BR122021015693B1 - Microrganismo produtor de lisina e método para a produção de l-lisina - Google Patents

Microrganismo produtor de lisina e método para a produção de l-lisina Download PDF

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Abstract

A presente invenção refere-se a um polinucleotídeo modificado que codifica cinase de aspartato (EC: 2.7.2.4, a seguir, referido como LysC), transcetolase (EC: 2.2.1.1, a seguir, referido como TKT) ou piruvato carboxilase (EC: 6.4.1.1 , a seguir, referido como Pyc), em que o códon de iniciação ATG é substituído com, um vetor que inclui o mesmo, um microrganismo transformado com o vetor, e um método para a produção de L-lisina utilizando dos mesmos.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Pedido Dividido do pedido de patente No. BR 11 2014 015215 2 depositado em 21/12/2012. Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se a um polinucleotídeo modificado em que o códon de iniciação ATG é substituído com, um vetor que inclui o mesmo, um microrganismo transformado compreendendo o polinucleotídeo, e um método para a produção de L-lisina utilizando dos mesmos.
Descrição da Técnica Relacionada
[002] As cepas do gênero Corynebacterium, especificamente Corynebacterium glutamicum, são os microrganismos Gram-positivos, que são amplamente usados para a produção de L-lisina. L-lisina é usada para alimentos de animais, medicamentos e cosméticos para os seres humanos, e é produzido por meio de fermentação da cepa Corynebacterium.
[003] Convencionalmente, uma cepa do gênero Corynebacterium possuindo genes melhorados da biossíntese da lisina e um método de produção de L-lisina usando o mesmo são conhecidos. Por exemplo, a Patente americana US No. 6.746.855 descreve um método para a produção de L-lisina através da cultura de Corynebacterium que tem uma expressão aumentada do gene lysE (gene transportador de exportação da lisina), e adicionalmente, os genes introduzidos selecionados a partir do grupo que consiste em um gene dapA, um gene IysC, um gene pyc e um gene dapB.
[004] Outro método é para amplificar genes na rota da biossíntese da lisina ou para modificar um promotor. Por exemplo, o pedido de patente Coreano em aberto N°s 2009-0082702 e 2009-0084099 descreve um método para a produção de L-lisina através da introdução de promotores melhorados do operon ddh e IysC-asd em Corynebacterium. O pedido de patente Coreano em aberto N° 2008-0025355 descreve um método para melhorar a produtividade de lisina através da amplificação do número de cópias dos genes na via de biossíntese da lisina, que são aspB, IysC, asd, dapA, dapB, lysA, e pyc, no cromossomo.
[005] Enquanto isso, o códon de iniciação, que é reconhecido pelos ribossomas para iniciar a tradução no cromossoma é geralmente ATG. A tradução pode ser controlada de acordo com o códon de iniciação do gene, e a sequência do códon de iniciação é importante na regulação da atividade da proteína. No entanto, enquanto ATG é um códon de iniciação comum entre os genes da biossíntese da lisina derivados de Corynebacterium glutamicum, o códon de iniciação de genes lysC e pyc é GTG, e TTG é para o gene tkt na via da pentose fosfato contém o códon de iniciação TTG (referência: J. Biotechnol. 104: 5
[006] Os presentes inventores têm feito esforços para encontrar um método para melhorar a produtividade da lisina, e como resultado, eles descobriram que o códon de iniciação dos genes do tipo selvagem IysC, tkt e pyc pode ser substituído por ATG para aumentar as atividades de cinase de aspartato, transcetolase e piruvato carboxilase sobre as suas atividades endógenas, completando assim a presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] Um objetivo da presente invenção é fornecer um polinucleotídeo modificado codificando a cinase de aspartato (EC:2.7.2.4, a seguir, referido como LysC), transcetolase (EC:2.2.1.1, a seguir, referido como TKT) ou carboxilase de piruvato (CE:6.4.1.1, a seguir, referido como Pyc), em que o códon de iniciação do polinucleotídeo é substituído por ATG.
[008] Outro objetivo da presente invenção é o de fornecer um vetor compreendendo um ou mais polinucleotídeos modificados que codificam aspartato quinase, transcetolase, ou piruvato carboxilase, em que o códon de iniciação do polinucleotídeo é substituído por ATG
[009] Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um microrganismo, em que uma ou mais dentre as enzimas têm atividade aumentada em comparação com a sua atividade endógena.
[010] Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para a produção de L-lisina, que compreende os passos de cultivar o microrganismo, e recuperar a L-lisina a partir do microrganismo em cultura ou do caldo de cultura.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS
[011] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo modificado codificando a cinase de aspartato (EC:2.7.2.4, a seguir, referido como LysC), transcetolase (EC:2.2.1.1, a seguir, referido como Tkt) ou piruvato carboxilase (CE:6.4.1.1, a seguir, referido como Pyc), em que o códon de iniciação do polinucleotídeo é substituído por ATG.
[012] Cada polinucleotídeo codificando aspartato quinase, transcetolase ou piruvato carboxilase pode também incluir uma substituição parcial, deleção, inserção ou adição no polinucleotídeo, desde que cada um deles tenha a atividade enzimática, e pode ter 70% ou mais de homologia com, especificamente, 80% ou mais de homologia, mais especificamente 90% ou mais de homologia, e muito mais especificamente 95% ou mais de homologia, e, o mais especificamente 100% de homologia com base no polinucleotídeo conhecido.
[013] Tal como aqui usado, o termo "homologia (homólogo)" significa que o grau de semelhança entre as sequências de nucleotídeos do gene IysC, gene tkt ou gene pyc das sequências de tipo selvagem e de nucleotídeos dos genes modificados correspondentes dos mesmos, isto é, o gene modificado IysC, o gene tkt ou o gene pyc, em que uma parte dos polinucleotídeos é substituída, eliminada, inserida ou adicionada.
