg 35
<210> 64
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
tcgagctcgg tacccctgcc tggtttgtct tgta 34
<210> 65
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
cggaaaatga agaaagttcg gccacgtcct ttcgg 35
<210> 66
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
aggacgtggc cgaactttct tcattttccg aaggg 35
<210> 67
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
ctctagagga tccccgtttc gatgcccact gagca 35
<210> 68
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
acccggggat cctctagaat gtttgtgatg cgcag 35
<210> 69
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
gtcagagagt acttacgctg atcgggaggg aaagc 35
<210> 70
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
atcagcgtaa gtactctctg actagcgtca ccctc 35
<210> 71
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
ctgcaggtcg actctagaaa agggattgga gtgtt 35
<210> 72
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
caacgaaagg aaacaatgtc tacttcagtt acttc 35
<210> 73
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
tcgagctcgg tacccctgcg acagcatgga actc 34
<210> 74
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
atcaaaacag atatcatgac aacaaccacc ggaag 35
<210> 75
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
cgctagtcag agagttcaca ccaaatcttc ctcag 35
<210> 76
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
ccgatcagcg taagtagaaa catcccagcg ctact 35
<210> 77
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
aactgaagta gacattgttt cctttcgttg ggtac 35
<210> 78
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
tactttaacg tctaaggtac cggcgcttca tgtca 35
<210> 79
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
ggtggttgtt gtcatgatat ctgttttgat ctcct 35
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
aatctggatt tccgccaggt 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 81
cttcctaact cctgaggaag 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 82
atccccatcg gcatctttat 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
cgatcacact gggctgatct 20
<210> 84
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
atcgataagc ttgatggtac cggcgcttca tgtca 35
<210> 85
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
ggaggtctta ctcatgatat ctgttttgat ctcct 35
<210> 86
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
atcaaaacag atatcatgag taagacctcc ctgga 35
<210> 87
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
ctgcaggaat tcgattcaga acagaacccg tgagc 35
<210> 88
<211> 281
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 多肽
<400> 88
Met Leu Lys Ile Ala Val Pro Asn Lys Gly Ser Leu Ser Glu Arg Ala
1 5 10 15
Met Glu Ile Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Ala Gly Arg Gly Asp Ser Lys
20 25 30
Ser Leu Asn Val Phe Asp Glu Ala Asn Asn Val Glu Phe Phe Phe Leu
35 40 45
Arg Pro Lys Asp Ile Ala Ile Tyr Val Ala Gly Gly Gln Leu Asp Leu
50 55 60
Gly Ile Thr Gly Arg Asp Leu Ala Arg Asp Ser Gln Ala Asp Val His
65 70 75 80
Glu Val Leu Ser Leu Gly Phe Gly Ser Ser Thr Phe Arg Tyr Ala Ala
85 90 95
Pro Ala Asp Glu Glu Trp Ser Ile Glu Lys Leu Asp Gly Lys Arg Ile
100 105 110
Ala Thr Ser Tyr Pro Asn Leu Val Arg Asp Asp Leu Ala Ala Arg Gly
115 120 125
Leu Ser Ala Glu Val Leu Arg Leu Asp Gly Ala Val Glu Val Ser Ile
130 135 140
Lys Leu Gly Val Ala Asp Ala Ile Ala Asp Val Val Ser Thr Gly Arg
145 150 155 160
Thr Leu Arg Gln Gln Gly Leu Ala Pro Phe Gly Glu Val Leu Cys Thr
165 170 175
Ser Glu Ala Val Ile Val Gly Arg Lys Asp Glu Lys Val Thr Pro Glu
180 185 190
Gln Gln Ile Leu Leu Arg Arg Ile Gln Gly Ile Leu His Ala Gln Asn
195 200 205
Phe Leu Met Leu Asp Tyr Asn Val Asp Arg Asp Asn Leu Asp Ala Ala
210 215 220
Thr Ala Val Thr Pro Gly Leu Ser His Pro Gln Val Ser Pro Leu Ala
225 230 235 240
Arg Asp Asn Trp Val Ala Val Arg Ala Met Val Pro Arg Arg Ser Ala
245 250 255
Asn Ala Ile Met Asp Lys Leu Ala Gly Leu Gly Ala Glu Ala Ile Leu
260 265 270
Ala Ser Glu Ile Arg Ile Ala Arg Ile
275 280
<210> 89
<211> 10676
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 89
gctccttagg gagccatctt ttggggtgcg gagcgcgatc cggtgtctga ccacggtgcc 60
ccatgcgatt gttaatgccg atgctagggc gaaaagcacg gcgagcagat tgctttgcac 120
ttgattcagg gtagttgact aaagagttgc tcgcgaagta gcacctgtca cttttgtctc 180
aaatattaaa tcgaatatca atatatggtc tgtttattgg aacgcgtccc agtggctgag 240
