ES2626048T3 - Procedimiento de producción de L-aminoácidos - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de producción de L-aminoácidos, comprendiendo el procedimiento 1) cultivar un microorganismo corineforme recombinante capaz de producir L-aminoácidos, en el que el microorganismo corineforme recombinante tiene un promotor inducible por acetato cadena abajo de un codon de terminación de un gen diana en un cromosoma; y 2) añadir acetato durante el cultivo para debilitar la expresión del gen diana, y para intensificar la capacidad de producción de L-aminoácidos del microorganismo corineforme recombinante, en el que el promotor inducible por acetato está en una dirección opuesta a la transcripción del gen diana.

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de producción de L-aminoácidos
Antecedentes
1. Campo
5 Una o más realizaciones de la presente invención se refieren a un procedimiento de producción de L-aminoácidos utilizando un procedimiento de inhibición de transcripción de genes.
2. Descripción de la técnica relacionada
El piruvato, que se produce mediante glucólisis de diversas fuentes de carbono en microorganismos corineformes, se transforma en aspartato vía oxaloacetato. El aspartato se transforma en aminoácidos tales como treonina,
10 metionina, isoleucina y lisina a través de diversas rutas biosintéticas (FIG. 1). Por lo tanto, la expresión de genes, localizados en cada punto de ramificación en los procesos biosintéticos de aminoácidos, puede inhibirse para disminuir la producción de subproductos y aumentar la producción de aminoácidos diana.
Como se ha descrito anteriormente, para desarrollar una cepa de microorganismo, que sea capaz de producir con gran fuerza materiales diana utilizando modificación por ingeniería genética y metabólica, la expresión de genes 15 relacionados con diversos procesos metabólicos de un microorganismo requiere controlarse de manera selectiva. Recientemente, se describió una tecnología para debilitar la expresión de genes, denominada “transcripción convergente artificial”, (Krylov y col., J Mol Microbiol Biotechnol, 18: 1-13, 2010). La transcripción convergente artificial es una tecnología que debilita la expresión de un gen diana insertando un promotor en una región cadena abajo de un terminador de la transcripción del gen diana de tal manera que la dirección opuesta del promotor causa
20 una colisión de complejos de ARN polimerasa procedentes de cada promotor durante la transcripción.
Los inventores desarrollaron una tecnología para inhibir, de manera selectiva, la expresión de un gen diana en presencia de acetato, insertando un promotor inducible por acetato en una dirección opuesta a la de la transcripción del gen diana, y aplicaron de un modo eficaz la tecnología para inhibir la expresión de genes localizados en puntos de ramificación en un microorganismo corineforme. Después, los inventores verificaron el proporcionar el
25 microorganismo corineforme de producción de L-aminoácidos con alto rendimiento, utilizando la tecnología y completando así la presente invención.
Sumario
El fin de la presente invención es ofrecer un procedimiento de producción de L-aminoácidos utilizando un promotor inducible por acetato para inhibir la transcripción de un gen diana.
30 Por consiguiente la presente invención ofrece un procedimiento de producción de L-aminoácidos, comprendiendo el procedimiento
1) cultivar un microorganismo corineforme recombinante capaz de producir L-aminoácidos, en el que el microorganismo corineforme recombinante tiene un promotor inducible por acetato cadena abajo de un codon de terminación de un gen diana en un cromosoma; y
35 2) añadir acetato durante el cultivo para debilitar la expresión del gen diana, y para intensificar la capacidad de producción de L-aminoácidos del microorganismo corineforme recombinante, en el que el promotor inducible por acetato está en una dirección opuesta a la de la transcripción del gen diana.
Las características preferidas se definen en las reivindicaciones 2 a 5.
Breve descripción de los dibujos
40 Estos y/u otros aspectos resultarán obvios y se apreciarán más fácilmente a partir de la siguiente descripción de las realizaciones, tomadas en conjunto con los dibujos acompañantes, en los que:
La FIG. 1 muestra puntos de ramificación del proceso de biosíntesis de aminoácidos en un microorganismo corineforme; La FIG. 2 es un diagrama esquemático que muestra la inhibición de la expresión del gen aceE insertando un
45 promotor del gen aceA a) entre el codon de terminación y el terminador de la transcripción cadena arriba del gen aceE o b) cadena abajo del terminador de la transcripción en una dirección opuesta a la dirección de la transcripción del gen aceE.
Descripción detallada
Se hará referencia ahora con detalle a las realizaciones, cuyos ejemplos se ilustran en los dibujos acompañantes, en
50 los que, en todos ellos, números de referencia similares se refieren a elementos similares. En este sentido, las presentes realizaciones pueden tener diferentes formas y no deben considerarse como que limitan las descripciones expuestas en el presente documento. Por consiguiente, las realizaciones se describen simplemente a continuación, por referencia a las figuras, explicando aspectos de la presente descripción. Expresiones tales como “al menos uno(a) de” cuando va delante de una lista de elementos, modifica toda la lista de elementos y no modifica los elementos individuales de la misma.
imagen2
5 En lo sucesivo, la presente invención se describe en detalle.
La presente invención ofrece un procedimiento de producción de L-aminoácidos, comprendiendo el procedimiento:
1) cultivar un microorganismo corineforme recombinante capaz de producir L-aminoácidos, en el que el microorganismo corineforme recombinante tiene un promotor inducible por acetato cadena abajo de un codón de terminación de un gen diana en un cromosoma; y
10 2) añadir acetato durante el cultivo para debilitar la expresión del gen diana, y para intensificar la capacidad de producción de L-aminoácidos del microorganismo corineforme recombinante, en el que el promotor inducible por acetato está en una dirección opuesta a la de la transcripción del gen diana.
La expresión “promotor inducible por acetato” utilizada en el presente documento se refiere a un promotor que, en presencia de acetato, tiene actividad inductora de expresión de genes.
15 En un microorganismo corineforme, el acetato se transforma mediante acetato quinasa (ackA, NCgI2656) y fosfotransacetilasa (pta, NCgI2657), o mediante succinil -CoA:acetato CoA-transferasa (actA, NCgI2480), en acetil CoA, y después se metaboliza mediante isocitrato liasa (aceA, NCgI2248) en un ciclo de glioxalato. En Escherichia coli, el acetato se transforma en acetil CoA mediante acetil-CoA sintetasa (acs, b4069) (Gerstmeir y col., J Biotechnol, 104: 99-122, 2003). La expresión de los genes mencionados, implicados en el metabolismo de acetato,
20 se induce en presencia de acetato. Por lo tanto, cuando se utilizan los promotores de los genes, la expresión del gen puede inducirse específicamente en presencia de acetato.
Los promotores inducibles por acetato incluyen un promotor de un gen que codifica la isocitrato liasa (aceA, NCgI2248) o un promotor de un operón de un gen que codifica la acetato quinasa (ackA, NCgI2656) y un gen que codifica la fosfotransacetilasa (pta, NCgI2657), que es un promotor cadena arriba del gen pta. Más específicamente,
25 entre los promotores inducibles por acetato descritos anteriormente, el promotor del gen aceA se representa por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 e incluye 486 pares de bases cadena arriba del gen aceA y 36 pares de bases desde un N-terminal de una fase de lectura abierta (ORF por las siglas en inglés open reading frame).
El promotor cadena arriba del gen pta, que es otro promotor inducible por acetato, se representa por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 e incluye 340 pares de bases cadena arriba del gen pta.
30 Además, es obvio que cualquier promotor capaz de inducir la expresión de un gen diana por acetato, puede incluirse en el ámbito de la presente invención. Por ejemplo, los promotores inducibles por acetato pueden incluir una secuencia de nucleótidos que incluya la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o 2, o que incluya una secuencia conservada de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o 2, y una o una pluralidad de nucleótidos (específicamente de 2 a 20, más específicamente, de 2 a 10, adicionalmente más específicamente, de 2 a 5
35 nucleótidos, dependiendo de la conformación estérica de los restos de aminoácido de una proteína) que se sustituyen, delecionan, insertan, añaden o invierten en una o más localizaciones. Siempre que la función del promotor inducible se mantenga o intensifique, este puede incluir una secuencia de nucleótidos que tiene más de 80 % de homología con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o 2, específicamente más de 90 %, más específicamente más de 95 %, adicionalmente más específicamente más de 97 %. Siempre que la función del
40 promotor inducible se mantenga, la secuencia de nucleótidos sustituida, delecionada, insertada, añadida o invertida puede incluir una secuencia mutante espontánea o incluso una secuencia mutante artificial.
