TWI785327B - 製造ｌ-胺基酸的微生物及使用該微生物製造ｌ-胺基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露係提供製造L-胺基酸或其前體的微生物及使用該微生物製造L-胺基酸或其前體的方法。

Description

製造L-胺基酸的微生物及使用該微生物製造L-胺基酸的方法
本揭露係關於製造L-胺基酸或其前體的微生物及使用該微生物製造L-胺基酸或其前體的方法。
L-胺基酸，蛋白質之基本構造單元，業經用作醫藥、食品添加劑、動物飼料、營養補充劑、殺蟲劑、消毒劑等的主要原材料。業經實施大量研究以研發以高收率製造L-胺基酸及其他有益物質的微生物及醱酵製程。例如，業經主要使用目標特異性途徑，諸如增加編碼牽涉入L-離胺酸生物合成之酶的基因表現的方法以及移除該生物合成之非必需基因的方法(韓國專利第10-0838038號)。
同時，棒狀桿菌(Corynebacterium)屬之菌株尤其是麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)係廣泛用來製造L-胺基酸及其他有益物質的革蘭氏陽性微生物。業經執行深入研究以研發以高收率製造該等胺基酸的微生物及醱酵製程。例如，業經主要使用目標特異性途徑，諸如在幫轉桿菌屬微生物中 增加編碼牽涉入胺基酸生物合成之酶的基因表現的方法以及移除該生物合成之非必需基因的方法(韓國專利第10-0924065號及第10-1208480號)。除了此等方法之外，亦業經使用移除未牽涉入胺基酸製造中之基因的方法以及移除其具體功能未知與胺基酸之製造有關的基因的方法。惟，仍需要探究以高收率有效製造L-胺基酸的方法。
本發明之發明人等業經作出大量嘗試以研發能夠以高收率製造L-胺基酸的微升，並且業經發現，L-胺基酸之製造率可藉由將源自另一微生物之蛋白質引入該微生物中而得以增加，從而完成本揭露。
本揭露之一目的係提供製造L-胺基酸或其前體的微生物，其中該微生物係經修飾以表現包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其功能性片段的蛋白質。
本揭露之另一目的係提供用於製造L-胺基酸或其前體的組成物，其中該組成物係包含經修飾以表現包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其功能性片段的蛋白質的微生物，或者蛋白質。
本揭露之又一目的係提供用於製造L-胺基酸或其前體的方法，該方法係包含：於培養基中培養該微生物；以及，從所培養之微生物或該培養基中回收L-胺基酸。
本揭露之再一目的係提供包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其 功能性片段的蛋白質用於增加L-胺基酸或其前體之製造的用途。
根據本揭露之製造L-胺基酸或其前體的微生物，其中該微生物係經修飾以表現包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其功能性片段的蛋白質，可製造L-絲胺酸、L-色胺酸、L-組胺酸、L-甲硫胺酸、L-半胱胺酸、及/或O-磷絲胺酸。
[最佳模式]
後文中將更詳細揭示本揭露。
同時，本揭露中所揭露之每一說明及具體實施態樣可應用於本文以揭示不同之說明及具體實施態樣。換言之，本揭露中所揭露之各種組分之全部組合係包括於本揭露之範疇內。此外，本揭露之範疇不應由下文提供之具體實施方式限制。
此外，彼等熟識該領域者將能夠使用常規實驗認知或證實本揭露之具體態樣的多種等效物。此類等效物擬包括於本揭露之範疇內。
為了達成上述目的，本揭露之一個態樣係係提供製造L-胺基酸或其前體的微生物，其中該微生物係經修飾以表現包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其功能性片段的蛋白質。
包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其功能性片段的蛋白質可係具有D-3-磷酸甘油酯脫氫酶活性的蛋白質。
於本揭露中，「D-3-磷酸甘油酯脫氫酶」係主要催化下述化學反 應的酶。
3-磷酸-D-甘油酯+NAD+
Figure 109114180-A0202-12-0004-173
3-磷酸氧丙酮酸酯+NADH+H+
2-羥基戊二酸酯+NAD+
Figure 109114180-A0202-12-0004-174
2-側氧基戊二酸酯+NADH+H+
對於本揭露之目標，D-3-磷酸甘油酯脫氫酶可係SerA，並且其序列可自已知之NCBI Genbank資料庫中鑒別。此外，任何具有與之等效之活性並且源自不同於用於製造L-胺基酸或其前體且包括該蛋白質之上揭微生物的微生物的其他蛋白質亦可使用而無限制。具體而言，該蛋白可係包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的蛋白質並且可與下列者互換使用：由SEQ ID NO：1之胺基酸序列構成的蛋白質、由SEQ ID NO：1之胺基酸序列組成的蛋白質、或具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的蛋白質，而不限於此。
該蛋白質可具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列，及/或與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性或同一性。此外，很明顯，任何具有包括一個或幾個胺基酸之刪除、修飾、替換或加入之胺基酸序列的輔助蛋白質係處於本揭露之範疇內，只要該胺基酸序列保留上揭之同源性或同一性以及與該蛋白質等效之效果即可。
此外，亦可使用任何具有D-3-磷酸甘油酯脫氫酶活性並且由在嚴苛條件下與使用已知基因序列構造之探針雜交的多核苷酸編碼的多肽而無限制，其中該基因序列係例如完全或部分地與編碼該多肽之核苷酸序列互補的核苷酸序列。
此外，對於本揭露之目標，該蛋白質可係源自不同於上揭製造L-胺基酸或其前體之微生物並且包括該蛋白質的其他微生物，並且該蛋白質具體可係源自固氮菌(Azotobacter)屬之蛋白質、與源自固氮菌屬者相同之蛋白質、或 任何能夠增加L-胺基酸或其前體製造的蛋白質，但不限於此。更具體地，固氮菌屬之微生物可係敏捷固氮菌(Azotobacter agilis)、亞美尼亞固氮菌(Azotobacter armeniacus)、拜氏固氮菌(Azotobacter beijerinckii)、圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)、固氮菌(Azotobacter sp.)CU26、固氮菌FA8、黑色固氮菌(Azotobacter nigricans)、雀稗固氮菌(Azotobacter paspali)、鹽鹼固氮菌(Azotobacter salinestris)、熱帶固氮菌(Azotobacter tropicalis)、或棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)，並且於本揭露之一個具體實施態樣中，可係源自棕色固氮菌者，但該微生物不限於此。
如本文中所用，術語「功能性片段」係指代胺基酸序列，其係具有等效於該蛋白質之效果，並且很明顯，任何具有包括一個或幾個胺基酸之刪除、修飾、替換或加入之胺基酸序列並且保留等效於該蛋白質之效果的蛋白質係處於本揭露之範疇內，並且就本揭露之目標而言，可視為功能性片段。
如本文中所用，儘管使用了「包含特定SEQ ID NO：之胺基酸序列的蛋白質或多肽」、「由特定SEQ ID NO：之胺基酸序列組成的蛋白質或多肽」或「具有特定SEQ ID NO：之胺基酸序列的蛋白質或多肽」的表達，但很明顯，任何具有包括一個或幾個胺基酸之刪除、修飾、替換、保守性替換或加入之胺基酸序列的蛋白質亦可用於本揭露中，只要該蛋白質係具有與由特定SEQ ID NO：之胺基酸序列組成的多肽相同或等效的活性即可。例如，該蛋白質可具有對於該胺基酸序列之N端及/或C端之序列加入而不造成該蛋白質功能、天然出現之突變、靜默突變、或其保守性替換的改變。
術語「保守性替換」係指代將一個胺基酸替換為另一個具有類似結構及/或活性特性的胺基酸。此類胺基酸替換通常可基於殘基之極性、電荷、 溶解性、疏水性、親水性、及/或兩親特性而出現。例如，荷正電(鹼性)胺基酸係包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；荷負電(酸性)胺基酸係包括麩胺酸及天冬胺酸；芳族胺基酸係包括苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸；以及，疏水性胺基酸係包括丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸。
本揭露之另一態樣係提供編碼包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之蛋白質的多核苷酸。
如本文中所用，術語「多核苷酸」係具有包括DNA分子及RNA分子在內之綜合意義，並且於多核苷酸中係基本結構單元之核苷酸不僅可包括天然核苷酸，而且可包括其中糖或鹼基係經修飾之類似物(《核苷酸類似物》(cheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980))；Uhlman and Peyman,Chemical Reviews,90：543-584(1990))。
編碼包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之蛋白質的多核苷酸可具有任何能夠編碼源自棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)之具有D-3-磷酸甘油酯脫氫酶活性之蛋白質的序列，但不限於此。另選地，該多核苷酸可具有任何編碼具有增加L-胺基酸或其前體製造之活性且包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的蛋白質的序列，但不限於此。
該多核苷酸可係，例如，編碼與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源性或同一性之多肽的多核苷酸。具體而言，例如，編碼包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少70%同源性或同一性之胺基酸序列的蛋白質的多核苷酸可係SEQ ID NO：95之多核苷酸序列或與SEQ ID NO：95之核苷酸序列具有至少70%、75%、 80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同源性或同一性的多核苷酸。
此外，很明顯，該多核苷酸亦可係下述多核苷酸，其可被轉譯為包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與SEQ ID NO：1具有至少70%同一性之胺基酸序列的蛋白質或者藉由密碼子簡併性而與之具有同源性或同一性的蛋白質。另選地，該多核苷酸可具有核苷酸序列，該核苷酸序列可在嚴苛條件下與使用已知基因序列(例如，與該核苷酸序列完全或部分地互補的核苷酸序列)構造的探針雜交以編碼包含與SEQ ID NO：1具有至少70%同一性之胺基酸序列的蛋白質，但不限於此。術語「嚴苛條件」係指代允許多核苷酸之間特異性雜交的條件。此類條件係詳細揭露於已知檔案(例如，冷泉港出版社印行之《分子克隆實驗室手冊(第二版)》(J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989)、約翰威立出版公司印行之《分子生物學現代方法》(F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York))中。例如，嚴苛條件可包括以下條件：於該條件下，具有高同源性或同一性例如至少70%、80%、具體85%、具體90%、更具體95%、更具體97%、或甚至更具體99%同源性或同一性的基因彼此雜交，同時，具有低於上揭彼等之同源性或同一性的基因不彼此雜交；或係以下條件，於該條件下，洗滌係於南方雜交之通常洗滌條件下實施一次，並且具體兩次或三次，鹽濃度及溫度係對應於60℃、1×SSC、0.1% SDS，具體地60℃、0.1×SSC、0.1% SDS，且更具體地68℃、0.1×SSC、0.1% SDS。雜交係具有兩個多核苷酸具有互補序列，但鹼基可由於雜交之嚴苛條件而誤配。術語「互補」係用以揭示能夠彼此雜交之核苷酸鹼基之間的關係。例如，就DNA 而言，腺苷係與胸苷互補，而胞苷係與鳥苷互補。因此，本揭露可不僅包括基本上類似之多核苷酸序列，而且可包括其單離之與完整序列互補的多核苷酸片段。
具體而言，具有同源性或同一性之多核苷酸可使用上揭之包括使用55℃之Tm值之雜交製程的雜交條件偵檢。據此，Tm值可係60℃、63℃或65℃，但不限於此，並且可由本發明所屬領域具有通常知識者根據其目標適宜地調節。
「同源性」及「同一性」係指代兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的相關程度，並且可表現為百分比。
術語同源性及同一性一般可互換使用。
保守多核苷酸或多肽之序列同源性或同一性可藉由標準比對算法測定，並且藉由程式建立之缺省空隙罰分可與之一起使用。實質上同源或同一之序列通常可在整個序列上或整個序列之至少50%、60%、70%、80%或90%上在中度或高度嚴苛條件下彼此雜交。於經雜交之多核苷酸中，亦可慮及包括替代密碼子之簡併密碼子的多核苷酸。