[014] Tal como aqui usado, o termo "códon de iniciação" significa três nucleotídeos correspondentes a tradução de um ponto de partida, quando uma sequência de codificação de RNAm (RNA mensageiro) é traduzida em uma proteína. Em geral, os códons de iniciação encontrados no cromossomo dos microrganismos são ATG (AUG em mRNA), GTG (GUG em mRNA) e TTG (UUG em mRNA), e existem em uma proporção de 62,5%- 66,5%, 23,1% - 24,3% e 10,3% -13,2% de acordo com o resultado da análise de toda a sequência do genoma de Corynebacterium glutamicum (referência: Handbook of Corynebacterium glutamicum, 40p, Lothar Eggeling & Michael Bott, 2005).
[015] Entre os genes da biossíntese da lisina derivados de Corynebacterium relatados até agora, IysC e pyc tem o códon de iniciação de GTG, e tkt tem o códon de iniciação TTG. O códon de iniciação desses genes não é ATG, que é considerado como uma característica única de Corynebacterium.
[016] O polinucleotídeo modificado de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo fato de que o codon de iniciação do gene IysC, tkt ou pyc é substituído por ATG, e esses polinucleotídeos modificados possuindo tal códon de iniciação substituídos foram modificados em primeiro lugar pelos presentes inventores. Em mais detalhes, o códon de iniciação GTG do polinucleotídeo que codifica cinase de aspartato (LysC) ou carboxilase de piruvato (Pyc) é substituído com ATG, e o códon de iniciação TTG do polinucleotídeo codificando a transcetolase (TKT) é substituído com ATG na presente invenção. Mais especificamente, as sequências de genes IysC, tkt, e pyc são SEQ ID NOs. 13, 14, e 15, respectivamente, as sequências dos genes possuindo o códon de iniciação substituído como ATG são representados pelas SEQ ID NOs. 16, 17, e 18, respectivamente.
[017] As substituições de bases dos códons de iniciação podem ser realizadas por qualquer método conhecido no estado da técnica, por exemplo, mutagênese de sítio específico, recombinação homóloga, mas não estão limitadas a eles.
[018] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um vetor compreendendo um ou mais polinucleotídeos modificados de polinucleotídeos modificados codificando cinase de aspartato, transcetolase ou carboxilase de piruvato, em que o códon de iniciação do polinucleotídeo é substituído com ATG.
[019] Os polinucleotídeos modificados possuindo o códon de iniciação substituído como ATG e codifricando aspartato quinase, transcetolase ou piruvato carboxilase, que está compreendido no vetor da presente invenção, podem incluir aqueles em que uma parte dos polinucleotídeos é substituída, eliminada, inserida ou adicionada, contanto que eles tenham atividade enzimática, e possa ter 70% ou mais de homologia, especialmente 80% ou mais de homologia, mais especificamente 90% ou mais de homologia, muito mais especificamente 95% ou mais de homologia, e o mais especificamente 100% de homologia.
[020] Além disso, os polinucleotídeos modificados possuindo o códon de iniciação substituído como ATG e que codificam cinase de aspartato, transcetolase ou carboxilase de piruvato, que está compreendido no vetor da presente invenção, também podem incluir apenas uma parte do gene que codifica cinase de aspartato, transcetolase ou carboxilase de piruvato, contanto que eles tenham o códon de iniciação substituído como ATG.
[021] Tal como aqui utilizado, o termo "vetor" refere-se a uma construção de DNA que contém uma sequência de bases que é operacionalmente ligada a uma sequência de controle adequada, para a expressão de um gene alvo em um hospedeiro adequado. As sequências de controle podem incluir um promotor para iniciar a transcrição, uma determinada sequência de operador para controlar tal transcrição, uma sequência codificando um sítio de ligação ao ribossoma adequado para o mRNA, e uma sequência de terminação para controle de transcrição e tradução. O vetor usado na presente invenção não é particularmente limitado, e pode ser qualquer vetor conhecido no estado da técnica, desde que seja replicável no hospedeiro. Por exemplo, o vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago, ou um inserto do genoma potencial, e é especificamente pDZ (Patente Coreana No. 10-0924065), mas não está limitado a eles. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode ser integrado no próprio genoma.
[022] Especificamente, uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO. 13, 14 ou 15) que compreende o códon de iniciação do gene IysC, tkt ou pyc foi adquirido, e com base nesta sequência, iniciadores possuindo o códon de iniciação substituído como ATG foram sintetizados. Um PCR foi realizado usando os iniciadores e um DNA cromossômico da cepa produzindo L-lisina como um molde, de modo a obter o DNA do qual uma extremidade é substituída com ATG. Este fragmento de DNA assim obtido foi clonado em um vetor para obter um vetor recombinante final. Mais especificamente, na presente invenção, vetores pDZ-IysC (ATG), pDZ-tkt (ATG) e pDZ-pyc (ATG) foram construídos, respectivamente.
[023] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um microrganismo que inclui um ou mais polinucleotídeos modificados com o códon de iniciação substituído como ATG e codificando enzimas selecionadas a partir de um grupo constituído por aspartato quinase, transcetolase e piruvato carboxilase, e depois melhorou em níveis de tradução de mRNAs transcritos a partir dos polinucleotídeos em proteínas, resultando em atividades melhoradas de uma ou mais das enzimas em comparação com as atividades endógenas destas. O microrganismo da presente invenção pode ter atividade melhorada da cinase de aspartato, transcetolase ou carboxilase de piruvato usando os polinucleotídeos modificados em combinações de um, dois, ou três dos mesmos, em que os polinucleotídeos codificam as enzimas modificadas correspondentes e são substituídos com ATG no códon de iniciação.
[024] A fim de substituir ATG por códons de iniciação de genes alvo no cromossoma do microrganismo, vários métodos conhecidos no estado da técnica podem ser usados. Por exemplo, o códon de iniciação de sequências de genes endógenos IysC, tkt e pyc no microrganismo pode ser substituído no cromossomo. Alternativamente, os genes correspondentes possuindo sequências de códon de iniciação substituído pode ser introduzido no microrganismo sob a forma de um plasmídeo.