El término “homología” como se usa en presente documento se refiere a la identidad entre dos secuencias de nucleótidos diferentes. La homología puede determinarse mediante un procedimiento conocido en esta técnica utilizando un programa informático BLAST 2.0 que calcula parámetros tales como puntuación, identidad y similitud.
45 Sin embargo, el procedimiento de determinación de la homología no está limitado a este.
A menos que se mencione de otra manera en el presente documento, la expresión “cadena arriba” se refiere a una dirección 5’, y la expresión “cadena abajo”, se refiere a una dirección 3’. Normalmente, la dirección del avance de la transcripción es de 5’ a 3’, de tal manera que la posición del promotor normalmente es cadena arriba(5’) del gen diana.
50 En el presente documento, un gen diana en un cromosoma puede ser un gen implicado en un proceso de síntesis biológica de aminoácidos, tales como treonina, metionina, isoleucina y lisina, a partir de diversas fuentes de carbono, especialmente un gen localizado en un punto de ramificación de una ruta biosintética.
Por ejemplo, con respecto a la lisina, un gen de la subunidad E1 de la piruvato deshidrogenasa (aceE, NCgI2167) que está implicado en la conversión de piruvato en acetil CoA, un gen de homoserina deshidrogenasa (hom, 55 NCg11136) que produce homoserina a partir de aspartato y un gen de UDP-N-acetilmuramoilalanil-D-glutamato-2,6diaminopimelato ligasa (murE, NCgI2083) que utiliza meso-2,6-diaminopimelato, que es un precursor de lisina en
imagen3
síntesis somática, se localizan en puntos de ramificación de la ruta biosintética.
Además, un gen de dihidrodipicolinato sintasa (dapA, NCgI1896) implicado en la producción de lisina a partir de aspartato está en un punto de ramificación con respecto a treonina, y un gen de homoserina quinasa (thrB, NCg11137) implicado en la producción de treonina a partir de homoserina, está en un punto de ramificación con
5 respecto a metionina. Con respecto a la alanina y a la valina, que son aminoácidos derivados de piruvato, un gen de la subunidad 1 de la piruvato deshidrogenasa (aceE, NCgI2167) implicado en la conversión de piruvato en acetil CoA está en un punto de ramificación.
Por lo tanto, puede seleccionarse un gen diana del grupo que consiste en un gen que codifica una subunidad E1 de la piruvato deshidrogenasa (aceE, NCgI2167), un gen que codifica una homoserina deshidrogenasa (hom,
10 NCg11136), un gen que codifica una UDP-N-acetilmuramoilalanil-D-glutamato-2,6-diaminopimelato ligasa (murE, NCgI2083) y un gen que codifica una di-hidrodipicolinato sintasa (dapA, NCgI1896), pero no se limita a estos.
Específicamente, la subunidad E1 de la piruvato deshidrogenasa (aceE, NCgI2167) es una de las subunidades proteicas del complejo de piruvato deshidrogenasa (PDHC), que está implicada en el flujo de entrada de piruvato que es un metabolito final de la glucolisis en un ciclo de ácido tricarboxílico (ciclo TCA). Por lo tanto, el debilitamiento
15 de la expresión del gen aceE puede disminuir el flujo de entrada de fuentes de carbono en un ciclo TAC y aumentar el flujo de entrada de fuentes de carbono en una ruta biosintética de lisina para aumentar la producción de lisina.
La homoresina deshidrogenasa (hom, NCg11136) es una enzima que sintetiza homoserina a partir de aspartato semialdehído. Dado que el aspartato semialdehído es uno de los precursores intermedios de una ruta biosintética de lisina, el debilitamiento de la actividad del gen hom puede disminuir el flujo de entrada de fuentes de carbono en una
20 ruta biosintética de homoserina y aumentar el flujo de entrada de fuentes de carbono en una ruta biosintética de lisina para aumentar la producción de lisina.
La UDP-N-acetilmuramoilalanil-D-glutamato-2,6-diaminopimelato ligasa (murE, NCgI2083) utiliza meso-2,6-diaminopimelato para la síntesis somática. Dado que la meso-2,6-diaminopimelato se utiliza también como un precursor para la biosíntesis de lisina, el debilitamiento de la actividad del gen murE puede disminuir el flujo de
25 entrada de fuentes de carbono en la síntesis somática y aumentar el flujo de entrada de fuentes de carbono en una ruta biosintética de lisina para aumentar la producción de lisina.
La dihidrodipicolinato sintasa (dapA, NCgI1896) es una enzima que está implicada en la producción de lisina utilizando aspartato semialdehído. Dado que el aspartato semialdehído es uno de los precursores intermedios de una ruta biosintética de lisina, el debilitamiento de la actividad del gen dapA puede disminuir el flujo de entrada de
30 fuentes de carbono en la ruta biosintética de lisina y aumentar el flujo de entrada de fuentes de carbono en una ruta biosintética de treonina para aumentar la producción de treonina.
En el presente documento, la expresión “codón de terminación” se utiliza para referirse a codones que no codifican un aminoácido en ARNm, sino que actúan como una señal para la terminación de la síntesis de proteínas. Convencionalmente, como codones de terminación, se utilizan tres codones, que incluyen UAA, UAG y UGA.
35 En el presente documento, la expresión “terminador de la transcripción” se utiliza para referirse a una secuencia repetida inversa rica en bases GC. Un terminador de la transcripción forma un bucle en horquilla para terminar la transcripción de genes.
En la presente invención, para debilitar la expresión de un gen diana, como se describe anteriormente, puede introducirse un promotor inducible por acetato cadena abajo de un codon de terminación de un gen diana,
40 específicamente, entre un codon de terminación y cadena arriba de un terminador de la transcripción. Un promotor inducible por acetato puede utilizarse para causar una transcripción inversa de un gen diana de tal manera que los complejos de ARN polimerasa pueden entran en conflicto entre sí para debilitar la expresión de un gen diana.
La expresión de un gen diana puede debilitarse en cualquier momento del cultivo. Más específicamente la expresión de un gen diana puede debilitarse antes o durante el cultivo.
45 En el presente documento, el término “transformación” se utiliza para referirse a la introducción de un vector que incluye un polinucleótido que codifica un gen diana en una célula hospedadora, de tal manera que una proteína codificada por el polinucleótido puede expresarse en la célula hospedadora. Siempre que un polinucleótido introducido pueda expresarse en una célula hospedadora, el polinucleótido puede insertarse en el cromosoma de la célula hospedadora o existir fuera del cromosoma. Además, el polinucleótido incluye ADN o ARN que codifica una
50 proteína diana. Siempre que el polinucleótido pueda introducirse y expresarse en una célula hospedadora, el polinucleótido puede introducirse en cualquier forma.
En una realización de la invención, el microorganismo corineforme puede incluir microorganismos de los géneros Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter sp. y Microbacterium sp. Como ejemplos de microorganismos corineformes se incluyen Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium 55 flavum, Brevibacterium lactofermentum y variantes productoras de L-aminoácidos preparadas a partir de los mismos. Específicamente, el microorganismo corineforme puede ser Corynebacterium glutamicum, pero no está limitado a
imagen4
estos ejemplos.
Más específicamente, los microorganismos corineformes en la presente invención pueden incluir Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (n.º de registro anterior: KFCC10881, referido a la patente coreana n.º: 10-0159812), Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (referido a la patente coreana n.º: 10-0924065) y Corynebacterium
5 glutamicum KCCM11347P (n.º de registro anterior: KFCC10750, referido a la patente coreana n.º: 10-0073610).
En la presente invención también puede incluirse Corynebacterium glutamicum CJ3P como microorganismo corineforme. CJ3P ha evolucionado hasta tener la capacidad de producir lisina introduciendo mutación en tres genes implicados en la eficiencia de producción de lisina, pyc(P458S), hom(V59A) y lysC(T311I)) en una cepa parental, Corynebacterium glutamicum de tipo silvestre (ATCC13032) de acuerdo con el informe de Binder y col. (Binder y
10 col., Genome Biology, 13: R40, 2012).
Además, otro microorganismo corineforme en la presente invención puede ser Corynebacterium glutamicum KCCM11222P, que es una cepa productora de L-treonina (referida a la patente coreana n.º: 10-1335853).
De acuerdo con una realización de la presente invención, en todos los organismos corineformes en los que se introdujo un promotor representado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, la
15 productividad de L-lisina o L-treonina aumentó en comparación con la de la cepa parental.
Con respecto al procedimiento proporcionado en la presente invención, el cultivo de un microorganismo corineforme puede realizarse aplicando cualquiera de las condiciones y métodos de cultivo conocidos en esta técnica.
