CN104160015A - 生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物的喹啉酸生产方法 - Google Patents
生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物的喹啉酸生产方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104160015A CN104160015A CN201380009522.1A CN201380009522A CN104160015A CN 104160015 A CN104160015 A CN 104160015A CN 201380009522 A CN201380009522 A CN 201380009522A CN 104160015 A CN104160015 A CN 104160015A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid
- gene
- quinolinic acid
- recombinant microorganism
- joint
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
- C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
-
- F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
- F16—ENGINEERING ELEMENTS AND UNITS; GENERAL MEASURES FOR PRODUCING AND MAINTAINING EFFECTIVE FUNCTIONING OF MACHINES OR INSTALLATIONS; THERMAL INSULATION IN GENERAL
- F16K—VALVES; TAPS; COCKS; ACTUATING-FLOATS; DEVICES FOR VENTING OR AERATING
- F16K37/00—Special means in or on valves or other cut-off apparatus for indicating or recording operation thereof, or for enabling an alarm to be given
- F16K37/0025—Electrical or magnetic means
- F16K37/0041—Electrical or magnetic means for measuring valve parameters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12Y104/03—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
- C12Y104/03016—L-Aspartate oxidase (1.4.3.16)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/01072—Quinolinate synthase (2.5.1.72)
-
- F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
- F16—ENGINEERING ELEMENTS AND UNITS; GENERAL MEASURES FOR PRODUCING AND MAINTAINING EFFECTIVE FUNCTIONING OF MACHINES OR INSTALLATIONS; THERMAL INSULATION IN GENERAL
- F16K—VALVES; TAPS; COCKS; ACTUATING-FLOATS; DEVICES FOR VENTING OR AERATING
- F16K37/00—Special means in or on valves or other cut-off apparatus for indicating or recording operation thereof, or for enabling an alarm to be given
- F16K37/0066—Hydraulic or pneumatic means
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物生产喹啉酸的方法,所述重组微生物表达这样的融合蛋白,其中L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶由接头连接。
Description
技术领域
本发明涉及生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物生产喹啉酸的方法。
背景技术
喹啉酸(quinolinic acid)也被称为2,3-吡啶-二羧酸,在医药、农药、染料等诸多领域中被用于化学合成物的前体。
上述喹啉酸可以通过化学或生物合成方法制备。化学合成方法将来自石油的不可再生(non-renewable)材料作为原料使用,因此会受到环境问题和油价或石油提取单位成本的影响。