acgcatccgc taaagcccca ggaaccctgt gcagaaagaa aacactcctc tggctaggta 300
gacacagttt attgtggtag agttgagcgg gtaactgtca gcacgtagat cgaaaggtgc 360
acacatgtga agacatttga ctcgctgtac gaagaacttc ttaaccgtgc tcagacccgc 420
cctgaagggt ctggaaccgt ggccgccttg gataaaggca tccatcatct aggtaagaag 480
gtcatcgaag aagccggaga ggtctggatt gcagccgagt atgagaccga tgaagagcta 540
gccggagaaa tctcccagct catttattgg acccaggtca tcatggttgc tcgcggcctg 600
aagccagaag atatctacaa gaacctgtag gagttttaaa gcaatcatgt tgaaaatcgc 660
tgtcccaaac aaaggctcgc tgtccgagcg cgccatggaa atcctcgccg aagcaggcta 720
cgcaggccgt ggagattcca aatccctcaa cgtttttgat gaagcaaaca acgttgaatt 780
cttcttcctt cgccctaaag atatcgccat ctacgttgct ggtggccagc tcgatttggg 840
tatcaccggc cgcgaccttg ctcgcgattc ccaggctgat gtccacgaag ttctttccct 900
cggcttcggt tcctccactt tccgttacgc agcaccagct gatgaagagt ggagcatcga 960
aaagctcgac ggcaagcgca tcgctacctc ttaccccaac cttgttcgcg atgacctcgc 1020
agcacgtggg ctttccgctg aggtgctccg cctcgacggt gcagtagagg tatccatcaa 1080
gcttggtgtc gcagatgcca tcgccgatgt tgtatccacc ggccgcacgc tgcgtcagca 1140
aggtcttgca cctttcggcg aggttctgtg cacctctgag gctgtcattg ttggccgcaa 1200
ggatgaaaag gtcaccccag agcagcagat cctgcttcgc cgcatccagg gaattttgca 1260
cgcgcagaac ttcctcatgc tggattacaa cgtcgaccgc gacaacctgg acgctgccac 1320
tgcagtaacc ccaggcttat cccacccaca ggtatcccca ctggcacgcg acaactgggt 1380
tgctgtacgc gccatggtgc cacgcaggtc agctaacgcc atcatggata agcttgctgg 1440
actcggcgct gaagccatcc tggcttctga aatccgcatc gcccgcatct aggaggccta 1500
aaaacgaccg agcctattgg gattaccatt gaagccagtg tgagttgcat cacattggct 1560
tcaaatctga gactttaatt tgtggattca cgggggtgta atgtagttca taattaaccc 1620
cattcggggg agcagatcgt agtgcgaacg atttcaggtt cgttccctgc aaaaactatt 1680
tagcgcaagt gttggaaatg cccccgtttg gggtcaatgt ccatttttga atgtgtctgt 1740
atgattttgc atctgctgcg aaatctttgt ttccccgcta aagttgagga caggttgaca 1800
cggagttgac tcgacgaatt atccaatgtg agtaggtttg gtgcgtgagt tggaaaaatt 1860
cgccatactc gcccttgggt tctgtcagct caagaattct tgagtgaccg atgctctgat 1920
tgacctaact gcttgacaca ttgcatttcc tacaatcttt agaggagaca caacatgacc 1980
aaaactgtcg cccttctcga ctacggatct ggaaaccttc gttctgctca acgcgcacta 2040
gagcgtgccg gtgcagaagt tatcgtgagc tccgatccag aagtttgcac caacgctgat 2100
ggcctcctag ttcctggagt gggcgcattt gatgcctgca tgaagggttt gaaaaacgtc 2160
ttcggacatc gcattatcgg acagcgtctt gctggtggac gtccagtgat gggtatttgt 2220
gtgggcatgc agatcctgtt cgatgaaggc gatgagcacg gcattaagtc agctggttgc 2280
ggcgagtggc ctggcaaagt ggaacgcctc caagcggaga tcctgcctca catggggtgg 2340
aacacacttg aaatgcctac caactcacca atgtttgagg gaatttcacc tgatgagcgt 2400
ttctacttcg tgcactccta tggtgtgcgc aagtggacgt tggaaaccga cgatctgacc 2460
acgcctccag aggttgtgtg ggcgaagcac gaaaatgatc gttttgtggc agctgtggaa 2520
aacggcacgc tgtgggctac tcaattccac ccagaaaaat caggtgacgc aggcgcacag 2580
ctactgcgaa actggatcaa ctacatctaa cagataggat caatattcat gaccttcact 2640
attcttcctg cagtcgatgt agttaacgga caagcagttc gcctagatca gggcgaggcc 2700
ggcactgaaa agtcttatgg cacccctttg gaatccgcac tgaagtggca ggagcagggt 2760
gcaaagtggt tgcactttgt ggacctggac gcagcgttca accgtggttc caaccatgag 2820
atgatggcgg aaattgtcgg caagctcgat gttgatgtgg agctcactgg cggtatccgt 2880
gatgatgagt ctctggagcg cgcgctggca accggtgcac gtcgtgtaaa cattggtacc 2940
gctgctctgg agaagccaga gtggattgct tctgcgattc aacgctatgg cgagaagatt 3000
gctgtcgata tcgctgtgcg tttggaagat ggtgaatggc gcacccgtgg aaacggttgg 3060
gtctccgatg gtggcgatct gtgggaagtt ctcgagcgtt tggattccca aggttgtgca 3120
cgtttcgtgg ttaccgatgt gtccaaggac ggcaccttga gtggtccaaa tgttgagctg 3180
ctgcgtgagg ttgctgcagc tacagacgca cctatcgtgg catctggtgg aatttctgtt 3240
ttggaagatg ttttggaact agccaagtac caggatgagg gcattgattc cgtcatcatt 3300
ggcaaggcac tttatgagca caagttcacc ctcgaagagg ctttggctgc agtagaaaag 3360
ctcggttaat acatggatgc tcgtgggatg ttggccattg cggaggccgt tgtagatgat 3420
gccgaagccc tcttcatgca gggcttcgga gctgcacctg cccatatgaa atccccgggg 3480
gattttgcca cggaagtgga tatggccatc gaatcccata tgcgttcgat gctgaacatg 3540
atgacaggca ttgctgtcat cggtgaagaa ggtggcggtg cgacctccgg cacgcgctgg 3600
gtgattgatc ccatcgacgg caccgccaac ttcgcggcgt ccaacccgat gagcgcgatc 3660
ctggtgtctt tgcttgtcga cgaccagccc gtcctgggta ttacctccat gcccatgctg 3720
ggtaaacgcc tcaccgcttt tgaaggttca ccgctgatga tcaacggtga acctcaggaa 3780
ccattgcaag aacaatccag tttggtatcc cacattggtt ttagttccat ggcctccccg 3840