多肽序列之間或多核苷酸序列之間的同源性或同一性可使用該領域中已知之任何算法測定，例如，BLAST(參見：Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873,(1993))或由皮爾森(Pearson)提出之FASTA(參見：Methods Enzymol.,183,63,1990)。基於算法BLAST，業經研發了作為BLASTN或BLASTX而已知的程式(參見：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。此外，胺基酸序列之間或多核苷酸序列之間同源性、相似性或同一性的存在可藉由在界定之嚴苛條件下的南方雜交實驗比對此等序列而證實(界定之嚴苛雜交條件係處於學科技術之範疇內)，並且可藉由具有本發明所屬領域具有通常知識者已知的方法確 定(例如，冷泉港出版社印行之《分子克隆實驗室手冊(第二版)》(J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989)以及約翰威立出版公司印行之《當代分子生物學方法》(F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York))。
如本文中所用，關於蛋白質之術語「待表現/經表現」係意指一狀態，於該狀態中，靶標蛋白質係被引入微生物中，或者在該蛋白質存在於微生物中的情況下，該蛋白質之活性比其內源性活性或其在修飾之前的活性有所增強。
具體而言，術語「蛋白質之引入」係指代提供特定蛋白質之活性至微生物，其中該蛋白質係並非該微生物原始具備者，或者該蛋白質之活性比其內源性活性或修飾前之活性有所增強。例如，蛋白質之引入可指代將編碼特定蛋白質之多核苷酸引入染色體中，或將包括編碼該特定蛋白質之多核苷酸的片段或載體引入微生物中，從而能夠表現該蛋白質之活性。「內源性活性」係指代，當藉由天然或人工因子造成之修飾轉變微生物時，在轉變前之該微生物母株原始具備的蛋白質活性。
如本文中所用，術語「胺基酸或其前體」係指代可使用該蛋白質製造之胺基酸或其前體，且其可包括絲胺酸、色胺酸、組胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、L-胱硫醚、L-類半胱氨酸、O-乙醯基類絲胺酸、O-琥珀醯基類絲胺酸、L-類絲胺酸、及/或O-磷絲胺酸，但不限於此。於本揭露中，該胺基酸可係L-胺基酸，具體而言，L-絲胺酸、L-色胺酸、L-組胺酸、L-甲硫胺酸、或L-半胱胺酸，但可包括由微生物從各種碳源經由代謝製程製造之全部L-胺基酸。該前體可係O-乙醯基類絲胺酸或O-琥珀醯基類絲胺酸，其係由O-乙醯基類絲胺酸硫化氫解 酶轉化為甲硫胺酸之前體(KR10-1048593)；L-類絲胺酸、L-類半胱胺酸、或L-胱硫醚，其係甲硫胺酸前體；以及乙醯基絲胺酸，其係L-半胱胺酸前體；及/或O-磷絲胺酸，其係由O-磷絲胺酸硫化氫解酶轉化為半胱胺酸之前體，但不限於此。更具體而言，該胺基酸或其前體可係L-絲胺酸、L-色胺酸、L-組胺酸、L-甲硫胺酸、O-磷絲胺酸、或L-半胱胺酸，但不限於此。
為了增強L-胺基酸或其前體之生物合成，可使用包含根據本揭露之SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其功能性片段的蛋白質。例如，為了增強L-絲胺酸、L-色胺酸、L-組胺酸、L-甲硫胺酸、L-半胱胺酸、L-類半胱胺酸、L-胱硫醚、乙醯基絲胺酸、O-乙醯基類絲胺酸、O-琥珀醯基類絲胺酸、L-類絲胺酸、及/或O-磷絲胺酸之生物合成，微生物可經修飾以表現包含根據本揭露之SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其功能性片段的蛋白質。作為具體實例，可引入包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的蛋白質或可增強該蛋白質之活性。此外，製造L-胺基酸或其前體之能力可藉由額外地引入或增強特定蛋白質之活性或將特定蛋白質之活性滅活而進一步增強。
具體而言，該微生物可藉由進一步包括下列者而製造L-胺基酸或其前體：i)具有經弱化之活性的磷絲胺酸磷酸酶，ii)具有經增強之活性的3-磷絲胺酸胺基轉移酶，或iii)具有經弱化之活性的磷絲胺酸磷酸酶及具有經增強之活性的3-磷絲胺酸胺基轉移酶兩者，但不限於此。
該微生物可藉由色胺酸操縱子之增強、色胺酸酶(TnaA)之滅活、Mtr膜蛋白(Mtr)之滅活、或其任何組合予以進一步修飾，但不限於此。
具體而言，該微生物可藉由下列者予以進一步修飾：將TrpR滅活來增強色胺酸操縱子，其中TrpR係抑制與牽涉入L-色胺酸製造中的L-色胺酸 之生物合成相關之基因(trpEDCBA)表現；將色胺酸酶(TnaA)滅活，其中色胺酸酶係於將細胞外L-色胺酸引入細胞中發揮作用；以及Mtr膜蛋白之滅活，其中該膜蛋白係於將細胞內L-色胺酸及水分子分解為吲哚、戊二酸酯、及氨(NH3)中發揮作用；但不限於此。
此外，對於本揭露之目標，該微生物可藉由增強其操縱子予以進一步修飾，但不限於此。
具體而言，可將裂分為總計4個操縱子之生物合成基因以簇形式引入該微生物中，其中啟動子係經取代，以增強L-組胺酸生物合成途徑，並且L-組胺酸生物合成簇係裂分為總計4個操縱子(hisE-hisG、hisA-impA-hisF-hisI、hisD-hisC-hisB、及cg0911-hisN)。組胺酸操縱子可藉由使用載體增強，其中該載體可同步地將生物合成基因引入該微生物中，但不限於此。
此外，對於本揭露之目標，該微生物可藉由轉錄調節子(McbR)之滅活、甲硫胺酸合成酶(meth)之增強、亞硫酸還原酶[NADPH]血紅素蛋白β-成分(cysI)之增強、或其任何組合予以進一步修飾，但不限於此。
具體而言，該微生物可藉由滅活McbR(其係甲硫胺酸/半胱氨酸轉錄調節子)、增強甲硫胺酸合成酶(Meth)、增強亞硫酸還原酶[NADPH]血紅素蛋白β-成分、或其任何組合予以進一步修飾，但不限於此。
特定蛋白質之活性的引入、增強及滅活可使用該領域中任何適宜的已知方法實施。
本文中所用，蛋白質活性之「增強」係意指，當與其內源性活性相比時，蛋白質之活性被引入或增加。活性之「引入」係意指微生物擷取該微生物尚未天然地或人工地具備之特定多肽的活性。
如本文中所用，術語蛋白質活性相對於其內源性活性之「增加」係包括於該微生物中之蛋白質的活性較之於該蛋白質之內源性活性或修飾前之活性有所增強。術語「內源性活性」係指代，當藉由天然或人工因子造成之修飾轉變微生物時，在轉變前之該微生物母株或未修飾之微生物原始具備的蛋白質活性。內源性活性亦可與修飾前之活性互換使用。活性之增加可包括外來蛋白質之引入以及該蛋白質之內源性活性的增強。蛋白質活性之增加/增強可藉由基因表現之增加/增強達成。
具體而言，根據本揭露之蛋白質活性增加可藉由而不限於下列方法之一者達成：
(1)增加編碼該蛋白質的多核苷酸之拷貝數的方法，
(2)修飾表現控制序列以增加該多核苷酸之表達的方法，
(3)修飾染色體上之多核苷酸序列以增強該蛋白質活性的方法，
(4)引入具有該蛋白質活性之外來多核苷酸或具有該蛋白質活性之密碼子優化修飾多核苷酸的方法，或
(5)藉由其任何組合增強活性的方法。
上文(1)中揭示的增加多核苷酸拷貝數之方法並無特定限制，但可以可操作地鏈結至載體之形式或整合入宿主細胞染色體之形式予以實施。具體而言，本方法可藉由下述者實施：將載體引入宿主細胞內，該載體係不受宿主影響而複製並發揮功能，並且係可操作地鏈結至編碼本揭露之蛋白質的多核苷酸；或將載體引入宿主細胞內，該載體係將該多核苷酸插入宿主細胞之染色體內並且係可操作地鏈結至該多核苷酸，從而增加宿主細胞染色體中該多核苷酸的拷貝數。
之後，上文(2)中揭示的修飾表現控制序列以增加該多核苷酸之表現的方法係藉由下述者實施：藉由刪除、插入、非保守替換、保守替換、或其任何組合將修飾引入該核苷酸序列中以進一步增強該表現控制序列之活性，或將該核苷酸序列替換為具有更強活性之核苷酸序列，但不限於此。表現控制序列可包括啟動子、操縱子序列、核糖體結合位點編碼序列、以及用於調節轉錄及轉譯終止之序列，但不限於此。
替代固有啟動子之強效異源性啟動子可鏈結多核苷酸表現單元之上游，該強效啟動子之實例可包括CJ1至CJ7啟動子(韓國專利第0620092號及國際公開第WO2006/065095號)、lysCP1啟動子(國際公開第WO2009/096689號)、EF-Tu啟動子、groEL啟動子、aceA啟動子、aceB啟動子、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、蘭達噬菌體(lambda phage)PR啟動子、PL啟動子、tet啟動子、gapA啟動子、SPL1、SPL7或SPL13啟動子(韓國專利第10-1783170號)、或O2啟動子(韓國專利第10-1632642號)，但不限於此。此外，上文(3)中揭示的修飾染色體上多核苷酸序列的方法係藉由下述者實施：藉由刪除、插入、非保守替換、保守替換、或其任何組合將變異引入表現控制序列中以進一步增強該多核苷酸序列之活性，或該核苷酸序列係經修飾以具有更強活性之核苷酸序列，但不限於此。
此外，上文(4)中揭示之引入外來多核苷酸序列的方法可藉由下述者實施：將編碼具有與該蛋白質相同/類似活性之蛋白質的外來多核苷酸或者其密碼子優化變種多核苷酸引入宿主細胞內。外來多核苷酸可係任何具有與該蛋白質相同/類似活性之多核苷酸，但不限於此。此外，可將其經優化之密碼子引入宿主細胞內以實施在宿主細胞中對所引入之外來多核苷酸的經優化之轉錄及 轉譯。該引入可藉由具有本發明所屬領域具有通常知識者適當選擇的任何已知轉形方法予以實施。當所引入之多核苷酸被表現於宿主細胞中時，係製造該蛋白質且其活性可得以增加。
最後，上文(5)中所揭示之藉由方法(1)至(4)之任何組合增強活性的方法可藉由將下述至少一種方法組合而實施：增加編碼該蛋白質之多核苷酸拷貝數、修飾表現控制序列以增加其表現、修飾染色體上之該多核苷酸、引入具有該蛋白質活性之外來多核苷酸或其密碼子經優化之變異多核苷酸。
如本文中所用，術語蛋白質活性之「弱化」係包括活性較之於內源性活性減低及消除兩者的概念。
蛋白質活性之弱化可藉由該領域中習知之多種方法達成。該方法之實例係包括：刪除染色體上編碼該蛋白質之基因的一部分或全部的方法，包括當該活性被消除的情況；將染色體上編碼該蛋白質之基因替換為突變基因以減低該蛋白質活性的方法；將突變引入染色體上編碼該蛋白質之基因的表現控制序列中的方法；將編碼該蛋白質之基因的表現控制序列替換為具有較弱活性或無活性的序列(例如，將該基因的內源性啟動子替換為較弱之啟動子)；刪除染色體上編碼該蛋白質之基因的一部分或全部的方法；引入與染色體上該基因之轉錄本互補結合之反義寡核苷酸(例如，反義RNA)以抑制mRNA轉譯為該蛋白質的方法；人工地將與SD序列互補之序列加入編碼該蛋白質之基因之SD序列的上游以形成二級結構，從而抑制其與核糖體結合的方法；以及將啟動子併入開讀框(ORF)之3’端以誘導逆轉錄的方法(逆轉錄工程(RTE))；或它們的任何組合，但不限於此。
具體而言，刪除編碼該蛋白質之基因的一部分或全部的方法可藉 由下述者實施：適用於染色體插入微生物內之載體將染色體內編碼內源性靶點蛋白質之多核苷酸替換為在核酸序列中具有部分刪除的多核苷酸或標記物基因。例如，可使用藉由內源性重組刪除該基因之一部分或全部的方法，但不限於此。此外，術語“部分”儘管可根據多核苷酸之類型而變並且可由具有本發明所屬領域具有通常知識者適宜地測定，但係指代1個核苷酸至300個核苷酸，具體而言，1個核苷酸至100個核苷酸，且更具體而言，1個核苷酸至50個核苷酸，但不限於此。
此外，修飾表現控制序列之方法可藉由下述者實施：經由刪除、插入、保守性替換、非保守性替換、或其任何組合而將修飾引入該表現控制序列中，以進一步弱化該表現控制序列之活性；或者將該表現控制序列替換為具有更弱活性之核酸序列。表現控制序列可包括啟動子、操縱子序列、編碼核糖體結合位點之序列、以及用於調節轉錄及轉譯終止之序列，但不限於此。
此外，修飾染色體上該基因序列之方法可藉由下述者實施：誘導經由刪除、插入、保守性替換、非保守性替換、或其組合的修飾以進一步弱化該序列中該蛋白質之活性，或者將該基因序列替換為經修飾以均有更弱活性或無活性的基因，但不限於此。
如本文中所用，表現「製造L-胺基酸之微生物或其前體」係指代能比野生型或未修飾之微生物更大量地從培養基中含有之碳源製造L-胺基酸或其前體的微生物。此外，該微生物可指代天然地具有製造L-胺基酸或其前體之能力的微生物，或藉由向不能製造L-胺基酸或其前體的微生物母株提供製造L-胺基酸或其前體之能力而製備的微生物。具體而言，該微生物可係下述微生物，其係經修飾以表現包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的蛋白質或其功能那些片段 以用於製造L-胺基酸或其前體，但不限於此。