作为生物合成方法的代表性的例子,公开了在下述大肠杆菌(E.coli)中生产喹啉酸的方法:在去除了喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性的大肠杆菌中,通过克隆具有编码L-天冬氨酸氧化酶(NadB)和喹啉酸合成酶(NadA)的基因的不同拷贝数的质粒,使上述两种基因的表达得到增强(Eur.J.Biochem.175,221-228(1988),DE3826041)。此时,产生的喹啉酸的浓度为500mg/L或以下的非常低的水平。生成如此低浓度的喹啉酸的第一个原因是NadR的转录抑制,其为编码L-天冬氨酸氧化酶的nadB和编码喹啉酸合成酶的nadA的与NAD相关的转录抑制子。第二个原因是NAD导致的L-天冬氨酸氧化酶——NadB蛋白质的反馈抑制。第三个原因是大肠杆菌中由碳源至L-天冬氨酸的生物合成途径变弱。
为了解决第一个原因,在韩国专利公报第10-2012-008267号中,使用了微生物菌株来将喹啉酸的产量提高到5.5g/L,其中将在转录阶段受到抑制的喹啉酸生物合成基因L-天冬氨酸氧化酶(NadB)和喹啉酸合成酶(NadA)的启动子区域替换为组成型启动子(constitutivepromoter),并增强了L-天冬氨酸生物合成路径。
通过生物合成方法由L-天冬氨酸合成喹啉酸的生物合成途径如以下反应方案所示。
1)L-天冬氨酸氧化酶(NadB)
L-天冬氨酸+氧<=>过氧化氢+α-亚氨基丁二酸+H+
2)喹啉酸合成酶(NadA)
α-亚氨基丁二酸+磷酸二羟丙酮<=>喹啉酸+磷酸+2H2O
上述喹啉酸生物合成途径中的中间代谢产物α-亚氨基丁二酸是一种不稳定的物质,具有在细胞内由天然的脱氨基反应,转化为草酰乙酸酯的特性(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.257,No.2,Issue of January 25.pp.626-632,1982)。通常,当不稳定的中间代谢产物被用作基质时,如果上述基质与酶之间的碰撞频率不高,则会生成大量的副产物。但是,目前为止还没有为解决与喹啉酸的生产相关的上述问题而进行的尝试。
另一方面,将异种酶或蛋白质通过氨基酸接头连接,使它们表达为一个蛋白质的融合蛋白技术,被用于各种目的,例如将表达量少的蛋白质与表达量多的蛋白质连接,从而增加上述蛋白质的表达量,或者制备成与标记(Tag)连接的融合蛋白,从而提高蛋白质的纯化率等。
已知接头的设计对于制备融合蛋白是重要的。通常,多使用具有α-螺旋结构的螺旋形接头或结构上具有柔性(flexibility)的柔性接头,并且例如,根据想要实现的融合蛋白的特性,可通过组合上述两种接头设计和使用各种接头(Cancer Res 2005;65:(16).August 15,2005)。
公开
技术问题
本发明人尝试通过表达由不同类型的氨基酸接头连接而成的NadB和NadA的融合蛋白,来解决由不稳定的代谢产物导致的反应降低,并发现与现有的生物学生产方法相比,通过表达所述融合蛋白能够以高收率生产喹啉酸,从而完成本发明。
技术方案
本发明的目的是提供生产喹啉酸的重组微生物,其表达由接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供生产喹啉酸的方法,包括培养上述重组微生物的步骤和回收在上述培养过程中产生的喹啉酸的步骤。
有益效果
根据本发明,通过提供表达由接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的微生物,能够将现有生物学生产工序中的α-亚氨基丁二酸的自然分解反应最小化,由此能够以高产率生产喹啉酸。
附图说明
图1显示了根据本发明一具体实施方案的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的结构。
图2显示了pPro-NBA、pNBHL1A、pNBHL2A、pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A、pNBFL4A质粒的结构。
图3显示了表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和L-天冬氨酸转氨酶的基因的质粒pCPA的结构。
优选实施方案的详述
作为一个实施方案,本发明提供了生产喹啉酸的重组微生物,其表达由接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。
上述L-天冬氨酸氧化酶(以下,称为“NadB”)作为具有将L-天冬氨酸氧化为亚氨基丁二酸的活性的酶,可以具有由SEQ ID NO.42表示的氨基酸序列或与之有高同源性的氨基酸序列。
[L-天冬氨酸氧化酶的活性]
L-天冬氨酸+延胡索酸<=>α-亚氨基丁二酸+琥珀酸+H+,或者,
L-天冬氨酸+氧<=>过氧化氢+α-亚氨基丁二酸+H+
编码上述酶的基因nadB的序列可以从文献(Mol Syst Biol.2006;2:2006.0007.Epub 2006 Feb 21)中公开的大肠杆菌(Escherichia coli)的基因组序列(gi:GI:89109380)或者例如美国国家生物技术信息中心(NCBI)及日本DNA数据库(DDBJ)等数据库中获取。
上述喹啉酸合成酶(以下,称为“NadA”)作为具有从亚氨基丁二酸合成喹啉酸的活性的酶,可以具有由SEQ ID NO.43表示的氨基酸序列或与之有高同源性的氨基酸序列。
[喹啉酸合成酶的活性]
α-亚氨基丁二酸+磷酸二羟丙酮<=>喹啉酸+磷酸+2H2O
编码上述酶的基因nadA的序列可以从文献(Mol Syst Biol.2006;2:2006.0007.Epub 2006Feb 21)中公开的大肠杆菌的基因组序列(gi:GI:89109380)或NCBI及DDBJ等数据库中获取。
如果增强上述NadB和NadA的活性,则在细胞内作为喹啉酸前体的α-亚氨基丁二酸的蓄积与从α-亚氨基丁二酸至喹啉酸的生物合成增加,从而可以增加喹啉酸的生产量。但是,由于上述α-亚氨基丁二酸是不稳定的代谢物,尽管上述两种酶(NadB及NadA)的活性和表达量增加,如果α-亚氨基丁二酸与NadA的接触频率不高,则会生成大量的副产物,由此无法像期待的那样有效地生产喹啉酸。为了解决这个问题,本发明使NadB及NadA以通过接头相互连接的融合蛋白的形式在菌株中得到表达,从而能够以高收率生产喹啉酸。