[025] O microrganismo pode ser de qualquer cepa contato que possua a produtividade de L-lisina. Especificamente, pode ser um microrganismo de Corynebacterium sp. ou de Brevibacterium sp. Exemplos de microrganismos de Corynebacterium sp. ou Brevibacterium sp. incluem Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Além disso, variantes produtoras de L-lisina ou derivados destes, por exemplo, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (este microrganismo foi divulgado como KFCC10881, e re-depositado em uma Autoridade de Depósito Internacional sob o Tratado de Budapeste com Acesso No. KCCM11016P, Patente Coreana No. 10-0159812, Patente Coreana No. 10-0397322) e Corynebacterium glutamicum KFCC 11001, podem ser incluídos. Além disso, pode ser Corynebacterium glutamicum com Acesso No. KCCM11016P.
[026] Especificamente, Corynebacterium glutamicum com Acesso No. KCCM11016P foi transformada com um vetor que compreende o polinucleotídeo codificando cinase de aspartato, transcetolase ou carboxilase de piruvato em que o códon de iniciação é substituído com ATG para obter Corynebacterium glutamicum recombinante. Mais especificamente, pDZ-IysC (ATG), pDZ-tkt (ATG) ou pDZ-pyc (ATG) do vetor foi introduzido em Corynebacterium glutamicum, com o Acesso No. KCCM11016P, respectivamente, de modo a obter cada Corynebacterium glutamicum recombinante.
[027] Além disso, o microrganismo pode ser transformado com um vetor que compreende dois ou mais polinucleotídeos de polinucleotídeos que codificam cinase de aspartato, transcetolase ou carboxilase de piruvato e que possuem o códon de iniciação substituído como ATG. Especificamente, o vetor pDZ-tkt (ATG) compreendendo o gene do qual o códon de iniciação tenha sido substituído com ATGand codificando transcetolase é transformado em Corynebacterium glutamicum KCCM11016P IysC-, em que o códon de iniciação GTG de IysC é substituído com ATG, e através da segunda passagem, os códons de iniciação de IysC e tkt no cromossomo são substituídos com ATG de modo a obter Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-IysC-tkt. Além disso, o vetor de pDZ-pyc (ATG) que compreende polinucleotídeo do qual o códon de iniciação foi substituído com ATG e que codifica piruvato carboxilase é transformado em KCCM11016P IysC-, em que o códon de iniciação GTG de IysC é substituído com ATG, e através da segunda passagem, os códons de iniciação de IysC e pyc no cromossomo são substituídos com ATG de modo a obter-KCCM11016P IysC-pyc. Além disso, o vetor de pDZ-tkt (ATG) é transformado em KCCM11016P-IysC-pyc como preparado acima, em que o códon de iniciação GTG de IysC e pyc é substituído com ATG, e através da segunda passagem, os códons de iniciação de IysC, pyc e tkt no cromossomo são substituídos com ATG de modo a obter-KCCM11016P IysC-pyc-tkt. Foi confirmado que os códons de iniciação de IysC, pyc e tkt podem também ser substituídos com ATG em outras cepas produtoras de lisina pertencentes a Corynebacterium glutamicum, KFCC10750 (este microrganismo foi descrito como KFCC10750, e re-depositado a uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste com o Acesso No. KCCM11347P, Patente Coreana No. 10-0073610), KCCM10770P, Patente Coreana No. 10-0924065), CJ3P (Genome Biology, 2012, 13:R40) da mesma maneira. Estes resultados sugerem que os polinucleotídeos modificados da presente invenção podem ser estavelmente introduzidos em várias cepas pertencentes a Corynebacterium sp., aumentando assim a produtividade de L-lisina.
[028] Especificamente, o transformante KCCM11016P-IysC-pyc-tkt, o qual foi obtido através da introdução de vetores pDZ-IysC (ATG), pDZ-tkt (ATG) e pDZ-pyc (ATG) incluindo os polinucleotídeos que codificam cinase de aspartato, transcetolase e carboxilase de piruvato em Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, foi designado como Corynebacterium glutamicum CA01-2059, e depositado em 2 de maio de 2011 no Centro de Cultura Coreana de Microrganismos (a seguir, abreviado para "KCCM"), que é Autoridade Internacional de Depósito sob o Tratado de Budapeste, sob Acesso No. KCCM11188P. É depositado por uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste.
[029] O microrganismo de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo fato de que os códons de iniciação dos genes do tipo selvagem codificando as enzimas acima são substituídos com ATG, e por conseguinte, o microrganismo tem atividade melhorada da cinase de aspartato, transcetolase e carboxilase de piruvato em comparação com as atividades endógenas dos mesmos, resultante da melhoria notável dos níveis de tradução de RNAm transcrito a partir dos genes IysC, tkt e pyc nas proteínas.
[030] Tal como aqui usado, o termo "atividade endógena" significa a atividade de uma enzima em um microrganismo nativo, e por exemplo, a atividade da aspartato quinase, transcetolase ou carboxilase de piruvato em um microrganismo nativo pertencente ao Corynebacterium sp. O termo "atividade endógena melhorada" significa que a atividade é melhorada em comparação com a da enzima nativa.
[031] Especificamente, quando a atividade do aspartato cinase da cepa em que o códon de iniciação do gene IysC foi substituído com ATG foi comparada com a da cepa original KCCM11016P, aumento de 2,73 vezes na atividade da aspartato quinase foi observado (Tabela 4). Além disso, quando a atividade da transcetolase da cepa em que o códon de iniciação do gene tkt foi substituído com ATG foi comparada com a da cepa-parental KCCM11016P, aumento de 3,5 vezes na atividade de transcetolase foi observado (Tabela 5). Além disso, quando a atividade de piruvato carboxilase da cepa em que o códon de iniciação do gene pyc é substituído com ATG foi comparada com a da cepa parental KCCM11016P, aumento de 1,89 vezes na atividade da carboxilase de piruvato foi observado (Tabela 6).