此外，「製造L-胺基酸或其前體之微生物」係包括野生型微生物以及業經發生天然或人工基因修飾的微生物兩者，例如其中特定機制經由引入外源性基因、內源性基因之增強或滅活等而被弱化或增強的微生物，以及其中業經發生基因修飾或該活性業經增強以製造目標L-胺基酸或其前體。具體而言，該微生物之類型並無特定限制，只要該微生物能製造L-胺基酸或其前體即可，但該微生物可屬於腸桿菌屬(Enterobacter)、大腸桿菌屬(Escherichia)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、鋸桿菌屬(Serratia)、普羅維登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)。更具體而言，該微生物可係屬於棒狀桿菌屬或大腸桿菌屬之任何微生物。棒狀桿菌屬之微生物可係麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳糖醱酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、熱產氨棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒狀桿菌(Corynebacterium efficiens)、駐地棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)等，但不限於此。更具體而言，大腸桿菌屬之微生物可係大腸桿菌(Escherichia coli)，而棒狀桿菌屬之微生物可係麩胺酸棒狀桿菌，但不限於此。
對於本揭露之目標，該微生物可係包括該蛋白質並因此能夠製造L-胺基酸及其前體的任何微生物。
如本文中所用，「能夠製造L-胺基酸或其前體的微生物」之表述可與「製造L-胺基酸或其前體的微生物」及「具有製造L-胺基酸或其前體之能力的微生物」之表述互換地使用。
本揭露之另一態樣係提供用於製造L-胺基酸或其前體的組成物， 其中該組成物係包含經修飾以表現包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其功能性片段的蛋白質的微生物，或者蛋白質。
用於製造L-胺基酸或其前體之組成物係指代一種能夠藉由根據本揭露之蛋白質製造L-胺基酸或其前體的組成物。該組成物可包括該蛋白質、其功能性片段、或用來操作該蛋白質之任何組分，但不限於此。
本揭露之另一態樣係提供製造L-胺基酸或其前體之方法，其中該方法係包括於培養基中培養該微生物。
該方法可進一步包含從所培養之介質或該培養基中回收L-胺基酸或其前體。
於上述方法中，該微生物之培養可藉由但不限於批式培養、連續培養、饋料批式培養等該技術中已知者。就此而言，培養條件係無特別限制，但可藉由使用鹼性化合物(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)維持最優pH(例如，pH 5至9，具體pH 6至8，且最具體pH 6.8)。此外，可藉由加入氧氣或含氧氣體混合物至培養基中而維持好氧條件。培養溫度可維持於20℃至45℃，具體25℃至40℃，並且培養可實施約10小時至約160小時，但不限於此。於該培養過程中製造之胺基酸可被釋放如培養基中或保留在細胞內。
該培養基中待包含之碳源的實例可包括醣類及碳水化合物類(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露糖、糖蜜、澱粉及纖維素)、油類及脂肪類(例如，大豆油、葵花籽油、花生油、及椰子油)、脂肪酸類(例如，棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸)、醇類(例如，甘油及乙醇)、以及有機酸類(乙酸)，其可單獨使用或組合使用，等等，但不限於此。該培養基中待包含之氮源的實例可係含氮有 機化合物(例如，蛋白腖、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米浸液、大豆粉及尿素)、無機化合物(例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨)，其可單獨使用或組合使用，等等，但不限於此。作為磷源，可單獨使用或組合使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、及相對應之含鈉鹽類，但不限於此。此外，該培養基可包括必要之促生長材料諸如金屬鹽(例如，硫酸鎂或硫酸鐵)、胺基酸類、維生素類，但不限於此。
於本揭露之上揭培養步驟中製造的胺基酸可藉由使用根據該培養方法選擇之任何已知方法從培養溶液中收集目標胺基酸而回收。例如，可使用離心、過濾、離子交換層析、結晶及高效液相層析(HPLC)，並且可使用該領域中任何適宜方法從培養基或微生物回收目標胺基酸，但不限於此。
此外，該回收步驟可包括純化製程，該純化製程可使用該領域中習知之適宜方法實施。因此，所回收之胺基酸可係純化之胺基酸或包括胺基酸之微生物醱酵液(《生物技術與基因工程概論》(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering,A.J.Nair.,2008))。
此外，對於本揭露之目標，在微生物係經修飾以表現源自固氮菌之D-3-磷酸甘油酸脫氫酶的情況下，包括絲胺酸、色胺酸、組胺酸、甲硫胺酸及O-磷絲胺酸在內之L-胺基酸及其前體的產率增加。重要的是，經修飾之微生物係增加L-胺基酸及其前體之產率，而固氮菌屬之野生型菌株不能夠以非常小的量製造L-胺基酸或其前體。
本揭露之又一態樣係提供使用該組成物製造L-胺基酸或其前體的方法，該組成物係包含經修飾以表現包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其功能性片段的蛋白質的微生物，或者蛋白質。
經修飾以表現包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其功能性片段之蛋白質的微生物或包括該蛋白質的微生物係如上文揭示者。
本揭露之再一態樣係提供包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其功能性片段的蛋白質用於增加L-胺基酸或其前體之製造的用途。
SEQ ID NO：1或其功能性片段、L-胺基酸、及其前體係如上文揭示者。
[實施例]
[揭露之模式]
後文中將參考下述實施例更詳細揭示本揭露。惟，此等實施例係僅用於例示性說明之目標，而非試圖限制本揭露之範疇。同時，本申請之技術領域或類似技術領域的熟練人士可充分理解並容易地實施本說明書未揭示之技術主題。
實施例1：製備過表現源自固氮菌之D-3-磷酸甘油酯脫氫酶(serA(Avn))的載體
為了鑒別製造絲胺酸及OPS之能力是否藉由增強源自棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)之D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(後文中係指代為“SerA(Avn)”)而得以改善，係製備表現載體。
pCL1920載體(GenBank第AB236930號)係用來表現編碼SerA(Avn)之serA(Avn)基因(SEQ ID NO：1)，並且trc啟動子(Ptrc)係用作表現啟動子，從而構建pCL-Ptrc-serA(Avn)形式之載體。
作為對照，係製備包括源自大腸桿菌(E.coli)之D-3-磷酸甘油酸脫氫酶的載體並命名為pCL-Ptrc-serA*(G336V)，於該載體中，對絲胺酸之反饋抑 制係經釋放。用來製備該等載體之引子序列係顯示於下表1中。
表1
Figure 109114180-A0202-12-0020-1
於兩種載體之製備中使用的用於Ptrc之PCR，係使用SEQ ID NOS：2及SEQ ID NOS：3之引子實施。具體而言，用於外來serA(Avn)之PCR係使用SEQ ID NOS：4及SEQ ID NOS：5之引子實施，而用於serA*(G336V)之PCR係使用SEQ ID NOS：6及SEQ ID NOS：7之引子實施。經擴增的Ptrc與相對應基因之serA(Avn)及serA*(G336V)片段係藉由Gibson組裝分別克隆入以限制性核酸內切酶Smal處理之pCL1920載體內，從而構建pCL-Ptrc-serA(Avn)及pCL-Ptrc-serA*(G336V)。
實施例2：藉由將源自固氮菌之serA(Avn)引入野生型大腸桿菌中而製備菌株，並評估其絲胺酸製造能力
藉由使用野生型大腸桿菌株W3110作為平台菌株，藉由將實施例1中製備之兩種質體的每一者引入該W3110菌株中而製備菌株，並隨後評估此等菌株之絲胺酸製造能力。
該等菌株之每一者係種植於LB固體培養基中並於33℃溫育箱中越夜培養。於該LB固體培養基中越夜培養之菌株係接種至25-mL之表2中所示效價培養基中，並於34.5℃溫育箱中以200rpm培養40小時。結果係顯示於下表3中。
表2
Figure 109114180-A0202-12-0021-3
表3
Figure 109114180-A0202-12-0022-4
如表3中所示，與野生型菌株相比，其中對絲胺酸之反饋抑制得以釋放且serA活性得以增強之W3110/pCL-Ptrc-serA*(G336V)菌株係顯示絲胺酸製造增加60%。相比之下，證實包括源自固氮菌之serA(Avn)的W3110/pCL-Ptrc-serA(Avn)菌株係顯示絲胺酸製造比野生型菌株W3110增加160%，亦顯示比菌株W3110/pCL-Ptrc-serA*(G336V)增加62.5%。
實施例3：製備其中serB活性經弱化並引入源自固氮菌之外來serA(Avn)的菌株，並且評估該菌株之OPS製造能力
藉由弱化野生型大腸桿菌株W3110中之內源性磷絲胺酸磷酸酶(SerB)，製備製造O-磷絲胺酸(OPS)之微生物(亦命名為「CA07-0012」，登錄號KCCM11212P，揭露於韓國專利第10-1381048號及美國專利申請公開案第2012-0190081號中)。
將實施例1中製備之兩種類型的質體引入CA07-0012中，並且評估所製備之菌株的OPS製造能力。
該等菌株之每一者係種植於LB固體培養基中並於33℃溫育箱中越夜培養。於該LB固體培養基中越夜培養之菌株係接種至25-mL之表4中所示效價培養基中，並於34.5℃溫育箱中以200rpm培養40小時。結果係顯示於下表5中。
表4
Figure 109114180-A0202-12-0023-5
表5
Figure 109114180-A0202-12-0023-6
如上表5中所示，與野生型菌株相比，其中對絲胺酸之反饋抑制得以釋放且serA活性得以增強之CA07-0012/pCL-Ptrc-serA*(G336V)菌株係顯示OPS製造增加57%。證實包括源自固氮菌之serA(Avn)的CA07-0012/pCL-Ptrc-serA(Avn)菌株係顯示OPS製造比野生型菌株增加107%，亦顯示比CA07- 0012/pCL-Ptrc-serA*(G336V)菌株增加32%。
實施例4：製備用於共同過表現源自固氮菌之serA(Avn)及源自大腸桿菌之serC的載體
為了鑒別製造絲胺酸及OPS的能力是否藉由將serA(Avn)引入其中源自大腸桿菌之3-磷絲胺酸胺基轉移酶(serC)被過表現的菌株中而得以進一步改善，係製備用於表現serA(Avn)及serC之pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC形式的載體。
作為其陽性對照，係構建pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC載體以製備共表現serA*(G336V)及源自大腸桿菌之serC的微生物。用來製備該等載體之引子序列係顯示於下表6中。
表6
Figure 109114180-A0202-12-0024-7
使用實施例1中製備之pCL-Ptrc-serA(Avn)作為模板以及SEQ ID NOS：2及SEQ ID NOS：8之引子，實施用於Ptrc_serA(Avn)之PCR；以及，使用pCL-Ptrc-serA*(G336V)作為模板以及SEQ ID NOS：2及SEQ ID NOS：11之引子，實施用於Ptrc_serA*(G336V)之PCR。於兩種載體中使用之源自大腸桿菌的(RBS)serC，係經由使用w3110之基因組DNA作為模板以及SEQ ID NOS：9及SEQ ID NOS：10之引子實施的PCR獲得。
經擴增之Ptrc_serA(Avn)及(RBS)serC片段以及Ptrc_serA*(G336V)及(RBS)serC片段係分別藉由Gibson組裝使用經SmaI限制性核酸內切酶處理之pCL1920克隆(DG Gibson et al.,NATURE METHODS,VOL.6,NO.5,MAY 2009，NEBuilder HiFi DNA組裝預混液)，從而構建pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC及pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC。
實施例5：製備其中serC活性經增強並引入源自固氮菌之serA(Avn)的菌株，並且評估該菌株之絲胺酸製造能力
為了評估當將源自固氮菌之serA(Avn)引入其中serC被過表現之菌株內時的絲胺酸製造能力，係分別將實施例4中製備之兩種類型的質體引入W3110中。
該等菌株之每一者係種植於LB固體培養基中並於33℃溫育箱中越夜培養。於該LB固體培養基中越夜培養之菌株係接種至25-mL之表7中所示效價培養基中，並於34.5℃溫育箱中以200rpm培養40小時。結果係顯示於下表8中。
表7
Figure 109114180-A0202-12-0026-8
表8
Figure 109114180-A0202-12-0026-9
如上表8中所示，證實包括源自固氮菌之serA(Avn)的w3110/pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC菌株係顯示L-絲胺酸製造比包括serA*(G336V)之w3110/pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC菌株增加。換言之，係證實，L-絲胺酸製造能力係藉由將源自固氮菌之serA(Avn)包括在其中L-絲胺酸製造能力增加 之菌株中而得以進一步增加。
