JP6219481B2 - Ｌ−リジン生産能を有する微生物を用いてｌ−リジンを生産する方法 - Google Patents

Ｌ−リジン生産能を有する微生物を用いてｌ−リジンを生産する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6219481B2
JP6219481B2 JP2016207794A JP2016207794A JP6219481B2 JP 6219481 B2 JP6219481 B2 JP 6219481B2 JP 2016207794 A JP2016207794 A JP 2016207794A JP 2016207794 A JP2016207794 A JP 2016207794A JP 6219481 B2 JP6219481 B2 JP 6219481B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
lysine
atg
lysc
pyc
tkt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2016207794A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2017038617A (ja
Inventor
ホ リー，カン
ホ リー，カン
ジョ リム，サン
ジョ リム，サン
オク ムーン，ジュン
オク ムーン，ジュン
ウ ジャン，ジャエ
ウ ジャン，ジャエ
ジン パク，ス
ジン パク，ス
ヒ パク，サン
ヒ パク，サン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CJ CheilJedang Corp filed Critical CJ CheilJedang Corp
Publication of JP2017038617A publication Critical patent/JP2017038617A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6219481B2 publication Critical patent/JP6219481B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
    • C12Y202/01001—Transketolase (2.2.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02004—Aspartate kinase (2.7.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01001—Pyruvate carboxylase (6.4.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Description