[032] Verificou-se que a produtividade de L-lisina do microrganismo pode ser aumentada através da melhoria da atividade da cinase de aspartato, transcetolase, carboxilase de piruvato, ou uma combinação dos mesmos.
[033] Na presente invenção, as quantidades de L-lisina produzida nas cepas produtoras de L lisina, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-IysC, KCCM11016P-tkt, KCCM11016P-pyc, KCCM11016P-IysC-tkt, KCCM11016P- IysC-pyc, e-KCCM11016P -IysC-pyc-tkt foram medidos, e como resultado, eles mostraram uma melhoria notável na produção de L-lisina em comparação com a cepa parental KCCM11016P (Tabela 7). Além disso, outras cepas produtoras de lisina pertencentes a Corynebacterium glutamicum, KFCC10750 (Patente Coreana No. 10-0073610), KCCM10770P, Patente Coreana No. 10-0924065), e CJ3P (Genome Biology 2012, 13:R40), em que os códons de iniciação de IysC, pyc e tkt foram substituídos com ATG, mostraram uma melhoria notável na produção de L-lisina em comparação com a cepa parental (Tabelas 8 - 10). Estes resultados sugerem que os microrganismos que apresentam um tipo de polinucleotídeos modificados codificando lysC, Tkt, ou Pyc, ou possuindo dois tipos de polinucleotídeos modificados codificando as enzimas, ou com pelo menos três tipos de polinucleotídeos modificados codificando as enzimas e possuindo o códon de iniciação substituído como ATG no cromossomo, também mostraram a produtividade de L-lisina notavelmente melhorada em comparação com o microrganismo de tipo selvagem possuindo códon de iniciação GTG ou TTG.
[034] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de L-lisina, que compreende as etapas de cultivar o microrganismo tal como descrito acima; e recuperar a L-lisina a partir do microrganismo em cultura ou do meio de cultura.
[035] Para o cultivo, vários métodos de obtenção de L-lisina usando um microrganismo que são amplamente conhecidos no estado da técnica podem ser utilizados. O cultivo pode ser efetuado de acordo com o método amplamente conhecido, e às condições de cultivo, incluindo a temperatura, o tempo, o pH do meio, etc podem ser controladas adequadamente. Uma descrição detalhada do cultivo é dada no seguinte documento [Chmiel; Bioprozesstechnik 1 Einführung em die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), e Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]. Além disso, o cultivo pode incluir a cultura de batelada, cultura contínua e cultura em batelada alimentada. Especificamente, um processo em batelada, batelada alimentada ou batelada alimentada repetida pode ser operado de um modo contínuo, mas a presente invenção não está limitado a ele.
[036] Para uso no cultivo, um meio deve satisfazer a exigência de uma cepa particular empregada. Os meios de cultura para os microrganismos pertencentes a Corynebacterium sp. são bem conhecidos (por exemplo, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology Washington DC, USA, 1981). As fontes de carbono a serem utilizadas podem incluir sacarídeos e de carbohidratos tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; óleos e lipídeos tais como óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácidos graxos tais como o ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico; álcoois, tais como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos tais como ácido acético. Estes materiais podem ser usados separadamente ou em combinação. As fontes de nitrogênio a serem usadas podem incluir peptona, extrato de levedura, caldo de carne, extrato de malte, solução de infusão de milho, farinha de soja e uréia, ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. Estas fontes de nitrogênio podem ser usadas separadamente ou em combinação. As fontes de fósforo a serem utilizadas podem incluir fosfato de hidrogênio dipotássico, fosfato de dihidrogênio potássico, e sais de sódio correspondentes. Além disso, os meios de cultura pode conter sais de metais, tais como o sulfato de magnésio ou sulfato de ferro essencial para o crescimento. Por último, os nutrientes essenciais, tais como aminoácidos e vitaminas podem ser utilizados, além das substâncias acima mencionadas. Além disso, os precursores adequados podem ser adicionados ao meio de cultura. Estes materiais podem ser adequadamente adicionados à cultura durante cultivos em batelada ou modo contínuo.
[037] O pH do meio de cultura pode ser ajustado com um composto alcalino, tal como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia, ou um composto acídico, tal como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. A formação de espuma pode ser impedida utilizando um agente anti-espuma tal como o éster poliglicólico de ácidos graxos. O meio de cultura pode ser mantido sob condições aeróbicas com a introdução de oxigênio ou de um gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) ali. A temperatura da cultura está normalmente entre 20 e 45 °C e especialmente entre 25 e 40 °C. A cultura é continuada até que uma quantidade máxima de L- lisina seja produzida. A este respeito, pode ser realizada dentro de 10 a 160 horas. Depois de ser produzida, a L-lisina pode ser exportada para o meio de cultura ou pode permanecer no interior das células.
[038] Além disso, o método para a produção de L-lisina da presente invenção compreende a etapa de recuperação de L-lisina a partir do microrganismo em cultura ou do meio de cultura. O método de recuperação de L-lisina a partir do microrganismo ou do meio de cultura é amplamente conhecido no estado da técnica. Exemplos do método de recuperação de L-lisina podem incluir filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização e HPLC, mas não se limitam a estes.
Exemplos
[039] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, estes exemplos são apenas para fins ilustrativos, e a invenção não se destina a ser limitado por estes exemplos.
[040] Nos Exemplos, os vetores recombinantes para a substituição de ATG pelo códon de iniciação GTG ou TTG do gene IysC gene codificando a aspartato quinase, gene tkt que codifica transcetolase, e o gene pyc codificando piruvato carboxilase derivada a partir da cepa produtora de lisina, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, foram construídos. O vetor foi transformado na cepa KCCM11016P de Corynebacterium glutamicum para obter uma cepa com o códon de iniciação substituído no cromossoma, preparando-se assim uma cepa possuindo a produtividade da lisina aumentada.