w3110/pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC菌株係名為CA07-4383，係根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)放置於韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM))，並且於2018年11月9日指定登錄號為KCCM12381P。
實施例6：製備其中serB活性經弱化、SerC活性經提升並引入源自固氮菌之serA(Avn)的菌株，並且評估該菌株之OPS製造能力
為了評估當將源自固氮菌之serA(Avn)引入其中serB活性被弱化且serC被過表現之菌株中時的絲胺酸製造能力，係將實施例4中製備之兩種類型的質體分別引入CA07-0012中，並且評估此等菌株之OPS製造能力。
該等菌株之每一者係種植於LB固體培養基中並於33℃溫育箱中越夜培養。於該LB固體培養基中越夜培養之菌株係接種至25-mL之表9中所示效價培養基中，並於34.5℃溫育箱中以200rpm培養40小時。結果係顯示於下表10中。
表9
Figure 109114180-A0202-12-0028-13
表10
Figure 109114180-A0202-12-0028-15
如上表10中所示，證實包括源自固氮菌之serA(Avn)的CA07-0012/pCL-Ptrc-serA(Avn)-(RBS)serC菌株係具有比包括serA*(G336V)之CA07-0012/pCL-Ptrc-serA*(G336V)-(RBS)serC菌株更高的OPS製造。換言之，係證實， OPS製造能力係藉由將源自固氮菌之serA(Avn)包括在其中OPS製造能力增加之菌株中而得以進一步增加。
實施例7：製備其中引入源自固氮菌之serA(Avn)的大腸桿菌屬菌株，並且評估該菌株之色胺酸製造能力
實施例7-1：製備製造L-色胺酸之大腸桿菌屬微生物
製備L-色胺酸之大腸桿菌屬菌株係從野生型大腸桿菌W3110發展而來。為了鑒別L-色胺酸製造是否藉由修飾以表現具有產生L-色胺酸之活性的蛋白質而得以顯著增加，係使用製備為製造L-色胺酸之菌株作為母株。具體而言，牽涉入從分支酸鹽製造L-色胺酸之L色胺酸生物合成基因(trpEDCBA)的表現係被TrpR抑制。因此，係移除編碼TrpR之trpR基因。此外，為了根據L-色胺酸製造之增加而釋放對TrpE多肽的反饋抑制，係將脯胺酸，亦即，TrpE之N端第21個胺基酸，替換為絲胺酸(J.Biochem.Mol.Biol.32,20-24(1999))。
Mtr膜蛋白係於轉運細胞外L-色胺酸至細胞內中扮演角色，並且TnaA蛋白係於將細胞內L-色胺酸及水分子降解為吲哚、戊二酸鹽及氨(NH3)中扮演角色。因此，係移除抑制L-色胺酸製造及降解L-色胺酸之mtr基因及tnaA基因。
對於此等基因之移除，係使用λ-Red重組方法(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products,Datsenko KA,Wanner BL.,Proc Natl Acad Sci USA.2000 Jun 6；97(12)：6640-5)。為了移除mtr基因，係使用pKD4載體作為模板以及SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13之引子實施PCR以製備基因片段(1,580bp)，於該基因片段中，係結合有FRT-康黴素-FRT匣及位於該mtr基因側翼之50bp同源鹼基對，介於兩者間之處係 發生染色體同源重組。pKD4載體之康黴素抗生素標記物係用於證實靶點基因之乙醇以及抗生素基因之插入，以及，該FRT區係於在移除該靶點基因後移除該抗生素標記物中扮演角色。SolgTMTM Pfu-X DNA聚合酶係用作聚合酶，並且PCR係於下述擴增條件下所述：於95℃變性2分鐘；於95℃變性20秒，於62℃退火40秒，並於72℃聚合1分鐘，循環27次；以及於72℃聚合5分鐘。
表11
Figure 109114180-A0202-12-0030-16
用表現λ-Red重組酶(gam、bet及exo)之pKD46載體藉由電穿孔轉形大腸桿菌株W3110，並將其種植在含有50mg/L康黴素之LB固體培養基上。於業經證實使用pKD46載體轉形之大腸桿菌株W3110中，重組酶之表現係藉由在當OD600達到約0.1時於30℃將10mM L-阿拉伯糖加至其中而誘發。當OD600達到約0.6時，該菌株係製備為完全細胞並藉由電穿孔使用上述製程中獲得之線性基因轉形，FRT-康黴素-FRT匣及位於mtr基因側翼之50bp同源鹼基對係經結合於其中。對於在含有25mg/L康黴素之LB固體培養基上生長之菌落，係使用SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之引子以及在選擇所製備之782-bp 基因片段之處的菌落實施菌落PCR。
表12
Figure 109114180-A0202-12-0031-17
藉由同源重組而將該mtr基因自其移除之菌株係製備為完全細胞以移除康黴素抗生素標記物，並隨後藉由電穿孔使用pCP20載體轉形。藉由表現該FLP蛋白，pCP20載體係識別位於康黴素抗生素側翼之FRT位點並於該位點處結合在染色體上，從而移除介於FRT位點之間的抗生素標記物。於30℃，將使用pCP20載體轉形並於含有100mg/L胺苄青黴素及25mg/L氯黴素(chloroamphenicol)之LB固體培養基上生長的菌株在LB液體培養基中培養1小時，進一步於42℃培養15小時，並種植於LB固體培養基上。所生長之菌落係於含有100mg/L胺苄青黴素及25mg/L氯黴素之LB固體培養基、含有12.5mg/L康黴素之LB固體培養基、以及不含抗生素之LB固體培養基中培養。僅選擇於不含抗生素之LB固體培養基中培養的菌落。mtr基因之移除係藉由基因測序得以最終證實，並且該菌株係命名為CA04-9300。
藉由上揭之方法所述基因操縱以移除tnaA基因。使用pKD4載體作為模板以及SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17之引子實施PCR以製備基因片段(1,580bp)，於該基因片段中，係結合有FRT-康黴素-FRT匣及位於該mtr基因側翼之50bp同源鹼基對，染色體同源重組係發生於結合之處。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶係用作聚合酶，並且PCR係於下述擴增條件下所述：於95℃變性2分鐘； 於95℃變性20秒，於62℃退火40秒，並於72℃聚合1分鐘，循環27次；以及於72℃聚合5分鐘。
表13
Figure 109114180-A0202-12-0032-19
使用pKD46載體之轉形係經證實，以及，重組酶藉由加入10mM L-阿拉伯糖而表現於其中之CA04-9300菌株係藉由電穿孔使用線性基因片段轉形，於該基因片段中，係結合FRT-康黴素-FRT匣及位於tnaA基因側翼之50bp同源鹼基對。對於在含有25mg/L康黴素之LB固體培養基上生長之菌落，係使用SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：18之引子以及在選擇所製備之787-bp基因片段之處的菌落實施菌落PCR。
將藉由同源重組而自其移除tnaA基因的菌株製備為完全細胞，並使用pCP20載體轉形以移除康黴素抗生素標記物，並且藉由FLP蛋白質之表現製備康黴素抗生素標記物自其移除之菌株。tnaA基因之移除係藉由基因測序得以最終證實，並且該菌株係命名為CA04-9301。
為了移除trpR基因，係使用pKD4載體作為模板以及SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20之引子實施PCR以製備基因片段(1,580bp)，於該基因片段中，係結合有FRT-康黴素-FRT匣及位於該trpR基因側翼之50bp同源鹼基對，染色體同源重組係發生於結合之處。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶係用作聚合酶，並且PCR係於下述擴增條件下所述：於95℃變性2分鐘；於95℃變性20秒，於62℃退火40秒，並於72℃聚合1分鐘，循環27次；以及於72℃聚合5分鐘。
表14
Figure 109114180-A0202-12-0033-20
使用pKD46載體之轉形係經證實，以及，重組酶藉由加入10mM L-阿拉伯糖而表現於其中之CA04-9301菌株係藉由電穿孔使用線性基因片段轉形，於上揭之製程中獲得，於該基因片段中，係結合FRT-康黴素-FRT匣及位於tnaA基因側翼之50bp同源鹼基對。對於在含有25mg/L康黴素之LB固體培養基上生長之菌落，係使用SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：21之引子以及在選擇所 製備之838-bp基因片段之處的菌落實施菌落PCR。
將藉由同源重組而自其移除trpR基因的菌株製備為完全細胞，隨後使用pCP20載體轉形以移除康黴素抗生素標記物，並且藉由FLP蛋白質之表現製備康黴素抗生素標記物自其移除之菌株。trpR基因之移除係藉由基因測序得以最終證實，並且該菌株係命名為CA04-9307。
為了提供具有反饋對抗trpE特性之菌株CA04-9307，係使用大腸桿菌W3110之gDNA作為模板以及含有EcoRI限制型核酸內切酶位點的SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23之引子，實施PCR，從而獲得含有EcoRI序列之trpE基因片段(1,575bp)。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶係用作聚合酶，並且PCR係於下述擴增條件下所述：於95℃變性2分鐘；於95℃變性20秒，於62℃退火1分鐘，並於72℃聚合1分鐘，循環27次；以及於72℃聚合5分鐘。
表15
Figure 109114180-A0202-12-0034-22
藉由上揭方法獲得之trpE基因以及pSG76-C質體(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997,p.4426-4428)係使用EcoRI限制性核酸內切酶處理並克隆。大腸桿菌DH5α係藉由電穿孔使用經克隆之質體轉形，並且從含有25μg/mL氯黴素(chlororamphenocol)之LB板選擇大腸桿菌DH5α以獲得pSG76-C-trpE質體。
使用所獲得之pSG76-C-trpE質體以及SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25之引子實施定點突變(Stratagene,USA)以製備pSG76-C-trpE(P21S)。
表16
Figure 109114180-A0202-12-0035-23
菌株CA04-9307係使用pSG76-C-trpE(P21S)質體轉形，並且於LB-Cm培養基(10g/L酵母提取物、5g/L NaCl、10g/L胰腖及25μg/L氯黴素)中培養，並且選擇耐氯黴素之菌落。所選擇之轉形體係其中pSG76-C-trpE(P21S)質體藉由第一次插入被併入基因組之trpE區內的菌株。所得trpE(P21S)基因被插入其中的菌株係使用pAScep質體轉形(Journal of Bacteriology,July 1997,p.4426 to 4428)，該質體係表現裂解pSG76-C質體中存在之I-SceI區的限制性核酸內切酶I-SceI，以及，選擇在LB-Ap培養基(10g/L酵母提取物、5g/L NaCl、10g/L胰腖及100μg/L胺苄青黴素)中生長之菌株。使用SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23之引子於所選擇之菌株中擴增trpE基因，並藉由測序證實trpE(P21S)基因之替換。所製備之菌株係命名為CA04-4303。
實施例7-2：製備其中引入源自固氮菌之serA(Avn)的大腸桿菌屬菌株，並且評估該微生物之色胺酸製造能力
將實施例1中製備之pCL-Ptrc-serA(Avn)載體以及作為對照之pCL1920載體分別引入實施例1中製備之CA04-4303中，以製備CA04- 4303/pCL1920及CA04-4303/pCL-Ptrc-serA(Avn)菌株。為了檢查CA04-4303/pCL1920及CA04-4303/pCL-Ptrc-serA(Avn)菌株之L-色胺酸製造能力，兩種菌株係於含有50mg/L奇黴素之LB液體培養基中培養12小時。之後，每種菌株係於250ml轉角型三角振蕩培養瓶中溫育，該培養瓶中係含有25ml之製造培養基，使得最初之OD600值達到0.01，以及於37℃以200rpm振蕩培養48小時。當培養完成時，係藉由HPLC量測L-色胺酸之製造量
CA04-4303/pCL1920及CA04-4303/pCL-Ptrc-serA(Avn)菌株於該培養基中之L-色胺酸製造結果係顯示於下表17中。CA04-4303/pCL1920菌株係顯示1.2g/L之色胺酸製造，以及37mg/L的中間產物吲哚之蓄積量。惟，引入serA(Avn)之菌株係顯示1.7g/L之色胺酸製造而無吲哚之蓄積。
