CN104334728A - 利用具有产生l-赖氨酸能力的微生物产生l-赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码天冬氨酸激酶(EC:2.7.2.4；在下文中，称作LysC)、转酮醇酶(EC:2.2.1.1；在下文中，称作Tkt)或丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1；在下文中，称作Pyc)的修饰的多核苷酸，其中起始密码子由ATG替代；包括其的载体；用所述载体转化的微生物；和利用其产生L-赖氨酸的方法。

Description

利用具有产生L-赖氨酸能力的微生物产生L-赖氨酸的方法
发明背景
1.发明领域
本发明涉及修饰的多核苷酸——其中起始密码子用ATG替代；包括其的载体；包括该多核苷酸的微生物；和利用其产生L-赖氨酸的方法。
2.相关技术的描述
棒状杆菌属的菌株,特别地谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，是广泛地用于产生L-赖氨酸的革兰氏阳性微生物。L-赖氨酸用于动物饲料、人的药物和化妆品，并通过棒状杆菌菌株的发酵产生。
常规地，具有提高的赖氨酸生物合成基因的棒状杆菌属的菌株和利用其产生L-赖氨酸的方法是已知的。例如，美国专利号6,746,855公开了通过培养具有增强的lysE基因(赖氨酸输出载体基因，lysine export carrier gene)表达、并且另外引入选自dapA基因、lysC基因、pyc基因和dapB基因的基因的棒状杆菌而产生L-赖氨酸的方法。
另一个方法是扩增关于赖氨酸生物合成途径的基因以修饰启动子。例如，韩国专利申请特许公开号2009-0082702和2009-0084099公开了通过将改进的ddh启动子和lysC-asd操纵子引入棒状杆菌而产生L-赖氨酸的方法。韩国专利申请特许公开号2008-0025355公开了通过增加染色体中关于赖氨酸生物合成途径的基因——其是aspB、lysC、asd、dapA、dapB、lysA和pyc——的拷贝数而提高赖氨酸生产力的方法。
同时，由核糖体识别以启动染色体中翻译的起始密码子通常是ATG。翻译可根据基因的起始密码子而被控制，并且起始密码子的序列在蛋白质活性的调节中是重要的。然而，虽然ATG是源自谷氨酸棒状杆菌的赖氨酸生物合成基因中通常的起始密码子，但是lysC和pyc基因的起始密码子是GTG，并且TTG用于戊糖磷酸盐途径上的tkt基因，其含有起始密码子TTG(参考:J.Biotechnol.,104:5-
本发明人已作出许多努力来找到提高赖氨酸生产力的方法，结果，他们发现野生型lysC、tkt和pyc基因的起始密码子可用ATG替代以提高天冬氨酸激酶、转酮醇酶和丙酮酸羧化酶相对于其内源活性的活性，由此完成本发明。
发明概述
本发明的目的是提供编码天冬氨酸激酶(EC:2.7.2.4；在下文中，称作LysC)、转酮醇酶(EC:2.2.1.1；在下文中，称作Tkt)或丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1；在下文中，称作Pyc)的修饰的多核苷酸，其中多核苷酸的起始密码子用ATG替代。
本发明的另一个目的是提供包括一种或多种编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的修饰的多核苷酸的载体，其中多核苷酸的起始密码子用ATG替代。
本发明的另一个目的是提供微生物，其中一种或多种酶具有与它们的内源活性相比提高的活性。
本发明的另一个目的是提供产生L-赖氨酸的方法，包括培养所述微生物，和从培养的微生物或培养肉汤回收L-赖氨酸的步骤。
发明效果
本发明提供具有提高的L-赖氨酸生产力的棒状杆菌属微生物，其中一种或多种编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的基因的起始密码子被替代，以与天然微生物中它们的内源活性相比提高相应的酶活性。
优选实施方式的详细描述
一方面，本发明提供编码天冬氨酸激酶(EC:2.7.2.4；在下文中，称作LysC)、转酮醇酶(EC:2.2.1.1；在下文中，称作Tkt)或丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1；在下文中，称作Pyc)的修饰的多核苷酸，其中多核苷酸的起始密码子由ATG替代。
每个编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的多核苷酸还可包括多核苷酸中的部分替代、缺失、插入或添加，只要它们中的每个具有酶活性，和基于已知的多核苷酸可具有70％或更多的同源性，特别地80％或更多的同源性，更特别地90％或更多的同源性，和更特别地95％或更多的同源性，和最特别地100％同源性。
如本文所用，术语“同源性(同源的)”指野生型的lysC基因、tkt基因或pyc基因的核苷酸序列和其相应的修饰的基因，即，修饰的lysC基因、tkt基因或pyc基因的核苷酸序列——其中部分多核苷酸被替代、缺失、插入或添加——之间的相似性程度。