本発明は、開始コドンをＡＴＧに置換した変異型ポリヌクレオチド、それらを含むベク
ター、それらのポリヌクレオチドを含む微生物、及びそれを用いてＬ−リジンを生産する
方法に関する。
コリネバクテリウム(Corynebacterium)属微生物、特にコリネバクテリウムグルタミカ
ム(Corynebacterium glutamicum)は、Ｌ−リジン生産に多く用いられるグラム陽性の微生
物である。Ｌ−リジンは、動物飼料、人間の医薬品及び化粧品産業に使用されており、コ
リネバクテリウム属菌株を用いた発酵により生産されている。
従来、リジン生合成関連遺伝子が強化されたコリネバクテリウム属菌株及びそれを用い
たＬ−リジンの生産方法が周知である。例えば、特許文献１には、ｌｙｓＥ遺伝子(リジ
ン排出キャリア遺伝子)が強化され、ｄａｐＡ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ｐｙｃ遺伝子及
びｄａｐＢ遺伝子からなる群から選択される遺伝子がさらに導入されたコリネバクテリウ
ムを培養してＬ−リジンを生産する方法が開示されている。
他の方法として、リジン生合成経路上の遺伝子を増幅する方法や、プロモーターを改変
する方法が用いられてきた。例えば、特許文献２と特許文献３では、それぞれｄｄｈとｌ
ｙｓＣ−ａｓｄオペロンのプロモーターを改良し、コリネバクテリウムに導入してＬ−リ
ジンを生産する方法が開示されており、特許文献４では、リジン生合成経路遺伝子である
ａｓｐＢ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡ、ｐｙｃを染色体内で２コ
ピーに増幅してリジン生産効率を向上させる方法が開示されている。
一方、一般に染色体内の遺伝子の翻訳(translation)時にリボソームが認識して翻訳を
開始する開始コドンはＡＴＧであり、遺伝子の開始コドンによって翻訳レベルが異なって
調節されうるので、開始コドンの塩基配列はタンパク質活性調節において重要である。し
かし、一般的な開始コドンであるＡＴＧとは異なり、コリネバクテリウムグルタミカム由
来リジンの生合成関連遺伝子のうち、ｌｙｓＣとｐｙｃの開始コドンがＧＴＧであり、ペ
ントースリン酸経路上に存在するｔｋｔの開始コドンがＴＴＧであることが確認された(
非特許文献１)。
米国特許第６７４６８５５号明細書 韓国公開特許第２００９−００８２７０２号公報 韓国公開特許第２００９−００８４０９９号公報 韓国公開特許第１０−０９２４０６５号公報 韓国登録特許第１０−０１５９８１２号公報 韓国登録特許第１０−０３９７３２２号公報 韓国登録特許第１０−００７３６１０号公報
J. Biotechnol., 104: 5-25, 2003 Handbook of Corynebacterium glutamicum, 40p, Lothar Eggeling & Michael Bott, 2005 Binder et al. Genome Biology 2012, 13: R40 Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) Storhas; Bioreaktoren und periphere (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981 Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52: 541-545 Bradford, M.M 1976. Anal. Biochem. 72: 248-254 Biochem.J. (2004)382, 759-767
本発明者らはリジン生産効率を向上させる方法を見出すために鋭意努力した結果、野生
型であるｌｙｓＣ、ｔｋｔ及びｐｙｃ遺伝子の開始コドンをＡＴＧに置換することにより
、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼの活性
を内在的活性より増加させることができることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、アスパラギン酸キナーゼ(aspartate kinase; EC: 2.7.2.4; 以下、Ｌ
ｙｓＣともいう)、トランスケトラーゼ(transketolase; EC: 2.2.1.1; 以下、Ｔｋｔとも
いう)、又はピルビン酸カルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase; EC: 6.4.1.1; 以下、
Ｐｙｃともいう)をコードするそれぞれのポリヌクレオチドの開始コドンをＡＴＧに置換
した変異型ポリヌクレオチドを提供することである。
本発明の他の目的は、ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナー
ゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリヌクレ
オチドの少なくとも１つの変異型ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することである
。
さらに、本発明の他の目的は、前記酵素の少なくとも１つの酵素の活性が内在的活性よ
り増加した微生物を提供することである。
さらに、本発明の他の目的は、微生物を培養する工程と、培養した微生物又は培養培地
からＬ−リジンを回収する工程とを含む、Ｌ−リジンを生産する方法を提供することであ
る。
本発明によれば、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ、ピルビン酸カルボキ
シラーゼをコードする各遺伝子、又は様々な組み合わせを含む全遺伝子の開始コドンを置
換することにより、当該酵素の活性が天然微生物の内在的活性より増加し、Ｌ−リジンの
生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供することができる。
本発明の一態様は、アスパラギン酸キナーゼ(aspartate kinase; EC: 2.7.2.4; 以下、
ＬｙｓＣともいう)、トランスケトラーゼ(transketolase; EC: 2.2.1.1; 以下、Ｔｋｔと
もいう)、又はピルビン酸カルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase; EC: 6.4.1.1; 以下
、Ｐｙｃともいう)をコードするそれぞれのポリヌクレオチドの開始コドンをＡＴＧに置
換した変異型ポリヌクレオチドを提供する。
前記アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼを
コードするそれぞれのポリヌクレオチドは、それぞれの酵素活性を有するものであれば、
一部のヌクレオチドが置換、欠失、挿入及び付加されたものも含まれ、７０％以上、好ま
しくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ま
しくは１００％の相同性を有する。
本発明における「相同性(homologous)」とは、野生型のｌｙｓＣ遺伝子、ｔｋｔ遺伝子
及びｐｙｃ遺伝子と、それらに対応する変異型遺伝子であって、一部のヌクレオチドが置
換、欠失、挿入及び付加されたｌｙｓＣ遺伝子、ｔｋｔ遺伝子及びｐｙｃ遺伝子との核酸
配列の同一性の程度を示すものである。
本発明における「開始コドン(initiation codon)」とは、ｍＲＮＡ(messenger RNA)の
コード配列がタンパク質に翻訳される際の翻訳開始点に該当する３つのヌクレオチドを意
味する。一般に微生物の染色体上で見られる開始コドンとしては、ＡＴＧ(ｍＲＮＡ上で
はＡＵＧ)、ＧＴＧ(ｍＲＮＡ上ではＧＵＧ)、及びＴＴＧ(ｍＲＮＡ上ではＵＵＧ)があり
、コリネバクテリウムグルタミカムの全ゲノム塩基配列の分析結果によれば、これらはそ
れぞれ６２．５％〜６６．５％、２３．１％〜２４．３％、及び１０．３％〜１３．２％
の割合で存在することが分かる(非特許文献２)。
さらに、現在までに報告されているコリネバクテリウム由来のリジン生合成関連遺伝子
のうちｌｙｓＣとｐｙｃはＧＴＧを開始コドンとして用い、ｔｋｔはＴＴＧを開始コドン
として用いる。すなわち、前記遺伝子はＡＴＧを開始コドンとして用いず、これはコリネ
バクテリウム固有の特徴とみなされる。
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、前記ｌｙｓＣ、ｔｋｔ又はｐｙｃ遺伝子の開
始コドンがＡＴＧに置換されたことを特徴とし、この開始コドンが置換された変異型ポリ
ヌクレオチドは、本発明者らにより最初に見出されたものである。より具体的には、本発
明により前記アスパラギン酸キナーゼ(ＬｙｓＣ)及びピルビン酸カルボキシラーゼ(Ｐｙ
ｃ)をコードするポリヌクレオチドの開始コドンはＧＴＧからＡＴＧに置換され、前記ト
ランスケトラーゼ(Ｔｋｔ)をコードするポリヌクレオチドの開始コドンはＴＴＧからＡＴ
Ｇに置換される。より好ましくは、前記ｌｙｓＣ、ｔｋｔ、ｐｙｃの遺伝子配列がそれぞ
れ配列番号１３、１４、１５である場合、開始コドンがＡＴＧに置換された遺伝子配列は
それぞれ配列番号１６、１７、１８である。
開始コドンの塩基置換は、当業界で公知の任意の方法、例えば、部位特異的突然変異(s
ite-specific mutagenesis)、相同組換えにより行われるが、これらに限定されるもので
はない。
本発明の他の態様は、ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナー
ゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリヌクレ
オチドの少なくとも１つの変異型ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明のベクターに含まれるＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸
キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリ
ヌクレオチドは、それぞれの酵素活性を有するものであれば、遺伝子の一部のヌクレオチ
ドが置換、欠失、挿入及び付加されたものも含まれ、７０％以上、好ましくは８０％以上
、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の
相同性を有する。
また、本発明のベクターに含まれるＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラ
ギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異
型ポリヌクレオチドは、ＡＴＧに置換された開始コドンが含まれるものであれば、アスパ
ラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺
伝子の一部のみを含むものも含まれる。
本発明における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的遺伝子を発現させることができ
るように、好適な調節配列に作動可能に連結された遺伝子の塩基配列を含有するＤＮＡ産
物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、その転写を調節するた
めの任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並
びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。本発明において用いられるベクターは、
宿主内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界で公知の任意のベ
クターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ粒子、又は単に潜在的ゲノ
ム挿入物であってもよく、好ましくは、ｐＤＺ(特許文献４)を用いることができるが、こ
れらに限定されるものではない。ベクターは好適な宿主内に形質転換された後、宿主ゲノ
ムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。
具体的には、ｌｙｓＣ、ｔｋｔ又はｐｙｃ遺伝子のうち、開始コドン部位を含む塩基配
列(それぞれ配列番号１３、１４及び１５)を確保し、それに基づいて開始コドンがＡＴＧ
に置換されたプライマーを合成した。このプライマーを用いて、Ｌ−リジン生産菌株の染
色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、一方の末端がＡＴＧに置換されたＤＮ
Ａが得られた。得られたＤＮＡ断片をベクターにクローニングすることにより、最終的に
組換えベクターが得られた。より具体的には、本発明において、それぞれベクターｐＤＺ
−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)、ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)及びｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)を作製した。
本発明のさらに他の態様は、ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸
キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼからなる群から選択され
る少なくとも１つの酵素をコードする変異型ポリヌクレオチドを含み、これらから転写さ
れたｍＲＮＡのタンパク質への翻訳レベルが向上した結果として、前記酵素の少なくとも
１つの酵素の活性が内在的活性より増加した微生物を提供する。本発明の微生物は、ＡＴ
Ｇに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又は
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを用いて、それぞれ１
種、２種又は３種の組み合わせにより当該酵素の活性が増加した形態であってもよい。
微生物の染色体上で標的遺伝子の開始コドンをＡＴＧに置換するために、当業界で公知
の様々な方法を用いることができる。例えば、微生物に内在するｌｙｓＣ、ｔｋｔ及びｐ
ｙｃの開始コドン配列を染色体上に置換することができ、他の方法としては、開始コドン
配列が置換された当該遺伝子をプラスミドの形態で微生物内に導入することもできる。
前記微生物には、Ｌ−リジン生産能を有する微生物であればあらゆるものが含まれるが
、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属微生物であることが好ましく、例えば
前記コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属微生物としては、コリネバクテリウ
ムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウムサーモアミノゲネス(Corynebac
terium thermoaminogenes)ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウムフラバム(Brev
ibacterium flavum)ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウムラクトファーメンタム(Bre
vibacterium lactofermentum)ＡＴＣＣ１３８６９が挙げられる。また、これらから作製
されたＬ−リジン生産突然変異体又は菌株、例えば、コリネバクテリウムグルタミカムＫ
ＣＣＭ１１０１６Ｐ(前記微生物はＫＦＣＣ１０８８１で公開されたが、ブダペスト条約
上の国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１０１６Ｐの寄託番号が与えられた；特許文
献５，特許文献６)、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１１００１が含まれ、最
も好ましくは、受託番号ＫＣＣＭ１１０１６Ｐのコリネバクテリウムグルタミカムである
。
具体的には、受託番号ＫＣＣＭ１１０１６Ｐのコリネバクテリウムグルタミカムを、そ
れぞれＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケト
ラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで
形質転換することにより組換えコリネバクテリウムグルタミカムが得られ、より具体的に
は、受託番号ＫＣＣＭ１１０１６Ｐのコリネバクテリウムグルタミカムにそれぞれベクタ
ーｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)、ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)又はｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)を導
入することにより組換えコリネバクテリウムグルタミカムが得られた。
また、ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドの組み合わせにより２つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換してもよい。具体的には、ＡＴＧに置換された開始コドンを有するトランスケトラーゼをコードする遺伝子を含むベクターであるｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを、ｌｙｓＣの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣに形質転換し、２次交差過程を経ることによって、染色体上でｌｙｓＣとｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換されたコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔが得ることができた。また、ＡＴＧに置換された開始コドンを有するピルビン酸カルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであるｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)ベクターを、ｌｙｓＣの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣに形質転換し、２次交差過程を経ることにより、染色体上でｌｙｓＣとｐｙｃの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃが得られた。また、ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを、前記作製されたｌｙｓＣとｐｙｃの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃに形質転換し、２次交差過程を経ることにより、染色体上でｌｙｓＣ、ｐｙｃ及びｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔが得られた。同様に、ＫＦＣＣ１０７５０(前記微生物はＫＦＣＣ１０７５０で公開されたが、ブダペスト条約上の国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１３４７Ｐの寄託番号が与えられた；特許文献７)、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ(特許文献４)、ＣＪ３Ｐ(非特許文献３)のコリネバクテリウムグルタミカム属に属する他のリジン生産菌株においても、同様の方法でｌｙｓＣ、ｐｙｃ及びｔｋｔの開始コドンをＡＴＧに置換できることが確認された。これらの結果は、本発明の変異型ポリヌクレオチドが様々なコリネバクテリウム属菌株に安定して導入されてＬ−リジン生産量を増加させることができることを裏付けるものである。