<製造培養基(pH 7.0)>
70g之葡萄糖、20g之(NH4)2SO4、1g之MgSO4‧7H2O、2g之KH2PO4、2.5g之酵母提取物、5g之檸檬酸鈉、1g之NaCl、以及40g之CaCO3(基於1L之蒸餾水)。
表17
含有serA(Avn)之L-色胺酸製造的證實
Figure 109114180-A0202-12-0036-24
如自上述結果可見者，估計藉由引入serA(Avn)而供應L-絲胺酸係充分，並且證實，於L-色胺酸之生物合成的最終步驟中，L-色胺酸之產率增 加且無中間產物吲哚之蓄積。
實施例7-3：製備將源自固氮菌之外來serA(Avn)引入其中的製造色胺酸之麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium Glutamicum)株
為了證實源自固氮菌之serA(Avn)基因對於製造色胺酸之棒狀桿菌屬菌株的效果，KCCM12218P(韓國專利申請公開第2018-0089329號)係用作製造L-色胺酸之棒狀桿菌屬菌株。
藉由將麩胺酸棒狀桿菌serA(後文中係指代為serA(Cgl))基因替換為待藉由gapA啟動子表現的源自固氮菌之serA(Avn)基因。
對於這一基因操縱，首先，係獲得位於啟動子之上游的區域以及位於serA(Cgl)基因之OFR下游的區域，其中染色體同源重組係於該處發生。具體而言，啟動子上游區域之基因片段係藉由使用麩胺酸幫轉桿菌之染色體DNA作為模板以及SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27之引子的PCR獲得，而下游區域之基因片段係藉由實施使用SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：29之引子的PCR獲得。此外，gapA啟動子區域係藉由實施使用麩胺酸棒狀桿菌之染色體DNA作為模板以及SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31之引子的PCR獲得。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶係用作聚合酶，並且PCR係於下述擴增條件下所述：於95℃變性5分鐘；於95℃變性30秒，於58℃退火30秒，並於72℃聚合60秒，循環30次；以及於72℃聚合5分鐘。
源自固氮菌之serA(Avn)基因區域係藉由實施使用實施例1中製備之pCL-Ptrc_-serA(Avn)載體作為模板以及SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33之引子的PCR獲得。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶係用作聚合酶，並且PCR係於下述擴 增條件下所述：於95℃變性5分鐘；於95℃變性30秒，於58℃退火30秒，並於72℃聚合30秒，循環30次；以及於72℃聚合5分鐘。
藉由Gibson組裝，使用經擴增的用於染色體同源重組之上游區域及下游區域、gapA啟動子、源自固氮菌的serA(Avn)基因、以及由SmaI限制性核酸內切酶裂解之用於染色體轉形的pDZ載體經由克隆獲得重組質體，且命名為pDZ-PgapA-serA(Avn)。該克隆係藉由以計算之莫耳數混合Gibson組裝試劑以及每一基因片段，之後於50℃溫育1小時。
製造L-色氨酸之麩胺酸棒狀桿菌株KCCM12218P係使用所製備之pDZ-PgapA-serA(Avn)載體藉由電穿孔轉形，並令其進行第二次轉變製程以獲得其中serA(cgl)基因被替換為由gapA啟動子表現之固氮菌serA基因的菌株。這一基因操縱係藉由實施PCR及基因組測序而得以證實，該PCR係使用SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35之引子分別擴增該基因被插入其中之同源重組的上游及下游區域外的區域，並且所得菌株係命名為KCCM12218P-PgapA-serA(Avn)。
這一實施例中使用之引子的序列係顯示於下表18中。
表18
Figure 109114180-A0202-12-0039-25
實施例7-4：評估將源自固氮菌之serA(Avn)引入其中之麩胺酸棒狀桿菌的色胺酸製造能力
根據下述方法，培養實施例7-3製備之KCCM12218P-PgapA-serA(Avn)菌株及母株KCCM12218P，以鑒別其色胺酸製造。每種菌株係於含有25ml之種植培養基的250ml轉角型三角振蕩培養瓶中溫育，以及於30℃以200rpm振蕩培養20小時。隨後，將1ml之種植培養基於含有25ml之製造培養基的250ml轉角型三角振蕩培養瓶中溫育，以及於30℃以200rpm振蕩培養24小時。當培養完成時，係藉由HPLC量測每種菌株之L-色胺酸製造。
<種植培養基(pH 7.0)>
20g之葡萄糖、10g之蛋白腖、5g之酵母提取物、1.5g之尿素、4g之KH2PO4、8g之K2HPO4、0.5g之MgSO4‧7H2O、100μg之生物素、1,000μg之鹽酸硫胺素、2,000μg之泛酸鈣、以及2,000μg之菸鹼醯胺(基於1L之蒸餾水)。
<製造培養基(pH 7.0)>
30g之葡萄糖、15g之(NH4)2SO4、1.2g之MgSO4‧7H2O、1g之KH2PO4、5g之酵母提取物、900μg之生物素、4,500μg之鹽酸硫胺素、4,500μg之泛酸鈣、以及30g之CaCO3(基於1L之蒸餾水)。
表19
引入外來之源自固氮菌之serA(Avn)的麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium Glutamicum)菌株之色胺酸製造的證實
Figure 109114180-A0202-12-0040-27
KCCM12218P及KCCM12218P-PgapA-serA(Avn)菌株之L-色胺酸製造的評估結果係顯示於上表19中。
儘管母株KCCM12218P係顯示2.5g/L之L-色胺酸製造並且中間產物吲哚係以59mg/L之量蓄積，但引入serA(Avn)之菌株係顯示3.1g/L之L-色胺酸製造而無吲哚之蓄積。
基於該等結果，估計藉由將源自固氮菌之serA(Avn)引入製造L-色胺酸之麩胺酸棒狀桿菌中而供應L-絲胺酸亦係充分，並且證實，於L-色胺酸之生物合成的最終步驟中，L-色胺酸之產率亦增加且無中間產物吲哚之蓄積。因此，可見當前體之製造被改善時色胺酸製造同時被改善的協同效應。
菌株KCCM12218P-PgapA-serA(Avn)係命名為CM05-8935，根據布達佩斯條約放置於韓國微生物培養中心(KCCM)，並且於2018年11月27日指定登錄號為KCCM12414P。
實施例8：製備引入源自固氮菌之serA(Avn)的麩胺酸幫轉桿菌並評估該菌株之組胺酸製造能力
實施例8-1：製造組胺酸之麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium Glutamicum)菌株的製備
製造L-組胺酸之麩胺酸棒狀桿菌株自從野生型菌株ATCC13032發展而來。為了釋放對HisG多肽(其係L-組胺酸生物合成通道的第一種酶)之反饋抑制，HisG之位於自N端計數第233位置處之甘胺酸係替換為組胺酸並且位於自N端計數第235位置處之蘇胺酸係同步替換為麩胺酸(SEQ ID NO：88)(ACS Synth.Biol.,2014,3(1),pp 21-29)。此外，為了增強L-組胺酸生物合成通道，分裂為總計4個操縱子之生物合成基因(hisD-hisC-hisB-hisN)係以簇之形式製備， 其中該啟動子係經替換並引入該菌株中(SEQ ID NO：89)。
對於這一基因操縱，首先係獲得hisG之第233及235個胺基酸之修飾的上游區域及下游區域，染色體同源重組係於該處發生。具體而言，hisG之第233及235個胺基酸之修飾的上游區域及下游區域基因片段係藉由實施使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體DNA作為模板以及SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37之引子的PCR而獲得，而hisG之第233及235個胺基酸之修飾的上游區域及下游區域基因片段係藉由實施使用SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39的PCR而獲得。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶係用作聚合酶，並且PCR係於下述擴增條件下所述：於95℃變性5分鐘；於95℃變性30秒，於60℃退火30秒，並於72℃聚合30秒，循環60次；以及於72℃聚合5分鐘。
藉由Gibson組裝(DG Gibson et al.,NATURE METHODS,VOL.6,NO.5,MAY 2009,NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)，使用經擴增的hisG之第233及235個胺基酸之修飾的上游區域及下游區域以及藉由SmaI限制性核酸內切酶裂解的用於染色體轉形之pDZ載體(韓國專利第10-0924065號)進行克隆，獲得重組質體，並且命名為pDZ-hisG(G233H,T235Q)。該克隆係藉由以計算之莫耳數混合Gibson組裝試劑以及每一基因片段，之後於50℃溫育1小時。
野生型麩胺酸棒狀桿菌株ATCC13032係使用所製備之pDZ-hisG(G233H,T235Q)載體藉由電穿孔轉形，並進行第二次轉換製程以獲得具有下述胺基酸替換的菌株，HisG之位於染色體上233位置處的甘胺酸替換為組胺酸，並且位於235位置處的蘇胺酸被替換為麩胺酸(SEQ ID NO：88)。這一基因操縱係藉由實施PCR及基因組測序而得以證實，該PCR係使用SEQ ID NO：40及 SEQ ID NO：41之引子分別擴增該基因被插入其中之同源重組的上游及下游區域外的區域，並且所得菌株係命名為CA14-0011。
這一實施例中使用之引子的序列係顯示於下表20中。
表20
Figure 109114180-A0202-12-0043-28
此外，為了增強L-組胺酸生物合成通道，分裂為總計4個操縱子之生物合成基因係以簇的形式引入，其中該啟動子係經替換。具體而言，L-組胺酸生物合成簇係分裂為總計四個操縱子(hisE-hisG、hisA-impA-hisF-hisI、hisD-hisC-hisB、及cg0911-hisN)，並且製備將該等生物合成基因同步引入微生物的載體。
此外，編碼γ-胺基丁酸酯通透酶的Ncgl1108基因(Microb Biotechnol.2014 Jan；7(1)：5-25))係用作該生物合成簇之插入位點。
對於這一基因操縱，首先，係獲得Ncgl1108之上游區域以及下游 區域，其中染色體同源重組係於該處發生。具體而言，Ncgl1108基因上游區域之基因片段係藉由使用麩胺酸幫轉桿菌之染色體DNA作為模板以及SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43之引子的PCR獲得，而Ncgl1108基因下游區域之基因片段係藉由實施使用SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45之引子的PCR獲得。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶係用作聚合酶，並且PCR係於下述擴增條件下所述：於95℃變性5分鐘；於95℃變性30秒，於60℃退火30秒，並於72℃聚合30秒，循環60次；以及於72℃聚合5分鐘。
藉由Gibson組裝(DG Gibson et al.,NATURE METHODS,VOL.6,NO.5,MAY 2009,NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)，使用經擴增的Ncgl1108基因的上游區域及下游區域以及藉由SmaI限制性核酸內切酶裂解的用於染色體轉形之pDZ載體(韓國專利第10-0924065號)進行克隆，獲得重組質體，並且命名為pDZ-△Ncgl1108。該克隆係藉由以計算之莫耳數混合Gibson組裝試劑以及基因片段，之後於50℃溫育1小時。
CA14-0011菌株係使用所製備之pDZ-△Ncgl1108載體藉由電穿孔轉形，並進行第二次轉換製程以獲得其中Ncgl1108基因被打斷的菌株。這一基因操縱係藉由實施PCR及基因組測序而得以證實，該PCR係使用SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：47之引子分別擴增該基因被打斷處之同源重組的上游及下游區域外的區域，並且所得菌株係命名為CA14-0736。
這一實施例中使用之引子的序列係顯示於下表21中。
Figure 109114180-A0305-02-0046-1
