KR101518860B1 - L-아미노산의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전사 저해 방법을 이용하여 목적 유전자의 발현을 약화시킨 재조합 코리네형 미생물을 이용하여, L-아미노산 생산방법에 관한 것이다.

Description

L-아미노산의 생산 방법 {Method for producing L-amino acid}
본 발명은 유전자 전사 저해 방법을 이용한 L-아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.
코리네형 미생물에서 각종 탄소원으로부터 해당과정(Glycolysis)을 거쳐 생성된 피루베이트(pyruvate)는 옥살로아세테이트(oxaloacetate)를 거쳐 아스파테이트(aspartate)로 전환된다. 당해 아스파테이트는 각 생합성 경로를 거쳐서 쓰레오닌(Threonine), 메치오닌(Methionine), 이소루신(isoleucine) 및 라이신(lysine)과 같은 아미노산류로 전환된다(도 1). 따라서, 아미노산 생합성 과정에서 분지점에 위치한 유전자의 발현을 저해함으로써 부산물 생산을 줄이고 목적 아미노산 생산을 증대시킬 수 있다.
상기와 같이 미생물을 유전공학적 또는 대사공학적 기술을 이용하여 목적 물질들을 고역가로 생산할 수 있는 균주로 개발하기 위해서는 미생물 내의 여러 가지 대사과정에 관련된 유전자의 발현을 선택적으로 조절할 수 있어야 한다. 최근, 유전자의 발현을 약화시키기 위한 '인공적 수렴 전사(artificial convergent transcription)'라는 기술이 보고되었다(Krylov et al., J Mol Microbiol Biotechnol, 18:1-13, 2010). 상기 인공적 수렴 전사 기술은 목표 유전자의 전사종결자(transcription terminator) 하단에 당 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 프로모터를 삽입함으로써 각 프로모터 유래의 RNA 폴리머라아제 복합체(RNA polymerase complex)가 전사과정 중 서로 충돌을 일으키게 하여 목표 유전자 발현을 약화시키는 기술이다.
이에 본 발명자들은 아세테이트 유도성 프로모터를 목표 유전자의 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입하여 아세테이트가 존재하는 조건하에서 선택적으로 목표 유전자의 발현을 저해하는 기술을 개발하였고, 이를 분지점에 위치한 유전자의 발현을 저해하는데 효과적으로 적용하여 L-아미노산의 생산성이 증대된 코리네형 미생물을 제공할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 아세테이트 유도성 프로모터를 이용하여 목적 유전자 전사를 저해함으로써 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 아세테이트 유도성 프로모터를, 염색체 내 목적 유전자의 종결코돈 하단에 도입하여 형질전환된, L-아미노산 생산능을 가진 재조합 코리네형 미생물을 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양 단계에서 아세테이트를 첨가함으로써 배양 중 상기 목적 유전자의 발현을 약화시켜, 상기 재조합 코리네형 미생물의 L-아미노산 생산능을 강화하는 단계;
를 포함하는 L-아미노산 생산방법을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 아세테이트 유도성 프로모터를 이용함으로써 적절한 시간 중에 아세테이트를 첨가함으로써 목적 유전자의 발현을 약화시켜 목적하는 L-아미노산을 고수율로 생산할 수 있으므로 L-아미노산의 생산에 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 코리네형 미생물에서 아미노산 생합성 과정의 분지점을 나타낸 도면이다.
도 2의 a)는 aceE 유전자의 종결코돈과 전사종결자 상단의 사이에 b)는 전사종결자 하단에 aceA 유전자의 프로모터를 aceE 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입하여 aceE 유전자의 발현을 저해하는 것을 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은
1) 아세테이트 유도성 프로모터를 염색체 내 목적 유전자의 종결코돈 하단에 도입시켜 형질전환된, L-아미노산 생산능을 가진 재조합 코리네형 미생물을 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양 단계에서 아세테이트를 첨가함으로써 배양 중 상기 목적 유전자의 발현을 약화시켜, 상기 재조합 코리네형 미생물의 L-아미노산 생산능을 강화하는 단계;
를 포함하는 L-아미노산 생산방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 용어 "아세테이트 유도성 프로모터(acetate-inducible promoter)"는 아세테이트가 존재하는 조건 하에서 발현유도활성을 가지는 프로모터를 말한다.
코리네형 미생물에서 아세테이트는 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ackA)와 포스포트란스아세틸라아제(phosphotransacetylase, pta)에 의해 또는 숙시닐-코에이:아세테이트 코에이-트랜스퍼라제(succinyl-CoA:acetate CoA-transferase, actA)에 의해 아세틸 코에이(acetyl CoA)로 전환된 후, 글리옥실산 회로의 이소시트레이트 리아제(isocitrate lyase, aceA)의 작용을 거쳐 대사된다. 대장균에서는 아세틸 코에이 신세타제(acetyl-CoA synthetase, acs)에 의해 아세테이트가 아세틸 코에이로 전환된다(Gerstmeir et al., J Biotechnol, 104, 99-122, 2003). 아세테이트 대사에 관여하는 위의 유전자들은 아세테이트가 존재하는 조건에서 발현이 유도된다. 따라서, 이들 유전자의 프로모터를 사용할 경우 아세테이트가 존재하는 조건에서 특이적으로 유전자의 발현을 유도할 수 있다.
이에, 아세테이트 유도성 프로모터로 이소시트레이트 리아제(isocitrate lyase)를 코딩하는 유전자(aceA)의 프로모터 또는 아세테이트 키나아제(acetate kinase)를 코딩하는 유전자(ackA)와 포스포트란스아세틸라아제(phosphotransacetylase)를 코딩하는 유전자(pta) 오페론의 프로모터, 즉 pta 유전자의 상단 프로모터를 들 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 기술된 아세테이트 유도성 프로모터 중 aceA 유전자의 프로모터는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지며, aceA 유전자 상단 486개의 염기쌍(base pairs)과 오픈리딩프레임(open reading frame, ORF)의 N-말단으로부터 36개의 염기쌍을 포함한다.
또 다른 아세테이트 유도성 프로모터인 pta 유전자의 상단 프로모터는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지며, pta 유전자 상단의 340개 염기쌍을 포함한다.
또한, 아세테이트에 의해 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있다면 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다. 그 예로, 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함하거나 또는 상기 서열번호 1 또는 2의 염기서열의 보존서열을 포함하고, 하나 이상의 위치에서의 1개 또는 다수개(단백질의 아미노산 잔기의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개)의 염기가 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위된 염기서열을 포함할 수 있는데, 상기 유도성 프로모터의 기능을 유지 또는 강화시킬 수 있는 한, 서열번호 1 또는 2의 염기서열에 대하여, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있고, 상기 염기의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등에는 상기 유도성 프로모터 기능을 유지하는 한 천연적으로 생기는 돌연변이 서열 또는 인위적인 변이 서열까지도 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "상동성"이란, 서로 다른 두 염기서열 사이의 동일성을 의미하는데, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0를 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서, 달리 언급하지 않는 한, 상기 용어 "상단(upstream)"은 5' 방향을 말하며, 상기 용어 "하단(downstream)"은 3' 방향을 말한다.
본 발명에서, 염색체 내 목적 유전자는 각종 탄소원으로부터 쓰레오닌(Threonine), 메치오닌(Methionine), 이소루신(isoleucine) 및 라이신(lysine) 등의 아미노산류 생합성 과정에 관련된 유전자이며, 특히 생합성 경로에서 분지점에 위치하는 유전자가 될 수 있다.
예를 들어, 라이신에서는 피루베이트를 아세틸 코에이(acetyl CoA)로 전환하는데 관련된 피루베이트 디하이드로게나제 서브유닛 E1(pyruvate dehydrogenase subunit E1, aceE) 유전자, 아스파테이트로부터 호모세린(homoserin)을 생성하는 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase, hom) 유전자, 그리고 라이신의 전구체인 메조-2,6-디아미노피머레이트(meso-2,6-Diaminopimelate)를 이용하여 균체 합성에 이용하는 유디피-엔-아세틸무라모일알라닐-디-글루타메이트-2,6-디아미노피머레이트 리가제(UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamate-2,6-diaminopimelate ligase, murE) 유전자 등이 생합성 경로의 분지점에 위치한다.