特に、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼ
をコードするポリヌクレオチドを含むベクターｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)、ｐＤＺ−ｔｋ
ｔ(ＡＴＧ)及びｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)をコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１
０１６Ｐに導入して得た形質転換体ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔを
コリネバクテリウムグルタミカムＣＡ０１−２０５９と命名し、２０１１年５月２日付け
でブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(Korean Culture cent
er of Microorganisms, 以下、「ＫＣＣＭ」略称する)に受託番号ＫＣＣＭ１１１８８Ｐ
として寄託した。すなわち、前記寄託は、ブダペスト条約に基づいて国際寄託機関に寄託
されたものである。
本発明による微生物は、前述したように野生型の開始コドンがそれぞれＡＴＧに置換さ
れたことを特徴とし、それによりｌｙｓＣ、ｔｋｔ及びｐｙｃ遺伝子から転写された各ｍ
ＲＮＡのタンパク質への翻訳レベルが大幅に増加した結果、アスパラギン酸キナーゼ、ト
ランスケトラーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性が野生型酵素の内在的活性
より増加したことを特徴とする。
本発明における「内在的活性」とは、微生物が天然状態で有する酵素の活性状態を意味
し、例えば、コリネバクテリウム属微生物が天然に有する、アスパラギン酸キナーゼ、ト
ランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性を意味する。「内在的活性
の増加」とは、天然状態の酵素活性に比べて活性がさらに向上したことを意味する。
具体的には、ｌｙｓＣ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株が示すアスパラギ
ン酸キナーゼ酵素活性を親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較した結果、２．７３倍
増加したアスパラギン酸キナーゼ活性を示すことが確認された(表４)。また、ｔｋｔ遺伝
子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株が示すトランスケトラーゼ酵素活性を親菌株で
あるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較した結果、３．５倍増加したトランスケトラーゼ活性を
示すことが確認された(表５)。また、ｐｙｃ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌
株が示すピルビン酸カルボキシラーゼ活性を親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較し
た結果、１．８９倍増加したピルビン酸カルボキシラーゼ活性を示すことが確認された(
表６)。
アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ又はその
組み合わせの活性を増加させることにより、微生物のＬ−リジン生産性が向上する。
本発明において、具体的にＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカム
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６
Ｐ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓ
Ｃ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔから生産されたＬ−リジ
ン生産量を測定した結果、親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較して著しく向上した
Ｌ−リジン生産量を示すことが分かった(表７)。同様に、ｌｙｓＣ、ｐｙｃ及びｔｋｔの
開始コドンがＡＴＧに置換された、ＫＦＣＣ１０７５０(特許文献７)、ＫＣＣＭ１０７７
０Ｐ(特許文献４)、ＣＪ３Ｐ(非特許文献３)のコリネバクテリウムグルタミカム属に属す
る他のリジン生産菌株においても、親菌株と比較して著しく向上したＬ−リジン生産量を
示すことが分かった(表８〜１０)。このような結果は、染色体上でＡＴＧに変異した開始
コドンを有するＬｙｓＣ、Ｔｋｔ、Ｐｙｃをコードする変異型ポリヌクレオチドをそれぞ
れ１種類ずつ保有する微生物、ＬｙｓＣ及びＴｋｔ、ＬｙｓＣ及びＰｙｃ、Ｔｋｔ及びＰ
ｙｃをコードする変異型ポリヌクレオチドをそれぞれ２種類ずつ保有する微生物、Ｌｙｓ
Ｃ、Ｔｋｔ及びＰｙｃをコードする変異型ポリヌクレオチドを３種類全て保有する微生物
が野生型のＧＴＧ又はＴＴＧ開始コドンを有する微生物より著しく向上したＬ−リジン生
産効率を示すことを裏付けるものである。
本発明のさらに他の態様は、前述した微生物を培養する工程と、培養した微生物又は培
養培地からＬ−リジンを回収する工程とを含む、Ｌ−リジンを生産する方法を提供する。
前記培養は、微生物を用いてＬ−リジンを培養する当業界で周知の様々な方法を用いる
ことができる。前記培養は、周知の方法で行うことができ、培養温度、培養時間、培地の
ｐＨなどの条件は適宜調節することができる。これら周知の培養方法は、非特許文献４及
び５に詳細に記述されている。また、培養方法にはバッチ培養(batch culture)、連続培
養(continuous culture)及び流加培養(fed-batch culture)が含まれ、好ましくは、バッ
チプロセス又は流加もしくは反復流加プロセス(fed batch or repeated fed batch proce
ss)で連続して培養することができるが 、これらに限定されるものではない。
培養に用いられる培地は、好適な方法で特定菌株の条件を満たさなければならない。コ
リネバクテリウム属微生物の培養培地は公知である(例えば、非特許文献６)。用いること
のできる糖源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、コ
コナッツ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセ
リン、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質は、
単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。用いることのできる窒素源
としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール
及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源は、単独で用いる
こともでき、混合物として用いることもできる。用いることのできるリン源としては、リ
ン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム、若しくはそれらに相当するナトリウム含
有塩が挙げられる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム又は硫酸鉄などの
金属塩を含有しなければならない。前記物質以外にも、アミノ酸及びビタミンなどの必須
成長物質が含まれてもよい。また、培養培地に好適な前駆体が用いられてもよい。前述し
た原料は、培養過程において培養物に好適な方法でバッチ式又は連続的に添加されてもよ
い。
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような塩化合物、又はリン酸、硫酸
のような酸化合物を好適な方法で用いて培養物のｐＨを調節することができる。また、脂
肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。好
気状態を保持するために、培養物内に酸素又は酸素含有気体(例えば、空気)を注入する。
培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。培養は、Ｌ−
リジンの所望の生成量が最大限に得られるまで続ける。このような目的で、通常１０〜１
６０時間で達成される。Ｌ−リジンは、培養培地中に排出されるか、微生物中に含まれて
いる場合もある。
また、本発明のＬ−リジンを生産する方法は、培養した微生物又は培養培地からＬ−リ
ジンを回収する工程を含む。微生物又は培養培地からＬ−リジンを回収する方法は当業界
で周知である。前記Ｌ−リジン回収方法には、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、
結晶化及びＨＰＬＣなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
発明を実施するための形態
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明
を例示的に示すものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
本実施例においては、リジン生産菌株のコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１
０１６Ｐに由来するアスパラギン酸キナーゼの遺伝子ｌｙｓＣ、トランスケトラーゼの遺
伝子ｔｋｔ、及びピルビン酸カルボキシラーゼの遺伝子ｐｙｃの開始コドンをＧＴＧ又は
ＴＴＧからＡＴＧに置換するための組換えベクターを作製した。前記ベクターをコリネバ
クテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株に形質転換して染色体上の開始コドン
が置換された菌株を得ることにより、リジン生産効率が増加した菌株を作製した。
本発明において用いるコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株は、
コリネバクテリウムグルタミカム野生株(ＡＴＣＣ１３０３２)を親菌株として人工変異法
により作製された、Ｓ−(２−アミノエチル)システイン(AEC)に対する耐性及びホモセリ
ン流出(homoserine leaky)の特徴を有する菌株である(ＫＦＣＣ１０８８１で公開された
。特許文献５、６参照)。また、ＫＦＣＣ１０７５０菌株は、人工変異法により作製され
たホモセリン栄養要求性と、Ｌ−ロイシン類似体である４−アザロイシン及び抗生剤の一
種であるリファンピシンに対する耐性とを有するコリネバクテリウムグルタミカムＬ−リ
ジン生産菌株であり(特許文献７)、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ菌株は、リジン生合成経路構成
遺伝子のうち６種を染色体上に２コピーずつ保有する、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ由来のＬ−
リジン生産菌株であり(特許文献４)、ＣＪ３Ｐ菌株は、Ｂｉｎｄｅｒらにより報告された
技術(非特許文献３)に基づいて、野生株のｐｙｃ、ｈｏｍ、ｌｙｓＣ遺伝子３種にそれぞ
れＰ４５８Ｓ、Ｖ５９Ａ、Ｔ３１１Ｉ変異を導入してＬ−リジン生産能を付与したコリネ
バクテリウムグルタミカム菌株である。
実施例１：コリネバクテリウムグルタミカム由来ｌｙｓＣの開始コドンがＡＴＧに置換
された組換えベクター(ｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ))の作製、及び開始コドン置換菌株の作
製
組換えベクターは、ｐＤＺ(特許文献４参照)を基本ベクターとして用いた。作製過程は
次の通りである。
(１)ｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)組換えベクターの作製
コリネバクテリウムグルタミカム由来ｌｙｓＣ遺伝子を確保するために、人工変異法に
より作製されたリジン生産菌株(コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ)
の染色体ＤＮＡを鋳型として用いた。米国国立保健研究所の遺伝子バンク(NIH GenBank)
に基づいてｌｙｓＣ遺伝子(ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０，Ｎｃｇｌ０２４７)の
開始コドン部位を含む塩基配列を確保し(配列番号１３)、これに基づいて開始コドンをＧ
ＴＧからＡＴＧに置換するための２対のプライマー(表１，配列番号１〜４)を合成した。
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記表１のプライマーを用いてＰＣ
Ｒを行った。ポリメラーゼにはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイファイＤＮＡポリメラーゼ(Str
atagene社)を用いた。ＰＣＲ条件は、９６℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニ
ーリング、及び７２℃で３０秒間の重合反応を３０サイクル繰り返した。こうして得られ
た２つのＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターにＩｎ−Ｆｕｓｉｏ
ｎ ＰＣＲ クローニングキット(Clontech社)でクローニングすることにより、最終的にｐ
ＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)組換えベクターを作製した。
(２)菌株の作製
作製したｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)ベクターをＫＣＣＭ１１０１６Ｐに電気パルス法で
形質転換し(非特許文献７による形質転換法を用いる)、その後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌ
を含有する選択培地で染色体上の同遺伝子との相同性に基づいて挿入された菌株を選択し
た。ベクターの染色体挿入が成功したか否かは、Ｘ−ｇａｌ(５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド)を含む固体培地で青色を示すか否かにより確認
することができる。染色体が１次挿入された菌株を栄養培地で振盪培養(３０℃，８時間)
し、その後それぞれ１０−４から１０−１０に希釈し、Ｘ−ｇａｌを含む固体培地に塗抹
した。ほとんどのコロニーが青色を示すのに対して、低い割合で出現する白色のコロニー
を選択することにより、２次交差(crossover)によりｌｙｓＣの開始コドン部位の塩基配
列が置換された菌株を選択した。選択した菌株の開始コドンの塩基置換が行われたか否か
は、配列番号１及び４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標的部位の塩基配列分
析過程を経て最終確認した。
Figure 0006219481
実施例２：コリネバクテリウムグルタミカム由来ｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換さ
れた組換えベクター(ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ))の作製、及び開始コドン置換菌株の作製
ｔｋｔ遺伝子は配列上に開始コドンと予想される２つのコドンが存在するが、ＲＢＳ(
リポゾーム結合部位)との距離プロテオミクス(proteomics)の結果とに基づいて、本発明
においては下流に存在するコドンを開始コドンとした。
(１)ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)組換えベクターの作製
コリネバクテリウムグルタミカム由来ｔｋｔ遺伝子を確保するために、ＫＣＣＭ１１０
１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型として用いた。米国国立保健研究所のジェンバンク(NIH Gen
Bank)に基づいてｔｋｔ遺伝子(ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０，Ｎｃｇｌ１５１２
)の開始コドン部位を含む塩基配列を確保し(配列番号１４)、これに基づいて開始コドン
をＴＴＧからＡＴＧに置換するための２対のプライマー(表２，配列番号５〜８)を合成し
た。
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記表２のプライマーを用いて実施
例１−１の条件でＰＣＲを行った。こうして得られた２つのＤＮＡ断片を、制限酵素Ｘｂ
ａＩで処理したｐＤＺベクターにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ クローニングキット(Clont
ech社)でクローニングすることにより、最終的にｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)組換えベクター
を作製した。
(２)菌株の作製
作製したｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを実施例１−２と同じ過程でリジン生産菌株
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｔｋｔの開始コドン
がＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔを得た。遺伝子の開始コドンの塩基
置換が行われた否かは、配列番号５及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標
的部位の塩基配列分析により最終確認した。
Figure 0006219481
実施例３：コリネバクテリウムグルタミカム由来ｐｙｃの開始コドンがＡＴＧに置換さ
れた組換えベクター(ｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ))の作製、及び開始コドン置換菌株の作製
(１)ｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)組換えベクターの作製