Un medio de cultivo que puede utilizarse en el cultivo de una cepa corineforme, puede ser, por ejemplo, los medios de cultivo descritos en Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology
20 (Washington D.C., USA, 1981).
Las fuentes de carbono, que pueden utilizarse en el medio de cultivo, pueden incluir un hidrato de carbono tal como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa, un aceite o lípido, tal como aceite de semilla de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de cacahuete, un ácido graso, tal como, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, un alcohol, tal como, glicerol y etanol y un ácido orgánico, tal como ácido acético. Estas
25 sustancias pueden estar individualmente o como una mezcla.
Las fuentes de nitrógeno que pueden utilizarse en el medio de cultivo, pueden incluir peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, líquido de macerado de maíz, semilla de soja y urea y una fuente de nitrógeno inorgánica tal como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Estas fuentes de nitrógeno también pueden estar individualmente o como una mezcla.
30 Las fuentes de fósforo que pueden utilizarse en el medio de cultivo, pueden incluir dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato dipotásico y una sal de los mismos que contenga sodio. Además, puede haber un medio de cultivo que incluya una sal metálica, tal como sulfato de magnesio y sulfato de hierro necesario para el crecimiento. Además de las sustancias descritas anteriormente, pueden utilizarse sustancias necesarias para el crecimiento, tales como aminoácidos y vitaminas. Además, en un medio de cultivo pueden utilizarse precursores apropiados. Durante el
35 cultivo las materias primas pueden añadirse a la solución de cultivo en un modo discontinuo o continuo.
Durante el cultivo del microorganismo, el pH del medio de cultivo puede ajustarse añadiéndole un compuesto básico tal como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio y amoniaco, o añadiéndole un compuesto ácido tal como ácido fosfórico y ácido sulfúrico en un modo apropiado. Además, la formación de burbujas puede reprimirse con un agente antiespuma tal como poliglicol éster de ácido graso. Para mantener las condiciones aerobias, se puede inyectar
40 oxígeno o un gas que contenga oxígeno (for ejemplo, aire) al medio de cultivo. La temperatura del medio de cultivo puede ser normalmente de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 45 °C, específicamente, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C. El cultivo puede continuar hasta que se produzca una cantidad deseada de un L-aminoácido, si bien, un tiempo de cultivo apropiado puede durar de aproximadamente 10 a 160 horas.
45 Con respecto al procedimiento proporcionado en la presente invención, el cultivo puede realizarse en un modo continuo o discontinuo, tal como un proceso discontinuo, un proceso semicontinuo y un proceso semicontinuo repetido. Estos procedimientos de cultivo son conocidos en la técnica y puede utilizarse cualquiera de los mismos.
El término “cultivo”, como se usa en el presente documento, puede incluir tanto la preparación de un medio de cultivo como el tiempo que dura el crecimiento del microorganismo.
50 Con respecto al procedimiento proporcionado en la presente invención, el procedimiento puede incluir adicionalmente una etapa de purificación o de recuperación. Un L-aminoácido diana puede purificarse o recuperarse de una solución de cultivo utilizando un procedimiento apropiado conocido en esta técnica de acuerdo con el procedimiento, tal como un cultivo discontinuo, continuo y semicontinuo.
imagen5
Un L-aminoácido producido en el cultivo de la presente invención puede ser uno seleccionado del grupo que consiste en treonina, metionina, isoleucina, lisina, valina y alanina, especialmente lisina o treonina.
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con mayor detalle con referencia a los ejemplos. Los fines de estos ejemplos son únicamente ilustrativos y el ámbito de la presente invención no se limita a 5 ellos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Selección de un promotor inducible por acetato
La isocitrato liasa (aceA, NCgI2248) es una enzima clave de un ciclo de glioxilato, y un gen que codifica la isocitrato liasa se expresa en presencia de acetato. Además, la acetato quinasa (ackA, NCgI2656) y la fosfotransacetilasa
10 (pta, NCgI2657), que son enzimas que están implicadas en el proceso metabólico del acetato, forman un operón, y su expresión se intensifica en presencia de acetato. Las regiones promotoras del gen aceA y del operón pta-ackA ya se conocen (Gerstmeir y col., J Biotechnol, 104, 99-122, 2003).
En el Ejemplo 1, para inhibir la transcripción de un gen diana en presencia de acetato, se seleccionaron un promotor del gen aceA y un promotor del operón pta-ack, que es una región promotora cadena arriba del gen pta. Basándose
15 en el gen aceA registrado en el US NIH GenBank (nº. de registro NCBI: NCgI2248), se obtuvo una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1), que incluía 486 pares de bases cadena arriba del gen aceA y 36 pares de bases de un N-terminal de una fase de lectura abierta (ORF). Además, basándose en el gen pta registrado en el US NIH GenBank (nº. de registro NCBI: NCgI2657), se obtuvo una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2), que incluía 340 pares de bases cadena arriba del gen pta.
20 Ejemplo 2: Preparación de un vector para inhibir la expresión del gen aceE
Una subunidad E1 de piruvato deshidrogenasa (aceE, NCgI2167) es una de las subunidades proteicas del complejo piruvato deshidrogenasa (PDHC), que está implicado en el flujo de entrada de piruvato que es un metabolito final de la glucolisis en un ciclo TCA. Por lo tanto, el debilitamiento de la expresión del gen aceE puede disminuir el flujo de entrada de fuentes de carbono
25 en un ciclo TCA y aumentar el flujo de entrada de fuentes de carbono en una ruta biosintética de lisina para aumentar la producción de lisina (Blombach y col., Appl Microbiol Biotechnol, 76(3): 615-23, 2007).
El promotor del gen aceA se insertó cadena abajo del gen aceE de tal manera que la transcripción a partir de este promotor puede ocurrir en una dirección opuesta a la dirección original de la transcripción del gen aceE para inhibir la expresión del gen aceE de manera selectiva en presencia de acetato (FIG. 2).
30 En primer lugar, para predecir un terminador de la trascripción del gen aceE, se utilizó el programa informático del conjunto de programas maestro CLC (CLC Bio, Dinamarca). Un terminador de la transcripción es una secuencia repetida invertida rica en bases GC y forma un bucle en horquilla para terminar la transcripción génica. El resultado de la predicción de un terminador de la transcripción del gen aceE mostró que 36 pares de bases, desde el par de bases 21 al par de bases 56 cadena abajo desde el codón de terminación del gen aceE, forma un bucle en horquilla
35 como un terminador de la transcripción. Basándose en este resultado, se prepararon dos vectores para insertar el promotor aceE cadena arriba o cadena abajo, respectivamente, del terminador de la transcripción del gen aceE de tal manera que la transcripción a partir de este promotor puede producirse en una dirección opuesta a la original.
<2-1> Preparación del vector pDZ-aceE1-PaceA para inhibir la expresión del gen aceE
Se preparó un vector insertando un promotor del gen aceE cadena abajo del codon de terminación de gen aceE, que 40 está entre el codon de terminación y cadena arriba del terminador de la transcripción.
Para obtener un fragmento de un gen aceE procedente de Corynebacterium glutamicum, como molde se utilizó el ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P para sintetizar cebadores (SEQ ID NO: 3 y 4), que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xbal en el extremo 5’ del fragmento y un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Spel en el extremo 3’ del fragmento. Se realizó 45 una PCR utilizando los cebadores sintetizados para obtener un fragmento de ADN que incluía 296 pares de bases entre el nucleótido 2474 desde el codon de inicio del gen aceE y el nucleótido 2769, un codon de terminación del gen aceE. Además, se sintetizaron cebadores (SEQ ID NO: 5 y 6), que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento Spel en un extremo 5’ del fragmento y un sitio de reconocimiento Xbal en el extremo 3’ del fragmento, y se realizó una PCR utilizando los cebadores para obtener un fragmento de ADN que incluyese 300
50 pares de bases cadena abajo del codon de terminación del gen aceE. Se utilizó ADN polimerasa PfuUltra™ de alta fidelidad (Stratagene) como una polimerasa, y se realizó una PCR con 30 ciclos de desnaturización a 95 °C durante 30 segundos; hibridación a 55 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 30 segundos y después polimerización a 72 °C durante 7 minutos.