또한, 쓰레오닌에서는 아스파테이트로부터 라이신 생성에 관여하는 디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase, dapA) 유전자, 메치오닌은 호모세린으로부터 쓰레오닌 생성에 관여하는 호모세린 키나아제(homoserine kinase, thrB) 유전자가 분지점이다. 피루베이트 유래 아미노산인 알라닌(Alanine), 발린(Valine)의 경우 피루베이트를 아세틸 코에이(acetyl CoA)로 전환하는데 관련된 피루베이트 디하이드로게나제 서브유닛 E1(pyruvate dehydrogenase subunit E1, aceE) 유전자가 분지점에 위치한다.
이에 목적 유전자의 구체적인 예로 피루베이트 디하이드로게나아제 서브유닛 E1을 코딩하는 유전자(aceE), 호모세린 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(hom), 유디피-엔-아세틸무라모일알라닐-디-글루타메이트-2,6-디아미노피머레이트 리가아제를 코딩하는 유전자(murE) 또는 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자(dapA)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 피루베이트 디하이드로게나제 서브유닛 E1(pyruvate dehydrogenase subunit E1, aceE)은 해당과정의 최종 대사물인 피루베이트를 TCA 회로(tricarboxylic acid cycle)로 유입시키는데 관여하는 PDHC(pyruvate dehydrogenase complex)의 구성 단백질 중 하나이다. 따라서, aceE 유전자의 발현량을 약화시킴으로써 TCA 회로로의 탄소원 유입을 약화시키고 라이신 생합성 쪽으로 탄소원의 유입을 늘려 라이신 생산을 증가시킬 수 있다.
호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase, hom)는 아스파테이트 세미알데히드(aspartate semialdehyde)로부터 호모세린 (homoserine)을 합성하는 효소이다. 아스파테이트 세미알데히드는 라이신 생합성 경로의 중간 전구체들 중 하나이므로, hom 유전자의 활성을 약화시킴으로써 호모세린 합성경로로의 탄소원 유입을 약화시키고 라이신 생합성 쪽으로 탄소원 유입을 늘려 라이신 생산을 증가시킬 수 있다.
유디피-엔-아세틸무라모일알라닐-디-글루타메이트-2,6-디아미노피머레이트 리가제(UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamate-2,6-diaminopimelate ligase, murE)는 균체 합성에 관여하는 효소로써 메조-2,6-디아미노피머레이트(meso-2,6-Diaminopimelate)를 균체 합성을 위해 사용한다. 메조-2,6-디아미노피머레이트는 또한 라이신 생합성의 전구체로 사용됨으로 murE 유전자의 활성을 약화시킴으로 균체 합성으로의 탄소원 유입을 약화시키고 라이신 생합성 경로로의 탄소원 유입을 늘려 라이신 생산을 증가시킬 수 있다.
디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase, dapA)는 아스파테이트 세미알데히드(aspartate semialdehyde)를 이용해 라이신 생성에 관여하는 효소이다. 아스파테이트 세미알데히드는 쓰레오닌 생합성 경로의 중간 전구체들 중 하나이므로 dapA 유전자의 활성을 약화시킴으로써 라이신 합성경로로의 탄소원 유입을 약화시키고 쓰레오닌 생합성 쪽으로 탄소원 유입을 늘려 쓰레오닌 생산을 증가시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 용어 "종결코돈(stop codon)"은 mRNA 상의 코돈 중 아미노산을 지정하지 않고 단백질 합성 과정이 끝났음을 알리는 신호로 작용하는 코돈으로, 일반적으로 UAA, UAG, UGA의 3가지가　종결코돈으로 사용된다.
본 발명에서, 상기 용어 "전사종결자(transcription terminator)"는 GC 염기가 많이 존재하는 역반복 서열(inverted repeat sequence)을 말하며, 헤어핀 루프(hairpin loop)를 형성함으로써 유전자의 전사를 종결시킨다.
본 발명에서는 상기 기술된 바와 같이 목적 유전자의 발현을 약화시키기 위한 목적으로 아세테이트 유도성 프로모터를 목적 유전자의 종결코돈 하단, 바람직하게는 종결코돈과 전사종결자 상단 사이에 도입시킬 수 있다. 아세테이트 유도성 프로모터를 사용함으로써 목표 유전자의 발현을 약화시킬 수 있는 시점에 아세테이트를 사용하여 목적 유전자가 역방향으로 전사되게 하여 RNA 폴리머라아제 복합체(RNA polymerase complex)가 전사과정 중 충돌을 일으키게 하여 목표 유전자 발현을 약화시키는 것이다.
상기 목표 유전자의 발현을 약화시킬 수 있는 시점은 배양 시기 중 어느 때나 가능하며, 보다 구체적으로는 배양 전 또는 배양 중일 수 있다.
본 발명에서, 상기 용어 "형질전환"은 목적 단백질을 암호화하는 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다.
본 발명에서 이용하는 L-아미노산 생산능을 가진 코리네형 미생물은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 아쓰로박터 속(Arthrobacter sp.) 및 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.)의 미생물을 포함하는 개념이다. 이러한 코리네형 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum) 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰이지만, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
더욱 구체적으로, 본 발명에서 코리네형 미생물로서 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주(구 기탁번호 KFCC10881, 한국 등록특허 0159812호 참고), 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P 균주(한국 등록특허 0924065호 참고), 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P 균주(구 기탁번호 KFCC10750, 한국 등록특허 1994-0001307 참고)를 사용하였다.
또한, 본 발명에서 코리네형 미생물로서 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P 균주를 사용하였으며, 이는 바인더(Binder) 등의 보고에 따라 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주(ATCC13032)를 모균주로 하여 라이신 생산 효율에 관련된 유전자 3종 (pyc(P458S), hom(V59A), lysC(T311I))에 대해 변이를 도입함으로써 라이신 생산능을 갖게 된 균주이다(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40).
또 다른 코리네형 미생물로서 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11222P 균주를 사용하였으며, 이는 L-쓰레오닌 생산 균주이다(한국 등록특허 20131126호 참조)2011-0127955).
본 발명의 일 구현에서, 본원발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 프로모터가 도입된 코리네형 미생물은 모두 모균주에 비하여 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능이 증가하였다.
본 발명의 방법에 있어서, 코리네형 미생물의 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법이 사용될 수 있다.
코리네형 균주의 배양을 위하여 사용될 수 있는 배지로는 예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)에 개시된 배지가 있다.
배지 중에서 사용될 수 있는 당원으로는 포도당, 사카로즈, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨을 함유하는 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
상기 미생물의 배양 중 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이다. 배양 시간은 원하는 L-아미노산의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으나, 바람직하게는, 10 내지 160 시간이다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양은 배치 공정, 주입 배치 및 반복 주입 배치 공정과 같은 연속식 또는 회분식으로 이루어질 수 있다. 이러한 배양 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 임의의 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 용어 "배양 단계"는 배지 조제 시기 및 배양 중 시기 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 L-아미노산은 추가로 정제 또는 회수하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 정제 또는 회수 방법은 본 발명의 미생물의 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-아미노산을 정제 또는 회수할 수 있다.
본 발명에서 상기 배양 단계에서 생산된 L-아미노산은 쓰레오닌, 메치오닌, 이소루신, 라이신, 발린 또는 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것 중 하나일 수 있으며, 바람직하게는 라이신 또는 쓰레오닌이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1 : 아세테이트 유도성 프로모터의 선정
이소시트레이트 리아제(isocitrate lyase, aceA)는 글리옥실산회로(glyoxylate cycle)의 주요 효소로써, 그 유전자는 아세테이트가 존재하는 조건에서 발현이 된다. 또한, 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ackA)와 포스포트란스아세틸라아제(phosphotransacetylase, pta) 역시 아세테이트 대사과정에 관여하는 효소로써 오페론을 이루고 있고, 아세테이트가 존재하는 조건에서 발현이 강화된다. 상기와 같은 aceA 유전자와 pta-ackA 오페론의 프로모터 부위는 이미 공지되어 있다(Gerstmeir et al., J Biotechnol, 104, 99-122, 2003).