コリネバクテリウムグルタミカム由来ｐｙｃ遺伝子を確保するために、ＫＣＣＭ１１０
１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型として用いた。米国国立保健研究所のジェンバンクに基づい
てｐｙｃ遺伝子(ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０，Ｎｃｇｌ０６５９)の開始コドン
部位を含む塩基配列を確保し(配列番号１５)、これに基づいて開始コドンをＧＴＧからＡ
ＴＧに置換するための２対のプライマー(表３，配列番号９〜１２)を合成した。
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記表３のプライマーを用いて実施
例１−１の条件でＰＣＲを行った。こうして得られた２つのＤＮＡ断片を、制限酵素Ｘｂ
ａＩで処理したｐＤＺベクターにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ クローニングキット(Clont
ech社)でクローニングすることにより、最終的にｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)組換えベクター
を作製した。
(２)菌株の作製
作製したｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)ベクターを実施例１−２と同じ過程でリジン生産菌株
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｐｙｃの開始コドン
がＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃを得た。遺伝子の開始コドンの塩基
置換が行われたか否かは、配列番号９及び１２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その
後標的部位の塩基配列分析により最終確認した。
Figure 0006219481
実施例４：ｌｙｓＣ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株におけるアスパラギ
ン酸キナーゼ酵素活性の測定
対数期の菌体を遠心分離(５，０００ｒｐｍ，１５分)により回収し、０．１％Ｔｒｉｓ
．ＨＣｌ(ｐＨ８．０)緩衝液で３回洗浄し、その後同緩衝液で６１０ｎｍの濁度が１６０
程度になるように懸濁した。懸濁液１．５ｍｌ当たり１．２５ｇのガラスビーズ(glass b
ead)を添加し、その後ビーズ式粉砕機(bead beater)を用いて６分間菌体を破砕した。遠
心分離(１５，０００ｒｐｍ，２０分)により上清を回収し、ブラッドフォード方法(非特
許文献８)によりタンパク質濃度を定量し、その後アスパラギン酸キナーゼ(ＬｙｓＣ)酵
素活性の測定のための粗タンパク質溶液として用いた。ＬｙｓＣ酵素活性の測定は、０．
１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、０．０１Ｍ塩化マグネシウム(ＭｇＣｌ２)、０．
６Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン(Hydroxylamine.HCl)(ｐＨ７．０)、４ｍＭ ＡＴＰ、０．２
Ｍアスパラギン酸塩(Aspartate)を含む反応液に０．０５ｍｌの粗タンパク質溶液を添加
することにより反応を開始した。３０℃で３０分間反応させ、その後停止液(stop soluti
on)(１０％ＦｅＣｌ２，３．３％ＴＣＡ，０．７Ｎ ＨＣｌ)を添加して反応を終了させ、
遠心分離により上清を回収し、５４０ｎｍで吸光度を測定した。ＬｙｓＣ酵素活性単位(
Ｕ)は、１分間に１ｍｇのタンパク質を生成するアスパラギン酸塩ヒドロキサメートのｎ
ｍｏｌｅと定義した。
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ菌株が示すＬｙｓＣ活性を親菌株であるＫＣＣＭ１１
０１６Ｐと比較した結果、２．７３倍増加したＬｙｓＣ活性を示すことが確認された(表
４)。
Figure 0006219481
実施例５：ｔｋｔ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株におけるトランスケト
ラーゼ酵素活性の測定
対数期の菌体を遠心分離(５，０００ｒｐｍ，１５分)により回収し、０．１％Ｔｒｉｓ
．ＨＣｌ(ｐＨ７．５)緩衝液で３回洗浄し、その後同緩衝液で６１０ｎｍの濁度が１６０
程度になるように懸濁した。懸濁液１．５ｍｌ当たり１．２５ｇのガラスビーズを添加し
、その後ビーズ式粉砕機を用いて６分間菌体を破砕した。遠心分離(１５，０００ｒｐｍ
，２０分)により上清を回収し、ブラッドフォード方法によりタンパク質濃度を定量し、
その後トランスケトラーゼ(Ｔｋｔ)酵素活性の測定のための粗タンパク質溶液として用い
た。Ｔｋｔ酵素活性の測定は、１ｍｌ当たり０．１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、
１０ｍＭ Ｄ−Ｒ５Ｐ、２ｍＭ Ｄ−Ｘｕ５Ｐ、１０μＭ ＴｈＤＰ、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ
２、１００μＭ ＮＡＤＨ、１ｕｎｉｔトリオースリン酸イソメラーゼ(triosephosphate
isomerase)、１ｕｎｉｔグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(glycerol-3-phosph
ate dehydrogenase)を含む反応液に粗タンパク質溶液を添加することにより反応を開始し
た。３０℃で２０〜３０分間反応させ、３４０ｎｍで吸光度を測定した。Ｔｋｔ酵素活性
単位(Ｕ)は、１分間に１μｍｏｌのグリセルアルデヒド３−リン酸(glyceraldehyde 3-ph
osphate)の形成を促進する酵素の量(ｍｇ)と定義し、比活性度(specific activity)はｕ
ｎｉｔｓ／ｍｇと定義した(非特許文献９)。
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔ菌株が示すＴｋｔ活性を親菌株であるＫＣＣＭ１１０１
６Ｐと比較した結果、３．５倍増加したＴｋｔ活性を示すことが確認された(表５)。
Figure 0006219481
実施例６：ｐｙｃ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株におけるピルビン酸カ
ルボキシラーゼ酵素活性の測定
対数期の菌体を遠心分離(５，０００ｒｐｍ，１５分)により回収し、５０ｍＭ塩化ナト
リウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ６．３)緩衝液で２回洗浄し、その後２０
％グリセリンを含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．５)緩衝液で懸濁した。懸濁液にＣ
ＴＡＢを０．３％となるように添加し、その後氷中に１分間放置した。菌体を遠心分離(
５，０００ｒｐｍ，１０分)により回収し、その後１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ７
．３)緩衝液で懸濁した。ブラッドフォード方法によりタンパク質濃度を定量し、その後
ピルビン酸カルボキシラーゼ(Ｐｙｃ)酵素活性の測定のための粗タンパク質溶液として用
いた。Ｐｙｃ酵素活性の測定は、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭピ
ルビン酸塩、４ｍＭ ＡＴＰを含む反応液に粗タンパク質を添加することにより反応を開
始した。３０℃で１．５分間反応させ、その後８０μｌの停止液(30% ο-リン酸)を添加
して反応を終了させ、遠心分離(１２，０００ｒｐｍ，１５分，４℃)により上清を回収し
た。１ｍｌ当たり５０μｌの上清、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ７．８)、１５０
μＭ ＮＡＤＨ、２．５Ｕ乳酸デヒドロゲナーゼ(lactate dehydrogenase)を添加し、その
後３７℃、３４０ｎｍで吸光度を測定した。Ｐｙｃ酵素活性単位(Ｕ)は、１分間に１ｍｇ
のタンパク質を生成する乳酸塩のｎｍｏｌｅと定義した。
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃ菌株が示すＰｙｃ活性を親菌株であるＫＣＣＭ１１０１
６Ｐと比較した結果、１．８９倍増加したＰｙｃ活性を示すことが確認された(表６)。
Figure 0006219481
実施例７：ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ由来ｌｙｓＣ、ｔｋｔ、ｐｙｃ遺伝子のうち組み合わ
せにより少なくとも２つの遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株の開発
組換えベクターは、実施例１、２、３で作製したｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)、ｐＤＺ−
ｔｋｔ(ＡＴＧ)、ｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)を用いた。作製過程は次の通りである。
ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを、実施例１で作製した、ｌｙｓＣの開始コドンがＧ
ＴＧからＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣに形質転換し、２次交差過
程を経て染色体上でｌｙｓＣとｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０
１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔを得た。遺伝子の開始コドンの塩基置換が行われたか否かは、
配列番号５及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標的部位の塩基配列分析に
より最終確認した。
実施例１と同じ過程でｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)ベクターを、実施例１で作製した、ｌｙ
ｓＣの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣに形
質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｌｙｓＣとｐｙｃの開始コドンがＡＴＧに置換
されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃを得た。遺伝子の開始コドンの塩基置換
が行われた否かは、配列番号９及び１２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標的
部位の塩基配列分析により最終確認した。
ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを、本実施例で作製した、ｌｙｓＣとｐｙｃの開始コ
ドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃに形質転
換し、２次交差過程を経て染色体上でｌｙｓＣ、ｐｙｃ及びｔｋｔの開始コドンがＡＴＧ
に置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔを得た。遺伝子の開始コ
ドンの塩基置換が行われたか否かは、配列番号５及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行
い、その後標的部位の塩基配列分析により最終確認した。
前述した遺伝子の組み合わせは例示的に示すものであり、遺伝子の組み合わせの範囲が
これらに限定されるものではない。
実施例８：開始コドンＡＴＧ置換菌株におけるリジンの生産
実施例１、２、３、７で最終的に作製したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ、ＫＣＣＭ
１１０１６Ｐ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓ
Ｃ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓ
Ｃ−ｐｙｃ−ｔｋｔをＬ−リジンの生産のために下記の方法で培養した。
下記の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのバッフル付三角フラスコに親菌株ＫＣＣ
Ｍ１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔ、Ｋ
ＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１
０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔを接種
し、３０℃で２０時間(２００ｒｐｍ)振盪培養した。下記の生産培地２４ｍｌを含有する
２５０ｍｌのバッフル付三角フラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で１２０時間
(２００ｒｐｍ)振盪培養した。
培養終了後に、ＨＰＬＣを用いた方法によりＬ−リジンの生産量を測定した。ＫＣＣＭ
１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔ、ＫＣ
ＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０
１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔに対する
培養液中のＬ−リジンの生産量の結果は下記表７の通りである。
Figure 0006219481
種培地(ｐＨ７．０)
原糖２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，
Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣ
ｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ(
蒸留水１リットル中)
生産培地(ｐＨ７．０)
ブドウ糖１００ｇ，(ＮＨ４)２ＳＯ４ ４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンステ
ィープソリッド(Corn Steep Solids)５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４７
Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カ
ルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ(蒸留水１リッ
トル中)
上記表７に示すように、開始コドンがＡＴＧに置換されたコリネバクテリウムグルタミ
カムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０
１６Ｐ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌ
ｙｓＣ−ｐｙｃは、親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて、Ｌ−リジン生産が４〜
９％増加したことが確認され、特に、３種の形質が全て導入されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ
−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔは、親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて、Ｌ−リジ
ン生産が実に１２％も増加したことが確認された。
実施例９：ｌｙｓＣ、ｔｋｔ、ｐｙｃ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＦＣ
Ｃ１０７５０由来菌株の開発、及びリジン生産能の比較
コリネバクテリウムグルタミカムに属する他のリジン生産菌株においても、ｌｙｓＣ、
ｐｙｃ、ｔｋｔ遺伝子の開始コドンをＡＴＧに置換した場合にリジン生産能増加効果があ
るかを確認するために、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＦ
ＣＣ１０７５０(特許文献７)に、実施例８で最も優れたリジン生産能増加効果を示した３
種の形質を全て導入した組換え菌株を作製し、ＫＦＣＣ１０７５０−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−
ｔｋｔと命名した。実施例８と同様の方法で培養し、そのＬ−リジン濃度を分析した(表
８)。
Figure 0006219481
上記表８に示すように、３種の形質が全て導入されたコリネバクテリウムグルタミカム
ＫＦＣＣ１０７５０−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔは、親菌株ＫＦＣＣ１０７５０に比べて
、リジン生産が１５％増加した。
実施例１０：ｌｙｓＣ、ｔｋｔ、ｐｙｃ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣ
ＣＭ１０７７０Ｐ由来菌株の開発、及びリジン生産能の比較
他のＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ
(特許文献４)に、実施例８で最も優れたリジン生産能増加効果を示した３種の形質を全て
導入した組換え菌株を作製し、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔと命名
した。実施例８と同様の方法で培養し、そのＬ−リジン濃度を分析した(表９)。
Figure 0006219481
上記表９に示すように、３種の形質が全て導入されたコリネバクテリウムグルタミカム
ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔは、親菌株ＫＣＣＭ１０７７０Ｐに比
べて、リジン生産が１１％増加した。
実施例１１：ＣＪ３Ｐ由来ｌｙｓＣ、ｔｋｔ、ｐｙｃ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置
換された菌株の開発、及びリジン生産能の比較
さらに他のＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＣＪ３Ｐ(非特
許文献３)に、実施例８で最も優れたリジン生産能増加効果を示した３種の形質を全て導
入した組換え菌株を作製し、ＣＪ３Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔと命名した。実施例８
と同様の方法で培養し、そのＬ−リジン濃度を分析した(表１０)。
Figure 0006219481
上記表１０に示すように、３種の形質が全て導入されたコリネバクテリウムグルタミカムＣＪ３Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔは、親菌株ＣＪ３Ｐに比べて、リジン生産が１８％以上増加した。