Los dos productos de amplificación de la PCR y un vector pDZ (referido a la patente coreana n.º: 10-0924065) para 55 la introducción cromosómica que ya se habían preparado escindiendo con una enzima de restricción Xbal, se clonaron utilizando un kit de clonación In-fusion (TAKARA, JP) para preparar un vector pDZ-aceE1.
imagen6
SEQ ID NO: 3: aceE-P1 F 5’-ccggggatcctctagacctccggcccatacgttgc -3’ SEQ ID NO: 4: aceE-P1 R 5’-ttgagactagttattcctcaggagcgtttg -3’ SEQ ID NO: 5: aceE-P2F 5’-gaataactagtctcaagggacagataaatc -3’
5 SEQ ID NO: 6: aceE-P2R 5’-gcaggtcgactctagagaccgaaaagatcgtggcag -3’
Para obtener un fragmento promotor de un gen aceA procedente de Corynebacterium glutamicum, se sintetizaron cebadores que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de escisión Spel en un extremo 5’ y en un extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NO: 7 y 8). La PCR se realizó utilizando como molde el ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P y los cebadores sintetizados para amplificar una región
10 promotora de aproximadamente 500 pares de bases que se representaba por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. El producto de amplificación de la PCR y un fragmento de ADN que se obtuvo tratando un vector pDZaceE1 con la enzima de restricción Spel, se clonaron utilizando un kit de clonación In-fusion (TAKARA, JP) para preparar un vector pDZ-aceE1-PaceA.
SEQ ID NO: 7: PaceA-P3F 5’-gtcccttgagactagtagcactctgactacctctg -3’ 15 SEQ ID NO: 8: PaceA-P3R 5’-ctgaggaata actagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
<2-2> Preparación del vector pDZ-aceE2-PaceA para inhibir la expresión del gen ace
Se preparó un vector insertando un promotor del gen aceA cadena abajo del terminador de la transcripción del gen aceE.
Para obtener un fragmento de un gen aceE procedente de Corynebacterium glutamicum, el ADN cromosómico de
20 Corynebacterium glutamicum KCCM11016P se utilizó como un molde, y se utilizaron los cebadores que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xbal en el extremo 5’ del fragmento y un sitio de reconocimiento de la enzima de escisión Spel en el extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NO: 9 y 10). Se realizó una PCR utilizando los cebadores sintetizados para obtener un fragmento de ADN que incluía 294 pares de bases entre el nucleótido 2538 desde el codon de inicio del gen aceE y el nucleótido 62 cadena abajo del
25 codon de terminación. Además, se utilizaron cebadores, que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento de enzima de restricción Spel en el extremo 5’ del fragmento y un sitio de reconocimiento de la enzima de escisión Xbal en el extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NOs: 11 y 12) para realizar un PCR para obtener un fragmento de ADN que incluía 294 pares de bases entre el nucleótido 69 cadena abajo del codon de terminación del gen aceE y el nucleótido de 36. Se utilizó la ADN polimerasa PfuUltra™ de alta fidelidad (Stratagene) como una
30 polimerasa y se realizó una PCR con 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos; hibridación a 55 °C durante 30 segundos; y polimerización a 72 °C durante 30 segundos y después polimerización a 72 °C durante 7 minutos.
Los dos productos de amplificación PCR y un vector pDZ para la introducción cromosómica que ya se había preparado por escisión con una enzima de restricción Xbal, se clonaron utilizando un kit de clonación In-fusion
35 (TAKARA, JP) para preparar un vector pDZ-aceE2.
SEQ ID NO: 9: aceE-P4F 5’-ccggggatcctctagaggtcccaggcgactacacc -3’ SEQ ID NO: 10: aceE-P4R 5’-gagctactagtacgacgaatcccgccgccagacta -3’ SEQ ID NO: 11: aceE-P5F 5’-gtcgtactagtagctctttttagccgaggaacgcc -3’ SEQ ID NO: 12: aceE-P5R 5’-gcaggtcgactctagacatgctgttggatgagcac -3’
40 Para obtener un fragmento promotor de un gen aceA procedente de Corynebacterium glutamicum, se sintetizaron cebadores que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de escisión Spel en un extremo 5’ y en un extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NO: 13 y 14). La PCR se realizó utilizando como molde el ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P y los cebadores sintetizados para amplificar una región promotora de aproximadamente 500 pares de bases que se representaba por una secuencia de nucleótidos de SEQ
45 ID NO: 1. El producto de amplificación de la PCR y un fragmento de ADN que se obtuvo tratando un vector pDZaceE2 con la enzima de restricción Spel, se clonaron utilizando un kit de clonación In-fusion (TAKARA, JP) para preparar un vector pDZ-aceE2-PaceA.
SEQ ID NO: 13: PaceA-P6F 5’-aaaaagagctactagtagcactctgactacctctg -3’
SEQ ID NO: 14: PaceA-P6R 5’-gattcgtcgtactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
50 Ejemplo 3: Preparación de cepas en las que se inserta el promotor del gen aceA cadena abajo del gen aceE
Los vectores pDZ-aceE1-PaceA y pDZ-aceE2-PaceA preparados en el Ejemplo 2 se introdujeron respectivamente mediante impulso eléctrico en Corynebacterium glutamicum KCCM11016P que es una cepa productora de L-lisina (procedimiento de transformación descrito en Van der Rest y col., Appl Microbiol Biotechnol, 52: 541-545, 1999). Se seleccionaron las cepas respectivas en las que se insertó el promotor del gen aceA cadena abajo del codón de 55 terminación del gen aceE en el cromosoma de tal manera que la transcripción desde este promotor puede ocurrir en una dirección opuesta a la dirección original, realizando una PCR para obtener una cepa productora de L-lisina. Las
imagen7
cepas seleccionadas se denominaron Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::aceE1-PaceA, y Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::aceE2-PaceA, respectivamente. Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::aceE1-PaceA se depositó internacionalmente con el nombre de Corynebacterium glutamicum CA012271 en el Korean Culture Center of Microorganism (Centro coreano de Cultivo de Microorganismos, siglas en inglés
5 KCCM) el 12 de junio del 2013 con el número de registro KCCM11432P. Las cepas preparadas se verificaron de manera que la secuencia de nucleótidos de la región diana obtenida se analizó realizando una PCR utilizando la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 6 como cebadores para la KCCM11016P::aceE1-PaceA, y la SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 12 como cebadores para la KCCM11016P::aceE2-PaceA.
Ejemplo 4: Comparación de productividad de lisina de cepas en las que el promotor del gen aceA se inserta 10 cadena abajo del gen aceE
La cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, que se utilizó como una cepa parental, y las cepas Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::aceE1-PaceA y Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::aceE2-PaceA que eran cepas productoras de L-lisina preparadas en el Ejemplo 3, se cultivaron mediante el procedimiento descrito a continuación.
15 Corynebacterium glutamicum KCCM11016P KCCM11016P::aceE1-PaceA y KCCM 11016P::aceE2-PaceA se inocularon respectivamente en 25 ml del medio de siembra descrito a continuación en matraces con deflectores angulares de 250 ml, seguido de cultivo con agitación a 200 rpm a 30 °C durante 20 horas. Se añadió 1 ml de la solución del cultivo de siembra a un matraz con deflector angular de 250 ml que incluía 24 ml del medio de producción descrito más adelante, seguido de cultivo con agitación a 200 rpm a 30 °C durante 72 horas. A
20 continuación se describen las composiciones respectivas del medio de siembra y los medios de producción.
<Medio de siembra (pH 7,0)>
glucosa 20 g, peptona 10 g, extracto de levadura 5 g, urea 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4•7(H2O) 0,5 g, biotina 100 μg, HCl tiamina 1.000 μg, pantotenato de calcio 2.000 μg, nicotinamida 2.000 μg (con referencia a 1 l de agua destilada).
25 <Medio de producción (pH 7,0)>
glucosa 100 g, (NH4)2SO4 40 g, proteína de soja 2,5 g, sólidos de macerado de maíz 5 g, urea 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4•7(H2O) 0,5 g, biotina 100 μg, HCl tiamina 1.000 μg, pantotenato de calcio 2.000 μg, nicotinamida 3.000 μg, CaCO3 30 g (con referencia a 1 l de agua destilada).
Después del cultivo, la concentración de L-lisina se midió utilizando HPLC. En la Tabla 1 se muestra la
30 concentración de L-lisina en las soluciones de cultivo de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, KCCM11016P::aceE1-PaceA y de KCCM11016P::aceE2-PaceA cuando no se añadía acetato.
Tabla 1. Variación de la producción de L-lisina (sin añadir acetato)
Cepa
Lisina (g/l)
Lote 1
Lote 2 Lote 3
KCCM11016P
43,5 43,1 43,4
KCCM11016P:: aceE1-PaceA
43,7 43,2 43,6
KCCM11016P:: aceE2-PaceA
43,3 43,4 43,7
Además, las cepas se cultivaron mediante el mismo procedimiento, excepto que se añadieron 5 g/l de acetato al 35 medio de producción para comparar la producción de L-lisina. En la Tabla 2 se muestra la concentración de L-lisina en las soluciones de cultivo.