上述NadB及NadA可以具有分别由SEQ ID NO.42和43表示的氨基酸序列,但根据微生物的种类或菌株,显示上述活性的蛋白质的氨基酸序列可能存在差异,因此不限定于此。即,只要上述NadB及NadA是以通过接头相互连接而制备的融合蛋白形式提供,从而有助于增加喹啉酸的产率,它们可以是在SEQ ID NO.42和43的氨基酸序列的一个或多个位置上,具有由一个或多个氨基酸的替换、缺失、插入或添加等而变异的氨基酸序列的突变体或人工变异体。在本文中,“多个”可根据蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的种类或位置而有所不同,具体地可以是2~20个,优选2~10个,更优选2~5个。此外,氨基酸的替换、缺失、插入、添加或倒位等可以包括基于表达上述多肽的微生物的个体和/或物种的差异性等的天然存在的突变或人工变异。
只要它们具有上述反应方案所示的NadB及NadA酶促活性,编码上述NadB及NadA酶的多核苷酸可以是编码分别与SEQ ID NO.42和43的氨基酸序列有80%或更高同源性,优选有90%或更高同源性,更优选有95%或更高同源性,更加优选有97%或更高同源性的蛋白质的多核苷酸。最优选地,所述多核苷酸可具有分别由SEQ ID NO.27和28表示的多核苷酸序列。
本发明中的术语“同源性”表示两个氨基酸序列之间的一致性,可通过本领域技术人员公知的方法进行确定,例如计算分数(score)、一致性(identity)、相似性(similarity)等参数的BLAST 2.0。
编码上述NadB及NadA酶的多核苷酸序列可以是SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.28的多核苷酸序列,或者可以在“严格的条件”下与由上述多核苷酸序列制得的探针杂交,还可以编码功能正常的蛋白质的变异体。
在本发明中,术语“严格的条件”指允许多核苷酸之间的特异性杂交的条件。在Molecular Cloning(A Laboratory Manual,J.Sambrook etal.,Editors,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,ColdSpring Harbor,New York,1989)或Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel et al.,Editors,John Wiley&Sons,Inc.,New York)中有具体的记载,例如于65℃下在杂交缓冲液(3.5×SSC、0.02%的聚蔗糖、0.02%的聚乙烯吡咯烷酮、0.02%的牛血清白蛋白、2.5mM的NaH2PO4(pH 7)、0.5%的SDS、2mM的EDTA)中的杂交。SSC是pH7的0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠。杂交后,在室温下用2×SSC清洗已转移有DNA的膜,并在68℃的温度下用0.1-0.5×SSC/0.1×SDS清洗。
本发明的融合蛋白是将显示不同活性的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶通过氨基酸接头互相连接而成的多肽,具有下述反应方案中所示的由L-天冬氨酸生物合成喹啉酸的活性。
[融合蛋白的活性]
L-天冬氨酸+氧+磷酸二羟丙酮<=>喹啉酸+磷酸+2H2O+过氧化氢
如果增强上述融合蛋白的活性,则会提高作为中间代谢产物的α-亚氨基丁二酸至喹啉酸的转化率,从而与独立地增强NadB及NadA活性的情况相比,能够以更高的产率生产喹啉酸。
上述融合蛋白可以是通过接头将L-天冬氨酸氧化酶的N端和喹啉酸合成酶的C端连接而成的多肽,或者是通过接头将L-天冬氨酸氧化酶的C端和喹啉酸合成酶的N端连接而成的多肽,优选是选自SEQ IDNO.47、48、49、50、51、52及53中的氨基酸序列。
上述接头位于NadB和NadA多肽之间或者编码这些多肽的基因之间,其可以是螺旋形接头或柔性接头。此外,可以单独地或组合使用螺旋形接头或柔性接头作为上述接头,可以使用“EAAAK”或“EAAAR”作为上述螺旋形接头,可以使用“GGSGGS”、“GGGS”、“GGSG”或“GS”作为柔性接头,但其不限于此。
上述接头可由5~30个氨基酸序列组成,并且可以将螺旋形接头或柔性接头单独地或重复地连接使用。
根据一个具体的实施方案,含有上述螺旋形接头的接头可以是LA(EAAAK)nAAA,含有上述柔性接头的接头可以是L(GGGS)nAAA。优选地,上述n可以是1~5的整数。
根据一个具体的实施方案,上述接头可以具有选自SEQ ID NO.54、55、56、57、58、59及60中的氨基酸序列,或者与它们有高同源性的氨基酸序列,但不限定于此。
本发明的“生产喹啉酸的重组微生物”是能够从培养基中的碳源生产并蓄积喹啉酸,并表达由接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白,从而能够以高产率生产喹啉酸的微生物。
通过导入编码上述融合蛋白的多核苷酸,可以制备本发明的重组微生物以表达融合蛋白。
根据一个具体的实施方案,本发明的重组微生物可以通过将含有编码上述融合蛋白的多核苷酸的重组载体转化到该重组微生物中来制备。