如本文所用，术语“起始密码子”指当mRNA(信使RNA)的编码序列翻译成蛋白质时对应于翻译起始点的3个核苷酸。一般而言，微生物染色体中发现的起始密码子是ATG(mRNA上是AUG)、GTG(mRNA上是GUG)和TTG(mRNA上是UUG)，并且根据谷氨酸棒状杆菌的全部基因组序列的分析结果它们以62.5％～66.5％、23.1％～24.3％和10.3％～13.2％的比率存在(参考:Handbook of Corynebacteriumglutamicum,40p,Lothar Eggeling&Michael Bott,2005)。
在迄今报道的源自棒状杆菌的赖氨酸生物合成基因当中，lysC和pyc具有起始密码子GTG，tkt具有起始密码子TTG。这些基因的起始密码子不是ATG，这被认为是棒状杆菌的独特特性。
根据本发明的修饰的多核苷酸的特征在于lysC,tkt或pyc基因的起始密码子由ATG替代，并且这些具有这样替代的起始密码子的修饰的多核苷酸已首先被本发明人修饰。更详细地，在本发明中编码天冬氨酸激酶(LysC)或丙酮酸羧化酶(Pyc)的多核苷酸的GTG起始密码子由ATG替代，编码转酮醇酶(Tkt)的多核苷酸的TTG起始密码子由ATG替代。更具体地，lysC、tkt和pyc基因的序列分别是SEQ ID NOs.13、14和15，具有的替代起始密码子为ATG的基因序列分别由SEQ ID NOs.16、17和18表示。
起始密码子的碱基替代可通过本领域已知的任何方法来进行，例如，位点专一诱变、同源重组，但不限于此。
另一方面，本发明提供这样的载体，其包括编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的修饰的多核苷酸中的一种或多种修饰的多核苷酸，其中多核苷酸的起始密码子由ATG替代。
具有的替代起始密码子为ATG并编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的修饰的多核苷酸——其可包含在本发明的载体中——可包括部分多核苷酸被替代、缺失、插入或添加的那些多核苷酸，只要它们具有酶活性，和可具有70％或更多的同源性,特别地80％或更多的同源性,更特别地90％或更多的同源性,更特别地95％或更多的同源性，和最特别地100％同源性。
进一步，具有的替代起始密码子为ATG并编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的修饰的多核苷酸——其可包含在本发明的载体中——还可只包括部分的编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的基因，只要它们具有的替代起始密码子为ATG。
如本文所用，术语“载体”指DNA构建物，其含有可操作地连接至合适的控制序列的碱基序列以在合适的宿主中表达靶基因。控制序列可包括启动转录的启动子、控制这种转录的某个操纵基因序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译终止的序列。用于本发明的载体没有特别限制，并且可以是本领域已知的任何载体，只要其在宿主中可复制。例如，载体可以是质粒、噬菌体颗粒或潜在的基因组插入物，并且特别地是pDZ(韩国专利号10-0924065)，但不限于此。一旦转化进合适的宿主，载体就可独立于宿主基因组而复制或起作用，或可整合进基因组本身。
具体地，获得包括lysC、tkt或pyc基因的起始密码子的核苷酸序列(SEQ ID NO.13、14或15)，和基于该序列，合成具有的替代起始密码子为ATG的引物。利用引物和L-赖氨酸-产生菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，以获得DNA，其一端由ATG替代。将这样获得的该DNA片段克隆进载体以获得最终的重组载体。更具体地，在本发明中，分别构建pDZ-lysC(ATG)、pDZ-tkt(ATG)和pDZ-pyc(ATG)载体。
另一方面，本发明提供包括一种或多种修饰的多核苷酸的微生物，该多核苷酸具有的替代的起始密码子为ATG并且编码选自天冬氨酸激酶、转酮醇酶和丙酮酸羧化酶的酶，和然后所述酶从多核苷酸转录的mRNAs到蛋白质的翻译水平被提高，导致与其内源活性相比一种或多种酶的活性提高。本发明的微生物可通过利用修饰的多核苷酸组合其一个、两个或三个而具有提高的天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的活性，其中修饰的多核苷酸编码相应的酶和在起始密码子上用ATG替代。
为了用ATG替代微生物染色体上靶基因的起始密码子，可利用本领域已知的多种方法。例如，微生物中内源lysC、tkt和pyc基因的起始密码子序列可在染色体上被替代。可选地，可将相应的具有替代起始密码子序列的基因以质粒的形式引入所述微生物。