[041] A cepa KCCM11016P de Corynebacterium glutamicum utilizada na presente invenção é uma cepa a qual é resistente a S-(2-aminoetil) cisteína (a seguir, referida como AEC) e é permeável a homoserina, preparada por mutação artificial com o tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) como uma cepa parental (divulgado como KFCC10881. Ver Patente Coreana No. 10-0159812, e Patente Coreana No. 10-0397322). Além disso, a cepa KFCC10750 cepa produtora de L-lisina de Corynebacterium glutamicum, que é auxotrófica a homoserina e resistente a um análogo de L-leucina, 4-azaleucina e um antibiótico rifampicina, preparado por mutação artificial (Patente Coreana No. 10-0073610), cepa KCCM10770P é uma cepa produtora de L-lisina derivada de KCCM11016P, que retém duas cópias de seis tipos de genes que constituem a via de biossíntese de lisina no cromossomo (Patente Coreana No. 100924065), e a cepa CJ3P é uma cepa de Corynebacterium glutamicum, que tem a produtividade de L-lisina através da introdução de cada uma das mutações P458S, V59A, e T311I em três tipos de genes do tipo selvagem pyc, hom, e IysC, com base na descrição de Binder et al. (Genome Biology 2012, 13:R40).
Exemplo 1: Construção do vetor recombinante (pDZ-IysC (ATG)) possuindo códon de iniciação substituído ATG em IysC derivado de Corynebacterium glutamicum e Preparação de cepa possuindo códon de iniciação substituído pDZ, (ver a Patente Coreana No. 10-0924065) foi utilizado como vetor de base para o vetor recombinante, que foi construído como a seguir. Construção de vetor recombinante pDZ-IysC (ATG)
[042] A fim de adquirir o gene IysC derivado de Corynebacterium glutamicum, DNA cromossômico de uma cepa produtora de lisina (Corynebacterium glutamicum KCCM11016P) preparado por mutação artificial foi usado como um molde. Com base no genBank no U.S. National Institutes of Health (NIH GenBank), a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO. 13) que contém a região do códon de iniciação do gene IysC (NCBI Acesso No. NC_003450, Ncgl0247) foi adquirida, e com base nesta sequência, dois pares de iniciadores (Tabela 1, SEQ ID NOs. 1 - 4) para substituir o códon de iniciação GTG com ATG, foram sintetizados.
[043] O PCR foi realizado utilizando DNA cromossômico de KCCM11016P como um molde e os iniciadores da seguinte Tabela 1. DNA polimerase de alta- fidelidade PfuUltraTM (Stratagene) foi utilizado como uma polimerase, e o PCR foi realizado com 30 ciclos de desnaturação a 96 °C durante 30 segundos; hibridização a 55 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 30 segundos. Dois fragmentos de DNA assim obtidos foram clonados no vetor de pDZ tratado com a enzima de restrição Xbal usando um kit de clonagem de PCR de fusão (Clontech), e finalmente, um vetor recombinante pDZ-IysC (ATG) foi construído.
(2) Preparação da cepa
[044] O vetor pDZ-IysC (ATG) assim construído foi transformado em KCCM11016P por um método de pulso elétrico (por utilização do método de transformação de acordo com Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545), e em seguida, as cepas em que o gene foi inserido no cromossomo por recombinação homóloga, foram selecionadas em um meio de seleção contendo 25 mg/L de kanamicina. A inserção cromossômica bem sucedida do vetor foi confirmada pela cor azul das colônias em meio sólido contendo X-gal (5-bromo- 4-cloro-3-indolil-(β-D-galactosideo). A cepa com a primeira inserção cromossômica foi cultiva sob agitação (30 °C, 8 horas), em um meio nutriente. Em seguida, a cepa em cultura foi diluída em série de 10-4 a 10-10, e a cultura diluída foi preparada em um meio sólido contendo X-gal. A maioria das colônias exibiu cor azul, enquanto colônias brancas também existiram em um nível baixo. Ao selecionar as colônias brancas, as cepas em que a sequência de nucleotídeos na região do códon de iniciação de IysC foi substituída por meio de uma segunda passagem, foram selecionadas. A substituição de nucleotídeos do códon de iniciação na cepa seleccionada foi finalmente confirmada por PCR utilizando os iniciadores de SEQ ID NOs. 1 e 4 e, em seguida, por meio da análise da sequência de nucleotídeo do sítio alvo.[Tabela 1]
Figure img0001
Exemplo 2: Construção do vetor recombinante (pDZ-tkt (ATG)) possuindo códon de iniciação ATG substituído em tkt derivado de Corynebacterium glutamicum e Preparação de cepa possuindo códon de iniciação substituído
[045] Existem dois códons que são esperados como um códon de iniciação na sequência do gene tkt. Com base na distância do RBS (sítio de ligação ribossômica) e do proteoma, o códon a jusante foi determinado como o códon de iniciação na presente invenção.
(1) Construção do vetor recombinante pDZ-tkt (ATG)
[046] A fim de adquirir gene tkt derivado de Corynebacterium glutamicum, o DNA cromossômico de KCCM11016P foi utilizado como um molde. Com base no genBank no U.S. National Institutes of Health (NIH GenBank), a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO. 14) que contém a região do códon de iniciação do gene tkt (NCBI Acesso No. NC_003450, Ncgl1512) foi adquirida, e com base nesta sequência, dois pares de iniciadores (Tabela 2, SEQ ID NOs. 5 - 8) para substituir o códon de iniciação TTG com ATG, foram sintetizados.
[047] O PCR foi realizado utilizando DNA cromossômico de KCCM11016P como um molde e os iniciadores da seguinte Tabela 2, sob as condições do Exemplo 1-1. Dois fragmentos de DNA assim obtidos foram clonados no vetor de pDZ tratado com a enzima de restrição Xbal usando um kit de clonagem de PCR de fusão (Clontech), e finalmente, um vector recombinante pDZ-tkt (ATG) foi construído.