본 실시예에서는 아세테이트가 존재하는 조건 하에서 목표 유전자의 전사를 저해할 목적으로 이용하기 위하여 aceA 유전자의 프로모터 및 pta-ack 오페론의 프로모터, 즉 pta 유전자의 상단 프로모터 부위를 선정하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)에 등록된 aceA 유전자(NCBI 등록번호 NCgl2248)의 염기서열을 근거로 하여 aceA 유전자 상단 486개의 염기쌍(base pair)과 오픈리딩프레임(open reading frame, ORF)의 N-말단으로부터 36개의 염기쌍을 포함하는 염기서열(서열번호 1)을 확보하였다. 또한 미국 국립 보건원의 유전자은행에 등록된 pta 유전자(NCBI 등록번호 NCgl2657)의 염기서열을 근거로 하여 pta 유전자 상단 340개의 염기쌍을 포함하는 염기서열(서열번호 2)을 확보하였다.
실시예 2 : aceE 유전자 발현 저해용 벡터 제작
피루베이트 디하이드로게나제 서브유닛 E1(pyruvate dehydrogenase subunit E1, aceE)은 해당과정의 최종 대사물인 피루베이트를 TCA 회로(tricarboxylic acid cycle)로 유입시키는데 관여하는 PDHC(pyruvate dehydrogenase complex)의 구성 단백질 중 하나이다. 따라서, aceE 유전자의 발현량을 약화시킴으로써 TCA 회로로의 탄소원 유입을 약화시키고 라이신 생합성 쪽으로 탄소원의 유입을 늘려 라이신 생산을 증가시킬 수 있다(Blombach B et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2007 Sep;76(3):615-23).
aceE 유전자 하단에 aceA 유전자 프로모터를 aceE 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입하여 아세테이트가 존재하는 조건 하에서 선택적으로 aceE 유전자의 발현을 저해하도록 하였다(도 2).
먼저 CLC 메인 워크벤치 소프트웨어(CLC main workbench software; CLC bio, Denmark)를 사용해 aceE 유전자의 전사종결자(transcription terminator)를 예측하였다. 전사종결자는 GC 염기가 많이 존재하는 역반복(inverted repeat)서열로써, 이 부위에서 헤어핀 루프(hairpin loop)를 형성하여 유전자의 전사를 종결시킨다. aceE 유전자의 전사종결자를 예측한 결과, aceE 유전자의 종결코돈(stop codon)으로부터 하단으로 21번째 염기부터 56번째 염기까지 36개 염기쌍(base pair)이 헤어핀 루프(hairpin loop) 구조를 이루어 전사종결자로 예측되었다. 이를 바탕으로 본 실시예에서는 aceE 유전자 전사종결자 상단 또는 하단에 aceA 유전자 프로모터를 aceE 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입할 수 있는 벡터 2종을 제작하였다.
<2-1> aceE 유전자 발현 저해용 pDZ - aceE1 - PaceA 벡터 제작
aceE 유전자 종결코돈의 하단, 즉 종결코돈과 전사종결자 상단 사이에 aceA 유전자 프로모터를 삽입하기 위한 벡터를 제작하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 aceE 유전자 단편을 확보하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 단편의 5' 말단에 제한효소 XbaI 인식부위와 3' 말단에 제한효소 SpeI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 3 및 4)를 합성하였다. 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 aceE 유전자 개시코돈(start codon)에서 2474번째 염기로부터 종결코돈인 2769번째 염기까지 296 bp를 포함하는 DNA 단편을 얻었다. 또한 단편의 5’말단에 제한효소 SpeI 인식부위와 3’말단에 제한효소 XbaI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 5 및 6)를 합성하고 PCR을 통하여 aceE 유전자 종결코돈 하단 300 bp를 포함하는 DNA 단편을 확보하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합 72℃, 30초를 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
상기 2개의 PCR 증폭 산물과 미리 제한효소 XbaI으로 절단하여 준비한 염색체 도입용 pDZ 벡터(한국 등록특허 0924065호 참고)를 In-fusion Cloning Kit(TAKARA, JP)를 이용, 클로닝하여 pDZ-aceE1 벡터를 제작하였다.
서열번호 3: aceE-P1F 5’- ccggggatcctctagacctccggcccatacgttgc -3’
서열번호 4: aceE-P1R 5’- ttgagactagttattcctcaggagcgtttg -3’
서열번호 5: aceE-P2F 5’- gaataactagtctcaagggacagataaatc -3’
서열번호 6: aceE-P2R 5’- gcaggtcgactctagagaccgaaaagatcgtggcag -3’
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 aceA 유전자의 프로모터 단편을 확보하기 위해 단편의 5’말단 및 3’말단에 각각 Spe I 제한효소 부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 7 및 8)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 서열번호 1의 염기서열을 가지는 약 500 bp의 프로모터 부위를 증폭하였다. 상기의 PCR 증폭 산물과 pDZ-aceE1 벡터를 제한효소 SpeI으로 처리하여 얻은 DNA 절편을 In-fusion Cloning Kit(TAKARA, JP)를 이용, 클로닝하여 pDZ-aceE1-PaceA 벡터를 제작하였다.
서열번호 7: PaceA-P3F 5’- gtcccttgagactagtagcactctgactacctctg -3’
서열번호 8: PaceA-P3R 5’- ctgaggaataactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
<2-2> aceE 유전자 발현 저해용 pDZ - aceE2 - PaceA 벡터 제작
aceE 유전자 전사종결자 하단에 aceA 유전자 프로모터를 삽입하기 위한 벡터를 제작하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 aceE 유전자 단편을 확보하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 단편의 5’말단에 제한효소 XbaI 인식부위와 3’말단에 제한효소 SpeI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 9 및 10)를 사용하였다. 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 aceE 유전자 개시코돈에서 2538번째 염기로부터 종결코돈 하단 62번째 염기까지 294 bp를 포함하는 DNA 단편을 얻었다. 또한, 단편의 5’말단에 제한효소 SpeI 인식부위와 3’말단에 제한효소 XbaI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 11 및 12)를 사용하고 PCR을 통하여 aceE 유전자 종결코돈 하단 69번째 염기로부터 362번째 염기까지 294 bp를 포함하는 DNA 단편을 확보하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합 72℃, 30초를 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
상기 2개의 PCR 증폭 산물과 미리 제한효소 XbaI으로 절단하여 준비한 염색체 도입용 pDZ 벡터를 In-fusion Cloning Kit(TAKARA, JP)를 이용, 클로닝하여 pDZ-aceE2 벡터를 제작하였다.
서열번호 9: aceE-P4F 5’- ccggggatcctctagaggtcccaggcgactacacc -3’
서열번호 10: aceE-P4R 5’- gagctactagtacgacgaatcccgccgccagacta -3’
서열번호 11: aceE-P5F 5’- gtcgtactagtagctctttttagccgaggaacgcc -3’
서열번호 12: aceE-P5R 5’- gcaggtcgactctagacatgctgttggatgagcac -3’
코리네박테리움 글루타미쿰 유래 aceA 유전자의 프로모터 단편을 확보하기 위해 단편의 5’말단 및 3’말단에 각각 제한효소 SpeI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 13 및 14)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 서열번호 1의 염기서열을 가지는 약 500 bp의 프로모터 부위를 증폭하였다. 상기의 PCR 증폭 산물과 pDZ-aceE2 벡터를 제한효소 SpeI으로 처리하여 얻은 DNA절편을 In-fusion Cloning Kit(TAKARA, JP)를 이용, 클로닝하여 pDZ-aceE2-PaceA 벡터를 제작하였다.