本発明は以下の態様を包含し得る。
［１］ アスパラギン酸キナーゼ(ＬｙｓＣ)、トランスケトラーゼ(Ｔｋｔ)、又はピルビン酸カルボキシラーゼ(Ｐｙｃ)をコードするそれぞれのポリヌクレオチドの開始コドンをＡＴＧに置換した変異型ポリヌクレオチド。
［２］ 前記アスパラギン酸キナーゼ(ＬｙｓＣ)又はピルビン酸カルボキシラーゼ(Ｐｙｃ)をコードするポリヌクレオチドの開始コドンがＧＴＧであり、前記トランスケトラーゼ(Ｔｋｔ)をコードするポリヌクレオチドの開始コドンがＴＴＧである上記［１］に記載の変異型ポリヌクレオチド。
［３］ 前記変異型ポリヌクレオチドが、配列番号１６、１７又は１８の塩基配列で表される上記［１］に記載の変異型ポリヌクレオチド。
［４］ ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むベクター。
［５］ ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むことにより、前記酵素の少なくとも１つの酵素の活性が内在的活性より増加した微生物。
［６］ 前記微生物が、上記［４］のベクターで形質転換された上記［５］に記載の微生物。
［７］ 前記微生物が、コリネバクテリウム属微生物である上記［５］に記載の微生物。
［８］ 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である上記［７］に記載の微生物。
［９］ 上記［５］〜［８］のいずれかによる微生物を培養する工程と、
前記培養した微生物又は培養培地からＬ−リジンを回収する工程とを含む、Ｌ−リジンを生産する方法。
Figure 0006219481
Figure 0006219481