所述微生物可以是任何菌株，只要它具有L-赖氨酸生产力。特别地它可以是棒状杆菌属或短杆菌属(Brevibacterium sp.)的微生物。棒状杆菌属或短杆菌属微生物的实施例包括谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)FERM BP-1539、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、发酵乳短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869。进一步，可包括从其衍生的产生L-赖氨酸的变体或菌株，例如，谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(该微生物被公开为KFCC10881，和在布达佩斯条约下重新保存到国际保藏管理局，登记号KCCM11016P，韩国专利号10-0159812，韩国专利号10-0397322)和谷氨酸棒状杆菌KFCC 11001。此外可以是谷氨酸棒状杆菌，登记号KCCM11016P。
具体地，将具有登记号KCCM11016P的谷氨酸棒状杆菌用包括编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的多核苷酸的载体转化，其中起始密码子被ATG替代以获得重组的谷氨酸棒状杆菌。更具体地，分别将pDZ-lysC(ATG)、pDZ-tkt(ATG)或pDZ-pyc(ATG)载体引入具有登记号KCCM11016P的谷氨酸棒状杆菌以获得每种重组的谷氨酸棒状杆菌。
进一步，可用包括编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶并且具有的替代起始密码子为ATG的多核苷酸中的两种或更多种多核苷酸的载体转化微生物。具体地，将包括其起始密码子已由ATG替代并编码转酮醇酶的基因的pDZ-tkt(ATG)载体转化进谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P-lysC，其中lysC的GTG起始密码子被ATG替代，并通过第二交换(second crossover)，将染色体上lysC和tkt的起始密码子用ATG替代以获得谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P-lysC-tkt。进一步，将包括其起始密码子已由ATG替代和编码丙酮酸羧化酶的多核苷酸的pDZ-pyc(ATG)载体转化进KCCM11016P-lysC，其中lysC的GTG起始密码子由ATG替代，并通过第二交换，将染色体上lysC和pyc的起始密码子由ATG替代以获得KCCM11016P-lysC-pyc。此外，将pDZ-tkt(ATG)载体转化进如上面所制备的KCCM11016P-lysC-pyc，其中lysC和pyc的GTG起始密码子由ATG替代，并通过第二交换，将染色体上lysC、pyc和tkt的起始密码子由ATG替代以获得KCCM11016P-lysC-pyc-tkt。据证实，lysC、pyc和tkt的起始密码子在属于谷氨酸棒状杆菌、KFCC10750(韩国专利号10-0073610)、KCCM10770P(韩国专利号10-0924065)、CJ3P(基因组Biology 2012,13:R40)的另一个赖氨酸-产生菌株中还可以以相同方式由ATG替代。这些结果提示本发明的修饰的多核苷酸可被稳定地引入属于棒状杆菌属的许多菌株，由此增加L-赖氨酸生产力。
具体地，将通过将包括编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶和丙酮酸羧化酶的多核苷酸的pDZ-lysC(ATG)、pDZ-tkt(ATG)和pDZ-pyc(ATG)载体引入谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P而获得的转化体KCCM11016P-lysC-pyc-tkt命名为谷氨酸棒状杆菌CA01-2059，并在2011年5月2日保藏在韩国微生物培养中心(在下文中，缩写为“KCCM”)——其是布达佩斯条约下的国际保藏管理局，登记号KCCM11188P。它在布达佩斯条约下由国际保藏管理局保藏。
根据本发明的微生物的特征在于编码以上酶的野生型基因的起始密码子被ATG替代，因此，所述微生物的天冬氨酸激酶、转酮醇酶和丙酮酸羧化酶活性与其内源活性相比提高，这是由于从lysC,tkt和pyc基因转录的mRNAs到蛋白质的翻译水平的显著提高。
如本文所用，术语“内源活性”指天然微生物中酶的活性，例如，属于棒状杆菌属的天然微生物中天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的活性。术语“提高的内源活性”指所述活性与天然酶的活性相比被进一步提高。
具体地，当将其中lysC基因的起始密码子由ATG替代的菌株中天冬氨酸激酶活性与亲本株KCCM11016P比较时，观察到天冬氨酸激酶活性增加2.73倍(表4)。进一步，当将其中tkt基因的起始密码子由ATG替代的菌株中转酮醇酶活性与亲本株KCCM11016P比较时，观察到转酮醇酶活性增加3.5倍(表5)。此外，当将其中pyc基因的起始密码子由ATG替代的菌株中丙酮酸羧化酶活性与亲本株KCCM11016P比较时，观察到丙酮酸羧化酶活性增加1.89倍(表6)。
发现微生物的L-赖氨酸生产力可通过提高天冬氨酸激酶、转酮醇酶、丙酮酸羧化酶的活性或其组合而增加。