本发明中,术语“转化”是指将基因导入宿主细胞内,使其能在宿主细胞内表达。只要被转化的基因能够在宿主细胞内表达,其可以位于任何位置而不受限制,不论是被插入染色体内还是位于染色体外。此外,只要上述基因能够导入宿主细胞内表达,其可以任何形式导入。例如,上述基因可以以含有上述基因自我表达所需要的所有要素的多核苷酸结构的表达盒(expression cassette)形式导入宿主细胞内。上述表达盒通常包括与上述基因可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点及翻译终止信号。上述表达盒可以是能够进行自我复制的表达载体形式。此外,上述基因可以以多核苷酸结构或其自身的形式导入宿主细胞中,且能够可操作地与宿主细胞中进行表达所需要的序列连接。
上述重组载体是一种通过将DNA导入宿主细胞来制备制备表达本发明的融合蛋白的微生物,以表达融合蛋白的方式,可以使用质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体等公知的表达载体,并且本领域技术人员可根据使用DNA重组技术的任意公知方法容易地制备载体。
优选地,上述重组载体可以是具有图2所示的切割图的pNBHL1A、pNBHL2A、pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A或pNBFL4A质粒载体,更优选地,上述质粒载体可以分别含有SEQ IDNO.34、35、36、37、38、39和40的核苷酸序列。
根据一个具体实施方案,生产喹啉酸的微生物可以是属于肠杆菌(Enterbacter sp.)、埃希氏菌(Escherichia sp.)、欧文氏菌(Erwinia sp.)、沙雷氏菌(Serratia sp.)、普罗威登斯菌(Providencia sp.)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.)或短杆菌(Brevibacterium sp.)的微生物,优选属于埃希氏菌的微生物,更优选为大肠杆菌,但不限定于此。
与内源性活性相比,本发明的微生物的喹啉酸磷酸核糖基转移酶(NadC)的活性会进一步减弱。本文的术语“内源性活性”是指天然微生物所具有的喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性。
上述NadC具有将喹啉酸转化为烟酸单核苷酸的活性,且可以具有SEQ ID NO.44的氨基酸序列或与之有高同源性的氨基酸序列。编码上述酶的基因nadC的序列可以从文献(Mol Syst Biol.2006;2:2006.0007.Epub 2006 Feb 21.)中公开的大肠杆菌的基因组序列(GI:89106990)或NCBI、DDBJ等数据库中获取。
[喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性]
5-磷基-α-D-核糖1-二磷酸+喹啉酸+2H+<=>CO2+二磷酸+烟酸单核苷酸
通过减弱上述NadC的活性,可以增加细胞内喹啉酸的蓄积。可通过选自以下的方法实现酶活性的减弱:1)编码上述酶的基因的部分或全部缺失,2)对表达调控序列进行修饰以减少基因的表达(例如,将上述基因的内源启动子替换为较弱的启动子),3)对染色体上的上述基因序列进行修饰,以减弱上述酶的活性,及4)它们的组合。在本发明的具体实施例中,通过同源重组的方式,将nadC从微生物的基因组中去除。
此外,可进一步修饰本发明的微生物,以增强选自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、L-天冬氨酸转氨酶及本发明的融合蛋白中的一种或多种蛋白质的活性,以增强磷酸烯醇式丙酮酸至L-天冬氨酸的生物合成途径。
上述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)及L-天冬氨酸转氨酶(AspC)具有从磷酸烯醇式丙酮酸合成L-天冬氨酸的活性,且可以具有分别由SEQ ID NO.45和46表示的氨基酸序列或与之有高同源性的氨基酸序列。编码上述酶的基因ppc或aspC的序列可以从文献(Mol Syst Biol.2006;2:2006.0007.Epub 2006Feb 21.)中公开的大肠杆菌的基因组序列(gi:GI:89110074,GI:89107778)或NCBI、DDBJ等数据库中获取。
[磷酸烯醇丙酮酸羧基酶的活性]
磷酸烯醇式丙酮酸+CO2→草酰乙酸+磷酸
[L-天冬氨酸转氨酶的活性]
草酰乙酸+谷氨酸<=>L-天冬氨酸+2-酮戊二酸
因此,如果增强PPC和AspC的活性,则可以增加细胞内作为喹啉酸前体的L-天冬氨酸的生产量,从而能够增加喹啉酸的生产量。
上述酶活性的增强可通过选自以下的方法实现:1)增加编码上述酶的基因的拷贝数的方法,2)对表达调控序列进行修饰以增加基因表达的方法,3)对染色体上的上述基因序列进行修饰,以增强上述酶的活性的方法,及4)它们的组合。在本发明的具体实施例中,构建了含有编码上述酶的基因的质粒,并将其导入生产喹啉酸的微生物中,以增加上述基因的拷贝数,从而诱导活性的增强。
可以使用将编码上述融合蛋白的基因的内源性启动子替换为活性增强的启动子,或者诱发启动子突变以增强启动子的活性,或者增加上述基因的拷贝数等方法,以增强上述融合蛋白的活性。通常可以使用pTac、pTrc、pPro、pR、pL、pCJ1、pCysK等作为上述活性增强的启动子。
在本发明的具体实施例中,将nadB和nadA的启动子取代为组成型启动子pPro(SEQ ID NO.32),以将组成型表达的nadB和nadA基因制备成质粒形式,所述组成型表达的nadB和nadA基因在转录抑制因子NadR以细胞内NAD浓度来抑制nadB及nadA的表达时不受抑制,并将质粒导入微生物中以诱导天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的过度表达。此外,本发明的具体实施例中,将编码NadB-L-NadA的基因的启动子取代为pPro启动子,从而诱导NadB-L-NadA的过度表达。在这一点上,pPro启动子仅作为抵抗细胞内的反馈抑制并提高蛋白质的表达的一个实例,本发明中所使用的启动子不限于此。