Claims (4)

  1. アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼからなる群より選択される２つの酵素活性が内在的活性より増加したリジン生産微生物であって、
    前記酵素をコードするポリヌクレオチドの開始コドンが、ＡＴＧに置換されており、
    前記微生物が、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、リジン生産微生物。
  2. 請求項１に記載の微生物を培養する工程と、
    前記培養した微生物又は培養培地からＬ−リジンを回収する工程とを含む、Ｌ−リジンを生産する方法。
  3. 前記アスパラギン酸キナーゼ(ＬｙｓＣ)又はピルビン酸カルボキシラーゼ(Ｐｙｃ)をコードするポリヌクレオチドの置換前の開始コドンがＧＴＧであり、前記トランスケトラーゼ(Ｔｋｔ)をコードするポリヌクレオチドの置換前の開始コドンがＴＴＧである、請求項１に記載のリジン生産微生物。
  4. 前記置換ポリヌクレオチドが、配列番号１６、１７又は１８の塩基配列で表される請求項１に記載のリジン生産微生物。
JP2016207794A 2011-12-21 2016-10-24 Ｌ−リジン生産能を有する微生物を用いてｌ−リジンを生産する方法 Active JP6219481B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2011-0139527 2011-12-21
KR20110139527 2011-12-21

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014548685A Division JP6082025B2 (ja) 2011-12-21 2012-12-21 Ｌ−リジン生産能を有する微生物を用いてｌ−リジンを生産する方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2017038617A JP2017038617A (ja) 2017-02-23
JP6219481B2 true JP6219481B2 (ja) 2017-10-25