此外，為了增強該生物合成簇，係獲得待替換為一組4個操縱子基因的啟動子區域。係獲得增強之lysC啟動子(後文中指代為lysCP1，韓國專利第10-0930203號)區及hisE-hisG區、gapA啟動子區及hisA-impA-hisF-hisI區、SPL13合成啟動子(韓國專利第10-1783170號)區及hisD-hisC-hisB區、以及CJ7合成啟動子(韓國專利第10-0620092號及WO2006/065095)區及cg0911-hisN區。具體而言，係實施使用KCCM10919P菌株(韓國專利第10-0930203號)之染色體作為模板以及SEQ ID NO：48及SEQ ID NO：49之引子的PCR。PfuUltraTM高保真度DNA聚合酶(Stratagene)係作為聚合酶進行PCR，並且藉此擴增之PCR產物係藉由使用QIAGEN製造之PCR純化套組純化，以獲得lysCP1啟動子區。hisE-hisG區之基因片段係藉由實施使用麩胺酸棒狀桿菌 CA14-0011之染色體DNA作為模板以及SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51之引子的PCR獲得。gapA啟動子區之基因片段係藉由實施使用SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：53之引子的PCR獲得，而hisA-impA-hisF-hisI區之基因片段係藉由實施使用SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55之引子的PCR獲得.此外，實施使用SPL13合成啟動子作為模板以及SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：57之引子的PCR，並且藉由實施使用麩胺酸棒狀桿菌CA14-0011之染色體DNA作為模板以及SEQ ID NO：58及SEQ ID NO：59之引子的PCR獲得hisD-hisC-hisB區之基因片段。隨後，實施使用合成啟動子作為模板以及SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：61之引子的PCR，並且藉由實施使用麩胺酸棒狀桿菌CA14-0011之染色體DNA作為模板以及SEQ ID NO：62及SEQ ID NO：63之引子的PCR獲得cg0911-hisN區之基因片段。
這一實施例中使用之引子的序列係顯示於下表22中。
表22
Figure 109114180-A0202-12-0047-30
Figure 109114180-A0202-12-0048-31
SolgTMTM Pfu-X DNA聚合酶係用作聚合酶，並且PCR係於下述擴增條件下所述：於95℃變性5分鐘；於95℃變性30秒，於60℃退火30秒，並於72℃聚合30秒，循環180次；以及於72℃聚合5分鐘。
藉由Gibson組裝(DG Gibson et al.,NATURE METHODS,VOL.6,NO.5,MAY 2009,NEBuilder HiFi DNA組裝預混液)，使用經擴增之lysCP1區及hisE-hisG區、gapA啟動子區及hisA-impA-hisF-hisI區、SPL13合成啟動子區及hisD-hisC-hisB區、CJ7合成啟動子區及cg0911-hisN區、以及由ScaI限制性核酸內切酶裂解之用於染色體轉形的pDZ vector-△NCgl1108載體進行克隆，獲得重組質體，並且命名為pDZ-△NCgl1108：：lysCP1_hisEG-PgapA_hisA-impA-hisFI-SPL13_HisDCB-CJ7_cg0911-hisN。該克隆係藉由以計算之莫耳數混合Gibson組 裝試劑以及每一基因片段，之後於50℃溫育1小時。
CA14-0011菌株係使用所製備之pDZ-△Ncgl1108：：PlysCm1_hisEG-PgapA_hisA-impA-hisFI-SPL13_HisDCB-CJ7_cg0911-hisN載體藉由電穿孔轉形，並進行第二次轉換製程以獲得其中生物合成基因被插入的菌株。這一基因操縱係藉由實施PCR及基因組測序而得以證實，該PCR係使用SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47之引子分別擴增該基因被插入其中之同源重組的上游及下游區域外的區域，並且所轉形之菌株係命名為CA14-0011。
CA14-0737菌株係根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)放置於韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM))，並且於2018年11月27日指定登錄號為KCCM 12411P。
實施例8-2：製備引入源自固氮菌之外來serA(Avn)的製造組胺酸之麩胺酸棒狀桿菌株
為了鑒別源自固氮菌的serA(Avn)基因對於增加L-組胺酸製造之效果，係使用CA14-0737菌株。
使用實施例7-3中製備之pDZ-PgapA-serA(Avn)，藉由將serA(Cgl)基因替換為待由gapA啟動子表達的源自固氮菌之serA(Avn)基因，製備菌株。
製造L-組胺酸之麩胺酸棒狀桿菌株係使用pDZ-PgapA-serA(Avn)載體藉由電穿孔轉形，並令其進行第二次轉變製程以獲得其中serA(Cgl)基因被替換為由gapA啟動子之強啟動子表現之固氮菌serA基因的菌株。這一基因操縱係藉由實施PCR及基因組測序而得以證實，該PCR係使用SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35之引子分別擴增該基因被插入其中之同源重組的上游及下游區域外的區域，並且所得菌株係命名為CA14-0738。
實施例8-3：評估引入源自固氮菌之外來serA(Avn)的製造組胺酸之麩胺酸棒狀桿菌株
根據下述方法培養上述實施例8-1及8-2中製備之CA14-0011、CA14-0736、CA14-0737及CA14-0738菌株，以鑒別L-組胺酸製造能力。每種菌株係於含有25ml之種植培養基的250ml轉角型三角振蕩培養瓶中溫育，以及於30℃以200rpm振蕩培養20小時。隨後，將1ml之種植培養基於含有25ml之製造培養基的250ml轉角型三角振蕩培養瓶中溫育，以及於30℃以200rpm振蕩培養24小時。當培養完成時，係藉由HPLC量測L-組胺酸之製造。
<種植培養基(pH 7.0)>
20g之葡萄糖、10g之蛋白腖、5g之酵母提取物、1.5g之尿素、4g之KH2PO4、8g之K2HPO4、0.5g之MgSO4‧7H2O、100μg之生物素、1,000μg之鹽酸硫胺素、2,000μg之泛酸鈣、以及2,000μg之菸鹼醯胺(基於1L之蒸餾水)。
<製造培養基(pH 7.0)>
100g之葡萄糖、40g之(NH4)2SO4、3g之酵母提取物、1g之KH2PO4、0.4g之MgSO4‧7H2O、0.01g之FeSO4‧7H2O、50μg之生物素、100μg之硫胺素、以及30g之CaCO3(基於1L之蒸餾水)。
表23
引入外來之源自固氮菌之serA(Avn)的麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium Glutamicum)菌株之L-組胺酸製造的證實
Figure 109114180-A0202-12-0051-32
製造L-組胺酸之麩胺酸棒狀桿菌的L-組胺酸製造的評估結果係顯示於上表24中。
儘管具有增強之組胺酸製造能力的母株CA14-0737係顯示4.09g/L之L-組胺酸製造，但經引入serA(Avn)之CA14-0738菌株係顯示5.07g/L之L-組胺酸製造，表明L-組胺酸製造比母株CA14-0737增加20%。
基於該等結果，係證實，藉由引入源自固氮菌的serA(Avn)，製造L-組胺酸的能力得以增強。CA14-0738菌株係根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)放置於韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM))，並且於2018年11月27日指定登錄號為KCCM 12412P。
實施例9：製備並評估引入固氮菌serA的製造甲硫胺酸(Met)之菌株
實施例9-1：用於mcbR基因刪除之重組載體的製造
為了製備製造甲硫胺酸之菌株，ATCC13032菌株係用以製備用於 滅活編碼甲硫胺酸/半胱胺酸轉錄調節子之mcbR基因的載體(J.Biotechnol.103：51-65,2003)。
具體而言，為了從麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體中刪除mcbR基因，係根據下述方法製備重組質體。基於放置在美國國立健康研究院(NIH)GenBank之核苷酸序列，係獲得麩胺酸棒狀桿菌的mcbR基因與側翼序列(SEQ ID NO：91)。
為了獲得所刪除之mcbR基因，係實施使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032之染色體DNA作為模板以及SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66及SEQ ID NO：67之引子的PCR。PCR係於下述擴增條件下所述：於95℃變性5分鐘；於95℃變性30秒，於53℃退火30秒，並於72℃聚合30秒，循環30次；以及於72℃聚合7分鐘。作為結果，係分別獲得700bp之DNA片段。
不能在麩胺酸棒狀桿菌中複製的pDZ載體(韓國專利第10-0924065號)以及經擴增之mcbR基因片段係使用限制性核酸內切酶SmaI處理，以便引入染色體中，並使用DNA連接酶連接。大腸桿菌DH5α係使用該載體轉形，並種植在含有25mg/L康黴素的LB固體培養基上。將具有靶點基因刪除之片段插入載體中，選擇使用該載體轉形的菌落。隨後，藉由質體提取方法獲得質體，並命名為pDZ-△mcbR。
這一實施例中使用之引子的序列係顯示於下表24中。
表24
Figure 109114180-A0202-12-0053-33
實施例9-2：製備其中metH及cysI Are得以同步增強的重組載體
為了製備製造甲硫胺酸之菌株，該技術中習知之ATCC13032菌株係用來製備載體，於該載體中，編碼甲硫胺酸合成酶之metH基因(Ncgl1450)及編碼亞硫酸還原酶之cysI基因(Ncgl2718)兩者係得以增強。
具體而言，為了額外地將metH基因及cysI基因插入麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體中，係根據下述方法製備重組質體。基於放置在美國國立健康研究院(U.S.National Institutes of Health(NIH))GenBank之核苷酸序列，係獲得麩胺酸棒狀桿菌的metH基因與側翼序列(SEQ ID NO：92)以及cysI基因與側翼序列(SEQ ID NO：93)。
首先，係製備用於移除Ncgl1021(轉位酶)的載體以插入這些基因。基於放置在美國國立健康研究院(NIH)GenBank之核苷酸序列，係獲得麩胺酸棒狀桿菌的Ncgl1021基因與側翼序列(SEQ ID NO：94)。為了獲得所刪除之Ncgl1021基因，係實施使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032之染色體DNA作為模板以及SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70及SEQ ID NO：71之引 子的PCR。PCR係於下述擴增條件下所述：於95℃變性5分鐘；於95℃變性30秒，於53℃退火30秒，並於72℃聚合30秒，循環30次；以及於72℃聚合7分鐘。作為結果，係獲得DNA片段。不能在麩胺酸棒狀桿菌中複製的pDZ載體(韓國專利第10-0924065號)以及經擴增之Ncgl1021基因片段係使用限制性核酸內切酶xbaI處理，以便引入染色體中，並藉由Gibson組裝進行克隆。大腸桿菌DH5α係使用該載體轉形，並種植在含有25mg/L康黴素的LB固體培養基上。將具有靶點基因刪除之片段插入載體中，選擇使用該載體轉形的菌落。隨後，藉由質體提取方法獲得質體，並命名為pDZ-△Ncgl1021。
接著，為了獲得metH基因及cysI基因，係實施使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032之染色體DNA作為模板以及SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：75之引子的PCR。此外，Pcj7啟動子係用以增強metH基因之表現，而Pspl1啟動子係用以增強cysI基因之表現。出於獲得此等基因之目的，首先，係藉由實施使用產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC 6872之染色體DNA作為模板以及SEQ ID NO：76及SEQ ID NO：77之引子的PCR獲得Pcj7啟動子，並且藉由實施使用該技術中已知之spl1-GFP載體(韓國專利第10-1783170號)之DNA作為模板以及SEQ ID NO：78及SEQ ID NO：79之引子的PCR獲得Pspl1啟動子。PCR係於下述擴增條件下所述：於95℃變性5分鐘；於95℃變性30秒，於53℃退火30秒，並於72℃聚合30秒，循環30次；以及於72℃聚合7分鐘。作為結果，係獲得metH基因、cysI基因、Pcj7啟動子、以及Pspl1啟動子的DNA片段。
之後，不能在麩胺酸棒狀桿菌中替換的pDZ-△Ncgl1021載體係使用限制性核酸內切酶Scal處理，而經擴增之4個DNA片段係使用限制性核酸 內切酶ScaI處理並藉由Gibson組裝克隆。大腸桿菌DH5α係使用該載體轉形，並種植在含有25mg/L康黴素的LB固體培養基上。將具有靶點基因刪除之片段插入載體中，選擇使用該載體轉形的菌落。隨後，藉由質體提取方法獲得質體，並命名為pDZ-△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI。