cgcaatacag cgtttcctgt ggagttgcgt cgggatcttc tgaccgagct cacggaatcg 3900
tatcttcgtc cccgcattac aggttcggtg ggtgttgatc tcgcgttcac tgcgcagggc 3960
atttttggag catgcgtatc gtttagtcct catgtttggg acaattccgc aggcgtgatg 4020
ttgatgcgcg ctgctggtgc acaagttact gacaccgaag gccatccgtg ggcaccaggt 4080
aggggagtcg tggccggaac aaaaagggct cacgatgtgc tgttaagtaa gattgaaaaa 4140
gttcggttga tgcatgcaga tgcaggtaat gaccagtcgt taaatgagga gtacaagtaa 4200
aatgggcgtg gcaattcgag ttattccttg cctggacgtg gacaacggcc gggttgttaa 4260
aggcgtgaac tttgaaaacc tccgcgatgc tggcgatcct gtggagttgg caaagcgcta 4320
tgacgaggaa ggggcagatg agctgacctt cctggatgtc accgcctcga agcatggtcg 4380
cggcaccatg ctggatgttg ttcgacgcac cgctgatcag gtgttcatcc ctctgactgt 4440
cggtggcggc gtgcgcagcg aagaagatgt tgatcaattg ctgcgcgctg gcgccgacaa 4500
ggtttcggtg aacacgtctg cgattgcccg tccagaactg ctgtcagagc tgtccaagcg 4560
ttttggtgct cagtgcatcg tgttgtctgt ggatgccagg cgcgttcctg aaggtggaac 4620
tcctcagcca tctggttttg aagtcaccac ccacggcggt tccaagtccg cagaacttga 4680
tgcaatcgag tgggcaaagc gcggcgaaga gctgggcgtt ggcgaaattc tgctcaactc 4740
catggacggc gacggcacca aaaacggctt tgacctagag ctgctggaaa aagttcgcgc 4800
agccgtatcc attcctgtaa tcgcctccgg cggcgctggc aaggcggagc atttcccacc 4860
agctgttgca gctggcgcca acgcagtgct tgccgcgacc attttccact tccgcgaagt 4920
aaccatcgcc gaagtaaagg gagccattaa agatgcagga tttgaggtgc ggaaatgagt 4980
gacaatccac aagagtatga gctggattgg gacgtcgaaa agcgattaaa gcttaacgac 5040
gccggcctgg tgccggcaat cgtccaggcc gacgggacca acgaggtcct catgatggcc 5100
tggatggata cccacgcgct agcctatact ttggcgaccc gccgtggaac ctatttttct 5160
aggtcccgca acgagtactg gatcaagggc ctgacctctg gaaacgtcca agaagtcacc 5220
ggacttgccc tcgactgcga cggcgacacc gtccttctga ccgtgaaaca aaccggcggt 5280
gcgtgccaca ctggtgccca cacatgtttc gacaatgacg ttttgctgta agcggtaccg 5340
gcgcttcatg tcaacaatct ttaacgtttt caagttcaca agtcgtgttc aaatggtgac 5400
aagattggac actgtgctga attggcacca agccctcata aatgatagat ctaaatcgaa 5460
tatcaatata tggtctgttt attggaacgc gtcccagtgg ctgagacgca tccgctaaag 5520
ccccaggaac cctgtgcaga aagaacaaat aatcgtgaat tttggcagca acagcggggc 5580
ctggtataat tgaaaacgtg caaaagcata gattattgga ggagatcaaa acaatgttga 5640
atgtcactga cctgcgaggt caaacaccat ccaagagcga catccgacgt gctttgccac 5700
gtggtggcac tgacgtgtgg tctgtgcttc ccatagtgca gcctgttgta gaagatgtcc 5760
aaaaccgcgg cgctgaagct gctttggatt acggcgagaa gttcgaccat attcgccccg 5820
cctcggtgcg ggtgccagct gaggttattg ctgcagcaga aaacacctta gatccgttgg 5880
tgcgtgaatc gattgaagag tcgattcgtc gcgtccgcaa ggttcacgct gagcaaaagc 5940
catccgagca caccactgaa ctttcaccag gtggcaccgt cactgagcgt ttcatgccga 6000
ttgatcgcgt gggactgtac gttccaggcg gcaatgcggt gtacccatca agcgtgatta 6060
tgaatactgt cccagctcaa gaggctggtg tgaactccct tgtggttgcg tcgcctcctc 6120
aggctgagca cggtggctgg cctcacccca ccattttggc ggcgtgttcc atcttgggtg 6180
ttgatgaggt gtgggctgtc ggcggcggtc aggccgtggc gttgctggct tatggtgatg 6240
acgctgcagg tctcgagcct gtggatatga tcactggacc tggcaatatc tttgtcaccg 6300
ctgcgaagcg cctggtcagg ggagtggtag gtactgattc tgaggctggc cctacagaaa 6360
tcgctgtgct tgctgatgcc tctgccaacg ccgtcaacgt tgcctacgat ctgatcagcc 6420
aagcagaaca cgatgtcatg gctgcgtccg tgctcatcac tgactccgag cagcttgcca 6480
aggacgtaaa cagggaaatc gaggcgcgtt actcaatcac gcgcaacgcc gagcgcgtcg 6540
cagaagcttt gcgcggggcc cagagtggca tcgtgcttgt cgacgacatt tccgtgggta 6600
tccaagtagc cgatcaatac gcagcggaac acctggaaat ccacactgag aacgcgcgcg 6660
ccgtagcaga gcagatcacc aacgcgggtg cgatcttcgt gggcgatttc tcaccagtac 6720
cactgggtga ttactccgca ggatccaacc acgtgctgcc aacctctgga tccgctcgtt 6780
tctccgcagg tctatccacg cacacgttcc ttcgcccagt caacctcatt gaatacgatg 6840
aggctgctct gaaggacgtc tcgcaggttg tcatcaactt tgccaacgcc gaagatcttc 6900
cagcgcacgg cgaagcaatc cgtgcacgct ttgaaaacct ccccaccacc gacgaggcct 6960
aagaaaaatg accaaaatta ctttgagcga tttgccattg cgtgaagaac tgcgcggtga 7020
gcacgcttac ggcgcacccc agctcaacgt tgatattcgc ctcaacacca acgaaaaccc 7080
ttacccaccg tcagaggcat tggtcgctga cttggttgcc accgtggata agatcgccac 7140
cgagctgaac cgctacccag agcgcgatgc tgtggaactg cgtgatgagt tggctgcgta 7200
catcaccaag caaaccggcg tggctgtcac cagggataac ctgtgggctg ccaatggttc 7260
caatgaaatt ctgcagcagc tgctgcaggc ttttggtgga cctggacgca ccgcgttggg 7320
attccaaccc agctattcca tgcacccaat tttggctaaa ggcacccaca ctgaattcat 7380
tgcggtgtcc cgaggtgctg atttccgcat cgatatggat gtggcgctgg aagaaattcg 7440