서열번호 13: PaceA-P6F 5’- aaaaagagctactagtagcactctgactacctctg -3’
서열번호 14: PaceA-P6R 5’- gattcgtcgtactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
실시예 3 : aceE 유전자 하단 aceA 유전자 프로모터 삽입주의 제작
상기 실시예 2에서 제조한 벡터 pDZ-aceE1-PaceA와 pDZ-aceE2-PaceA를 각각 전기펄스법을 이용하여 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 형질전환시키고(Appl. Microbiol.Biotechnol.(1999) 52:541-545에 의한 형질전환법 이용), 염색체 상의 aceE 유전자 종결코돈 하단에 aceA 유전자 프로모터가 aceE 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입된 균주를 PCR을 통해 분리함으로써 L-라이신을 생산하는 균주를 획득하였으며, 이를 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P::aceE1-PaceA와 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P::aceE2-PaceA로 명명하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P::aceE1-PaceA은 Corynebacterium glutamicum CA01-2271의 이름으로 한국미생물보존센터에 2013년 6월 12일 기탁번호 KCCM11432P로 국제기탁하였다. 제작된 균주는 KCCM11016P::aceE1-PaceA의 경우 서열번호 3과 서열번호 6, KCCM11016P::aceE2-PaceA의 경우 서열번호 9와 서열번호 12를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행함으로써, 목적 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.
실시예 4: aceE 유전자 하단 aceA 유전자 프로모터 삽입주의 라이신 생산능 비교
모균주로 이용한 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주 및 실시예 3에서 제작된 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P::aceE1-PaceA와 KCCM11016P::aceE2-PaceA를 L-라이신 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 종 배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 KCCM11016P와 KCCM11016P::aceE1-PaceA, KCCM11016P::aceE2-PaceA를 접종하고 30 ℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 72 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
< 종배지 ( pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
< 생산배지 ( pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 아세테이트(acetate)를 첨가하지 않았을 경우, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P와 KCCM11016P::aceE1-PaceA, KCCM11016P::aceE2-PaceA에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래 표 1과 같았다.
L-라이신 생산량 변화 (아세테이트 무첨가)
균주 라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 43.5 43.1 43.4
KCCM11016P::
aceE1-PaceA		 43.7 43.2 43.6
KCCM11016P::
aceE2-PaceA		 43.3 43.4 43.7
또한, 생산 배지에 아세테이트 5g/L를 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 균주를 배양하여 L-라이신 생산능을 비교하였다. 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래 표 2와 같았다.
L-라이신 생산량 변화 (아세테이트 5g/L 첨가)
균주 라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 45.6 45.3 45.8
KCCM11016P::
aceE1-PaceA		 47.2 47.1 47.4
KCCM11016P::
aceE2-PaceA		 46.7 46.5 47.0
상기의 표 1에 나타낸 바와 같이, 아세테이트가 존재하지 않는 조건에서 KCCM11016P::aceE1-PaceA, KCCM11016P::aceE2-PaceA 균주는 모균주 KCCM11016P와 라이신 생산능에 변화가 없음을 확인하였다.
그러나, 상기의 표 2의 결과에서 나타난 바와 같이, 아세테이트가 존재하는 조건에서는 KCCM11016P::aceE1-PaceA 균주의 경우, 모균주 KCCM11016P에 비하여 라이신 생산능이 3.6% 이상, KCCM11016P::aceE2-PaceA 균주의 경우는 모균주 KCCM11016P에 비하여 라이신 생산능이 2.5% 이상 증가되었음을 확인할 수 있었다.
그리고, KCCM11016P::aceE1-PaceA와 KCCM11016P::aceE2-PaceA를 비교하면 aceE 유전자 전사종결자 상단 쪽, 즉 종결코돈과 전사종결자 상단 사이에 aceA 프로모터를 삽입한 KCCM11016P::aceE1-PaceA의 경우가 라이신 생산에 더 효과적임을 볼 때 삽입부위로 유전자 종결코돈의 하단, 즉 종결코돈과 전사종결자 상단 사이를 이용하는 것이 유전자 발현을 더 효과적으로 저해할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 5 : aceE 유전자 발현 저해용 pDZ - aceE - Ppta 벡터 제작
아세테이트 키나아제(acetate kinase, ackA)와 포스포트란스아세틸라아제(phosphotransacetylase, pta)는 아세테이트 대사과정에 관여하는 효소로써 오페론을 이루고 있고, 이소시트레이트 리아제와 마찬가지로 아세테이트가 존재하는 조건에서 발현이 강화된다. 따라서, 이들 유전자의 프로모터를 사용할 경우 아세테이트가 존재하는 조건에서 특이적으로 유전자의 발현을 유도할 수 있다.
본 실시예에서는 아세테이트가 존재하는 조건 하에서 aceE 유전자의 발현을 저해할 목적으로, pta-ack 오페론의 프로모터, 즉 pta 유전자의 상단 프로모터 부위를 이용하기 위한 벡터를 제작하였다.
aceE 유전자의 발현을 저해하기 위해 aceE 유전자 종결코돈의 하단, 즉 종결코돈과 전사종결자 상단 사이에 pta 유전자 프로모터를 aceE 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입할 수 있는 벡터를 제작하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래 aceE 유전자 단편을 확보하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하여 실시예 2와 동일한 방법으로 pDZ-aceE1 벡터를 제작하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래 pta 유전자의 프로모터 단편을 확보하기 위해 단편의 5’말단 및 3’말단에 각각 제한효소 SpeI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 15 및 16)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 서열번호 2의 염기서열을 가지는 약 340 bp의 프로모터 부위를 증폭하였다. 상기의 PCR 증폭 산물과 pDZ-aceE1 벡터를 제한효소 SpeI으로 처리하여 얻은 DNA절편을 In-fusion Cloning Kit(TAKARA, JP)를 이용, 클로닝하여 pDZ-aceE1-Ppta 벡터를 제작하였다.
서열번호 15: Ppta-P7F 5’- gtcccttgagactagtctttgctggggtcagatttg -3’
서열번호 16: Ppta-P7R 5’- Ctgaggaataactagtacatcgcctttctaatttc -3’
실시예 6 : aceE 유전자 하단 pta 유전자 프로모터 삽입주의 제작 및 라이신 생산능 비교
상기 실시예 5에서 제조한 벡터 pDZ-aceE1-Ppta를 실시예 3과 동일한 방법으로 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 형질전환시키고, 염색체 상의 aceE 유전자 종결코돈 하단에 pta 유전자 프로모터가 aceE 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입된 균주를 PCR을 통해 분리함으로써 L-라이신을 생산하는 균주를 획득하고 KCCM11016P::aceE1-Ppta라 명명하였다. 제작균주 KCCM11016P::aceE1-Ppta는 서열번호 3과 서열번호 6을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행함으로써, 목적 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.
제작된 균주를 실시예 4와 동일한 방법으로 배양하고, 이로부터 회수된 L-라이신의 농도를 측정하였다. 아세테이트를 첨가하지 않았을 경우, 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래 표 3과 같았다.
L-라이신 생산량 변화 (아세테이트 무첨가)
균주 라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 42.9 43.5 43.4
KCCM11016P::
aceE1-Ppta		 43.2 43.3 43.6
또한, 생산 배지에 아세테이트 5g/L를 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 균주를 배양하여 L-라이신 생산능을 비교하였다. 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래 표 4와 같았다.
L-라이신 생산량 변화 (아세테이트 5g/L 첨가)
균주 라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 45.5 45.7 45.3
KCCM11016P::
aceE1-Ppta		 46.7 46.5 46.6
상기의 표 3에 나타낸 바와 같이, 아세테이트가 존재하지 않는 조건에서 KCCM11016P::aceE1-Ppta 균주는 모균주 KCCM11016P와 라이신 생산능에 변화가 없음을 확인하였다.