Tabla 2. Variación de la producción de L-lisina (5 g/l de acetato añadido)
Cepa
Lisina (g/l)
Lote 1
Lote 2 Lote 3
KCCM11016P
45,6 45,3 45,8
KCCM11016P:: aceE1-PaceA
47,2 47,1 47,4
KCCM11016P:: aceE2-PaceA
46,7 46,5 47,0
Como se muestra en la Tabla 1, en ausencia de acetato, la productividad de L-lisina de la cepas 40 KCCM11016P::aceE1-PaceA y KCCM11016P::aceE2-PaceA no era diferente de la de la cepa parental KCCM11016P.
Sin embargo, como se muestra en la Tabla 2, en presencia de acetato, la productividad de L-lisina de la cepa KCCM11016P::aceE1-PaceA fue más del 3,6 % más alta que la de la cepa parental KCCM11016P, y la de la cepa KCCM11016P::aceE2-PaceA fue más alta del 2,5 % más alta que la de la cepa parental KCCM11016P.
imagen8
Además, la comparación de la cepa KCCM11016P::aceE1-PaceA y de la cepa KCCM11016P::aceE2-PaceA muestra que la producción de L-lisina de la cepa KCCM11016P::aceE1-PaceA en la que se insertó el promotor aceA cadena arriba del terminador de la transcripción del gen aceE, que estaba entre el codon de terminación y cadena
5 arriba del terminador de la transcripción, era más efectiva. Esto indica que la región entre el codon de terminación y cadena arriba del terminador de la transcripción puede utilizarse para inhibir la expresión del gen de un modo más eficaz.
Ejemplo 5: Preparación del vector pDZ-aceE-Ppta para inhibir la expresión del gen aceE
La acetato quinasa (ackA, NCgI2656) y la fosfotransacetilasa (pta, NCgI2657), que son enzimas que están
10 implicadas en un proceso metabólico de acetato, forman un operón, y la expresión del mismo se intensifica en presencia de acetato. Por lo tanto, cuando se utilizan los promotores de los genes, la expresión de un gen puede inducirse específicamente en presencia de acetato.
En el Ejemplo 5, para inhibir la expresión del gen aceE en presencia de acetato, se preparó un vector utilizando un promotor del operón pta-ack que era la región promotora cadena arriba del gen pta.
15 Para inhibir la expresión del gen aceE, se construyó un vector que podía comprender un promotor del gen pta cadena abajo del codon de terminación del gen aceE, que está entre el codon de terminación y cadena arriba del terminador de la transcripción, de tal manera que la transcripción desde el promotor del gen pta puede producirse en una dirección opuesta a la dirección original de la transcripción del gen aceE.
Para obtener un fragmento de un gen aceE procedente de Corynebacterium glutamicum, como molde se utilizó el
20 ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P para preparar un vector pDZ-aceE1 mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 2.
Para obtener un fragmento promotor de un gen pta procedente de Corynebacterium glutamicum, se sintetizaron cebadores que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Spel en un extremo 5’ y en un extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16). El ADN cromosómico de
25 Corynebacterium glutamicum KCCM11016P se utilizó como molde, y los cebadores sintetizados se utilizaron para realizar una PCR para amplificar una región promotora de aproximadamente 340 pares de bases que se representaban por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. El producto de amplificación de la PCR y un fragmento de ADN, que se obtuvo tratando un vector pDZ-aceE1 con una enzima de restricción Spel, se clonaron utilizando un kit de clonación In-fusion (TAKARA, JP) para preparar un vector pDZ-aceE1-Ppta.
30 SEQ ID NO: 15: Ppta-P7F 5’-gtcccttgagactagtctttgctggggtcagatttg-3’ SEQ ID NO: 16: Ppta-P7R 5’-ctgaggaataactagtacatcgcctttctaatttc-3’
Ejemplo 6: Preparación de cepas en las que el promotor del gen pta se inserta cadena abajo del gen aceE ycomparación de productividad de lisina de las mismas
La cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P se transformó con el vector pDZ-aceE1-Ppta preparado en el
35 Ejemplo 5 mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 3. La cepa en la que se insertó el promotor del gen pta cadena abajo del codon de terminación del gen aceE en el cromosoma de tal manera que la transcripción podía producirse en una dirección opuesta a la dirección original de la transcripción del gen aceE, se seleccionó realizando una PCR para obtener una cepa productora de L-lisina, que se denominó KCCM11016P::aceE1-Ppta. La cepa KCCM11016P::aceE1-Ppta preparada se verificó de manera que la secuencia de nucleótidos de la región diana
40 obtenida se analizó realizando una PCR utilizando, como cebadores, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 6.
La cepa preparada se cultivó mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 4 y se midió la concentración de L-lisina recuperada de la solución de cultivo. En la Tabla 3 se muestra la concentración de L-lisina en la solución de cultivo cuando no se añadía acetato.
Tabla 3. Variación de la producción de L-lisina (sin añadir acetato)
Cepa
Lisina (g/l)
Lote 1
Lote 2 Lote 3
KCCM11016P
42,9 43,5 43,4
KCCM11016P:: aceE1-Ppta
43,2 43,3 43,6
Además, las cepas se cultivaron mediante el mismo procedimiento, excepto que se añadieron 5 g/l de acetato al medio de producción para comparar la producción de L-lisina. En la Tabla 4 se muestra la concentración de L-lisina en las soluciones de cultivo.
Tabla 4. Variación de la producción de L-lisina (5 g/l de acetato añadido)
Cepa
Lisina (g/l)
Lote 1
Lote 2 Lote 3
KCCM11016P
45,5 45,7 45,3
KCCM11016P:: aceE1-Ppta
46,7 46,5 46,6
Como se muestra en la Tabla 3, en ausencia de acetato, la productividad de L-lisina de la cepa KCCM11016P::aceE1-Ppta no fue diferente de la de la cepa parental KCCM11016P.
5 Sin embargo, como se muestra en la Tabla 4, en presencia de acetato, la productividad de L-lisina de la cepa KCCM11016P::aceE1-Ppta fue más del 2,4 % más alta que la de la cepa parental KCCM11016P.
Además, dado que la productividad de L-lisina de la cepa KCCM11016P::aceE1-PaceA era mayor que la de la cepa KCCM11016P::aceE1-Ppta, en presencia de acetato, la expresión de un gen diana puede inhibirse más eficazmente utilizando el promotor del gen aceA que utilizando el promotor del gen pta.
10 Ejemplo 7: Preparación de cepas en las que se inserta un promotor del gen aceA cadena abajo del gen aceE
Tres cepas productoras de L-lisina, que eran Corynebacterium glutamicum KFCC10750, KCCM10770P y CJ3P, se transformaron respectivamente con el vector pDZ-aceE1-PaceA preparado en el Ejemplo 2 mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 3. Las cepas en las que se insertó un promotor del gen aceA cadena abajo del codon de terminación del gen aceE en el cromosoma de tal manera que la transcripción puede producirse en una
15 dirección opuesta a la dirección original de la transcripción del gen aceE, se seleccionaron realizando una PCR. Las tres cepas productoras de L-lisina obtenidas eran KFCC10750::aceE1-PaceA, KCCM10770P::aceE1-PaceA y CJ3P::aceE1-PaceA. Las cepas preparadas se verificaron de tal manera que la secuencia de nucleótidos de la región diana obtenida se analizó realizando una PCR utilizando como cebadores la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 6.
Las cepas preparadas se cultivaron mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 4, y se midió la
20 concentración de L-lisina recuperada de las soluciones de cultivo. En la Tabla 5 se muestra la concentración de Llisina en las soluciones de cultivo cuando no se añadía acetato.
Tabla 5. Variación de la producción de L-lisina (sin añadir acetato)
Cepa
Lisina (g/l)
Lote 1
Lote 2 Lote 3
KFCC10750
38,3 38,0 38,4
KFCC10750::aceE1-PaceA
38,6 38,2 38,3
KCCM10770P
47,5 47,3 47,6
KCCM 10770P::aceE1-PaceA
47,3 47,7 47,5
CJ3P
8 8,4 8,3
CJ3P::aceE1-PaceA
8,2 8,1 8,5
Además, las cepas se cultivaron mediante el mismo procedimiento excepto que se añadieron 5 g/l de acetato al 25 medio de producción para comparar la producción de L-lisina. En la Tabla 6 se muestra la concentración de L-lisina en las soluciones de cultivo.