tgcaaagcag cctgacattg tttttgtcac caccccgaac aacccgaccg gtgatgtgac 7500
ctcgctggac gatgttgagc gcatcatcaa cgttgcccca ggcatcgtga tcgtggatga 7560
agcttatgcg gaattctccc catcaccttc agcaaccact cttctggaga agtacccaac 7620
caagctggtg gtgtcccgca ccatgagtaa ggcttttgat ttcgcaggtg gacgcctcgg 7680
ctacttcgtg gccaacccag cgtttatcga cgccgtgatg ctagtccgcc ttccgtatca 7740
tctttcagcg ctgagccaag cagccgcaat cgtagcgctg cgtcactccg ctgacacgct 7800
gggaaccgtc gaaaagctct ctgtagagcg tgttcgcgtg gcagcacgct tggaggaact 7860
gggctacgct gtggttccaa gtgagtccaa ctttgtgttc tttggagatt tctccgatca 7920
gcacgcggca tggcaggcat ttttggatag gggagtgctc atccgcgatg tgggaatcgc 7980
tgggcacttg cgcactacca ttggtgtgcc tgaggaaaat gatgcgtttt tggacgcagc 8040
tgcagagatc atcaagctga acctgtaaga gagaagaatt tttcatgact gtcgcaccaa 8100
gaattggtac cgcaacccgc accaccagcg aatccgacat caccgtcgag atcaacctgg 8160
acggcaccgg caaagtagat atcgataccg gcctgccatt tttcgaccac atgctcactg 8220
cattcggcgt gcacggcagt tttgatctga aagtccatgc caagggcgac atcgagatcg 8280
acgcacacca caccgtggaa gataccgcca tcgtgctcgg ccaagcactc cttgacgcta 8340
ttggcgacaa gaaaggcatc cgccgtttcg catcctgcca gctgcccatg gatgaggcat 8400
tagtggagtc cgtggtggat atctccggtc gcccatactt cgtgatctcc ggcgaaccag 8460
accacatgat cacctccgtg atcggtggac actacgcaac cgtgatcaac gagcacttct 8520
ttgaaaccct cgcgctcaac tcccgaatca ccctccacgt gatctgccac tacggccgcg 8580
accctcacca catcaccgaa gcagagtaca aggctgttgc ccgtgcgctg cgcggtgccg 8640
tagagatgga tcctcgtcaa acaggaatcc catccactaa gggagcgctc tagagaaaca 8700
tcccagcgct actaataggg agcgttgacc ttccttccac ggaccggtaa tcggagtgcc 8760
taaaaccgca tgcggcttag gctccaagat aggttctgcg cggccgggta atgcatcttc 8820
tttagcaaca agttgagggg taggtgcaaa taagaacgac atagaaatcg tctcctttct 8880
gtttttaatc aacatacacc accacctaaa aattccccga ccagcaagtt cacagtattc 8940
gggcacaata tcgttgccaa aatattgttt cggaatatca tgggatacgt acccaacgaa 9000
aggaaacact catggaaggc atgactaatc cagagcagac acatcccgct gcaagcctcg 9060
aagacatgat caaaaccatc acaaagacct tcgtgattgc tcacgatcag gattctgatg 9120
agcatcttgc gcaggcactg gtgtacaacg ctggacgttt ggcatggcgc atgcgcgaaa 9180
acggtgtgga tacggattac aagacttctg tgtctgatgt ggtcacggat gccgatcgtg 9240
cggccgaggc cttcgtcgca ggcgttcttg aagcgttgcg gcctgaggac ggcgtgcttg 9300
gcgaggaagg cgcggaccgg gcgtcgaaaa gcggaaaaac ctgggtcatc gacccggttg 9360
atggcaccta caacttcacc cagggctcag attattggtg ctcggcgctc gcgctggtcg 9420
agggcgatcc atccgcgcca tcgcgcgtgc ttttcggcgc cgtacaccgc ccagccatgg 9480
gttatacgtg gttcggtggc ccgggaatcc gcaccacgct cgacggcaag gagctagatt 9540
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tcgcggaacc tgatattcaa aaggcgtgga tgagcgttgc cacccaccct gcaacgctgc 9660
gcatgttcgg cgccggctcc atcgatttgg ccaacatcgc cgacggcagc atcggcgcat 9720
gggtgcagca cagcgtcgca gattgggact ggctacccgg ccgcgcactc atcgaaggcg 9780
tcggcggagc atgcatcaaa gtgaccgccg gcggcgtcga atggtccgtt gcaggaaacg 9840
cggaagcagt tagtgagatc tccgaaactt taagcgcact agactaacaa cacatgagca 9900
aatatgcaga cgatttagcc ttagccctcg aacttgccga acttgccgat tccatcaccc 9960
tcgaccgctt cgaagcctct gacctggaag tatcctccaa gccagacatg actcccgtca 10020
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ccgactccat cctcggtgaa gaattcggtg gcgacgtaga attcagcggc cgccagtgga 10140
tcatcgaccc catcgacggc accaaaaact acgtccgcgg cgtccccgta tgggcaaccc 10200
tgatcgcgct gctcgacaac ggcaaacccg tcgcaggtgt catctccgca cccgcactgg 10260
ctaggcgttg gtgggcatcc gaaggggccg gcgcatggcg caccttcaac ggcagctccc 10320
cacgcaaact gtccgtgtcc caggtgtcca agcttgacga cgcctccctc tccttctcct 10380
ccctctccgg ctgggccgaa cgagatttgc gcgatcagtt cgtctcccta actgatacca 10440
cctggcgact ccgcggctac ggcgacttct tctcctactg cctcgtcgcc gaaggtgccg 10500
tcgatatcgc cgctgaacca gaagtcagcc tctgggatct tgctcccctg tccatcctgg 10560
tcaccgaagc cggaggaaag ttcacctcac tggctggcgt cgatggacca cacggtggcg 10620
atgcagtagc caccaacggc atcctgcacg atgagacgct ggatcgttta aaatag 10676
<210> 90
<211> 281
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 多肽
<400> 90
Met Leu Lys Ile Ala Val Pro Asn Lys Gly Ser Leu Ser Glu Arg Ala
1 5 10 15
Met Glu Ile Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Ala Gly Arg Gly Asp Ser Lys
20 25 30
Ser Leu Asn Val Phe Asp Glu Ala Asn Asn Val Glu Phe Phe Phe Leu
35 40 45
Arg Pro Lys Asp Ile Ala Ile Tyr Val Ala Gly Gly Gln Leu Asp Leu