在另一个实施方案中,本发明提供了一种生产喹啉酸的方法,包括:(a)在含有碳源的培养基中培养重组微生物,所述重组微生物表达由接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白;及(b)回收在上述培养过程中产生的喹啉酸。
上述重组微生物可以在本领域公知的适宜的培养条件下于合适的培养基中进行培养。本领域技术人员可以使用此类培养方案并可根据所选择的微生物容易地进行调整。培养方法包括分批式、连续式和流加式培养,但不限定于此。微生物的各种培养方法公开在例如,“Biochemical Engineering”,James M.Lee,Prentice-Hall InternationalEditions,pp 138-176。
培养所使用的培养基必须以适当的方式满足特定微生物的需求。多种微生物的培养基公开在例如文献(“Manual of Methods for GeneralBacteriology”,American Society for Bacteriology(美国细菌学学会),Washington D.C.,USA,1981)。上述培养基含有各种碳源、氮源及微量元素。
可用于培养微生物的培养基中的碳源包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素等碳水化合物;大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油等油类;棕榈酸、硬脂酸和亚油酸等脂肪酸类;甘油和乙醇等醇类;乙酸等有机酸,但不限定于此。碳源可以单独或组合使用。
可用于培养微生物的培养基中的氮源包括胨类、酵母提取物、肉汁、麦精、玉米浸渍液(CSL)及大豆粉等有机氮源;尿素;硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵及硝酸铵等无机氮源,但不限定于此。氮源可以单独或组合使用。
可用于培养微生物的培养基的磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及相应的钠盐。此外,还可以包括硫酸镁或硫酸铁等金属盐。此外,上述培养基中还可以含有氨基酸、维生素及适宜的前体等。微生物培养用培养基或个别成分可以分批式或连续式方式添加。
此外,可以将氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸及硫酸等化合物以适宜的方式添加到微生物培养基中,从而控制发酵液的pH值。此外,在培养中可以使用脂肪酸聚乙二醇酯等消泡剂来抑制气泡生成。为了维持培养液的好氧状态,可以向发酵液中注入氧气或含氧气的气体(例如,空气)。发酵液的温度通常可以是20℃~45℃,优选25℃~40℃。培养期可以持续到获得期待量的喹啉酸为止,优选10~160小时。
本发明的具体实施例中,将表达质粒转化到去除了喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性的W3110△nadC菌株后,确认从这些菌株由天冬氨酸生产喹啉酸的生物合成能力,所述表达质粒包含编码由各种接头连接而成的NadB-L-NadA融合蛋白的基因。结果发现,与这些酶单独的表达相比,当L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶以融合蛋白表达时,能够以更高的收率生产喹啉酸(表2)。
此外,以包含编码上述融合蛋白的基因的表达质粒转化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和L-天冬氨酸转氨酶的活性得到增强并且喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性被去除的大肠杆菌后,确认了这些菌株CV01-0600、CV01-0601、CV01-0602、CV01-0603、CV01-0604、CV01-0605、CV01-0606及CV01-0607的喹啉酸产率。结果发现,通过L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的表达,能够以高收率生产喹啉酸,并且在以融合蛋白形式表达的同时,通过喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性的去除及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、L-天冬氨酸转氨酶的表达增强的组合,能够以比现有菌株更高的收率生产喹啉酸(表5)。
于2011年12月21日,根据布达佩斯条约将上述生产喹啉酸的菌株——大肠杆菌CV01-0604及CV01-0605保存在韩国微生物保存中心(KCCM,位于韩国首尔市西大门区弘济1洞)),登录号为KCCM11235P及KCCM11236P。即,上述寄存是寄存在布达佩斯条约下的国际保存单位。
实施例
下文将参照实施例和实验实例对本发明进行更加详细地说明。但是,下述实施例只是举例说明本发明,本发明的内容并不限定于下述实施例。
实施例1.生产喹啉酸的菌株的制备
<1-1>表达L-天冬氨酸氧化酶的质粒的制备
通过将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板的PCR,获得了编码L-天冬氨酸氧化酶的基因nadB。基于从美国国立卫生研究院的基因库(NIH GenBank)获得的SEQ ID NO.27的nadB基因的核苷酸序列(NCBI登记号“GI:89109380”),可以对nadB基因的含有ATG至TAA部分的ORF部分进行扩增,并合成了具有限制性内切酶NdeI和BamHI的识别位点的SEQ ID NO.1和2的引物。