在本发明中，测量L-赖氨酸-产生菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P-lysC、KCCM11016P-tkt、KCCM11016P-pyc、KCCM11016P-lysC-tkt、KCCM11016P-lysC-pyc和KCCM11016P-lysC-pyc-tkt中产生的L-赖氨酸的量，并且结果，它们显示与亲本株KCCM11016P相比L-赖氨酸产生显著提高(表7)。同样，属于谷氨酸棒状杆菌、KFCC10750(韩国专利号10-0073610)、KCCM10770P(韩国专利号10-0924065)和CJ3P(Genome Biology 2012,13:R40)的另一个赖氨酸-产生菌株——其中lysC、pyc和tkt的起始密码子由ATG替代——显示与亲本株相比L-赖氨酸产生的显著提高(表8～10)。这些结果提示染色体上具有一种类型的编码LysC、Tkt或Pyc的修饰的多核苷酸，或具有两种类型的编码所述酶的修饰的多核苷酸，或具有三种类型的编码所述酶的修饰的多核苷酸和具有的替代的起始密码子为ATG的微生物也显示与具有GTG或TTG起始密码子的野生型微生物相比显著提高的L-赖氨酸生产力。
另一方面，本发明提供产生L-赖氨酸的方法，包括培养如上面所描述的微生物；和从培养的微生物或培养肉汤回收L-赖氨酸的步骤。
对于培养，可使用利用本领域广泛已知的微生物产生L-赖氨酸的许多方法。培养可根据广泛已知的方法来进行，并且可适当控制培养条件，包括温度、时间、培养基的pH等。培养的详细描述在以下文件中给出[Chmiel；Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)，和Storhas；Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994)]。进一步，培养可包括分批培养、连续培养和补料分批培养。具体地，分批、补料分批或重复的补料分批法可以以连续方式操作，但是本发明不限于此。
对于培养中的使用，培养基必须满足使用的特定菌株的要求。用于属于棒状杆菌属的微生物的培养基众所周知(例如，Manual of Methods for General Bacteriology.American Society for Bacteriology.Washington D.C.,USA,1981)。将使用的碳源可包括糖类和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪如大豆油、葵花子油、蓖麻油和椰子脂；脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸；醇如甘油和乙醇；和有机酸如乙酸。这些物质可单独或组合使用。将使用的氮源可包括蛋白胨、酵母提取物、肉羹、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可单独或组合使用。将使用的磷源可包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和相应的钠盐。此外，培养基可含有生长必需的金属盐如硫酸镁或硫酸亚铁。最后，除了以上物质，可利用必需营养素如氨基酸和维生素。此外，可将适当的前体加入培养基。可将这些物质在培养期间以分批或连续方式适当地加入培养基。
培养基的pH可用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾或铵，或酸性化合物如磷酸或硫酸来调节。泡沫的产生可利用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制。培养基可通过向其中引入氧或含氧气体(例如，空气)而保持在需氧条件(aerobic condition)下。培养温度通常在20和45℃，特别地25和40℃之间。继续培养直到产生最大量的L-赖氨酸。从这一点上，它可在10至160hrs内完成。产生之后，L-赖氨酸可被输出到培养基或可保持在细胞内。
进一步，本发明的产生L-赖氨酸的方法包括从培养的微生物或培养肉汤回收L-赖氨酸的步骤。从微生物或培养肉汤回收L-赖氨酸的方法在本领域广泛已知。L-赖氨酸回收方法的实施例可包括过滤、阴离子交换层析、结晶和HPLC，但是不限于此。
实施例
在下文中，本发明将参考实施例被更详细地描述。然而，这些实施例仅用于说明的目的，本发明不意欲受这些实施例限制。
在实施例中，构建这样的重组载体，其用ATG替代衍生自赖氨酸-产生菌株，谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P的编码天冬氨酸激酶的lysC基因、编码转酮醇酶的tkt基因和编码丙酮酸羧化酶的pyc基因的GTG或TTG起始密码子。将载体转化进谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株以获得具有染色体上替代的起始密码子的菌株，由此制备具有提高的赖氨酸生产力的菌株。