(2) Preparação da cepa
[048] O vetor pDZ-tkt (ATG) assim construído foi transformado na cepa produtora de lisina KCCM11016P da mesma forma que no Exemplo 1-2, e KCCM11016P-tkt, em que o códon de iniciação de tkt no cromossomo foi substituído com ATG através de uma segunda passagem, foi obtido. A substituição de nucleotídeos do códon de iniciação do gene foi finalmente confirmada por PCR utilizando os iniciadores de SEQ ID NOs. 5 e 8 e, em seguida, por meio da análise da sequência de nucleotídeo do sítio alvo.[Tabela 2]
Figure img0002
Exemplo 3: Construção do vetor recombinante (pDZ-pyc (ATG)) possuindo o códon de iniciação ATG substituído em pyc derivado de Corynebacterium glutamicum e Preparação de cepa possuindo códon de iniciação substituído (2) Construção do vetor recombinante pDZ-pyc (ATG)
[049] A fim de adquirir gene pyc derivado de Corynebacterium glutamicum, o DNA cromossômico de KCCM11016P foi utilizado como um molde. Com base no genBank no U.S. National Institutes of Health (NIH GenBank), a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO. 15) que contém a região do códon de iniciação do gene pyc (NCBI Acesso No. NC_003450, Ncgl0659) foi adquirida, e com base nesta sequência, dois pares de iniciadores (Tabela 3, SEQ ID NOs. 9 - 12) para substituir o códon de iniciação GTG com ATG, foram sintetizados.
[050] O PCR foi realizado utilizando DNA cromossômico de KCCM11016P como um molde e os iniciadores da seguinte Tabela 3, sob as condições do Exemplo 1-1. Dois fragmentos de DNA assim obtidos foram clonados no vetor de pDZ tratado com a enzima de restrição Xbal usando um kit de clonagem de PCR de fusão (Clontech), e finalmente, um vetor recombinante pDZ-pyc (ATG) foi construído.
(2) Preparação da cepa
[051] O vetor pDZ-pyc (ATG) assim construído foi transformado na cepa produtora de lisina KCCM11016P da mesma forma que no Exemplo 1-2, e KCCM11016P-pyc, em que o códon de iniciação de pyc no cromossomo foi substituído com ATG através de uma segunda passagem, foi obtido. A substituição de nucleotídeos do códon de iniciação do gene foi finalmente confirmada por PCR utilizando os iniciadores de SEQ ID NOs. 9 e 12 e, em seguida, por meio da análise da sequência de nucleotídeo do sítio alvo. [Tabela 3]
Figure img0003
Exemplo 4: Medição da atividade enzimática da cinase de aspartato em cepa possuindo códon de iniciação ATG substituído no gene IysC
[052] As células em fase exponencial foram selecionadas por centrifugação (5.000 rpm, 15 minutos) e lavadas três vezes com tampão em 0,1% de Tris-HCl (pH 8,0), e em seguida, suspensa no mesmo tampão para uma turbidez a 610 nm de 160. As células foram rompidas por 6 minutos, utilizando uma batedeira de grânulo depois de esferas de vidro serem adicionadas a 1,25 g/1,5 ml da suspensão. O sobrenadante foi coletado por centrifugação (15.000 rpm, 20 minutos), e medido quantitativamente para o conteúdo de proteína pelo método de Bradford (Bradford, MM 1976. Anal. Biochem. 72:248-254) e utilizado como uma solução de proteína bruta para a medição da atividade enzimática da cinase de aspartato (LysC). A fim de quantificar a atividade enzimática de LysC, aproximadamente 0,05 mL da solução de proteína bruta foi adicionado a uma solução de reação contendo Tris-HCl (pH 8,0) 0,1 M, cloreto de magnésio 0,01 M (MgCl2), hidroxilamina.HCl 0,6 M (pH 7,0), ATP 4 mM, e aspartato 0,2 M para iniciar a reação. A mistura foi deixada reagir a 30 °C durante 30 minutos, e uma solução de parada (10% FeCl2, 3,3% TCA, 0,7 N HCl) foi adicionada para terminar a reação. O sobrenadante foi coletado por centrifugação, e a absorbância a 540 nm foi medida. A unidade (U) de atividade enzimática LysC foi definida como nmol de hidroxamato de aspartato produzido por 1 mg de proteína, durante 1 minuto.
[053] Cepa KCCM11016P IysC foi observada possuindo a atividade de LysC 2,73 vezes maior do que a da cepa parental KCCM11016P (Tabela 4).[Tabela 4]
Figure img0004
Exemplo 5: Medição da atividade enzimática da transcetolase em cepa possuindo códon de iniciação ATG substituído no gene tkt
[054] As células em fase exponencial foram coletadas por centrifugação (5.000 rpm, 15 minutos) e lavadas três vezes com tampão em 0,1% de Tris-HCl (pH 7,5), e em seguida, suspensa no mesmo tampão para uma turbidez a 610 nm de 160. As células foram rompidas por 6 minutos, utilizando uma batedeira de grânulo depois de esferas de vidro serem adicionadas a 1,25 g/1.5 ml da suspensão. O sobrenadante foi coletado por centrifugação (15.000 rpm, 20 minutos), e medido quantitativamente para o conteúdo de proteína pelo método de Bradford e utilizado como uma solução de proteína bruta para a medição da atividade enzimática de transcetolase (Tkt). A fim de quantificar a atividade enzimática da Tkt, a solução de proteína bruta foi adicionada a uma solução de reação que contém Tris-HCl (pH 7,5) 0,1 M, D-R5p 10 mM, D-Xu5P 2 μM, ThDP 10 μM, MgCl2 1,2 mM, NADH 100 μM, 1 unidade de isomerase de triosefosfato, 1 unidade de desidrogenase de glicerol-3-fosfato por 1 ml para iniciar a reação. A mistura foi deixada reagir a 30 °C durante 20 - 30 minutos e a absorbância a 340 nm foi medida. A unidade (U) de atividade enzimática de Tkt foi definida como a quantidade (mg) da enzima que catalisa a produção de 1 μmol de gliceraldeído 3-fosfato durante 1 minuto, e a atividade específica foi definida como unidades/mg (Biochem. (2004)382, 759-767).