50 55 60
Gly Ile Thr Gly Arg Asp Leu Ala Arg Asp Ser Gln Ala Asp Val His
65 70 75 80
Glu Val Leu Ser Leu Gly Phe Gly Ser Ser Thr Phe Arg Tyr Ala Ala
85 90 95
Pro Ala Asp Glu Glu Trp Ser Ile Glu Lys Leu Asp Gly Lys Arg Ile
100 105 110
Ala Thr Ser Tyr Pro Asn Leu Val Arg Asp Asp Leu Ala Ala Arg Gly
115 120 125
Leu Ser Ala Glu Val Leu Arg Leu Asp Gly Ala Val Glu Val Ser Ile
130 135 140
Lys Leu Gly Val Ala Asp Ala Ile Ala Asp Val Val Ser Thr Gly Arg
145 150 155 160
Thr Leu Arg Gln Gln Gly Leu Ala Pro Phe Gly Glu Val Leu Cys Thr
165 170 175
Ser Glu Ala Val Ile Val Gly Arg Lys Asp Glu Lys Val Thr Pro Glu
180 185 190
Gln Gln Ile Leu Leu Arg Arg Ile Gln Gly Ile Leu His Ala Gln Asn
195 200 205
Phe Leu Met Leu Asp Tyr Arg Val Asp Arg Asp Asn Leu Asp Ala Ala
210 215 220
Thr Ala Val Thr Pro Gly Leu Ser His Pro Gln Val Ser Pro Leu Ala
225 230 235 240
Arg Asp Asn Trp Val Ala Val Arg Ala Met Val Pro Arg Arg Ser Ala
245 250 255
Asn Ala Ile Met Asp Lys Leu Ala Gly Leu Gly Ala Glu Ala Ile Leu
260 265 270
Ala Ser Glu Ile Arg Ile Ala Arg Ile
275 280
<210> 91
<211> 2642
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 91
ctcccgcgca ctgctgcaat ccgcaccgtg cccaatgatg gtggttcgcc cacctgagaa 60
gattaagaag tagtttcttt taagtttcga tgccccggtt tcctgatttt gtgcagggag 120
gccggggcat tggtgtttgc gggttagttc gggccattcg aaagggagaa accaagggca 180
gccagacaga cgtgccaaga atctggattt ccgccaggtt ttggcacgcc cgtctggttt 240
aggcaatgag ataccgaaca cacgtgccaa aagttcggct ttttcgccga tcttgtcacg 300
cctgcctggt ttgtcttgta aagagtgatt tcatggccga gactcctaaa agtttgacct 360
cacaggattg cttctaaggg cctctccaat ctccactgag gtacttaatc cttccgggga 420
attcgggcgc ttaaatcgag aaattaggcc atcacctttt aataacaata caatgaataa 480
ttggaatagg tcgacacctt tggagcggag ccggttaaaa ttggcagcat tcaccgaaag 540
aaaaggagaa ccacatgctt gccctaggtt ggattacatg gatcattatt ggtggtctag 600
ctggttggat tgcctccaag attaaaggca ctgatgctca gcaaggaatt ttgctgaaca 660
tagtcgtcgg tattatcggt ggtttgttag gcggctggct gcttggaatc ttcggagtgg 720
atgttgccgg tggcggcttg atcttcagct tcatcacatg tctgattggt gctgtcattt 780
tgctgacgat cgtgcagttc ttcactcgga agaagtaatc tgctttaaat ccgtagggcc 840
tgttgatatt tcgatatcaa caggcctttt ggtcattttg gggtggaaaa agcgctagac 900
ttgcctgtgg attaaaacta tacgaaccgg tttgtctata ttggtgttag acagttcgtc 960
gtatcttgaa acagaccaac ccgaaaggac gtggccgaac gtggctgcta gcgcttcagg 1020
caagagtaaa acaagtgccg gggcaaaccg tcgtcgcaat cgaccaagcc cccgacagcg 1080
tctcctcgat agcgcaacca accttttcac cacagaaggt attcgcgtca tcggtattga 1140
tcgtatcctc cgtgaagctg acgtggcgaa ggcgagcctc tattcccttt tcggatcgaa 1200
ggacgccttg gttattgcat acctggagaa cctcgatcag ctgtggcgtg aagcgtggcg 1260
tgagcgcacc gtcggtatga aggatccgga agataaaatc atcgcgttct ttgatcagtg 1320
cattgaggaa gaaccagaaa aagatttccg cggctcgcac tttcagaatg cggctagtga 1380
gtaccctcgc cccgaaactg atagcgaaaa gggcattgtt gcagcagtgt tagagcaccg 1440
cgagtggtgt cataagactc tgactgattt gctcactgag aagaacggct acccaggcac 1500
cacccaggcg aatcagctgt tggtgttcct tgatggtgga cttgctggat ctcgattggt 1560
ccacaacatc agtcctcttg agacggctcg cgatttggct cggcagttgt tgtcggctcc 1620
acctgcggac tactcaattt agtttcttca ttttccgaag gggtatcttc gttgggggag 1680
gcgtcgataa gccccttctt tttagcttta acctcagcgc gacgctgctt taagcgctgc 1740
atggcggcgc ggttcatttc acgttgcgtt tcgcgcctct tgttcgcgat ttctttgcgg 1800
gcctgttttg cttcgttgat ttcggcagta cgggttttgg tgagttccac gtttgttgcg 1860
tgaagcgttg aggcgttcca tggggtgaga atcatcaggg cgcggttttt gcgtcgtgtc 1920
cacaggaaga tgcgcttttc tttttgtttt gcgcggtaga tgtcgcgctg ctctaggtgg 1980
tgcactttga aatcgtcggt aagtgggtat ttgcgttcca aaatgaccat catgatgatt 2040
gtttggagga gcgtccacag gttgttgctg acccaataga gtgcgattgc tgtggggaat 2100
ggtcctgtga ggccaaggga cagtgggaag atcggcgcga ggatcgacat cacgatcatg 2160
aacttcagca tgccgttaga gaatccggat gcgtaatcgt tggtttggaa gctgcggtac 2220
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acataagcgg gcagaggcac attgctcacg cgaccagcga ggaaagattc cacttcctca 2400
ggagttagga agccgatcga ctggaagacg ggattttcca aaccaccttc agggcgagcc 2460
atgcggagaa gtgcccagta aagaccaagg acaatcggta tctggatcag cccaggcaca 2520
caacctgcca gcgggttaat gccgtattcc ttattcaaat cattctggcg cttctgcaac 2580
tcccgaatgg acgcttcatc gtactttccc ttgtattctt cccggagcgc agcgcggtga 2640
gg 2642
<210> 92
<211> 5666
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 92