用于本发明的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株是这样的菌株，其对S-(2-氨乙基)半胱氨酸(在下文中，称作AEC)具有抗性，并且是高丝氨酸泄漏型(homoserine-leaky)的，通过利用野生型谷氨酸棒状杆菌(ATCC 13032)作为亲本株(被公开为KFCC10881。参见韩国专利号10-0159812和韩国专利号10-0397322)的人工突变而制备。进一步，KFCC10750菌株是谷氨酸棒状杆菌L-赖氨酸-产生菌株，其是高丝氨酸营养缺陷体和对L-亮氨酸类似物、4-重氮亮氨酸(azaleucine)和抗生素利福平有抗性，通过人工突变(韩国专利号10-0073610)制备，KCCM10770P菌株是衍生自KCCM11016P的L-赖氨酸-产生菌株，其染色体上保留两个拷贝的6种类型的构成赖氨酸生物合成途径的基因(韩国专利号10-0924065)，CJ3P菌株是通过将P458S、V59A和T311I突变中的每个引入野生型的三种类型的pyc、hom和lysC基因而具有L-赖氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌菌株，基于Binder等人的描述(Genome Biology 2012,13:R40)。
实施例1：衍生自谷氨酸棒状杆菌的lysC中具有替代的ATG起始密码子的重组 载体(pDZ-lysC(ATG))的构建和具有替代的起始密码子的菌株的制备
将pDZ(参见韩国专利号10-0924065)用作重组载体的基本载体，该重组载体被如下构建。
(1)pDZ-lysC(ATG)重组载体的构建
为了获得源自谷氨酸棒状杆菌的lysC基因，将通过人工突变制备的赖氨酸-产生菌株(谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P)的染色体DNA用作模板。基于在美国国立卫生研究院的基因库(NIH GenBank)，获得含有lysC基因起始密码子区的核苷酸序列(SEQID NO.13)(NCBI登记号NC_003450，Ncgl0247)，并且基于该序列，合成用ATG替代起始密码子GTG的两对引物(表1，SEQ ID NOs.1～4)。
利用KCCM11016P的染色体DNA作为模板和下面表1的引物来进行PCR。PfuUltraTM高保真度DNA聚合酶(Stratagene)用作聚合酶，PCR进行30个循环：在96℃变性30秒；在55℃退火30秒和在72℃聚合30秒。将这样获得的两种DNA片段利用In-Fusion PCR克隆试剂盒(Clontech)克隆到用限制性酶XbaI处理的pDZ载体中，最后，构建了pDZ-lysC(ATG)重组载体。
(2)菌株的制备
将这样构建的pDZ-lysC(ATG)载体通过电脉冲方法(通过利用根据Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541-545的转化方法)转化到KCCM11016P中，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基上选择其中基因通过同源重组插入染色体的菌株。载体成功插入染色体通过含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-(β-D-半乳糖苷)的固体培养基上的蓝色菌落来证实。将具有第一染色体插入的菌株在营养培养基中震荡培养(30℃，8小时)。然后，将培养的菌株从10-4连续稀释到10-10，并将稀释的培养物铺板在含有X-gal的固体培养基上。大多数菌落显示蓝色，而白色菌落也以低水平存在。通过选择白色菌落，选择其中在lysC起始密码子区处的核苷酸序列通过第二交换而替代的菌株。选择的菌株中起始密码子的核苷酸替代通过利用SEQ ID NOs.1和4的引物的PCR以及随后通过分析靶位点的核苷酸序列而被最后证实。
[表1]
引物 核苷酸序列 SEQ ID NO.
lysC/ATG/FX CCGGGGATCCTCTAGActtagggagccatcttttgg 1
lysC/ATG/R CCAGGGCCATCTTTGTGC 2
lysC/ATG/F GCACAAAGATGGCCCTGG 3
lysC/ATG/RX GCAGGTCGACTCTAGAAGTGACATCAACAATGCGTG 4
实施例2：衍生自谷氨酸棒状杆菌的tkt中具有替代的ATG起始密码子的重组载 体(pDZ-tkt(ATG))的构建和具有替代的起始密码子的菌株的制备
存在两种期望为tkt基因序列上起始密码子的密码子。基于与RBS(核糖体结合位点)的距离和蛋白质组学，在本发明中将下游密码子确定为起始密码子。
(1)pDZ-tkt(ATG)重组载体的构建
为了获得源自谷氨酸棒状杆菌的tkt基因，将KCCM11016P的染色体DNA用作模板。基于在美国国立卫生研究院的基因库(NIH GenBank)，获得含有tkt基因起始密码子区的核苷酸序列(SEQ ID NO.14)(NCBI登记号NC_003450，Ncgl1512)，和基于该序列，合成用ATG替代起始密码子TTG的两对引物(表2，SEQ ID NOs.5～8)。
利用KCCM11016P的染色体DNA作为模板和下面表2的引物在实施例1-1的条件下进行PCR。将这样获得的两种DNA片段利用In-Fusion PCR克隆试剂盒(Clontech)克隆到用限制性酶XbaI处理的pDZ载体，最后，构建了pDZ-tkt(ATG)重组载体。
(2)菌株的制备