그러나, 상기의 표 4의 결과에서 나타난 바와 같이, 아세테이트가 존재하는 조건에서는 KCCM11016P::aceE1-Ppta 균주는 모균주 KCCM11016P에 비하여 라이신 생산능이 2.4% 이상 증가되었음을 확인할 수 있었다.
또한, KCCM11016P::aceE1-PaceA 균주가 KCCM11016P::aceE1-Ppta 균주보다 라이신 생산능이 더 좋은 것을 볼 때, 아세테이트가 존재하는 조건에서 aceA 유전자의 프로모터를 사용하는 것이 pta 유전자의 프로모터를 사용하는 것보다 목표 유전자 발현을 더 효과적으로 저해할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 7 : aceE 유전자 하단 aceA 유전자 프로모터 삽입주의 제작
상기 실시예 2에서 제조한 벡터 pDZ-aceE1-PaceA를 실시예 3과 동일한 방법으로 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10750, KCCM10770P 및 CJ3P 3종 균주에 형질전환시키고, 염색체 상의 aceE 유전자 종결코돈 하단에 aceA 유전자 프로모터가 aceE 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입된 균주를 PCR을 통해 분리함으로써 L-라이신을 생산하는 KFCC10750::aceE1-PaceA, KCCM10770P::aceE1-PaceA 및 CJ3P::aceE1-PaceA 3종 균주를 획득하였다. 제작된 균주는 서열번호 3과 서열번호 6을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행함으로써, 목적 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.
제작된 균주를 실시예 4와 동일한 방법으로 배양하고, 이로부터 회수된 L-라이신의 농도를 측정하였다. 아세테이트를 첨가하지 않았을 경우, 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래 표 5와 같았다.
L-라이신 생산량 변화 (아세테이트 무첨가)
균주 라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
KFCC10750 38.3 38.0 38.4
KFCC10750::aceE1-PaceA 38.6 38.2 38.3
KCCM10770P 47.5 47.3 47.6
KCCM10770P::aceE1-PaceA 47.3 47.7 47.5
CJ3P 8 8.4 8.3
CJ3P::aceE1-PaceA 8.2 8.1 8.5
또한, 생산 배지에 아세테이트 5g/L를 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 균주를 배양하여 L-라이신 생산능을 비교하였다. 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래 표 6과 같았다.
L-라이신 생산량 변화 (아세테이트 5g/L 첨가)
균주 라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
KFCC10750 39.3 39.5 39.2
KFCC10750::aceE1-PaceA 41.3 41.6 41.0
KCCM10770P 47.5 47.3 47.6
KCCM10770P::aceE1-PaceA 49.0 48.6 48.8
CJ3P 8 8.4 8.3
CJ3P::aceE1-PaceA 9.5 9.7 9.4
상기의 표 5에 나타낸 바와 같이, 아세테이트가 존재하지 않는 조건에서 KFCC10750::aceE1-PaceA, KCCM10770P::aceE1-PaceA 및 CJ3P::aceE1-PaceA 3종 균주는 모균주와 라이신 생산능에 변화가 없음을 확인하였다.
그러나, 상기의 표 6의 결과에서 나타난 바와 같이, 아세테이트가 존재하는 조건에서는 라이신 생산능이 KFCC10750::aceE1-PaceA 균주는 모균주 대비 5%, KCCM10770P::aceE1-PaceA 균주는 모균주 대비 2.8%, CJ3P::aceE1-PaceA 균주는 모균주 대비 15% 각각 증가되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 8 : hom 유전자 발현 저해용 벡터 제작
L-라이신 생합성 경로와 같은 기질을 사용하는 L-쓰레오닌 생합성 경로를 약화시켜 L-라이신 생산 능력을 증가시킬 수 있다. L-쓰레오닌 생합성 경로를 약화시키기 위해 아스파테이트로부터 호모세린(homoserin)을 생성하는 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase, hom) 유전자의 효소 활성을 감소시키는 방법을 들 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 hom 유전자는 thrB 유전자와 hom-thrB 오페론을 이루고 있고 전사종결자는 thrB 유전자 하단에 존재한다. 그리고 hom-thrB 오페론의 상단, 즉 hom 유전자 상단에 프로모터가 존재하고, 추가로 thrB 유전자 ORF 상단에도 두 번째 프로모터가 존재하는 것으로 보고되어 있다(Mateos et al., J Bacteriol, 176(23), 7362-7371, 1994). 따라서 hom 유전자 종결코돈 하단에 aceA 유전자 프로모터를 hom 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입하여 아세테이트가 존재하는 조건에서 선택적으로 hom 유전자의 발현을 저해하도록 하였고 thrB 유전자의 발현을 유지하기 위해 thrB 유전자 ORF 상단에 두 번째 프로모터 서열을 추가하였다.
본 실시예에서는 hom 유전자 종결코돈 하단과 thrB 유전자 상단 사이에 aceA 유전자 프로모터를 삽입하기 위한 재조합 벡터를 제작하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래 hom 유전자 단편을 확보하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 단편의 5’말단에 제한효소 XbaI 인식부위와 3’말단에 제한효소 SpeI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 17 및 18)를 합성하였다. 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 hom 유전자 개시코돈에서 1039번째 염기로부터 종결코돈인 1338번째 염기까지 300 bp를 포함하는 DNA 단편을 얻었다. hom 유전자 발현 저해를 위해 hom-thrB 오페론 사이에 aceA 프로모터가 삽입되더라도 thrB 유전자는 발현이 유지되어야 한다. 그래서 hom 유전자 종결코돈 하단 300 bp를 포함하는 DNA 단편 제작시 32 bp의 thrB 프로모터 서열을 DNA 단편의 5’쪽에 추가할 수 있도록 고안한 프라이머(서열번호 19 및 20)를 합성하였다. 이 프라이머(서열번호 19 및 20)를 가지고 PCR을 수행하여 단편의 5’말단에 제한효소 SpeI 인식부위와 3’말단에 제한효소 XbaI 인식부위를 가진 344 bp의 DNA 단편을 확보하였다. PCR은 실시예 2와 동일한 조건을 사용하여 진행하였다.
상기 2개의 PCR 증폭 산물과 미리 제한효소 XbaI으로 절단하여 준비한 염색체 도입용 pDZ 벡터를 In-fusion Cloning Kit(TAKARA, JP)를 이용, 클로닝하여 pDZ-hom 벡터를 제작하였다.
서열번호 17: hom-h1F 5’- ccggggatcctctagaccaggtgagtccacctacg -3’
서열번호 18: hom-h1R 5’- gaggcggatcactagtttagtccctttcgaggcgg -3’
서열번호 19: hom-h2F 5’- actagtgatccgcctcgaaagggac -3’
서열번호 20: hom-h2R 5’- gcaggtcgactctagagactgcggaatgttgttgtg -3’
코리네박테리움 글루타미쿰 유래 aceA 유전자의 프로모터 단편을 확보하기 위해 단편의 5’말단 및 3’말단에 각각 제한효소 SpeI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 21 및 22)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 서열번호 1의 염기서열을 가지는 약 500 bp의 프로모터 부위를 증폭하였다. 상기의 PCR 증폭 산물과 pDZ-hom 벡터를 제한효소 SpeI으로 처리하여 얻은 DNA절편을 In-fusion Cloning Kit(TAKARA, JP)를 이용, 클로닝하여 pDZ-hom-PaceA 벡터를 제작하였다.
서열번호 21: PaceA-h3F 5’- gaggcggatcactagtagcactctgactacctctg -3’
서열번호 22: PaceA-h3R 5’- aagggactaaactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
실시예 9 : hom 유전자 하단 aceA 유전자 프로모터 삽입주의 제작 및 라이신 생산능의 비교
상기 실시예 8에서 제조한 벡터 pDZ-hom-PaceA를 실시예 3과 동일한 방법으로 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 형질전환시키고, 염색체 상의 hom 유전자 종결코돈 하단에 aceA 유전자 프로모터가 hom 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입된 균주를 PCR을 통해 분리함으로써 L-라이신을 생산하는 KCCM11016P::hom-PaceA를 획득하였다. 제작균주 KCCM11016P::hom-PaceA는 서열번호 17과 서열번호 20을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행함으로써, 목적 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.