tgtcatgctt ccggaggtgc gcagggctcg agactccgga aagctatttg ccactccgat 60
gtttgggtca ctcgacgaga tacgtgctga tcacctaatt tggtgcacag ggtttcggcc 120
ggcgattagg ccagttcgtc aacttctcaa acacggacaa ccaaaggttc ctggtcttta 180
tttagtaggc tacggagatt ggacgggacc tgggtctgcg actatcacag gggtcgggct 240
ttatgccaag cgagcagcca aagagattgc cgcgtcagtc ggcaaagtcg ttaaatagtt 300
tgaaggctaa gaacttaatg ttaaagcgaa aattgttttg acacctcaac taatgcagcg 360
atgcgttctt tccagaatgc tttcatgaca gggatgctgt cttgatcagg caggcgtctg 420
tgctggatgc cgaagctgga tttattgtcg cctttggagg tgaagttgac gctcactcga 480
gaatcatcgg ccaaccattt ggcattgaat gttctaggtt cggaggcgga ggttttctca 540
attagtgcgg gatcgagcca ctgcgcccgc aggtcatcgt ctccgaagag cttccacact 600
ttttcgaccg gcaggttaag ggttttggag gcattggccg cgaacccatc gctggtcatc 660
ccgggtttgc gcatgccacg ttcgtattca taaccaatcg cgatgccttg agcccaccag 720
ccactgacat caaagttgtc cacgatgtgc tttgcgatgt gggtgtgagt ccaagaggtg 780
gcttttacgt cgtcaagcaa ttttagccac tcttcccacg gctttccggt gccgttgagg 840
atagcttcag gggacatgcc tggtgttgag ccttgcggag tggagtcagt catgcgaccg 900
agactagtgg cgctttgcct gtgttgctta ggcggcgttg aaaatgaact acgaatgaaa 960
agttcgggaa ttgtctaatc cgtactaagc tgtctacaca atgtctactt cagttacttc 1020
accagcccac aacaacgcac attcctccga atttttggat gcgttggcaa accatgtgtt 1080
gatcggcgac ggcgccatgg gcacccagct ccaaggcttt gacctggacg tggaaaagga 1140
tttccttgat ctggaggggt gtaatgagat tctcaacgac acccgccctg atgtgttgag 1200
gcagattcac cgcgcctact ttgaggcggg agctgacttg gttgagacca atacttttgg 1260
ttgcaacctg ccgaacttgg cggattatga catcgctgat cgttgccgtg agcttgccta 1320
caagggcact gcagtggcta gggaagtggc tgatgagatg gggccgggcc gaaacggcat 1380
gcggcgtttc gtggttggtt ccctgggacc tggaacgaag cttccatcgc tgggccatgc 1440
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gcaggcgctg gctggattcg tctccgaata tggcctgtcc atggtgggtg gttgttgtgg 1920
caccacacct gagcacatcc gtgcggtccg cgatgcggtg gttggtgttc cagagcagga 1980
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gaaagaggac tccgtcgcgt cgctgtacac ctcggtgcca ttgtcccagg aaaccggcat 2100
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<210> 93
<211> 11332
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 93
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gcaaagctgg tggaattgct cgagccaggc cgtatcggcg tggagttgtc cgaggaactc 10260
cagctgcacc cagagcagtc cacagacgcg tttgtgctct accacccaga ggcaaagtac 10320
tttaacgtct aacacctttg agagggaaaa ctttcccgca cattgcagat cgtgccactt 10380
taactaaggt tgacggcatg attaaggcga ttttctggga catggacggc acgatggtgg 10440
actctgagcc acagtggggc attgctacct acgagctcag cgaagccatg ggccgccgcc 10500
tcaccccgga gctccgggaa ctcaccgtcg gctcgagcct gccgcgcacc atgcgcttat 10560
gcgcagagca cgcaggcatt acattgagcg acgcggacta cgagcgctac cgggctggca 10620
tgttcgcccg ggtccatgag cttttcgacg aatccctcgt cccaaatcca ggcgtcaccg 10680
aactcctgac agagttgaag gccctcgaga tccccatgtt ggtcaccacc aacacagagc 10740
gcgatctcgc gacccgttca gtcgcagccg tgggaaatga gttcttcatc ggttctatcg 10800
ctggtgatga agtcccaaca gcaaagccag cccccgacat gtacctcgaa gcagcacgac 10860
gtgtgggctt tgacccatca gagtgcctcg tgttcgaaga ttcctacaac ggcatgctgg 10920
gcgctgttac tgcaggttgc cgcgtcattg gtctgcaccc agaagaagtc caagcgccag 10980
aaggtgtagt gcctttgcgt tccctccacg gtaaaaactc tttcgaaggt gtcaccgctg 11040
agatggtcac tgcctggtac caccagatcg agccggcagg tgtcgcaaaa taaaaccagg 11100
tgggggagtg aaattattcg actaatatcc tcccccaaac acacattgat aactgttgtg 11160
tggaagaatg taccgagtga agacatttga ctcgctgtac gaagaacttc ttaaccgtgc 11220
tcagacccgc cctgaagggt ctggaaccgt ggccgccttg gataaaggca tccatcatct 11280
aggtaagaag gtcatcgaag aagccggaga ggtctggatt gcagccgagt at 11332
<210> 94
<211> 3311
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 94
ctcattccag cgtcacgacg ttccgaaggt actggttacc tggcattggg cactaccgtt 60
tctgcagcac ttggaccagc cctagcactt tttgtcctag gaacatttga ttacgacatg 120
ctgtttatcg tggtcttggc aacctcggtc atctctttga tcgccgtcgt gttcatgtac 180
tttaagacca gcgaccctga gccttctggg gaaccagcca agttcagctt caaatctatt 240
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ggcgtcattg cctacatcaa cgcatttgct gaagaacgcg atctgattac gggtgctgga 360
ttgttcttca ttgcctacgc agtatcaatg tttgtgatgc gcagcttcct tggcaaactg 420
caggaccgtc gcggagacaa cgtcgttatt tactttggat tgttcttctt cgttatttcc 480
ttgacgattt tgtcctttgc cacttccaac tggcacgttg tgttgtccgg agtcattgca 540