以与实施例1-2相同的方式将这样构建的pDZ-tkt(ATG)载体转化进赖氨酸-产生菌株KCCM11016P，获得KCCM11016P-tkt，其中通过第二交换，染色体上tkt的起始密码子由ATG替代。基因起始密码子的核苷酸替代通过利用SEQ ID NOs.5和8的引物的PCR以及随后通过分析靶位点的核苷酸序列而被最后证实。
[表2]
实施例3：衍生自谷氨酸棒状杆菌的pyc中具有替代的ATG起始密码子的重组 载体(pDZ-pyc(ATG))的构建和具有替代的起始密码子的菌株的制备
(1)pDZ-pyc(ATG)重组载体的构建
为了获得源自谷氨酸棒状杆菌的pyc基因，将KCCM11016P的染色体DNA用作模板。基于在美国国立卫生研究院的基因库(NIH GenBank)，获得含有pyc基因起始密码子区的核苷酸序列(SEQ ID NO.15)(NCBI登记号NC_003450，Ncgl0659)，和基于该序列，合成用ATG替代起始密码子TTG的两对引物(表3，SEQ ID NOs.9～12)。
利用KCCM11016P的染色体DNA作为模板和下面表3的引物在实施例1-1的条件下进行PCR。将这样获得的两种DNA片段利用In-Fusion PCR克隆试剂盒(Clontech)克隆到用限制性酶XbaI处理的pDZ载体，最后，构建了pDZ-pyc(ATG)重组载体。
(2)菌株的制备
以与实施例1-2相同的方式将这样构建的pDZ-pyc(ATG)载体转化进赖氨酸-产生菌株KCCM11016P，获得KCCM11016P-pyc，其中通过第二交换，染色体上pyc的起始密码子由ATG替代。基因起始密码子的核苷酸替代通过利用SEQ ID NOs.9和12的引物的PCR以及随后通过分析靶位点的核苷酸序列而被最后证实。
[表3]
实施例4：lysC基因中具有替代的ATG起始密码子的菌株中天冬氨酸激酶酶活 性的测量
通过离心(5,000rpm，15分钟)收集处于指数期的细胞并且用0.1％Tris.HCl(pH8.0)缓冲液洗三次，然后悬浮在相同的缓冲液中以在610nm达到160的浊度。在将玻璃球以1.25g/1.5ml悬浮液加入之后，利用小球拍打器将细胞分裂6分钟。通过离心(15,000rpm，20分钟)收集上清液，并通过Bradford方法(Bradford,M.M 1976.Anal.Biochem.72:248-254)定量测量蛋白质含量和用作粗蛋白溶液用以测量天冬氨酸激酶(LysC)酶活性。为了定量LysC酶活性，将约0.05mL粗蛋白溶液加入含有0.1MTris.HCl(pH 8.0)、0.01M氯化镁(MgCl2)、0.6M羟胺.HCl(pH 7.0)、4mM ATP和0.2M天冬氨酸盐的反应溶液以启动反应。允许混合物在30℃反应30分钟，并加入终止溶液(10％FeCl2、3.3％TCA、0.7N HCl)以终止反应。通过离心收集上清液，和测量在540nm的吸光度。LysC酶活性的单位(U)被定义为1mg蛋白质1分钟产生的天冬氨酸氧肟酸盐的纳摩尔数。
观察KCCM11016P-lysC菌株，具有较亲本株KCCM11016P高2.73倍的LysC活性(表4)。
[表4]
LysC酶活性
菌株 酶活性(倍)
LysC
KCCM11016P 1.00
KCCM11016P-lysC 2.73
实施例5：tkt基因中具有替代的ATG起始密码子的菌株中转酮醇酶酶活性的测 量
通过离心(5,000rpm，15分钟)收集处于指数期的细胞并用0.1％Tris.HCl(pH 7.5)缓冲液洗三次，然后悬浮在相同的缓冲液中以在610nm达到160的浊度。将玻璃球以1.25g/1.5ml悬浮液加入之后，利用小球拍打器将细胞分裂6分钟。通过离心(15,000rpm，20分钟)收集上清液，并通过Bradford方法定量测量蛋白质含量和用作粗蛋白溶液用以测量转酮醇酶(Tkt)酶活性。为了定量Tkt酶活性，将粗蛋白溶液加入每1ml含有0.1M Tris.HCl(pH7.5)、10mM D-R5P、2mM D-Xu5P、10μM ThDP、1.2mM MgCl2、100μM NADH、1单位磷酸丙糖异构酶、1单位甘油-3-磷酸脱氢酶的反应溶液以启动反应。允许混合物在30℃反应20～30分钟，并测量在340nm的吸光度。将Tkt酶活性的单位(U)定义为1分钟催化产生1μmol甘油醛3-磷酸酯的酶的量(mg)，并将比活性定义为单位/mg(Biochem.J.(2004)382,759-767)。
观察KCCM11016P-tkt菌株，具有较亲本株KCCM11016P高3.5倍的Tkt活性(表5)。
[表5]
Tkt酶活性
菌株 酶活性(倍)
Tkt
KCCM11016P 1.00
KCCM11016P-tkt 3.5
实施例6：pyc基因中具有替代的ATG起始密码子的菌株中丙酮酸羧化酶酶活性 的测量
通过离心(5,000rpm，15分钟)收集处于指数期的细胞并用含有50mM氯化钠(NaCl)的50mM Tris.HCl(pH 6.3)缓冲液洗两次，然后悬浮在含有20％甘油的100mMHEPES(pH 7.5)缓冲液中。将CTAB加入悬浮液至0.3％的浓度，并置于冰上1分钟。通过离心(5,000rpm，10分钟)收集细胞，然后悬浮在100mM Tris.HCl(pH 7.3)缓冲液中。蛋白质含量通过Bradford方法定量测量和用作粗蛋白溶液用以测量丙酮酸羧化酶(Pyc)酶活性。为了定量Pyc酶活性，将粗蛋白溶液加入含有25mM NaHCO3、5mMMgCl2、3mM丙酮酸盐和4mM ATP的反应溶液以启动反应。允许混合物在30℃反应1.5分钟，并加入80μl终止溶液(30％ο-磷酸)以终止反应。通过离心(12,000rpm，15min，4℃)收集上清液。每1ml加入50μl上清液、150mM Tris.HCl(pH 7.8)、150μM NADH和2.5U乳酸脱氢酶，并在37℃测量在340nm的吸光度。将Pyc酶活性的单位(U)被定义为1分钟1mg蛋白质产生的乳酸盐的纳摩尔数。