以大肠杆菌W3110的染色体DNA为模板,使用SEQ ID NO.1和2的寡核苷酸作为引物,实施PCR。使用PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶,通过重复30次循环进行PCR,每个循环包括96℃下变性30秒、50℃下退火30秒及72℃下延伸2分钟。由此,获得了约1.9kb扩增的基因,所述基因均含有nadB基因和限制性内切酶NdeI和BamHI的识别位点。
对上述通过PCR获得的nadB基因用限制性内切酶NdeI和BamHI进行处理,所述nadB基因通过连接(ligation)到用限制性内切酶NdeI和BamHI处理过的pProLar(CloneTech)载体而被克隆,最终制得克隆有nadB基因的pPro-nadB重组载体,而nadB基因的表达受到作为组成型启动子的pPro启动子的调控。
<1-2>表达L-天冬氨酸氧化酶及喹啉酸合成酶的质粒的制备
通过将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板的PCR,获得编码喹啉酸合成酶的基因nadA。基于从美国国立卫生研究院的基因库(NIH GenBank)获得的SEQ ID NO.28的nadA基因的碱基序列数据(NCBI登记号“GI:89107601”),可以对nadA基因的含有ATG至TAA部分的ORF部分进行扩增,并且合成具有限制性内切酶ApaI和NotI的识别位点的SEQ ID NO.3和4的引物。
以大肠杆菌W3110的染色体DNA为模板,使用上述SEQ ID NO.3和4的寡核苷酸作为引物,实施PCR。使用PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶,通过重复30次循环进行PCR,每个循环包括96℃下变性30秒、50℃下退火30秒及72℃下延伸2分钟。由此,获得了约1.0kb扩增的基因,所述基因含有nadA基因和限制性内切酶ApaI和NotI的识别位点。
此外,通过将pProLar(CloneTech)载体的染色体DNA作为模板的PCR,获得了Pro启动子。基于从CloneTech公司获得的Pro启动子的碱基序列数据(SEQ ID NO.32),合成了具有限制性内切酶BamHI和ApaI的识别位点的SEQ ID NO.5和6的引物,以连接pPro启动子和上述扩增的nadA基因。
以大肠杆菌W3110的染色体DNA为模板,使用SEQ ID NO.5和6的寡核苷酸作为引物,实施PCR。使用PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶,通过重复30次循环进行PCR,每个循环包括96℃下变性30秒、50℃下退火30秒及72℃下延伸1分钟。由此,获得了约0.135kb扩增的基因,所述基因含有pPro启动子和限制性内切酶BamHI和ApaI的识别位点。
用限制性内切酶ApaI和NotI对上述通过PCR获得的nadA基因进行处理,并且用ApaI和BamHI对扩增的pPro启动子片段进行处理。用限制性内切酶处理过的nadA及pPro启动子片段通过连接到用限制性内切酶NotI和BamHI处理过的上述<实施例1-1>中获得的pPro-nadB而被克隆,最终制得5.7Kb的pPro-NBA重组载体,所述pPro-NBA重组载体克隆有表达受到作为组成型启动子的pPro启动子的调控的nadB基因和表达受到pPro启动子调控的nadA基因。制得的pPro-NBA具有SEQ ID NO.33的序列。图2显示了质粒pPro-NBA的结构,所述质粒表达编码L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的基因。
<1-3>表达NadB-L-NadA的质粒的制备
为了制备表达含有接头的NadB-L-NadA的质粒,使用上述<实施例1-2>中制得的pPro-NBA(SEQ ID NO.33)作为模板,使用SEQ IDNO.7和8的寡核苷酸作为引物,实施PCR。使用PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶,通过重复30次循环进行PCR,每个循环包括96℃下变性30秒、50℃下退火30秒及72℃下延伸2分钟。由此,获得了含有pPro启动子和限制性内切酶的位点XhoI和位于nadB基因末端的接头的约1.8kb扩增的基因。
此外,为了扩增nadA基因片段,将pPro-NBA作为模板,使用SEQ ID NO.15和16的寡核苷酸作为引物,实施PCR,所述nadA基因片段与上述的约1.8kb扩增的基因末端具有序列同源性,其具有限制性内切酶位点XhoI,含有pPro启动子及位于nadB基因末端的接头,并且在nadA基因末端含有限制性内切酶位点NotI。使用PfuUltraTMDNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶,通过重复30次循环进行PCR,每个循环包括96℃下变性30秒、50℃下退火30秒及72℃下延伸2分钟。由此,获得了约1.1kb扩增的基因,其可通过同源性连接与接头相连,并且在nadA基因的末端含有限制性内切酶位点NotI。