Family

ID=48669667

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014548685A Active JP6082025B2 (ja) 2011-12-21 2012-12-21 Ｌ−リジン生産能を有する微生物を用いてｌ−リジンを生産する方法
JP2016207794A Active JP6219481B2 (ja) 2011-12-21 2016-10-24 Ｌ−リジン生産能を有する微生物を用いてｌ−リジンを生産する方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014548685A Active JP6082025B2 (ja) 2011-12-21 2012-12-21 Ｌ−リジン生産能を有する微生物を用いてｌ−リジンを生産する方法

Country Status (15)

Country Link
US (2) US9593354B2 (ja)
EP (2) EP3404101A3 (ja)
JP (2) JP6082025B2 (ja)
KR (3) KR101483344B1 (ja)
CN (4) CN104334728B (ja)
BR (2) BR112014015215B1 (ja)
CA (1) CA2860252C (ja)
DK (1) DK2796555T3 (ja)
ES (1) ES2696173T3 (ja)
IN (1) IN2014MN01298A (ja)
MX (1) MX353594B (ja)
MY (1) MY171302A (ja)
PL (1) PL2796555T3 (ja)
RU (3) RU2616870C1 (ja)
WO (1) WO2013095071A2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023222515A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222510A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222505A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3404101A3 (en) * 2011-12-21 2018-12-26 Cj Cheiljedang Corporation Method for producing l-lysine using microorganisms having ability to produce l-lysine
KR101755767B1 (ko) 2014-09-05 2017-07-10 씨제이제일제당 (주) L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법
KR101793328B1 (ko) * 2015-07-03 2017-11-03 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
EP3497226A4 (en) * 2016-08-15 2020-07-01 Cathay Biotech Inc. CONTROL OF THE DISTRIBUTION OF A BIOFILM FOR THE PRODUCTION OF AMINO ACIDS OR PRODUCTS FROM AMINO ACIDS
KR101863456B1 (ko) * 2016-11-15 2018-06-01 씨제이제일제당 (주) L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 생산방법
DE102017004751A1 (de) * 2017-05-18 2018-11-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Pyruvatcarboxylase und für die Pyruvatcarboxylase kodierende DNA, Plasmid enthaltend die DNA, sowie Mikroorganismus zur Produktion und verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Bioynthese Oxalacetat als Vorstufe beeinhaltet und Chromosom
EP3456833A1 (en) 2017-09-18 2019-03-20 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-amino acids
EP3467099A1 (en) 2017-10-05 2019-04-10 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-amino acids
EP3498853A1 (en) 2017-12-14 2019-06-19 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-lysine
KR101915433B1 (ko) * 2018-02-13 2018-11-05 씨제이제일제당 (주) 시트레이트 신타아제 (Citrate synthase)의 활성이 약화된 변이형 폴리펩타이드 및 이를 이용한 L-아미노산 생산방법
EP3594355A1 (en) 2018-07-12 2020-01-15 Evonik Operations GmbH Method for the fermentative production of l-lysine
EP3599282B1 (en) 2018-07-24 2021-03-17 Evonik Operations GmbH Method for the fermentative production of l-lysine
RU2019128538A (ru) 2018-09-26 2021-03-11 Эвоник Оперейшенс ГмбХ Способ ферментативного получения l-лизина
EP3660158A1 (en) 2018-11-29 2020-06-03 Evonik Operations GmbH Method for the fermentative production of l-lysine
CN109554322B (zh) * 2018-12-03 2020-08-04 江南大学 一种高产l-苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法
EP3670525A1 (en) 2018-12-18 2020-06-24 Evonik Operations GmbH Method for the fermentative production of l-lysine using c. glutamicum strains with a mutated kup transporter
US10829746B2 (en) 2019-01-23 2020-11-10 Evonik Operations Gmbh Method for the fermentative production of L-lysine
WO2021048353A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 Evonik Operations Gmbh Coryneform bacteria with a heterologous threonine transporter and their use in the production of l-threonine
CN112877269B (zh) * 2020-01-15 2021-12-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 生产赖氨酸的微生物以及赖氨酸的生产方法
WO2022050524A1 (ko) * 2020-09-03 2022-03-10 대상 주식회사 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
CA3217309A1 (en) * 2021-04-30 2022-11-03 Cj Cheiljedang Corporation Corynebacterium glutamicum variant having improved l-lysine production ability, and method for producing l-lysine by using same
AU2021443607A1 (en) * 2021-04-30 2023-11-16 Cj Cheiljedang Corporation Corynebacterium glutamicum variant with improved l-lysine production ability, and method for producing l-lysine using same
CN113308426B (zh) * 2021-05-27 2022-10-18 齐鲁工业大学 一种改造tk基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用
KR20230053351A (ko) * 2021-10-14 2023-04-21 대상 주식회사 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
CN113957073B (zh) * 2021-10-19 2023-09-01 山东寿光巨能金玉米开发有限公司 一种tkt基因启动子突变体及其在生产L-赖氨酸中的应用