观察KCCM11016P-pyc菌株，具有较亲本株KCCM11016P高1.89倍的Pyc活性(表6)。
[表6]
Pyc酶活性
菌株 酶活性(倍)
Pyc
KCCM11016P 1.00
KCCM11016P-pyc 1.89
实施例7：lysC、tkt和pyc基因的两个或多个基因中具有替代的ATG起始密码 子的衍生自KCCM11016P的菌株的生长
作为重组载体，利用实施例1、2和3中制备的pDZ-lysC(ATG)pDZ-tkt(ATG)pDZ-pyc(ATG)，制备过程如下。
将pDZ-tkt(ATG)载体转化进实施例1的KCCM11016P-lysC，其中lysC的GTG起始密码子由ATG替代，并通过第二交换，染色体上lysC和tkt的起始密码子被ATG替代以获得KCCM11016P-lysC-tkt。基因起始密码子的核苷酸替代通过利用SEQ IDNOs.5和8的引物的PCR以及然后通过分析靶位点的核苷酸序列而被最后证实。
以与实施例1中相同的方式，将pDZ-pyc(ATG)载体转化进实施例1的KCCM11016P-lysC，其中lysC的GTG起始密码子由ATG替代，并通过第二交换，染色体上lysC和pyc的起始密码子由ATG替代以获得KCCM11016P-lysC-pyc。基因起始密码子的核苷酸替代通过利用SEQ ID NOs.9和12的引物的PCR以及然后通过分析靶位点的核苷酸序列而被最后证实。
将pDZ-tkt(ATG)载体转化进本实施例的KCCM11016P-lysC-pyc，其中lysC和pyc的GTG起始密码子由ATG替代，并通过第二交换，染色体上lysC、pyc和tkt的起始密码子由ATG替代以获得KCCM11016P-lysC-pyc-tkt。基因起始密码子的核苷酸替代通过利用SEQ ID NOs.5和8的引物的PCR以及然后通过分析靶位点的核苷酸序列而被最后证实。
基因的上述组合仅用于说明的目的，基因组合的范围不意欲受限于此。
实施例8：在具有替代的ATG起始密码子的菌株中产生赖氨酸
将实施例1、2、3和7中最终制备的KCCM11016P-lysC、KCCM11016P-tkt、KCCM11016P-pyc、KCCM11016P-lysC-tkt、KCCM11016P-lysC-pyc、KCCM11016P-lysC-pyc-tkt通过以下方法培养用于L-赖氨酸产生。
亲本株KCCM11016P和KCCM11016P-lysC、KCCM11016P-tkt、KCCM11016P-pyc、KCCM11016P-lysC-tkt、KCCM11016P-lysC-pyc、KCCM11016P-lysC-pyc-tkt接种在各自含有25ml下面描述的种子培养基的250ml三角带挡板的烧瓶(corner-baffled flasks)中，并将生成物在30℃以200rpm摇动培养20小时。将1mL产生的种子培养肉汤接种到含有24ml下面描述的生产培养基的250ml三角带挡板的烧瓶中，并在30℃摇动(200rpm)培养120小时。
完成培养之后，产生的L-赖氨酸的量通过HPLC测量。测量KCCM11016P和KCCM11016P-lysC、KCCM11016P-tkt、KCCM11016P-pyc、KCCM11016P-lysC-tkt、KCCM11016P-lysC-pyc、KCCM11016P-lysC-pyc-tkt的培养肉汤中L-赖氨酸的结果显示在下面的表7中。
[表7]
菌株 赖氨酸(g/l)
第1批 第2批 第3批
KCCM11016P 45.2 44.7 45.6
KCCM11016P-lysC 47.5 46.2 47.9
KCCM11016P-tkt 47.4 48.5 47.0
KCCM11016P-pyc 47.9 46.3 47.8
KCCM11016P-lysC-tkt 49.7 49.3 49.2
KCCM11016P-lysC-pyc 50.1 48.9 49.6
KCCM11016P-lysC-pyc-tkt 50.7 50.2 51.1
种子培养基(pH 7.0)
20g粗糖、10g蛋白胨、5g of酵母抽提物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5g MgSO47H2O、100μg生物素、1000μg硫胺素-HCl、2000μg泛酸钙、2000μg烟碱酰胺(在1升蒸馏水中)
生产培养基(pH 7.0)
100g葡萄糖、40g(NH4)2SO4、2.5g大豆蛋白质、5g玉米浆固体(corn steepsolids)、3g尿素、1g KH2PO4、0.5g MgSO47H2O、100μg生物素、1000μg硫胺素-HCl、2000μg泛酸钙、3000μg烟碱酰胺、30g CaCO3(在1升蒸馏水中)