[055] Cepa KCCM11016P-tkt foi observada possuindo a atividade de Tkt 3,5 vezes maior do que a da cepa parental KCCM11016P (Tabela 5). [Tabela 5]
Figure img0005
Exemplo 6: Medição da atividade enzimática da carboxilase de piruvato em cepa possuindo códon de iniciação ATG substituído no gene pyc
[056] As células em fase exponencial foram coletadas por centrifugação (5.000 rpm, 15 minutos) e lavadas duas vezes com Tris-HCl 50 mM (pH 6,3) contendo cloreto de sódio 50 mM (NaCl), e, em seguida, suspenso em HEPES 100 mM (pH 7,5) de tampão contendo 20% de glicerol. CTAB foi adicionado à suspensão a uma concentração de 0,3%, e deixado em gelo durante 1 minuto. As células foram recolhidas por centrifugação (5000 rpm, 10 minutos) e em seguida, suspensas em tampão Tris-HCl 100 mM (pH 7,3). O conteúdo de proteína foi medido quantitativamente por um método de Bradford e utilizado como uma solução de proteína bruta para a medição da atividade enzimática de carboxilase de piruvato (Pyc). A fim de quantificar a atividade enzimática de Pyc, a solução de proteína bruta foi adicionada a uma solução de reação contendo NaHCO3 25 mM, MgCl2 5 mM, piruvato 3 mM e ATP 4 mM para iniciar a reação. A mistura foi deixada reagir a 30 °C durante 1,5 minutos, e 80 μl de solução de parada (30%, ácido o-fosfórico) foi adicionado para terminar a reação. O sobrenadante foi coletado por centrifugação (12.000 rpm, 15 min, 4 °C). 50 μl do sobrenadante, Tris-HCl (pH 7,8) 150 mM, NADH 150 μM, e 2,5 L de lactato desidrogenase foram adicionados por 1 ml e a absorbância a 340 nm foi medida a 37 °C. A unidade (U) de atividade enzimática de Pyc foi definida como nmol de lactato produzido por 1 mg de proteína, durante 1 minuto.
[057] Cepa KCCM11016P-pyc foi observada possuindo a atividade de Pyc 1,89 vezes maior do que a da cepa parental KCCM11016P (Tabela 6). [Tabela 6]
Figure img0006
Exemplo 7: Desenvolvimento de cepas derivadas de KCCM11016P possuindo códons de iniciação ATG substituídos em dois ou mais genes de IysC, tkt, e genes pyc
[058] Como os vetores recombinantes, pDZ-IysC (ATG) pDZ-tkt(ATG) pDZ- pyc (ATG) preparados nos Exemplos 1, 2, e 3 foram usados, e o processo de preparação é como a seguir.
[059] O vetor pDZ-tkt (ATG) foi transformado em KCCM11016P-IysC do Exemplo 1, em que o códon de iniciação GTG de IysC foi substituído com ATG, e através da segunda passagem, os códons de iniciação de IysC e tkt no cromossomo foram substituídos com ATG de forma a obter KCCM11016P IysC- tkt. A substituição de nucleotídeos do códon de iniciação do gene foi finalmente confirmada por PCR utilizando os iniciadores de SEQ ID NOs. 5 e 8 e, em seguida, por meio da análise da sequência de nucleotídeo do sítio alvo.
[060] Na mesma maneira que no Exemplo 1, o vetor pDZ-pyc(ATG) foi transformado em KCCM11016P-IysC do Exemplo 1, em que o códon de iniciação GTG de IysC foi substituído com ATG, e através da segunda passagem, os códons de iniciação de IysC e pyc no cromossomo foram substituídos com ATG de forma a obter KCCM11016P IysC-pyc. A substituição de nucleotídeos do códon de iniciação do gene foi finalmente confirmada por PCR utilizando os iniciadores de SEQ ID NOs. 9 e 12 e, em seguida, por meio da análise da sequência de nucleotídeo do sítio alvo.
[061] O vetor pDZ-tkt (ATG) foi transformado em KCCM11016P-IysC-pyc do presente Exemplo, em que o códon de iniciação GTG de IysC e pyc foi substituído com ATG, e através da segunda passagem, os códons de iniciação de IysC, pyc e tkt no cromossomo foram substituídos com ATG de forma a obter KCCM11016P IysC-pyc-tkt. A substituição de nucleotídeos do códon de iniciação do gene foi finalmente confirmada por PCR utilizando os iniciadores de SEQ ID NOs. 5 e 8 e, em seguida, por meio da análise da sequência de nucleotídeo do sítio alvo.
[062] As combinações acima dos genes são apenas para fins ilustrativos, e o escopo das combinações de genes não se destina a ser limitado pelos mesmos.
Exemplo 8: Produção de lisina na cepa possuindo códon de iniciação ATG substituído
[063] KCCM11016P-IysC, KCCM11016P-tkt, KCCM11016P-pyc,KCCM11016P-IysC-tkt, KCCM11016P-IysC-pyc, KCCM11016P-IysC-pyc-tkt finalmente preparados nos Exemplos 1, 2, 3, e 7 foram cultivados para a produção de L-lisina pelo método seguinte.
[064] As cepas parentais KCCM11016P e KCCM11016P-IysC, KCCM11016P-tkt, KCCM11016P-pyc, KCCM11016P-IysC-tkt, KCCM11016P- IysC-pyc, KCCM11016P-IysC-pyc-tkt foram inoculadas nos respectivos frascos de 250 ml de canto-torcido, contendo 25 ml do meio de semeadura descrito abaixo, e a resultante foi cultivada a 30 °C sob agitação a 200 rpm durante 20 horas. 1 ml do caldo de cultura de semente resultante foi inoculado em um frasco de canto torcido de 250 ml contendo 24 ml do meio de produção descrito abaixo, e cultivado a 30 °C sob agitação (200 rpm) durante 120 horas.