모균주로 이용한 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주와 제작된 KCCM11016P::hom-PaceA 균주를 L-라이신 생산을 위해 실시예 4와 동일한 방법으로 배양하고, 이로부터 회수된 L- 라이신의 농도를 측정하였다. 아세테이트를 첨가하지 않았을 경우, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P와 KCCM11016P::hom-PaceA에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래 표 7과 같았다.
L-라이신 생산량 변화 (아세테이트 무첨가)
균주 라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 43.2 43.3 43.6
KCCM11016P::
hom-PaceA		 43.3 43.6 43.4
또한, 생산 배지에 아세테이트 5g/L를 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 균주를 배양하여 L-라이신 생산능을 비교하였다. 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래 표 8과 같았다.
L-라이신 생산량 변화 (아세테이트 5g/L 첨가)
균주 라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 44.9 45.6 45.2
KCCM11016P::
hom-PaceA		 46.3 46.6 46.4
상기의 표 7에 나타낸 바와 같이, 아세테이트가 존재하지 않는 조건에서 KCCM11016P::hom-PaceA 균주는 모균주 KCCM11016P와 라이신 생산능에 변화가 없음을 확인하였다.
그러나 상기의 표 8의 결과에서 나타난 바와 같이, 아세테이트가 존재하는 조건에서 KCCM11016P::hom-PaceA 균주는 모균주 KCCM11016P에 비하여 라이신 생산능이 2.6% 이상 증가되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 10 : murE 유전자 발현 저해용 벡터 제작
유디피-엔-아세틸무라모일알라닐-디-글루타메이트-2,6-디아미노피머레이트 리가제(UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamate-2,6-diaminopimelate ligase, murE)는 라이신 생합성의 전구체로 사용되는 메조-2,6-디아미노피머레이트(meso-2,6-Diaminopimelate)를 이용하여 균체 합성에 이용하는데 murE 유전자의 활성을 약화시킴으로써 균체 합성으로의 탄소원 유입을 약화시키고 라이신 생합성 경로로 탄소원 유입을 늘려 라이신 생산을 증가시킬 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 murE 유전자(NCgl2083)는 NCgl2076부터 NCgl2082까지 7개 유전자와 함께 오페론을 이루고 있다. 오페론의 전사는 NCgl2083 murE 유전자로부터 시작해서 NCgl2076 유전자의 방향으로 진행된다. 따라서 전사종결자는 NCgl2076 유전자 하단에 존재한다. murE 유전자 종결코돈 하단에 aceA 유전자 프로모터를 murE 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입하여 아세테이트가 존재하는 조건에서 선택적으로 murE 유전자의 발현을 저해하도록 하였고 오페론의 처음에 위치하는 murE 유전자 이외 나머지 7개 유전자의 발현을 유지하기 위해 NCgl2082 유전자 ORF 상단에 murE 오페론의 프로모터를 추가로 삽입하였다.
본 실시예에서는 murE 유전자 종결코돈 하단에 aceA 유전자 프로모터를 삽입하기 위한 재조합 벡터를 제작하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래 murE 유전자 단편을 확보하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 단편의 5’말단에 제한효소 XbaI 인식부위와 3’말단에 제한효소 XhoI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 23 및 24)를 합성하였다. 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 murE 유전자 개시코돈에서 1267번째 염기로부터 종결코돈인 1566번째 염기까지 300 bp를 포함하는 DNA 단편을 얻었다. 또한 단편의 5’말단에 제한효소 XhoI 인식부위와 3’말단에 제한효소 XbaI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 25 및 26)를 합성하고 PCR을 통하여 murE 유전자 종결코돈 하단 10번째 염기로부터 292 bp를 포함하는 DNA 단편을 확보하였다. PCR은 실시예 2와 동일한 조건을 사용하여 진행하였다. 상기 2개의 PCR 증폭 산물과 미리 제한효소 XbaI으로 절단하여 준비한 염색체 도입용 pDZ 벡터를 In-fusion Cloning Kit(TAKARA, JP)를 이용, 클로닝하여 pDZ-murE 벡터를 제작하였다.
서열번호 23: mur-m1F 5’- ccggggatcctctagaaaccctcgttcagaggtgc -3’
서열번호 24: mur-m1R 5’- ttgtgatcatctcgagctatccttcttccgtagtaag -3’
서열번호 25: mur-m2F 5’- agctcgagatgatcacaatgacccttgg -3’
서열번호 26: mur-m2R 5’- gcaggtcgactctagacatgagcataaatgtcagc -3’
코리네박테리움 글루타미쿰 유래 aceA 유전자의 프로모터 단편을 확보하기 위해 단편의 5’말단에 제한효소 XhoI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 27 및 28)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 서열번호 1의 염기서열을 가지는 약 500 bp의 프로모터 부위를 증폭하였다. 또한 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 murE 오페론의 프로모터 부위를 확보하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 단편의 3’말단에 제한효소 XhoI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 29 및 30)를 합성하였다. 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 murE 유전자 ORF 상단 300 bp를 포함하는 DNA 단편을 얻었다. 상기 2개의 PCR 증폭 산물과 pDZ-murE 벡터를 제한효소 XhoI으로 처리하여 얻은 DNA절편을 In-fusion Cloning Kit(TAKARA, JP)를 이용, 클로닝하여 pDZ-murE-PaceA-PmurE 벡터를 제작하였다.
서열번호 27: mur-m3F 5’- tcatcagcagcactctgactacctctg -3’
서열번호 28: mur-m3R 5’- agaaggatagctcgagttcctgtgcggtacgtggc -3’
서열번호 29: mur-m4F 5’- agagtgctgctgatgatcctcgatttg -3’
서열번호 30: mur-m4R 5’- ttgtgatcatctcgagggttttctctcctccacagg -3’
실시예 11 : murE 유전자 하단 aceA 유전자 프로모터 삽입주의 제작 및 라이신 생산능의 비교
상기 실시예 10에서 제조한 벡터 pDZ-murE-PaceA-PmurE를 실시예 3과 동일한 방법으로 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 형질전환시키고, 염색체 상의 murE 유전자 종결코돈 하단에 aceA 유전자 프로모터가 murE 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입된 균주를 PCR을 통해 분리함으로써 L-라이신을 생산하는 KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE를 획득하였다. 제작균주 KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE는 서열번호 23과 서열번호 26을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행함으로써, 목적 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.
모균주로 이용한 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주와 제작된 KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE를 L-라이신 생산을 위해 실시예 4와 동일한 방법으로 배양하고, 이로부터 회수된 L-라이신의 농도를 측정하였다. 아세테이트를 첨가하지 않았을 경우, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P와 KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래 표 9와 같았다.
L-라이신 생산량 변화 (아세테이트 무첨가)
균주 라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 43.5 43.9 44.0
KCCM11016P::
murE-PaceA-PmurE		 43.7 44.1 43.8
또한, 생산 배지에 아세테이트 5g/L를 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 균주를 배양하여 L-라이신 생산능을 비교하였다. 배양액 중의 L-라이신 농도는 아래 표 10과 같았다.
L-라이신 생산량 변화 (아세테이트 5g/L 첨가)
균주 라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 45.2 45.6 45.3
KCCM11016P::
murE-PaceA-PmurE		 46.6 46.9 46.5
상기의 표 9에 나타낸 바와 같이, 아세테이트가 존재하지 않는 조건에서 KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE 균주는 모균주 KCCM11016P와 라이신 생산능에 변화가 없음을 확인하였다.