将上述制得的“含有pPro启动子、限制性内切酶位点XhoI及位于nadB基因末端的接头的约1.8kb扩增的基因”和“与上述约1.8kb扩增的基因的末端具有序列同源性,并且在nadA基因的末端含有限制性内切酶的位点NotI的nadA基因片段”进行混合,并实施拼接(Sewing)PCR。使用PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶,通过重复10次循环进行PCR,每个循环包括96℃下变性60秒、50℃下退火60秒及72℃下延伸1分钟。将SEQ ID NO.7和16的寡核苷酸添加到PCR反应液中,进一步实施PCR。使用PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶,通过重复20次循环进行PCR,每个循环包括96℃下变性30秒、50℃下退火30秒及72℃下延伸3分钟。由此,获得了含有“限制性内切酶XhoI_pPro启动子_nadB_接头_nadA_限制性内切酶NotI”的约2.9kb扩增的融合蛋白基因。
用限制性内切酶XhoI和NotI对通过上述PCR获得的“限制性内切酶XhoI_pPro启动子_nadB_接头_nadA_限制性内切酶NotI”基因片段进行处理。用限制性内切酶处理过的“pPro启动子_nadB_接头_nadA基因片段”通过连接到用限制性内切酶XhoI和NotI处理过的pProLar(CloneTech)载体上而被克隆,最终制得表达受到作为组成型启动子的pPro启动子的调控、nadB基因和nadA基因由接头克隆成单一融合蛋白的pNBHL1A重组载体。本实施例中使用的接头由5~30个氨基酸组成,并具有分别由SEQ ID NO.54、55、56、57、58、59和60表示的氨基酸序列。
通过将含有接头的SEQ ID NO.8的寡核苷酸替换为SEQ ID NO.9、10、11、12、13或14的寡核苷酸来扩增nadB基因片段的方法,扩增含有各种接头的基因,其每个含有pPro启动子和位于nadB基因末端的接头,并使用与上述相同的方法制备pNBHL2A、pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A及pNBFL4A重组载体。制得的pNBHL1A、pNBHL2A、pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A及pNBFL4A分别具有SEQ ID NO.34、35、36、37、38、39及40的核苷酸序列。此外,如此制得的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白分别具有SEQ ID NO.47、48、49、50、51、52及53的氨基酸序列。图2显示了质粒pNBHL1A、pNBHL2A、pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A及pNBFL4A的结构,所述质粒表达编码由多种接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的基因。
<1-4>表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及L-天冬氨酸转氨酶的质粒的制备
通过将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板的PCR,获得了编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶进行编码的基因ppc。基于从美国国立卫生研究院的基因库(NIH GenBank)获得的SEQ ID NO.29的ppc基因的碱基序列(NCBI登记号“GI:89110074”),可以对ppc基因的含有启动子至终止子的部分进行扩增,并合成具有限制性内切酶HindIII和BamHI的识别位点的SEQ ID NO.17和18的引物。
将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板,使用SEQ ID NO.17和18的寡核苷酸作为引物,实施PCR。使用PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶,通过重复30次循环进行PCR,每个循环包括96℃下变性30秒、50℃下退火30秒及72℃下延伸4分钟。由此,获得了含有ppc基因和限制性内切酶HindIII和BamHI的识别位点的约3.1kb扩增的基因。
用限制性内切酶HindIII和BamHI对通过上述PCR获得的ppc基因进行处理,然后通过连接在用限制性内切酶HindIII和BamHI处理过的pCL1920(AB236930)载体上将其克隆,最终制得克隆有ppc基因的pCP重组载体。
为了在克隆有ppc基因的pCP重组载体上克隆aspC基因,通过将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板的PCR,获得了编码L-天冬氨酸转氨酶的基因aspC。基于从美国国立卫生研究院的基因库(NIH GenBank)获得的SEQ ID NO.30的aspC基因的碱基序列(NCBI登记号“GI:89107778”),可以对aspC基因的含有启动子至终止子的部分进行扩增,并合成了具有限制性内切酶BamHI和KpnI的识别位点的SEQ ID NO.19和20的引物。
将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板,使用SEQ ID NO.19和20的寡核苷酸作为引物,实施PCR。使用PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶,通过重复30次循环进行PCR,每个循环包括96℃下变性30秒、50℃下退火30秒及72℃下延伸2分钟。由此,获得了含有aspC基因和限制性内切酶BamHI和KpnI的识别位点的约1.5kb扩增的基因。