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5358866A (en) * 1991-07-03 1994-10-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cytosine deaminase negative selection system for gene transfer techniques and therapies
CN101220366B (zh) * 1994-12-09 2011-10-05 味之素株式会社 新的赖氨酸脱羧酶基因以及生产l-赖氨酸的方法
CZ293268B6 (cs) * 1995-06-07 2004-03-17 Ajinomoto Co., Inc. Rekombinantní DNA, bakterie a způsob výroby L-lyzinu
KR0159812B1 (ko) 1995-12-20 1998-11-16 손경식 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법
JP4075087B2 (ja) 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
WO1999018228A2 (de) * 1997-10-04 1999-04-15 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aminosäuren der aspartat- und/oder glutamatfamilie und im verfahren einsetzbare mittel
DE19831609B4 (de) * 1997-10-04 2009-11-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel
DE19931317A1 (de) * 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
US6171833B1 (en) * 1998-12-23 2001-01-09 Massachusetts Institute Of Technology Pyruvate carboxylase from corynebacterium glutamicum
WO2000039305A1 (en) * 1998-12-23 2000-07-06 Massachusetts Institute Of Technology PYRUVATE CARBOXYLASE FROM $i(CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM)
US20020086371A1 (en) * 1999-07-07 2002-07-04 Degussa-Huls Aktiengesellschaft L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of L-lysine
US6797509B1 (en) * 1999-07-09 2004-09-28 Degussa-Huls Ag Nucleotide sequences which code for the tal gene
BR0010713A (pt) * 2000-03-17 2002-02-13 Degussa Processo para a preparação fermentativa de l-aminoácidos com amplificação do gene tkt
KR100397322B1 (ko) 2000-12-30 2003-09-06 씨제이 주식회사 엘-라이신의 제조방법
WO2003078620A1 (fr) * 2002-03-19 2003-09-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Isopropylmalate isomerase mutee
DE10361268A1 (de) * 2003-12-24 2005-07-28 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102004011248A1 (de) * 2004-03-09 2005-09-22 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
AU2005321630A1 (en) 2004-07-02 2006-07-06 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
EP2386650B1 (en) * 2006-04-07 2013-07-03 Evonik Degussa GmbH Method for producing L-amino acids using the gap promoter
EP3170889A1 (en) * 2006-09-15 2017-05-24 CJ Cheiljedang Corporation A corynebacteria having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same
HUE028873T2 (en) 2006-10-24 2017-01-30 Basf Se A method for increasing gene expression using modified codon usage
US8133714B2 (en) * 2007-09-27 2012-03-13 Evonik Degussa Gmbh Process for the fermentative preparation of organic chemical compounds using coryneform bacteria in which the SugR gene is present in attenuated form
KR100930203B1 (ko) 2008-01-28 2009-12-07 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
KR100987281B1 (ko) 2008-01-31 2010-10-12 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
KR20130038944A (ko) 2008-04-30 2013-04-18 바스프 에스이 이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 감소된 미생물을 사용한 정밀 화학물질의 생산 방법
DE102008001874A1 (de) * 2008-05-20 2009-11-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
GB0809169D0 (en) * 2008-05-20 2008-06-25 Sinvent As Method of L-lysine production
JP5719434B2 (ja) * 2010-06-15 2015-05-20 パク グアン インダストリアル カンパニー リミテッドＰａｉｋ Ｋｗａｎｇ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 微生物を用いたアスパラギン酸系アミノ酸の生産方法
DE102011118019A1 (de) * 2011-06-28 2013-01-03 Evonik Degussa Gmbh Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens
EP3404101A3 (en) * 2011-12-21 2018-12-26 Cj Cheiljedang Corporation Method for producing l-lysine using microorganisms having ability to produce l-lysine

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023222515A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222510A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222505A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof

Also Published As

Publication number Publication date
MX2014007385A (es) 2015-08-20
KR101483395B1 (ko) 2015-01-16
US9593354B2 (en) 2017-03-14
KR20140093649A (ko) 2014-07-28
KR20130072183A (ko) 2013-07-01
MX353594B (es) 2018-01-18
DK2796555T3 (en) 2018-12-10
CN105483145A (zh) 2016-04-13
EP2796555B1 (en) 2018-08-29
ES2696173T3 (es) 2019-01-14
BR112014015215B1 (pt) 2021-11-23
CN109251934B (zh) 2023-07-18
CN104334728B (zh) 2018-09-25
US9938546B2 (en) 2018-04-10
EP3404101A3 (en) 2018-12-26
CN109251934A (zh) 2019-01-22
CA2860252C (en) 2019-07-23
WO2013095071A3 (ko) 2013-08-22
IN2014MN01298A (ja) 2015-07-03
US20150099281A1 (en) 2015-04-09
CN105624175A (zh) 2016-06-01
KR101483396B1 (ko) 2015-01-16
BR122021015693B1 (pt) 2022-05-03
BR112014015215A2 (pt) 2018-11-06
US20170145453A1 (en) 2017-05-25
CN105483145B (zh) 2021-04-06
PL2796555T3 (pl) 2019-04-30
EP2796555A2 (en) 2014-10-29
MY171302A (en) 2019-10-08
JP2017038617A (ja) 2017-02-23
EP2796555A4 (en) 2015-12-09
CA2860252A1 (en) 2013-06-27
KR101483344B1 (ko) 2015-01-15
RU2014127151A (ru) 2016-02-10
RU2588665C2 (ru) 2016-07-10
WO2013095071A2 (ko) 2013-06-27
KR20140090130A (ko) 2014-07-16
RU2615454C1 (ru) 2017-04-04
EP3404101A2 (en) 2018-11-21
RU2616870C1 (ru) 2017-04-18
CN104334728A (zh) 2015-02-04
JP6082025B2 (ja) 2017-02-15
JP2015500660A (ja) 2015-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6219481B2 (ja) Ｌ−リジン生産能を有する微生物を用いてｌ−リジンを生産する方法
JP6695308B2 (ja) Ｌ−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたｌ−リジン生産方法
US8426577B2 (en) Promoter and a production method for L-lysine using the same
JP5412446B2 (ja) トランスポゾンを利用した形質転換用ベクター、前記ベクターで形質転換された微生物及びこれを利用したｌ−リジン生産方法
US8058036B2 (en) Microorganism of Corynebacterium genus having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same
JP6625133B2 (ja) ピルビン酸デヒドロゲナーゼ変異体、それを含む微生物及びそれを用いるｌ−アミノ酸生産方法
DK2236610T3 (en) Promoter and improved method for producing L-lysine using the same
DK2430152T3 (en) A microorganism with increased L-lysine productivity and method for producing L-lysine using the same
JP2023550754A (ja) シュワネラ・オネイデンシス由来蛋白質を発現する微生物、およびこれを利用したｌ－アミノ酸の生産方法
EP2430152B1 (en) Microorganism with enhanced l-lysine productivity and method for producing l-lysine using the same
JP2024515389A (ja) Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたｌ－リシンの生産方法

Legal Events

Date Code Title Description
TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20170912

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20170927

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6219481

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250