這一實施例中使用之引子的序列係顯示於下表25中。
表25
Figure 109114180-A0202-12-0055-34
實施例9-3：製造L-甲硫胺酸之菌株的研發以及使用該菌株製造L-甲硫胺酸
藉由經由染色體同源重組之電穿孔(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52：541-545,1999)，使用如上揭者製備之pDC-△mcBR、pDZ-△Ncgl1021及pDZ-△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI載體之每一種將ATCC13032菌株轉形。隨後，於含有蔗糖之固體培養基中實施第二次重組。一旦第二次重組完成，即藉由實施使用SEQ ID NO：80及SEQ ID NO：81之引子的PCR鑒別具有mcBR刪除的經轉形之麩胺酸棒狀桿菌株，並且藉由使用SEQ ID NO：82及SEQ ID NO：83之引子的PCR鑒別具有Ncgl1021基因刪除及Pcj7-metH-Pspl1cysI基因插入Ncgl1021位點的經轉形之菌株。重組之菌株係各自命名為麩胺酸棒狀桿菌13032/△mcbR、13032/△Ncgl1021、及13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI。
這一實施例中使用之引子的序列係顯示於下表26中。
表26
Figure 109114180-A0202-12-0056-35
為了評估所製備之13032/△mcbR、13032/△Ncgl1021、及CJP13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI菌株之L-甲硫胺酸製造能力，係根據下述方法培養此等菌株及母株麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032。
麩胺酸棒狀桿菌株ATCC13032以及本發明之麩胺酸棒狀桿菌株13032/△mcbR、13032/△Ncgl1021及13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI係各自於含有25ml之種植培養基的250ml轉角型三角振蕩培養瓶中溫育，並於30℃ 在以200rpm振蕩下培養20小時。隨後，將1ml之種植培養基於含有24ml之製造培養基的250ml轉角型三角振蕩培養瓶中溫育，以及於30℃以200rpm振蕩培養48小時。種植培養基及製造培養基之組成係如下。
<種植培養基(pH 7.0)>
20g之葡萄糖、10g之蛋白腖、5g之酵母提取物、1.5g之尿素、4g之KH2PO4、8g之K2HPO4、0.5g之MgSO4‧7H2O、100μg之生物素、1,000μg之鹽酸硫胺素、2,000μg之泛酸鈣、以及2,000μg之菸鹼醯胺(基於1L之蒸餾水)。
<製造培養基(pH 8.0)>
50g之葡萄糖、12g之(NH4)2S2O3、5g之酵母提取物、1g之KH2PO4、1.2g之MgSO4‧7H2O、100μg之生物素、1,000μg之鹽酸硫胺素、2,000μg之泛酸鈣、3,000μg之菸鹼醯胺、以及30g之CaCO3(基於1L之蒸餾水)。
分析藉由根據上揭方法培養該等菌株獲得之培養中所含之L-甲硫胺酸的濃度並顯示於下表27中。
表27
所製備之菌株的評估
Figure 109114180-A0202-12-0057-36
作為結果，係證實，其中僅刪除mcbR基因之菌株係顯示0.12g/L之L-甲硫胺酸製造，表明與對照菌株相比之增加。此外，其中metH及cysI基因係過度表現而無mcBR刪除之菌株係顯示0.18g/L之L-甲硫胺酸製造，表明與對照菌株相比之增加。
實施例9-4：源自固氮菌之D-3-磷酸甘油酯脫氫酶(serA(Avn))過表現載體的製備
製備表現載體以鑒別製造甲硫胺酸之能力是否藉由增強源自固氮菌之D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(後文中指代為serA(Avn))而得以改善。
為了表現編碼SerA(Avn)之serA(Avn)基因(SEQ ID NO：1)，係使用可用於麩胺酸棒狀桿菌之轉形中的穿梭載體pECCG117(Biotechnology letters vol 13,No.10,p.721-726 1991或韓國專利公開第92-7401號)。作為表現啟動子，spl1啟動子(後文稱為Pspl1)係用以製備pECCG117-Pspl1-serA(Avn)載體。用於Pspl1之PCR係使用SEQ ID NOS：84及SEQ ID NOS：85之引子實施，而用於外來serA(Avn)之PCR係使用SEQ ID NOS：86及SEQ ID NOS：87之引子實施。經擴增之Pspl1及serA(Avn)基因片段係藉由Gibson組裝使用經限制性核酸內切酶EcoRV處理的pECCG117載體進行克隆，從而製備pECCG117-Pspl1-serA(Avn)。
這一實施例中使用之引子的序列係顯示於下表28中。
表28
Figure 109114180-A0202-12-0059-37
實施例9-5：使用野生型菌株大腸桿菌製備引入源自固氮菌之serA(Avn)的製造L-甲硫胺酸之菌株，並評估其L-甲硫胺酸製造能力
藉由電穿孔，使用上揭之pECCG117-Pspl1-serA(Avn)載體分別將13032/△mcbR及13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI菌株轉形(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52：541-545,1999)。重組菌株係分別命名為麩胺酸棒狀桿菌13032/△mcbR(pECCG117-Pspl1-serA(Avn))及13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI(pECCG117-Pspl1-serA(Avn))。
為了評估所製備之重組質體13032/△mcbR(pECCG117-Pspl1-serA(Avn))及13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI(pECCG117-Pspl1-serA(Avn))的L-甲硫胺酸製造能力，此等菌株及其母株(13032/△mcbR及13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI)係根據下述方法培養。
麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032以及根據本揭露製備之菌株麩胺酸棒狀桿菌13032/△mcbR、13032/△Ncgl1021、13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI係各自於含有25ml之種植培養基的250ml轉角型三角振蕩培養瓶中溫育，並於30℃在以200rpm振蕩下培養20小時。隨後，將1ml之種植培養基於含有24 ml之製造培養基的250ml轉角型三角振蕩培養瓶中溫育，以及於30℃以200rpm振蕩培養48小時。特別地，於額外地將康黴素(25mg/l)加至其中之後，培養其中包括該載體之菌株。種植培養基及製造培養基之組成係如下。
<種植培養基(pH 7.0)>
20g之葡萄糖、10g之蛋白腖、5g之酵母提取物、1.5g之尿素、4g之KH2PO4、8g之K2HPO4、0.5g之MgSO4‧7H2O、100μg之生物素、1,000μg之鹽酸硫胺素、2,000μg之泛酸鈣、以及2,000μg之菸鹼醯胺(基於1L之蒸餾水)。
<製造培養基(pH 8.0)>
50g之葡萄糖、12g之(NH4)2S2O3、5g之酵母提取物、1g之KH2PO4、1.2g之MgSO4‧7H2O、100μg之生物素、1,000μg之鹽酸硫胺素、2,000μg之泛酸鈣、3,000μg之菸鹼醯胺、以及30g之CaCO3(基於1L之蒸餾水)。
分析藉由根據上揭方法培養該等菌株獲得之培養中所含之L-甲硫胺酸的濃度並顯示於下表29中。
表29
所製備之菌株的評估
Figure 109114180-A0202-12-0060-38
作為結果，係證實，使用pECCG117-Pspl1-serA(Avn)轉形之兩種菌株皆顯示比對照菌株增加之L-甲硫胺酸製造。此外，13032/△mcbR(pECCG117-Pspl1-serA(Avn))菌株係顯示比對照菌株增加83%之L-甲硫胺酸製造，而13032/△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI pECCG117-Pspl1-serA(Avn))菌株係顯示比對照菌株增加78%之L-甲硫胺酸製造。因此，根據這一實施例，證實微生物之L-甲硫胺酸製造能力係藉由將源自固氮菌之serA(Avn)引入其中而得以改善
13032/△mcbR菌株係命名為CM02-0618，根據布達佩斯條約放置於韓國微生物培養中心(KCCM)，並且於2019年1月4日指定登錄號為KCCM12414P。此外，13032/△mcbR(pECCG117-Pspl1-serA(Avn))菌株係命名為CM02-0693，根據布達佩斯條約放置於韓國微生物培養中心(KCCM)，並且於2018年11月27日指定登錄號為KCCM12413P。
儘管業經參照具體示例性說明之具體實施態樣揭示本揭露，但本揭露所屬領域之熟練人士應理解，本揭露可藉由其他具體形式例示之而不悖離本揭露之技術精神或主要特征。因此，於各種意義上，上揭之具體實施態樣係視為示例性說明而非限制性者。此外，本公開之範疇應藉由所附申請專利範圍而非具體實施方式界定之，並且應理解，源自本揭露之意義及範疇的所有修飾或變更及其等效物係包括於本揭露之範疇內。
【生物材料寄存1】
【寄存國家】KR南韓
【寄存機構】韓國微生物保存中心
【寄存日期】2018/11/09
【寄存號碼】KCCM12381P
【生物材料寄存2】
【寄存國家】TW中華民國
【寄存機構】財團法人食品工業發展研究所
【寄存日期】2020/08/07
【寄存號碼】BCRC 911014
【生物材料寄存3】
【寄存國家】KR南韓
【寄存機構】韓國微生物保存中心
【寄存日期】2018/11/27
【寄存號碼】KCCM12411P
【生物材料寄存4】
【寄存國家】TW中華民國
【寄存機構】財團法人食品工業發展研究所
【寄存日期】2020/08/07
【寄存號碼】BCRC 911018
【生物材料寄存5】
【寄存國家】KR南韓
【寄存機構】韓國微生物保存中心
【寄存日期】2018/11/27
【寄存號碼】KCCM12412P
【生物材料寄存6】
【寄存國家】TW中華民國
【寄存機構】財團法人食品工業發展研究所
【寄存日期】2020/08/07
【寄存號碼】BCRC 911019
【生物材料寄存7】
【寄存國家】KR南韓
【寄存機構】韓國微生物保存中心
【寄存日期】2018/11/27
【寄存號碼】KCCM12413P
【生物材料寄存8】
【寄存國家】TW中華民國
【寄存機構】財團法人食品工業發展研究所
【寄存日期】2020/08/07
【寄存號碼】BCRC 911016
【生物材料寄存9】
【寄存國家】KR南韓
【寄存機構】韓國微生物保存中心
【寄存日期】2018/11/27
【寄存號碼】KCCM12414P
【生物材料寄存10】
【寄存國家】TW中華民國
【寄存機構】財團法人食品工業發展研究所
【寄存日期】2020/08/07
【寄存號碼】BCRC 911017
【生物材料寄存11】
【寄存國家】KR南韓
【寄存機構】韓國微生物保存中心
【寄存日期】2019/01/04
【寄存號碼】KCCM12425P
【生物材料寄存12】
【寄存國家】TW中華民國
【寄存機構】財團法人食品工業發展研究所
【寄存日期】2020/08/07
【寄存號碼】BCRC 911015
<110> CJ第一製糖股份有限公司(CJ CHEILJEDANG CORPORATION)
<120> 製造L-胺基酸的微生物及使用該微生物製造L-胺基酸的方法
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<213> 未知
<220>
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<400> 1
Figure 109114180-A0305-02-0065-2
Figure 109114180-A0202-12-0065-11
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<223> 引子
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<223> 引子
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<211> 40
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<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 5
Figure 109114180-A0202-12-0066-43