[065] Depois de completar a cultura, a quantidade de produção de L-lisina foi determinada por HPLC. Os resultados da medição de L-lisina, em caldos de cultura de KCCM11016P e KCCM11016P-IysC, KCCM11016P-TKT, KCCM11016P-pyc, KCCM11016P-IysC-TKT, KCCM11016P-IysC-pyc,KCCM11016P-IysC-pyc-TKT são mostrados na seguinte Tabela 7.[Tabela 7]
Figure img0007
Meio de semeadura (pH 7,0)
[066] 20 g de açúcar em bruto, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura,1,5 g de uréia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4 7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de tiamina-HCl, 2000 μg de cálcio-pantotenato, 2000 μg de nicotina amida (em 1 litro de água destilada)
O meio de produção (pH 7,0)
[067] 100 g de glicose, 40 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de sólidos de milho, 3 g de uréia, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4 7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de Tiamina-HCl, 2000 μg de cálcio-pantotenato, 3000 μg de nicotina amida, 30 g de CaCO3 (em 1 litro de água destilada)
[068] Como mostrado na Tabela 7, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-IysC, KCCM11016P-TKT, KCCM11016P-pyc, KCCM11016P- IysC-TKT, e KCCM11016P-IysC-pyc possuindo códon de iniciação ATG substituído foram revelados por mostrarem 4 - 9% de aumento em produtividade de L-lisina, em comparação com a cepa parental KCCM11016P. Em particular, KCCM11016P-IysC-pyc-tkt introduzido com todos os três genes foi encontrada apresentando um aumento na produtividade de L-lisina tão elevada como 12%, em comparação com a cepa parental KCCM11016P.
Exemplo 9: Desenvolvimento de cepa derivada de KFCC10750 possuindo códons de iniciação ATG substituído em genes IysC, tkt, e pyc e Comparação de produtividade de lisina
[069] A fim de analisar se a substituição dos códons de iniciação com ATG em genes IysC, pyc e tkt também afeta a produtividade da lisina em outras cepas produtoras de lisina pertencentes a Corynebacterium glutamicum, a cepa produzindo L-lisina de Corynebacterium glutamicum KFCC10750 (Patente Coreana No. 10-0073610) foi introduzido com todos os três genes que mostraram o efeito mais extraordinário de aumentar a produtividade de lisina no Exemplo 8, de modo a preparar uma cepa recombinante, que foi nomeada como KFCC10750-IysC-pyc-tkt. A cepa foi cultivada do mesmo modo como no Exemplo 8, e a concentração de L-lisina foi analisada (Tabela 8).[Tabela 8]
Figure img0008
[070] Como mostrado na Tabela 8, Corynebacterium glutamicum KFCC10750-IysC-pyc-tkt introduzido com todos os três genes mostrou aumento de 15% na produtividade de lisina, em comparação com a cepa parental KFCC10750.
Exemplo 9: Desenvolvimento de cepa derivada de KCCM10770P possuindo códons de iniciação ATG substituído em genes IysC, tkt, e pyc e Comparação de produtividade de lisina
[071] Outra cepa de Corynebacterium glutamicum produzindo L-lisina KCCM10770P (Patente Coreana No. 10-0924065) foi introduzida com todos os três genes que mostraram o efeito mais extraordinário de aumentar a produtividade de lisina no Exemplo 8, de modo a preparar uma cepa recombinante, que foi nomeada como KCCM10770P-lysC-pyc-tkt. A cepa foi cultivada do mesmo modo como no Exemplo 8, e a concentração de L-lisina foi analisada (Tabela 9). [Tabela 9]
Figure img0009
[072] Como mostrado na Tabela 9, Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-IysC-pyc-tkt introduzido com todos os três genes mostrou aumento de 11% na produtividade de lisina, em comparação com a cepa parental KCCM10770P.
Exemplo 11: Desenvolvimento de cepa derivada de CJ3P possuindo códons de iniciação ATG substituído em genes IysC, tkt, e pyc e Comparação de produtividade de lisina
[073] Ainda outra cepa de Corynebacterium glutamicum produzindo L-lisina CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40) foi introduzida com todos os três genes que mostraram o efeito mais extraordinário de aumentar a produtividade de lisina no Exemplo 8, de modo a preparar uma cepa recombinante, que foi nomeada como CJ3P-lysC-pyc-tkt. A cepa foi cultivada do mesmo modo como no Exemplo 8, e a concentração de L-lisina foi analisada (Tabela 10).[Tabela 10]
Figure img0010
[074] Como mostrado na Tabela 10, Corynebacterium glutamicum CJ3P- lysC-pyc-tkt introduzido com todos os três genes mostrou aumento de 18% na produtividade de lisina, em comparação com a cepa parental CJ3P.
Efeito da invenção
[075] A presente invenção fornece um microrganismo Corynebacterium sp. possuindo a produtividade de L-lisina melhorada, em que os códons de iniciação de um ou mais genes que codificam a cinase de aspartato, transcetolase, ou carboxilase de piruvato são substituídos para aumentar as atividades das enzimas correspondentes, em comparação com as suas atividades endógenas de um microrganismo nativo.

Claims (4)

1. Microrganismo produtor de lisina caracterizado por possuir atividade melhorada de uma enzima de aspartato quinase (LysC) em comparação com a atividade endógena desta enzima em um microrganismo não modificado, em que os códons de iniciação de um polinucleotídeo que codifica a enzima é substituído com ATG, em que o microrganismo é o Corynebacterium sp, e em que o polinucleotídeo que codifica aspartato quinase (LysC), cujos códons de iniciação são substituídos por ATG, é representado pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 16.
2. Microrganismo produtor de lisina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microrganismo Corynebacterium sp. ser Corynebacterium glutamicum.
3. Microrganismo produtor de lisina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por antes da substituição com ATG, o códon de iniciação do polinucleotídeo que codifica aspartato quinase (LysC) ser GTG.
4. Método para a produção de L-lisina, caracterizado por compreender as etapas de cultura do microrganismo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3; e recuperar a L-lisina a partir do microrganismo em cultura ou do caldo de cultura.
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