Tabla 6. Variación de la producción de L-lisina (5 g/l de acetato añadido)
Cepa
Lisina (g/l)
Lote 1
Lote 2 Lote 3
KFCC10750
39,3 39,5 39,2
KFCC10750::aceE1-PaceA
41,3 41,6 41,0
KCCM10770P
47,5 47,3 47,6
KCCM 10770P::aceE 1-PaceA
49,0 48,6 48,8
CJ3P
8 8,4 8,3
CJ3P::aceE1-PaceA
9,5 9,7 9,4
Como se muestra en la Tabla 5, en ausencia de acetato, la productividad de L-lisina de las tres cepas 30 KFCC10750::aceE1-PaceA, KCCM10770P::aceE1-PaceA, CJ3P::aceE1-PaceA no fue diferente de la de la cepa parental.
Sin embargo, como se muestra en la Tabla 6, en presencia de acetato, la productividad de L-lisina de la cepa KFCC10750::aceE1-PaceA fue 5 % mayor que la de la cepa parental, que la de la cepa KCCM10770P::aceE1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
PaceA fue 2,8 % mayor que la de la cepa parental y que la de la cepa CJ3P::aceE1-PaceA fue 15 % mayor que la de la cepa parental.
Ejemplo 8: Preparación de un vector para inhibir la expresión del gen hom
La ruta biosintética de la L-treonina utilizando el mismo sustrato que el de la ruta biosintética de L-lisina puede debilitarse para aumentar la productividad de L-lisina. Un ejemplo de los procedimientos de debilitamiento de la ruta biosintética de L-treonina es disminuir la actividad enzimática de la homoserina deshidrogenasa (hom, NCg11136) que produce homoserina a partir de aspartato.
En Corynebacterium glutamicum, el gen hom forma el operón hom-thrB con el gen thrB, y el terminador de transcripción del gen hom existe cadena abajo del gen thrB. Se indicó que un promotor existe cadena arriba del operón hom-thrB que está cadena arriba del gen hom. Además, se indicó que existe un segundo promotor cadena arriba del operón del gen thrB (Mateos y col., J Bacteriol, 176: 7362-7371,1994). Por lo tanto, un promotor del aceA se insertó cadena abajo del codon de terminación del gen hom de tal manera que la transcripción desde este promotor puede producirse en una dirección opuesta a la dirección original de la transcripción del gen hom para inhibir de manera selectiva la expresión del gen hom en presencia de acetato. Para mantener la expresión del gen thrB, se añadió una segunda secuencia promotora cadena arriba de la ORF del gen thrB.
En el Ejemplo 8, se preparó un vector recombinante insertando un promotor del gen aceA entre cadena abajo del codon de terminación del gen hom y cadena arriba del gen thrB.
Para obtener un fragmento de un gen hom procedente de Corynebacterium glutamicum, el ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P se usó como un molde y se sintetizaron cebadores, que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xbal en el extremo 5’ del fragmento y un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Spel en el extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NO: 17 y 18). Se realizó una PCR utilizando los cebadores sintetizados para obtener un fragmento de ADN que incluía 300 pares de bases entre el nucleótido 1039 desde el codon de inicio del gen hom y el nucleótido 1338 que era un codon de terminación. Incluso cuando se insertaba aceA entre los operones hom-thrB, la expresión del gen thrB podía mantenerse. Por lo tanto, cuando el fragmento de ADN que incluía 300 pares de bases del codon de terminación del gen hom cadena abajo se preparó, se sintetizaron cebadores que se diseñaron para añadir adicionalmente una secuencia promotora thrB de 32 pares de bases en un lado 5’ (SEQ ID NO: 19 y 20). Se realizó una PCR utilizando estos cebadores (SEQ ID NO: 19 y 20) para obtener un fragmento de ADN de 334 pares de bases que tenía un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Spel en el extremo 5’ del fragmento y un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xbal en el extremo 3’ del fragmento. La PCR se realizó en las mismas condiciones que las del Ejemplo 2.
Los dos productos de amplificación por PCR y un vector Pdz para la introducción cromosómica, que ya se había preparado escindiendo con una enzima de restricción Xbal, se clonaron utilizando un kit de clonación In-fusion (TAKARA, JP) para preparar un vector pDZ-hom.
SEQ ID NO: 17: hom-h1F 5’-ccggggatcctctagaccaggtgagtccacctacg -3’
SEQ ID NO: 18: hom-h1R 5’-gaggcggatcactagtttagtccctttcgaggcgg -3’
SEQ ID NO: 19: hom-h2F 5’-actagtgatccgcctcgaaagggac -3’
SEQ ID NO: 20: hom-h2R 5’-gcaggtcgactctagagactgcggaatgttgttgtg -3’
Para obtener un fragmento promotor de un gen aceA procedente de Corynebacterium glutamicum, se sintetizaron cebadores que se diseñaron para que tuviese un sitio de reconocimiento de la enzima de escisión Spel en un extremo 5’ y en un extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NO: 21 y 22). La PCR se realizó utilizando como molde ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P y los cebadores sintetizados para amplificar una región promotora de aproximadamente 500 pares de bases se representaron mediante una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. El producto de amplificación de la PCR y un fragmento de ADN que se obtuvo tratando un vector pDZ-hom con una enzima de restricción Spel, se clonaron utilizando un kit de clonación In-fusion (TAKARA, JP) para preparar un vector pDZ-hom-PaceA.
SEQ ID NO: 21: PaceA-h3F 5’-gaggcggatcactagtagcactctgactacctctg -3’
SEQ ID NO: 22: PaceA-h3R 5’-aagggactaaactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
Ejemplo 9: Preparación de cepas en las que se inserta el promotor del gen aceA cadena abajo del gen hom ycomparación de la productividad de lisina de las mismas
La cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P que es una cepa productora de L-lisina, se transformó con el vector pDZ-hom-PaceA preparado en el Ejemplo 8 mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 3. La cepa en la que se insertó el promotor del gen aceA cadena abajo del codon de terminación del gen hom en el cromosoma de tal manera que podía producirse la transcripción en una dirección opuesta a la dirección original de la transcripción del gen hom, se seleccionó realizando una PCR para obtener una cepa productora de L-lisina, que se denominó KCCM11016P::hom-PaceA. La cepa KCCM11016P::hom-PaceA preparada se verificó de manera que la secuencia de nucleótidos de la región diana obtenida se analizó realizando una PCR utilizando como cebadores la SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 20.
imagen9
La cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P que se utilizó como una cepa parental y la cepa KCCM11016P::hom-PaceA preparada se cultivaron mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 4, y se midió la concentración de L-lisina recuperada de las soluciones de cultivo. En la Tabla 7 se muestra la concentración
5 de L-lisina en las soluciones de cultivo de la cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P y de la cepa KCCM11016P::hom-PaceA cuando no se añadía acetato.
Tabla 7. Variación de la producción de L-lisina (sin añadir acetato)
Cepa
Lisina (g/l)
Lote 1
Lote 2 Lote 3
KCCM11016P
43,2 43,3 43,6
KCCM11016P:: hom-PaceA
43,3 43,6 43,4
Además, las cepas se cultivaron mediante el mismo procedimiento excepto que se añadieron 5 g/l de acetato al 10 medio de producción para comparar la producción de L-lisina. En la Tabla 8 se muestra la concentración de L-lisina en las soluciones de cultivo.
Tabla 8. Variación de la producción de L-lisina (5 g/l de acetato añadido)
Cepa
Lisina (g/l)
Lote 1
Lote 2 Lote 3
KCCM11016P
44,9 45,6 45,2
KCCM11016P:: hom-PaceA
46,3 46,6 46,4
Como se muestra en la Tabla 7, en ausencia de acetato, la productividad de L-lisina de la cepa KCCM11016P::hom15 PaceA no fue diferente de la de la cepa parental KCCM11016P.
Sin embargo, como se muestra en la Tabla 8, en presencia de acetato, la productividad de L-lisina de la cepa KCCM11016P::hom-PaceA fue más de 2,6 % más alta que la de la cepa parental KCCM11016P.
Ejemplo 10: Preparación de un vector para inhibir la expresión del gen murE
La UDP-N-acetilmuramoilalanil-D-glutamato-2,6-diaminopimelato ligasa (murE, NCgI2083) utiliza meso-2,6-di
20 aminopimelato, que es un precursor para la biosíntesis de lisina, en síntesis somática. El debilitamiento de la actividad del gen murE puede disminuir el flujo de entrada de fuentes de carbono a la síntesis somática y aumentar el flujo de entrada de fuentes de carbono a una ruta biosintética de lisina para aumentar la producción de lisina.