그러나, 상기의 표 10의 결과에서 나타난 바와 같이, 아세테이트가 존재하는 조건에서 KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE 균주는 모균주 KCCM11016P에 비하여 라이신 생산능이 2.8% 이상 증가되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 12 : dapA 유전자 발현 저해용 벡터 제작
L-쓰레오닌 생합성 경로와 같은 기질을 사용하는 L-라이신 생합성 경로를 약화 시켜 L-쓰레오닌 생산 능력을 증가시킬 수 있다. L-라이신 생합성 경로를 약화시키기 위해 아스파테이트로부터 라이신 생성에 관여하는 디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase, dapA) 유전자의 효소 활성을 감소시키는 방법을 들 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 dapA 유전자는 ORF4(NCgl1895) 유전자와 dapA-ORF4 오페론을 이루고 있고 따라서 전사종결자는 ORF4 유전자 하단에 존재한다. 그리고 dapA-ORF4 오페론의 상단, 즉 dapA 유전자 상단에 프로모터가 존재하고, 추가로 ORF4 유전자 상단에도 프로모터 서열이 존재하는 것으로 보고되어 있다(Patek et al., Biotechnology letters, Vol 19, No 11, 1997). 따라서 dapA 유전자 종결코돈 하단에 aceA 유전자 프로모터를 dapA 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입하여 아세테이트가 존재하는 조건에서 선택적으로 dapA 유전자의 발현을 저해하도록 하였고, ORF4 유전자의 발현을 유지하기 위해 ORF4 유전자 상단의 프로모터 부위 100 bp 서열을 ORF4 유전자 ORF 상단에 추가하였다.
본 실시예에서는 dapA 유전자 종결코돈 하단에 aceA 유전자 프로모터를 삽입하기 위한 재조합 벡터를 제작하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래 dapA 유전자 단편을 확보하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 단편의 5’말단에 제한효소 XbaI 인식부위와 3’말단에 제한효소 SpeI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 31 및 32)를 합성하였다. 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 dapA 유전자 개시코돈에서 606번째 염기로부터 종결코돈인 906번째 염기까지 301 bp를 포함하는 DNA 단편을 얻었다. 또한 단편의 5’말단에 제한효소 SpeI 인식부위와 3’말단에 제한효소 XbaI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 33 및 34)를 합성하고 PCR을 통하여, ORF4 유전자의 발현을 유지할 수 있도록 dapA 유전자 개시코돈에서 809번째 염기로부터 종결코돈 하단 2번째 염기까지 100 bp의 프로모터 서열을 추가로 포함하고, dapA 유전자 종결코돈 하단 213 bp를 포함하는 DNA 단편을 확보하였다. PCR은 실시예 2와 동일한 조건을 사용하여 진행하였다. 상기 2개의 PCR 증폭 산물과 미리 제한효소 XbaI으로 절단하여 준비한 염색체 도입용 pDZ 벡터를 In-fusion Cloning Kit(TAKARA, JP)를 이용, 클로닝하여 pDZ-dapA 벡터를 제작하였다.
서열번호 31: dapA-d1F 5’- ccggggatcctctagatgtttggcttgctttgggc -3’
서열번호 32: dapA-d1R 5’- gttgatgcactagtttatagaactccagcttt -3’
서열번호 33: dapA-d2F 5’- ttctataaactagtgcatcaacgtaggagatcc -3’
서열번호 34: dapA-d2R 5’- gcaggtcgactctagacgttctgggaaccctgag -3’
코리네박테리움 글루타미쿰 유래 aceA 유전자의 프로모터 단편을 확보하기 위해 단편의 5’말단 및 3’말단에 각각 제한효소 SpeI 인식부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 35 및 36)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 서열번호 1의 염기서열을 가지는 약 500 bp의 프로모터 부위를 증폭하였다. 상기의 PCR 증폭 산물과 pDZ-dapA 벡터를 제한효소 SpeI으로 처리하여 얻은 DNA절편을 In-fusion Cloning Kit(TAKARA, JP)를 이용, 클로닝하여 pDZ-dapA-PaceA 벡터를 제작하였다.
서열번호 35: PaceA-d3F 5’- acgttgatgcactagtagcactctgactacctctg -3’
서열번호 36: PaceA-d3R 5’- agttctataaactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
실시예 13 : dapA 유전자 하단 aceA 유전자 프로모터 삽입주의 제작 및 쓰레오닌 생산능의 비교
L-쓰레오닌 생산주에서 dapA 유전자 발현 저해 효과를 확인하기 위해 L-쓰레오닌 생산주인 KCCM11222P(한국 특허 공개번호 2013-0061570)에 상기 실시예 12에서 제조한 벡터 pDZ-dapA-PaceA를 실시예 3과 동일한 방법으로 형질전환시키고, 염색체 상의 dapA 유전자 하단에 aceA 유전자 프로모터가 dapA 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입된 균주를 PCR을 통해 분리함으로써 L-쓰레오닌을 생산하는 KCCM11222P::dapA-PaceA를 획득하였다. 제작균주 KCCM11222P::dapA-PaceA는 서열번호 31과 서열번호 34를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행함으로써, 목적 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.
모균주로 이용한 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11222P 균주와 제작된 KCCM11222P::dapA-PaceA 균주를 L-쓰레오닌 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 ·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 20 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 ·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
배양을 종료한 후, HPLC를 이용하여 배양액 중 L-쓰레오닌의 농도를 분석하였다. 아세테이트를 첨가하지 않았을 경우, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11222P와 KCCM11222P::dapA-PaceA에 대한 배양액 중의 L-쓰레오닌 농도는 아래 표 11과 같았다.
L-쓰레오닌 생산량 변화 (아세테이트 무첨가)
균주 쓰레오닌 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11222P 7.0 6.9 7.2
KCCM11222P::
dapA-PaceA		 7.1 7.3 7.0
또한, 생산 배지에 아세테이트 5g/L를 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 균주를 배양하여 L-쓰레오닌 생산능을 비교하였다. 배양액 중의 L-쓰레오닌 농도는 아래 표 12와 같았다.
L-쓰레오닌 생산량 변화 (아세테이트 5g/L 첨가)
균주 쓰레오닌 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11222P 7.6 7.4 7.7
KCCM11222P::
dapA-PaceA		 11.2 11.5 11.4
상기의 표 11에 나타낸 바와 같이, 아세테이트가 존재하지 않는 조건에서 KCCM11222P::dapA-PaceA 균주는 모균주 KCCM11222P와 쓰레오닌 생산능에 변화가 없음을 확인하였다.