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aaaaccgaat tcggtacggc cttctccact ttgttcctgt ttgtggactt aggttttggc 660
tttggaccta ttatcctggg agcagtttct gcggcaattg gtttcggacc tatgtatgca 720
gcactggcag gtgtgggtgt gattgccgga atcttctacc tgttcacaca cgctcgcacc 780
gatcgagcta agaatggctt tgttaaacac ccagagcctg tcgctttagt tagctagttc 840
tttcagcttt ccctcccgat cagcgtaaac cggcccttcc ggttttgggg tacatcacag 900
aacctgggct agcggtgtag acccgaaaat aaacgagcct tttgtcaggg ttaaggttta 960
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catcgctgac accatctgcc gcactgcgga actaggactc accatcaccg gcgcttccga 1080
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atgctcccaa cctggggtgt ttcgtcatca cacccaccgg atgctcattg atttacccat 1200
cgtcgggttt cccaccaaac tgtttatccg tctacctcgc taccgctgca ccaaccccac 1260
atgtaagcaa aagtatttcc aagcagaact aagctgcgct gaccacggta aaaaggtcac 1320
ccaccgggtc acccgctgga ttttacaacg ccttgctatt gaccggatga gtgttcacgc 1380
aaccgcgaaa gcacttgggc tagggtggga tttaacctgc caactagccc tcgatatgtg 1440
ccgtgagctg gtctataacg atcctcacca tcttgatgga gtgtatgtca ttggggtgga 1500
tgagcataag tggtcacata atagggctaa gcatggtgat gggtttgtca ccgtgattgt 1560
cgatatgacc gggcatcggt atgactcacg gtgtcctgcc cggttattag atgtcgtccc 1620
aggtcgtagt gctgatgctt tacggtcctg gcttggctcc cgcggtgaac agttccgcaa 1680
tcagatacgg atcgtgtcca tggatggatt ccaaggctac gccacagcaa gtaaagaact 1740
cattccttct gctcgtcgcg tgatggatcc attccatgtt gtgcggcttg ctggtgacaa 1800
gctcaccgcc tgccggcaac gcctccagcg ggagaaatac cagcgtcgtg gtttaagcca 1860
ggatccgttg tataaaaacc ggaagacctt gttgaccacg cacaagtggt tgagtcctcg 1920
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tgcgtggctt gcgtatcagg cgattattga ttgttatcag atgggtaata agcgtgaagc 2040
gaagaagaaa atgcggacca ttattgatca gcttcgggtg ttgaaggggc cgaataagga 2100
actcgcgcag ttgggtcgta gtttgtttaa acgacttggt gatgtgttgg cgtatttcga 2160
tgttggtgtc tccaacggtc cggtcgaagc gatcaacgga cggttggagc atttgcgtgg 2220
gattgctcta ggtttccgta atttgaacca ctacattctg cggtgcctta tccattcagg 2280
gcagttggtc cataagatca atgcactcta aaacaggaag agcccgtaaa cctctgacta 2340
gcgtcaccct ctgattaagg cgaccgcgga tttaagagca gaggctgcca cgagcgcatc 2400
ttcacggctg tgtgttgtac taaaagtaca gcgcacagcc gttcgtgctt gatcctcctc 2460
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gcacacaatg ccttggcgtt ccaattccag aagaacagtt tcagatccta tgctgtcgaa 2580
gagaaaagat gcgtgtccat caatgcgcat cctaggatgt ccagtcaggt gtgctcccgg 2640
gatagtgaga acttcctcga tgaattcgcc aagatctgga taggattccg ccctggccaa 2700
ttccaaggca gtggcaaagg cgatagcccc cgcaacgttt tccgtgccac tacgccgccc 2760
tttttcctgg ccgccgccat ggattaccgg ctccagggga agctttgacc ataacactcc 2820
aatcccttta ggcgcaccga atttatgacc cgacaaactt aacgcgtcaa ctcccaagtc 2880
aaaggttaaa tgtgcagctt gcactgcatc ggtgtgaaaa ggcgtactgc ttaccgccgc 2940
caactcagct atcggctgaa tggttcccac ctcattgttg gcataaccaa tgctgatcaa 3000
tgtggtgtcc ggcctgactg ctttgcggag accctccggg gagatcagcc cagtgtgatc 3060
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ggggcgtcct ccgataatgc gggccacccg agttcgagca tcctccagcc ccgcagaggc 3300
gagtcttccc a 3311
<210> 95
<211> 1230
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 95
atgagcaaga cctctctcga caagagcaag atccgcttcc ttctgctgga aggcgtccac 60
cagaccgcac tggatacgct caaggctgcc ggctacacca acatcgagta cctgaccggc 120
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ggcaccatcc gcagccgcgt gctgttctga 1230
PCT/RO/134表
Figure QDA0003318166780000011
Figure QDA0003318166780000021
Figure QDA0003318166780000031
Figure QDA0003318166780000041
Figure QDA0003318166780000051

Claims (15)

1.生产L-氨基酸或其前体的微生物，其中所述微生物被修饰以表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述蛋白质源自棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)。
3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物进一步具有：i)减弱的磷酸丝氨酸磷酸酶活性，ii)增强的3-磷酸丝氨酸氨基转移酶活性，或iii)减弱的磷酸丝氨酸磷酸酶活性和增强的3-磷酸丝氨酸氨基转移酶活性。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物通过增强trp操纵子、灭活色氨酸酶(TnaA)、灭活Mtr膜蛋白(Mtr)或其任何组合而被进一步修饰。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物进一步具有增强的his操纵子。
6.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物通过灭活McbR(转录调节子；mcbR)、增强甲硫氨酸合酶(meth)、增强亚硫酸还原酶[NADPH]血红蛋白β-组分(cysI)或其任何组合而被进一步修饰。
7.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物属于棒状杆菌属(Corynebacterium)或埃希氏菌属(Escherichia)。