En Corynebacterium glutamicum, el gen murE (NCgI2083) forma un operón con siete genes de NCgI2076 a NCgI2082. La transcripción del operón comienza desde murE NCgI2083 en dirección del gen NCgI2076. De este 25 modo, existe un terminador de la transcripción cadena abajo del gen NCgI2076. Por lo tanto, se insertó un promotor del gen aceA cadena abajo del codon de terminación del gen murE de tal manera que podía producirse la transcripción en una dirección opuesta a la dirección original de la transcripción del gen murE para inhibir de manera selectiva la expresión del gen murE en presencia de acetato. Para mantener la expresión de los otros siete genes excepto la del gen murE que se localizaba en la primera región del operón, adicionalmente se añadió el promotor del
30 operón murE cadena arriba de la ORF del gen NCgI2082.
En el Ejemplo 10, se preparó un vector recombinante insertando un promotor del gen aceA cadena abajo del codon de terminación del gen murE.
Para obtener un fragmento de un gen murE procedente de Corynebacterium glutamicum, el ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P se usó como molde, y se sintetizaron cebadores, que se diseñaron para 35 que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xbal en el extremo 5’ del fragmento y un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xhol en el extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NO: 23 y 24). Se realizó una PCR utilizando los cebadores sintetizados para obtener un fragmento de ADN que incluía 300 pares de bases entre el nucleótido 1267 desde el codon de inicio del gen murE y el nucleótido 1566 que era un codon de terminación. Además, se sintetizaron cebadores diseñados para que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de 40 restricción Xhol en un extremo 5’ del fragmento y un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xbal en un extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NO: 25 y 26). Se realizó una PCR utilizando los cebadores sintetizados para obtener un fragmento de ADN que incluía 292 pares de bases desde el nucleótido 10 cadena abajo del codon de terminación del gen murE. Se realizó una PCR en las mismas condiciones que las del Ejemplo 2. Los dos productos de amplificación de la PCR y un vector pDZ para la introducción cromosómica que ya se había preparado
45 escindiendo con una enzima de restricción Xbal, se clonaron utilizando un kit de clonación In-fusion (TAKARA, JP) para preparar un vector pDZ-murE.
imagen10
SEQ ID NO: 23: mur-m1 F 5’-ccggggatcctctagaaaccctcgttcagaggtgc -3’ SEQ ID NO: 24: mur-m1 R 5’-ttgtgatcatctcgagctatccttcttccgtagtaag -3’ SEQ ID NO: 25: mur-m2F 5’-ag ctcgagatgatcacaatgacccttgg -3’ SEQ ID NO: 26: mur-m2R 5’-gcaggtcgactctagacatgagcataaatgtcagc -3’
5 Para obtener un fragmento de un gen aceA procedente de Corynebacterium glutamicum, se sintetizaron cebadores que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xhol en un extremo 5’ del fragmento (SEQ ID NO: 27 y 28). Como molde se utilizó el ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11016, y los cebadores sintetizados se utilizaron para realizar una PCR para amplificar una región promotora de aproximadamente 500 pares de bases que se representaba mediante una secuencia de bases de SEQ ID NO: 1.
10 Además, para obtener una región promotora de un operón murE procedente de Corynebacterium glutamicum, como molde se usó el ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P y se sintetizaron cebadores que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xhol en un extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NO: 29 y 30). Se realizó una PCR utilizando los cebadores sintetizados para obtener un fragmento de ADN que incluía 300 pares de bases cadena arriba de la ORF del gen murE.
15 Los dos productos de amplificación por PCR y el fragmento de ADN obtenido tratando el vector pDZ-murE con la enzima de restricción Xhol se clonaron utilizando un kit de clonación In-fusion (TAKARA, JP) para preparar un vector pDZ-murE-PaceA-PmurE.
SEQ ID NO: 27: mur-m3F 5’-tcatcagcagcactctgactacctctg -3’ SEQ ID NO: 28: mur-m3R 5’-agaaggatagctcgagttcctgtgcggtacgtggc -3’ 20 SEQ ID NO: 29: mur-m4F 5’-agagtgctgctgatgatcctcgatttg -3’ SEQ ID NO: 30: mur-m4R 5’-ttgtgatcatctcgagggttttctctcctccacagg -3’
Ejemplo 11: Preparación de cepas en las que se insertó un promotor del gen aceA cadena abajo del gen murE y comparación de la productividad de lisina de las mismas
La cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P se transformó con el vector pDZ-murE-PaceA-PmurE 25 preparado en el Ejemplo 10 mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 3.
La cepa en la que se insertó un promotor del gen aceA cadena abajo del codón de terminación del gen murE en el cromosoma de tal manera que la transcripción podía ocurrir en una dirección opuesta a la dirección original de la transcripción del gen murE, se seleccionó realizando una PCR para obtener una cepa productora de L-lisina, que se denominó KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE. La cepa KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE preparada se verificó
30 de manera que las secuencias de nucleótidos de la región diana obtenidas se analizó realizando una PCR utilizando la SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 26 como cebadores.
La cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, que se usó como una cepa parental, y la cepa KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE preparada, se cultivaron mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 4, y se midió la concentración de la L-lisina recuperada de las soluciones de cultivo. En la Tabla 9 se muestra la
35 concentración de L-lisina en las soluciones de cultivo de la cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P y de la cepa KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE cuando no se añade acetato.
Tabla 9. Variación de la producción de L-lisina (sin añadir acetato)
Cepa
Lisina (g/l)
Lote 1
Lote 2 Lote 3
KCCM11016P
43,5 43,9 44,0
KCCM11016P:: murE-PaceA-PmurE
43,7 44,1 43,8
Además, las cepas se cultivaron mediante el mismo procedimiento excepto que se añadieron 5 g/l de acetato al 40 medio de producción para comparar la producción de L-lisina. En la Tabla 10 se muestra la concentración de L-lisina en las soluciones de cultivo.

Tabla 10. Variación de la producción de L-lisina (5 g/l de acetato añadido)
Cepa
Lisina (g/l)
Lote 1
Lote 2 Lote 3
KCCM11016P
45,2 45,6 45,3
KCCM11016P:: murE-PaceA-PmurE
46,6 46,9 46,5
Como se muestra en Tabla 9, en ausencia de acetato, la productividad de L-lisina de la cepa KCCM11016P::murE45 PaceA-PmurE no era diferente de la de la cepa parental KCCM11016P.
imagen11
Sin embargo, como se muestra en la Tabla 10, en presencia de acetato, la productividad de L-lisina de la cepa KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE fue más de 2,8 % más alta que la de la cepa parental KCCM11016P.
Ejemplo 12: Preparación de un vector para inhibir la expresión del gen dapA
La ruta biosintética de la L-lisina utilizando el mismo sustrato que el de la ruta biosintética de la L-treonina puede
5 debilitarse para aumentar la productividad de L-treonina. Un ejemplo de los procedimientos de debilitamiento de la ruta biosintética de L-lisina es disminuir la actividad enzimática de la dihidrodipicolinato sintasa (dapA, NCgI1896) que está implicada en la producción de lisina a partir de aspartato.
En Corynebacterium glutamicum, el gen dapA forma el operón dapA-ORF4 con el gen ORF4 (NCgI1895), y por tanto el terminador de la transcripción del gen dapA existe cadena abajo del gen ORF4. Además, se notificó que existía un 10 promotor cadena arriba del operón dap-ORF4 que está cadena arriba del gen dapA, y que existía un segundo promotor cadena arriba del gen ORF4 (Patek y col., Biotechnology letters, 19: 1113-1117, 1997). Por lo tanto, se insertó un promotor del gen aceA cadena abajo del codon de terminación del gen dapA de tal manera que la transcripción puede producirse en una dirección opuesta a la dirección original de la transcripción del gen dapA para inhibir de manera selectiva la expresión del gen dapA en presencia de acetato. Para mantener la expresión del gen
15 ORF4, se añadió una secuencia de región promotora de aproximadamente 100 pares de bases en el gen ORF4 cadena arriba en la ORF cadena arriba del gen ORF4.
En el Ejemplo 12, se preparó un vector recombinante insertando un promotor del gen aceA cadena abajo del codon de terminación del gen dapA.
Para obtener un fragmento de un gen dapA procedente de Corynebacterium glutamicum, como molde se usó el ADN
20 cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P y se sintetizaron cebadores que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xbal en un extremo 5’ del fragmento y un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Spel en un extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NO: 31 y 32). Se realizó una PCR utilizando los cebadores sintetizados para obtener un fragmento de ADN que incluía 301 pares de bases entre el nucleótido 606 del codon de inicio del gen de dapA y el nucleótido 906 que era un codon de terminación.