그러나, 상기의 표 12의 결과에서 나타난 바와 같이, 아세테이트가 존재하는 조건에서는 KCCM11222P::dapA-PaceA 균주의 경우, 모균주 KCCM11222P에 비하여 쓰레오닌 생산능이 50% 이상 증가되었음을 확인할 수 있었다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11432P 20130612
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Method for producing L-amino acid <130> PN106397 <150> KR 2013/0121090 <151> 2013-10-11 <160> 36 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 522 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(486) <223> aceA <400> 1 agcactctga ctacctctgg aatctaggtg ccactcttct ttcgatttca acccttatcg 60 tgtttggcga tgtgatcaga ctaagtgatc accgtcacca gcaaaagggg tttgcgaact 120 ttactaagtc attacccccg cctaaccccg acttttatct aggtcacacc ttcgaaacct 180 acggaacgtt gcggtgcctg cattttccca tttcagagca tttgcccagt acatccgtac 240 tagcaactcc cccgcccact ttttctgcga agccagaact ttgcaaactt cacaacaggg 300 gtgaccaccc ccgcacaaaa cttaaaaacc caaaccgatt gacgcaccaa tgcccgatgg 360 agcaatgtgt gaaccacgcc accacgcaaa ccgatgcaca tcacgtcgaa acagtgacag 420 tgcattagct catactttgt ggtcggcacc gcccattgcg aatcagcact taaggaagtg 480 actttgatgt caaacgttgg aaagccacgt accgcacagg aa 522 <210> 2 <211> 340 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(340) <223> pta <400> 2 ctttgctggg gtcagatttg tcacgctgcg cgctttcata gaccccatta atggggggtg 60 aagagctgta aagtaccgct aaaaactttg caaagggtgc ttcgcaactt gtaaccgctc 120 cgtattgttt tctacggcaa taagcatttg tgctgctcaa agcgtggaat tgagatcggt 180 ttgaaaatta caaaataaaa ctttgcaaac cgggctgtac gcaaggcgga cgaacgctaa 240 actatgtaag aaatcacaac ctcccctcat tagtgccagg aggcacaagc ctgaagtgtc 300 atcaatgaga aggttcaggc tgaaattaga aaggcgatgt 340 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceE P1F <400> 3 ccggggatcc tctagacctc cggcccatac gttgc 35 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceE P1R <400> 4 ttgagactag ttattcctca ggagcgtttg 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceE P2F <400> 5 gaataactag tctcaaggga cagataaatc 30 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceE P2R <400> 6 gcaggtcgac tctagagacc gaaaagatcg tggcag 36 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PaceA P3F <400> 7 gtcccttgag actagtagca ctctgactac ctctg 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PaceA P3R <400> 8 ctgaggaata actagtttcc tgtgcggtac gtggc 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceE P4F <400> 9 ccggggatcc tctagaggtc ccaggcgact acacc 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceE P4R <400> 10 gagctactag tacgacgaat cccgccgcca gacta 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceE P5F <400> 11 gtcgtactag tagctctttt tagccgagga acgcc 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceE P5R <400> 12 gcaggtcgac tctagacatg ctgttggatg agcac 35 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PaceA P6F <400> 13 aaaaagagct actagtagca ctctgactac ctctg 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PaceA P6R <400> 14 gattcgtcgt actagtttcc tgtgcggtac gtggc 35 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppta P7F <400> 15 gtcccttgag actagtcttt gctggggtca gatttg 36 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppta P7R <400> 16 ctgaggaata actagtacat cgcctttcta atttc 35 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hom h1F <400> 17 ccggggatcc tctagaccag gtgagtccac ctacg 35 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hom h1R <400> 18 gaggcggatc actagtttag tccctttcga ggcgg 35 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hom h2F <400> 19 actagtgatc cgcctcgaaa gggac 25 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hom h2R <400> 20 gcaggtcgac tctagagact gcggaatgtt gttgtg 36 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PaceA h3F <400> 21 gaggcggatc actagtagca ctctgactac ctctg 35 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PaceA h3R <400> 22 aagggactaa actagtttcc tgtgcggtac gtggc 35 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mur m1F <400> 23 ccggggatcc tctagaaacc ctcgttcaga ggtgc 35 <210> 24 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mur m1R <400> 24 ttgtgatcat ctcgagctat ccttcttccg tagtaag 37 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mur m2F <400> 25 agctcgagat gatcacaatg acccttgg 28 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mur m2R <400> 26 gcaggtcgac tctagacatg agcataaatg tcagc 35 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mur m3F <400> 27 tcatcagcag cactctgact acctctg 27 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mur m3R <400> 28 agaaggatag ctcgagttcc tgtgcggtac gtggc 35 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mur m4F <400> 29 agagtgctgc tgatgatcct cgatttg 27 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mur m4R <400> 30 ttgtgatcat ctcgagggtt ttctctcctc cacagg 36 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dapA d1F <400> 31 ccggggatcc tctagatgtt tggcttgctt tgggc 35 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dapA d1R <400> 32 gttgatgcac tagtttatag aactccagct tt 32 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dapA d2F <400> 33 ttctataaac tagtgcatca acgtaggaga tcc 33 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dapA d2R <400> 34 gcaggtcgac tctagacgtt ctgggaaccc tgag 34 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PaceA d3F <400> 35 acgttgatgc actagtagca ctctgactac ctctg 35 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PaceA d3R <400> 36 agttctataa actagtttcc tgtgcggtac gtggc 35

Claims (7)

1) 아세테이트 유도성 프로모터를, 염색체 내 목적 유전자의 종결코돈 하단에 도입시켜 형질전환된, L-아미노산 생산능을 가진 재조합 코리네형 미생물을 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양 단계에서 아세테이트를 첨가함으로써 배양 중 상기 목적 유전자의 발현을 약화시켜, 상기 재조합 코리네형 미생물의 L-아미노산 생산능을 강화하는 단계;
를 포함하는 L-아미노산의 생산방법으로서, 상기 종결코돈 하단은 상기 아세테이트 유도성 프로모터가 목적 유전자 전사 방향의 역방향으로 작동하여 목적 유전자 발현이 약화될 수 있도록 하는 위치인 것인 L-아미노산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 종결코돈 하단은 상기 목적 유전자의 종결코돈과 전사종결자 상단의 사이인 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 아세테이트 유도성 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 목적 유전자는 피루베이트 디하이드로게나아제 서브유닛 E1를 코딩하는 유전자, 호모세린 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 유디피-엔-아세틸무라모일알라닐-디-글루타메이트-2,6-디아미노피머레이트 리가아제를 코딩하는 유전자로 이루어지는 군으부터 하나 이상의 유전자가 선택되는 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 생산방법.
제4항에 있어서,
상기 L-아미노산은 L-라이신인 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 목적 유전자는 디하이드로디피콜리네이트 신타아제를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 생산방법.
제6항에 있어서,
상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌인 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 생산방법.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101518860B1 (ko) * 2013-10-11 2015-05-12 씨제이제일제당 (주) L-아미노산의 생산 방법
CN105734004B (zh) * 2016-03-02 2020-06-19 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其制备方法、应用
KR101925930B1 (ko) * 2017-07-24 2019-02-26 씨제이제일제당 주식회사 Ｌ-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
JP7018128B2 (ja) 2018-03-09 2022-02-09 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション 新規なプロモーター及びこれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法
KR102221040B1 (ko) * 2019-05-09 2021-03-03 씨제이제일제당 주식회사 L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산을 생산하는 방법
KR102134418B1 (ko) * 2019-06-17 2020-07-16 씨제이제일제당 주식회사 L-타이로신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-타이로신 생산 방법
KR102207867B1 (ko) * 2020-01-21 2021-01-26 씨제이제일제당 주식회사 Nadp 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 미생물을 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005006564A (ja) 2003-06-19 2005-01-13 Japan Tobacco Inc 硝酸イオン誘導性プロモーター
KR101335853B1 (ko) 2011-12-01 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6649379B1 (en) * 1987-06-12 2003-11-18 Massachusetts Institute Of Technology Method and deregulated enzyme for threonine production
JP3036912B2 (ja) * 1991-09-02 2000-04-24 協和醗酵工業株式会社 遺伝子発現調節ｄｎａ
CN1117152C (zh) * 1994-03-04 2003-08-06 味之素株式会社 生产l－赖氨酸的方法
AU705550B2 (en) * 1995-06-07 1999-05-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine
EP1029919B1 (de) * 1999-02-20 2004-03-31 Degussa AG Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
JP4306169B2 (ja) * 1999-12-24 2009-07-29 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法及び新規遺伝子
AU2002230431A1 (en) * 2000-11-15 2002-05-27 Archer-Daniels-Midland Company Corynebacterium glutamicum promoters
KR100397423B1 (ko) * 2001-02-13 2003-09-13 씨제이 주식회사 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
DE10224088A1 (de) * 2002-05-31 2003-12-11 Degussa Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien die ein abgeschwächtes mez-Gen enthalten
JP2004261150A (ja) * 2003-03-04 2004-09-24 Ajinomoto Co Inc 目的物質の製造法
JP2010226956A (ja) * 2007-07-23 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
KR101518860B1 (ko) * 2013-10-11 2015-05-12 씨제이제일제당 (주) L-아미노산의 생산 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005006564A (ja) 2003-06-19 2005-01-13 Japan Tobacco Inc 硝酸イオン誘導性プロモーター
KR101335853B1 (ko) 2011-12-01 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법

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