8.根据权利要求7所述的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
9.根据权利要求1所述的微生物，其中所述L-氨基酸或其前体选自L-丝氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、O-琥珀酰高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、L-高丝氨酸、乙酰丝氨酸、L-胱硫醚、L-高半胱氨酸、和O-磷酸丝氨酸。
10.生产L-氨基酸或其前体的方法，所述方法包括在培养基中培养根据权利要求1至9中任一项所述的微生物。
11.根据权利要求10所述的方法，进一步包括从培养的所述微生物或所述培养基中回收L-氨基酸或其前体。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述L-氨基酸或其前体选自丝氨酸、色氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、L-半胱氨酸、O-琥珀酰高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、L-高丝氨酸、乙酰丝氨酸、L-胱硫醚、L-高半胱氨酸、和O-磷酸丝氨酸。
13.包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质用于增加L-氨基酸或其前体的生产的用途。
14.用于生产L-氨基酸或其前体的组合物，其中所述组合物包含微生物，所述微生物被修饰以表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质；或所述蛋白质。
15.利用权利要求14所述的组合物生产L-氨基酸或其前体的方法。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102527895B1 (ko) * 2021-01-11 2023-04-28 씨제이제일제당 (주) GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법
KR20240000169A (ko) * 2022-06-23 2024-01-02 씨제이제일제당 (주) L-히스티딘 배출 단백질 및 이를 이용한 l-히스티딘 생산 방법
KR20240000168A (ko) * 2022-06-23 2024-01-02 씨제이제일제당 (주) L-히스티딘 배출 단백질 및 이를 이용한 l-히스티딘 생산 방법

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11253187A (ja) * 1998-01-12 1999-09-21 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−セリンの製造法
JP2004254694A (ja) * 2003-02-26 2004-09-16 Ajinomoto Co Inc グルコースおよびペントースの混合物の発酵によりｌ−アミノ酸を産生する方法
CN101223279A (zh) * 2005-07-18 2008-07-16 巴斯福股份公司 产生甲硫氨酸的重组微生物
CN103710319A (zh) * 2007-04-11 2014-04-09 Cj第一制糖株式会社 组合物及甲硫氨酸的生产方法
US20140134680A1 (en) * 2011-06-29 2014-05-15 Metabolic Explorer Microorganism for methionine production with enhanced glucose import
CN104099267A (zh) * 2014-06-10 2014-10-15 江南大学 一株高产l-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建及应用
CN104561163A (zh) * 2013-10-11 2015-04-29 Cj第一制糖株式会社 生产l-氨基酸的方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA74383A (en) 1901-09-03 1902-01-14 Charles Williamson Milne Pump and valve
JPH07114700B2 (ja) * 1987-08-31 1995-12-13 味の素株式会社 プラスミドを含有する微生物を用いたｌ―セリンの製造方法
JP2967996B2 (ja) * 1989-06-06 1999-10-25 協和醗酵工業株式会社 Ｌ―トリプトファンの製造法
KR0145735B1 (ko) 1990-09-19 1998-08-17 정용문 전화기 받침대
JP3997631B2 (ja) * 1998-01-12 2007-10-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
KR101073370B1 (ko) 2003-07-29 2011-10-17 아지노모토 가부시키가이샤 물질 생산에 영향을 미치는 대사 흐름을 결정하는 방법
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
RU2447146C2 (ru) * 2005-07-18 2012-04-10 Эвоник Дегусса Гмбх Рекомбинантные микроорганизмы, продуцирующие метионин
AU2007295159B2 (en) 2006-09-15 2012-09-13 Cj Cheiljedang Corporation A Corynebacteria having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same
KR100838038B1 (ko) 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR100930203B1 (ko) 2008-01-28 2009-12-07 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
EP2395096B1 (en) * 2009-02-09 2014-04-09 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Process for producing L-amino acids
KR101048593B1 (ko) 2009-02-27 2011-07-12 씨제이제일제당 (주) 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합물을 사용하여 메치오닌 생산능을 증가시키는 방법
KR101381048B1 (ko) * 2010-10-20 2014-04-14 씨제이제일제당 (주) Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법
KR101632642B1 (ko) 2015-01-29 2016-06-22 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 그의 용도
JP6679803B2 (ja) 2016-08-31 2020-04-15 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション 新規プロモーター及びその用途
KR102035844B1 (ko) 2018-02-23 2019-10-23 씨제이제일제당 주식회사 L-트립토판을 생산하는 재조합 코리네형 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11253187A (ja) * 1998-01-12 1999-09-21 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−セリンの製造法
JP2004254694A (ja) * 2003-02-26 2004-09-16 Ajinomoto Co Inc グルコースおよびペントースの混合物の発酵によりｌ−アミノ酸を産生する方法
CN101223279A (zh) * 2005-07-18 2008-07-16 巴斯福股份公司 产生甲硫氨酸的重组微生物
CN103710319A (zh) * 2007-04-11 2014-04-09 Cj第一制糖株式会社 组合物及甲硫氨酸的生产方法
US20140134680A1 (en) * 2011-06-29 2014-05-15 Metabolic Explorer Microorganism for methionine production with enhanced glucose import
CN104561163A (zh) * 2013-10-11 2015-04-29 Cj第一制糖株式会社 生产l-氨基酸的方法
CN104099267A (zh) * 2014-06-10 2014-10-15 江南大学 一株高产l-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
佚名: "登录号：WP_012703298.1" *

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