如表7所示，发现与亲本株KCCM11016P相比，具有替代的ATG起始密码子的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P-lysC、KCCM11016P-tkt、KCCM11016P-pyc、KCCM11016P-lysC-tkt和KCCM11016P-lysC-pyc显示L-赖氨酸生产力增加4～9％。特别地，发现与亲本株KCCM11016P相比，引入所有三个基因的KCCM11016P-lysC-pyc-tkt显示L-赖氨酸生产力增加高达12％。
实施例9：lysC、tkt和pyc基因中具有替代的ATG起始密码子的KFCC10750 衍生的菌株的生长和赖氨酸生产力的比较
为了检查lysC、pyc和tkt基因中用ATG替代起始密码子是否在属于谷氨酸棒状杆菌的其它赖氨酸-产生菌株中影响赖氨酸生产力，将所有三个基因——其显示实施例8中最好的增加赖氨酸生产力的效应——引入L-赖氨酸-产生菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10750(韩国专利号10-0073610)以制备重组菌株，将其命名为KFCC10750-lysC-pyc-tkt。将菌株以与实施例8相同的方式培养，并分析L-赖氨酸浓度(表8)。
[表8]
如表8所示，引入所有三个基因的谷氨酸棒状杆菌KFCC10750-lysC-pyc-tkt显示：与亲本株KFCC10750相比赖氨酸生产力15％的增加。
实施例10：lysC、tkt和pyc基因中具有替代的ATG起始密码子的KCCM10770P 衍生的菌株的生长和赖氨酸生产力的比较
将所有三个基因——其显示实施例8中最好的增加赖氨酸生产力的效应——引入另一个L-赖氨酸-产生菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P(韩国专利号10-0924065)以制备重组菌株，将其命名为KCCM10770P-lysC-pyc-tkt。以与实施例8相同的方式培养菌株，并分析L-赖氨酸浓度(表9)。
[表9]
如表9所示，引入所有三个基因的谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-lysC-pyc-tkt显示：与亲本株KCCM10770P相比赖氨酸生产力11％的增加。
实施例11：lysC、tkt和pyc基因中具有替代的ATG起始密码子的CJ3P衍生的 菌株的生长和赖氨酸生产力的比较
将所有三个基因——其显示实施例8中最好的增加赖氨酸生产力的效应——引入另一个L-赖氨酸-产生菌株谷氨酸棒状杆菌CJ3P(Binder等人，Genome Biology 2012,13:R40)以制备重组菌株，将其命名为CJ3P-lysC-pyc-tkt。以与实施例8相同的方式培养菌株，并分析L-赖氨酸浓度(表10)。
[表10]
如表10所示，引入所有三个基因的谷氨酸棒状杆菌CJ3P-lysC-pyc-tkt显示：与亲本株CJ3P相比赖氨酸生产力18％的增加。
原始保藏接收证明
至：CJ第一制糖株式会社
5005-GA NAMDAEMUN-RO，CHUNG-KU，
大韩民国
证明上述翻译与原文内容没有相互违背
                    2012年12月21日
                    专利代理人Son Min印
原始保藏接收证明
至：CJ第一制糖株式会社
5005-GA NAMDAEMUN-RO，CHUNG-KU，
大韩民国
证明上述翻译与原文内容没有相互违背
                  2012年12月21日
                  专利代理人Son Min印

Claims (9)

1.编码天冬氨酸激酶(LysC)、转酮醇酶(Tkt)或丙酮酸羧化酶(Pyc)的修饰的多核苷酸，其中所述多核苷酸的起始密码子由ATG替代。
2.根据权利要求1所述的修饰的多核苷酸，其中所述编码天冬氨酸激酶(LysC)或丙酮酸羧化酶(Pyc)的多核苷酸的所述起始密码子是GTG，并且所述编码转酮醇酶(Tkt)的多核苷酸的所述起始密码子是TTG。
3.根据权利要求1所述的修饰的多核苷酸，其中所述修饰的多核苷酸由SEQ IDNO.16、17或18的核苷酸序列表示。
4.包括一种或多种修饰的多核苷酸的载体，所述修饰的多核苷酸选自编码天冬氨酸激酶(LysC)、转酮醇酶(Tkt)和丙酮酸羧化酶(Pyc)的修饰的多核苷酸，其中所述多核苷酸的起始密码子由ATG替代。
5.修饰的微生物，其一种或多种酶的活性与它们的内源活性相比提高，其中所述酶选自天冬氨酸激酶、转酮醇酶和丙酮酸羧化酶，并且编码所述酶的多核苷酸的起始密码子由ATG替代。
6.根据权利要求5所述的微生物，其中用权利要求4所述的载体转化所述微生物。
7.根据权利要求5所述的微生物，其中所述微生物是棒状杆菌属。
8.根据权利要求7所述的微生物，其中所述棒状杆菌属微生物是谷氨酸棒状杆菌。
9.产生L-赖氨酸的方法，包括培养权利要求5至8中任一项所述的微生物；和从所述培养的微生物或培养肉汤回收L-赖氨酸的步骤。
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