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<211> 40
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<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 6
Figure 109114180-A0202-12-0066-44
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<211> 40
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<223> 引子
<400> 7
Figure 109114180-A0202-12-0067-45
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<211> 40
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<223> 引子
<400> 8
Figure 109114180-A0202-12-0067-46
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<213> 人工序列
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<223> 引子
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Figure 109114180-A0202-12-0067-47
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<223> 引子
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Figure 109114180-A0202-12-0067-48
<210> 11
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<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 11
Figure 109114180-A0202-12-0068-49
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 12
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<223> 引子
<400> 13
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<212> DNA
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<223> 引子
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<400> 17
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<210> 18
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<400> 20
Figure 109114180-A0202-12-0070-59
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<400> 23
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<223> 引子
<400> 24
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<211> 37
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<223> 引子
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<223> 引子
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<223> 引子
<400> 80
Figure 109114180-A0202-12-0083-129
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 81
Figure 109114180-A0202-12-0084-130
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 82
Figure 109114180-A0202-12-0084-131
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 83
Figure 109114180-A0202-12-0084-132
<210> 84
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 84
Figure 109114180-A0202-12-0084-133
<210> 85
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 85
Figure 109114180-A0202-12-0085-134
<210> 86
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 86
Figure 109114180-A0202-12-0085-135
<210> 87
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 87
Figure 109114180-A0202-12-0085-136
<210> 88
<211> 281
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 多肽
<400> 88
Figure 109114180-A0202-12-0085-137
Figure 109114180-A0202-12-0086-139
<210> 89
<211> 10676
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 89
Figure 109114180-A0202-12-0086-138
Figure 109114180-A0202-12-0087-140
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Figure 109114180-A0202-12-0092-145
Figure 109114180-A0202-12-0093-146
<210> 90
<211> 281
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 多肽
<400> 90
Figure 109114180-A0202-12-0093-147
Figure 109114180-A0202-12-0094-148
<210> 91
<211> 2642
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 91
Figure 109114180-A0202-12-0094-150
Figure 109114180-A0202-12-0095-151
Figure 109114180-A0202-12-0096-152
<210> 92
<211> 5666
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 92
Figure 109114180-A0202-12-0096-154
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<210> 93
<211> 11332
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 93
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Figure 109114180-A0202-12-0100-159
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<210> 94
<211> 3311
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 94
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<210> 95
<211> 1230
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 95
Figure 109114180-A0202-12-0108-170
Figure 109114180-A0202-12-0109-171

Claims (12)

  1. 一種製造L-胺基酸或其前體的微生物，其中該微生物係經修飾以表現包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的蛋白質，其中該微生物係屬於棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或大腸桿菌屬(Escherichia)，其中該L-胺基酸或其前體係選自由L-絲胺酸、L-色胺酸、L-組胺酸、L-甲硫胺酸、L-半胱胺酸、O-琥珀醯基類絲胺酸、O-乙醯基類絲胺酸、L-類絲胺酸、乙醯基絲胺酸、L-胱硫醚、L-類半胱胺酸及O-磷絲胺酸所組成之群組。
  2. 如請求項1所述之微生物，其中該蛋白質係源自棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)。
  3. 如請求項1所述之微生物，其中該微生物進一步具有i)經弱化之磷絲胺酸磷酸酶活性，ii)經增強之3-磷絲胺酸胺基轉移酶活性，或iii)經弱化之磷絲胺酸磷酸酶活性及經增強之3-磷絲胺酸胺基轉移酶活性兩者。
  4. 如請求項1所述之微生物，其中該微生物係藉由色胺酸操縱子之增強、色胺酸酶(TnaA)之滅活、Mtr膜蛋白(Mtr)之滅活、或其任何組合予以進一步修飾。
  5. 如請求項1所述之微生物，其中該微生物進一步具有經增強之組胺酸操縱子。
  6. 如請求項1所述之微生物，其中該微生物係藉由McbR(轉錄調節子；mcbR)之滅活、甲硫胺酸合成酶(meth)之增強、亞硫酸還原酶[NADPH]血紅素蛋白β-成分(cysI)之增強、或其任何組合予以進一步修飾。
  7. 如請求項1所述之微生物，其中該微生物係麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)或大腸桿菌(Escherichia coli)。
  8. 一種製造L-胺基酸或其前體的方法，該方法係包含於培養基中培養如請求項1至7中任一項所述之微生物，其中該L-胺基酸或其前體係選自由L-絲胺酸、L-色胺酸、L-組胺酸、L-甲硫胺酸、L-半胱胺酸、O-琥珀醯基類絲胺酸、O-乙醯基類絲胺酸、L-類絲胺酸、乙醯基絲胺酸、L-胱硫醚、L-類半胱胺酸及O-磷絲胺酸所組成之群組。
  9. 如請求項8所述之方法，進一步包含從所培養之微生物或該培養基中回收L-胺基酸或其前體。
  10. 一種微生物的用途，該微生物經修飾以表現包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的蛋白質，用於增加L-胺基酸或其前體之製造，其中該微生物係屬於棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或大腸桿菌屬(Escherichia)，其中該L-胺基酸或其前體係選自由L-絲胺酸、L-色胺酸、L-組胺酸、L-甲硫胺酸、L-半胱胺酸、O-琥珀醯基類絲胺酸、O-乙醯基類絲胺酸、L-類絲胺酸、乙醯基絲胺酸、L-胱硫醚、L-類半胱胺酸及O-磷絲胺酸所組成之群組。
  11. 一種用於製造L-胺基酸或其前體的組成物，其中該組成物係包含微生物，該微生物經修飾以表現包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的蛋白質，其中該微生物係屬於棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或大腸桿菌屬(Escherichia)，其中該L-胺基酸或其前體係選自由L-絲胺酸、L-色胺酸、L-組胺酸、L-甲硫胺酸、L-半胱胺酸、O-琥珀醯基類絲胺酸、O-乙醯基類絲胺酸、L-類絲胺酸、乙醯基絲胺酸、L-胱硫醚、L-類半胱胺酸及O-磷絲胺酸所組成之群組。
  12. 一種使用如請求項11所述之組成物製造L-胺基酸或其前體的 方法，其中該L-胺基酸或其前體係選自由L-絲胺酸、L-色胺酸、L-組胺酸、L-甲硫胺酸、L-半胱胺酸、O-琥珀醯基類絲胺酸、O-乙醯基類絲胺酸、L-類絲胺酸、乙醯基絲胺酸、L-胱硫醚、L-類半胱胺酸及O-磷絲胺酸所組成之群組。
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