25 Además, se sintetizaron cebadores, que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Spel en un extremo 5’ del fragmento y un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xbal en un extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NOs: 33 y 34). A través de una PCR, se obtuvo un fragmento de ADN que adicionalmente incluía una secuencia de región promotora de aproximadamente 100 pares de bases entre el nucleótido 809 del codon de inicio del gen dapA y el nucleótido 2 en el codon de terminación cadena abajo, para
30 mantener la expresión del gen ORF4, y 213 pares de bases del codon de terminación del gen dapA. La PCR se realizó en las mismas condiciones que las del Ejemplo 2. Los dos productos de amplificación de la PCR y un vector pDZ para la introducción cromosómica que ya se había preparado mediante la escisión con una enzima de restricción Xbal, se clonaron utilizando un kit de clonación In-fusion (TAKARA, JP) para preparar un vector pDZdapA.
35 SEQ ID NO: 31: dapA-d1 F 5’-ccggggatcctctaga tgtttggcttgctttgggc -3’ SEQ ID NO: 32: dapA-d1 R 5’-gttgatgcactagtttatagaactccagcttt-3’ SEQ ID NO: 33: dapA-d2F 5’-ttctataaactagtgcatcaacgtaggagatcc -3’ SEQ ID NO: 34: dapA-d2R 5’-gcaggtcgactctagacgttctgggaaccctgag -3’
Para obtener un fragmento promotor de un gen aceA procedente de Corynebacterium glutamicum, se sintetizaron
40 cebadores que se diseñaron para que tuviesen un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Spel en un extremo 5’ y en un extremo 3’ del fragmento (SEQ ID NO: 35 y 36). La PCR se realizó utilizando como molde el ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P y los cebadores sintetizados para amplificar una región promotora de aproximadamente 500 pares de bases que se representaba por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. El producto amplificado de la PCR y un fragmento de ADN, que se obtuvo tratando un vector pDZ-dapA
45 con la enzima de restricción Spel, se clonaron utilizando el kit de clonación In-fusion (TAKARA, JP) para preparar un vector pDZ-dapA-PaceA.
SEQ ID NO: 35: PaceA-d3F 5’-acgttgatgc actagt agcactctgactacctctg -3’ SEQ ID NO: 36: PaceA-d3R 5’-agttctataa actagt ttcctgtgcggtacgtggc -3’
Ejemplo 13: Preparación de cepas en las que se inserta el promotor del gen aceA cadena abajo del gen dapA 50 y comparación de la productividad de treonina de las mismas
Para verificar el efecto de la inhibición de la expresión del gen dapA en una cepa productora de L-treonina, el vector pDZ-dapA-PaceA preparado en el Ejemplo 12 se transformó mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 3 en una cepa de Corynebacterium glutamicum KCCM11222P (patente coreana n.º 2013-0061570) que es una cepa productora de L-treonina. La cepa en la que se insertó el promotor del gen aceA cadena abajo del codon de 55 terminación del gen dapA en el cromosoma de tal manera que podía producirse la transcripción en una dirección opuesta a la dirección original de la transcripción del gen dapA se seleccionó realizando una PCR, que se denominó KCCM11222P::dapA-PaceA. La cepa KCCM11222P::dapA-PaceA preparada se verificó de manera que la secuencia de nucleótidos de la región diana obtenida se analizó realizando una PCR utilizando la SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO:
5
10
15
20
25
30
35
40
34 como cebadores.
La cepa de Corynebacterium glutamicum KCCM11222P, que se utilizó como una cepa parental, y la cepa KCCM11222P::dapA-PaceA preparada se cultivaron mediante el procedimiento descrito más adelante.
Cada una de las cepas se inoculó respectivamente a 25 ml de un medio de siembra en matraces deflectores angulares de 250 ml, seguido de un cultivo con agitación a 200 rpm a 30 °C durante 20 horas. Después de esto, se añadió 1 ml de la solución de cultivo de siembra a un matraz deflector angular de 250 ml incluyendo 24 ml de un medio de producción, seguido de un cultivo con agitación a 200 rpm a 30 °C durante 48 horas a 200 rpm. Las composiciones respectivas del medio de siembra y los medios de producción se describen a continuación.
<Medio de siembra (pH 7,0)>
glucosa 20 g, peptona 10 g, extracto de levadura 5 g, urea 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4•7(H2O) 0,5 g, biotina 100 μg, HCL tiamina 1.000 μg, pantotenato de calcio 2.000 μg, nicotinamida 2.000 μg (con referencia a 1 l de agua destilada).
<Medio de producción (pH 7,0)>
glucosa 100 g, (NH4)2SO4 20 g, proteína de soja 2,5 g, sólidos de macerado de almidón 5 g, urea 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4•7(H2O) 0,5 g, biotina 100 μg, HCL tiamina 1.000 μg, pantotenato de calcio 2.000 μg, nicotinamida 3.000 μg, CaCO3 30 g (con referencia a 1 l de agua destilada).
Después del cultivo, la concentración de L-treonina en la solución de cultivo se midió mediante HPLC. En la Tabla 11 se muestra la concentración de L-treonina en las soluciones de cultivo de Corynebacterium glutamicum KCCM11222P y KCCM11222P::dapA-PaceA cuando no se añade acetato.

Tabla 11. Variación de la producción de L-treonina (sin añadir acetato)
Cepa
Treonina (g/l)
Lote 1
Lote 2 Lote 3
KCCM11222P
7,0 6,9 7,2
KCCM11222P:: dapA-PaceA
7,1 7,3 7,0
Además, las cepas se cultivaron mediante el mismo procedimiento excepto que se añadieron 5 g/l de acetato al medio de producción para comparar la producción de L-treonina. En la Tabla 12 se muestra la concentración de Ltreonina en las soluciones de cultivo.
Tabla 12. Variación de la producción de L-treonina (5 g/l de acetato añadido)
Cepa
Treonina (g/l)
Lote 1
Lote 2 Lote 3
KCCM11222P
7,6 7,4 7,7
KCCM11222P:: dapA-PaceA
11,2 11,5 11,4
Como se muestra en Tabla 11, en ausencia de acetato, la productividad de L-treonina de la cepa KCCM11222P::dapA-PaceA no era diferente de la de la cepa parental KCCM11222P.
Sin embargo, como se muestra en la Tabla 12, en presencia de acetato, la productividad de L-treonina de la cepa KCCM11222P::dapA-PaceA fue más del 50 % superior que la de la cepa parental KCCM11222P.
[Número de registro]
Nombre del centro de investigación: colección coreana de cultivos tipo (internacional)
Número de registro: KCCM11432P
Fecha de registro: 12 de junio de 2013
Como se ha descrito anteriormente, de acuerdo con una o más de las realizaciones anteriores de la presente invención, puede utilizarse un promotor inducible por acetato para producir de un modo eficaz L-aminoácidos, dado que un L-aminoácido diana puede producirse en un alto rendimiento debilitando la expresión de un gen diana añadiendo acetato a un tiempo apropiado.
Aunque se han descrito una o más realizaciones de la presente invención con referencia a las figuras, los expertos en la materia han de entender que pueden realizarse diversos cambios en cuanto a la forma y detalles en su interior sin alejarse del ámbito de la presente invención como se define en las siguientes reivindicaciones.

Claims (5)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de producción de L-aminoácidos, comprendiendo el procedimiento
    1) cultivar un microorganismo corineforme recombinante capaz de producir L-aminoácidos, en el que el microorganismo corineforme recombinante tiene un promotor inducible por acetato cadena abajo de un codon de
    5 terminación de un gen diana en un cromosoma; y 2) añadir acetato durante el cultivo para debilitar la expresión del gen diana, y para intensificar la capacidad de producción de L-aminoácidos del microorganismo corineforme recombinante,
    en el que el promotor inducible por acetato está en una dirección opuesta a la transcripción del gen diana.
  2. 2. El procedimiento de producción de L-aminoácidos de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cadena abajo
    10 del codón de terminación está entre el codón de terminación y la cadena arriba de un terminador de transcripción del gen diana.
  3. 3.
    El procedimiento de producción de L-aminoácidos de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el promotor inducible por acetato se representa por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
  4. 4.
    El procedimiento de producción de L-aminoácidos de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el gen diana es al
    15 menos un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen que codifica una subunidad E1 de la piruvato deshidrogenasa, un gen que codifica una homoserina deshidrogenasa, un gen que codifica un gen UDP-Nacetilmuramoilalanil-D-glutamato-2,6-diaminopimelato ligasa y un gen que codifica una dihidrodipicolinato sintasa.
  5. 5. El procedimiento de producción de L-aminoácidos de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el L-aminoácido es L-lisina o L-treonina.
    20
    23
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