对通过上述PCR获得的aspC基因用限制性内切酶BamHI和KpnI进行处理,然后通过连接在用限制性内切酶BamHI和KpnI处理过的pCP载体上而被克隆,最终制得同时克隆有aspC基因和ppc基因的pCPA重组载体。制得的pCPA载体具有SEQ ID NO.41的序列。图3显示了质粒pCPA的结构,所述质粒pCPA表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和L-天冬氨酸转氨酶的基因。
<1-5>喹啉酸磷酸核糖基转移酶缺陷株的制备
在本实施例中,通过将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板的PCR,获得了喹啉酸分解途径中的nadC基因。基于从美国国立卫生研究院的基因库(NIH GenBank)获得的nadC基因的碱基序列(NCBI登记号“GI:89106990”),合成了可对nadC基因的下游(downstream)部分进行扩增的SEQ ID NO.21和22的引物、对nadC的上游和下游部分及loxpCm进行扩增的SEQ ID NO.23和24的引物、对上游部分进行扩增的SEQ ID NO.25和26的引物。
通过实施将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板,使用SEQID NO.21、22和25、26的寡核苷酸作为引物的PCR,分别扩增了0.5kb和0.3kb的nadC基因的上游部分和下游部分。此外,通过实施将含有loxpCm的质粒载体pLoxpCat2载体作为模板,使用SEQ ID NO.23和24的寡核苷酸作为引物的PCR,扩增了1.0kb的两端具有nadC基因同源序列的loxpCm基因。使用PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶,通过重复30次循环进行PCR,每个循环包括96℃下变性30秒、53℃下退火30秒及72℃下延伸1分钟。之后,将通过上述的PCR反应获得的nadC-上游片段、nadC-下游片段、loxpCm片段作为模板,实施PCR,通过重复10次循环进行PCR,每个循环包括96℃下变性60秒、50℃下退火60秒及72℃下延伸1分钟,及在添加SEQ ID NO.21和26的引物后,实施20次循环。由此,获得了1.8kb的含有nadC基因上游区-loxpCm-nadC基因下游区的nadC缺陷盒。
通过电穿孔将制得的nadC缺陷盒转化到含有pKD46作为λRed重组酶(lambda red recombinase)表达载体的大肠杆菌W3110中,将其涂抹到含有氯霉素作为选择标记的LB(Luria-Bertani)平板培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g及琼脂1.5%/L)上,在37℃下过夜培养后,筛选耐氯霉素的菌株。
将筛选出的菌株直接作为模板,使用SEQ ID NO.21和26的引物,在相同条件下实施PCR后,通过在1.0%琼脂糖凝胶上,确认基因大小在野生株的情况下为1.0kb,在nadC缺陷株的情况下为1.8kb,从而确定nadC基因的缺失。此外,通过与上述方法相同的方法,使作为野生型大肠杆菌的菌株W3110的nadC基因缺失。
实施例2.表达融合蛋白的菌株的制备及评价
<2-1>表达融合蛋白的菌株的制备
将质粒pNBHL1A、pNBHL2A、pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A、pNBFL4A及pPro-NBA通过CaCl2法转化到<实施例1-5>中制备的W3110△nadC菌株后,将菌株涂抹在LB-Km平板培养基(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、卡那霉素25μg/L)上,在37℃下过夜培养,所述质粒表达编码由上述<实施例1-3>中制得的多种接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的单一融合蛋白的基因。之后,筛选耐卡那霉素的菌落。由此,获得了将L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶表达为单一融合蛋白的菌株。
<2-2>含有多种接头的融合蛋白的由天冬氨酸至喹啉酸的产率的比较
为了比较含有多种接头的融合蛋白的由天冬氨酸至喹啉酸的生物合成能力,将<实施例2-1>中获得的表达融合蛋白的菌株接种到于37℃培养箱中的5ml的LB-Km-IPTG(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、卡那霉素25μg/L、IPTG 10mM)液体培养基中,并在37℃下以250rpm过夜培养后,得到发酵。将如此获得的发酵液以4000rpm离心10分钟,得到仅有表达融合蛋白的菌株后,在500μl的pH 7.0tris缓冲液中再悬浮后,使用超声裂解细胞法对细胞进行裂解。
使用通过上述方法获得的含有表达的融合蛋白的全细胞裂解液,通过酶促反应对由L-天冬氨酸至喹啉酸的生物合成能力进行比较。表1显示了用于比较由L-天冬氨酸至喹啉酸的生物合成能力的酶促反应液的成分。
表1
反应液的成分 | 单位(ml) |
200mM的L-天冬氨酸 | 0.1 |
200mM的磷酸二羟丙酮 | 0.1 |
细胞裂解液 | 0.1 |
1M的Tris缓冲液(pH 7.0) | 0.1 |
蒸馏水 | 0.6 |
总计 | 1.0 |
将上述反应组合物在37℃下反应30分钟。通过HPLC对发酵液中的L-天冬氨酸和喹啉酸进行分析。在表2中示出了反应分析结果,其表示每种融合蛋白由L-天冬氨酸生产喹啉酸的产率。
表2
※摩尔转换率(%)=生成的喹啉酸(M)/添加的L-天冬氨酸(M)
分别表达L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的pPro-NBA使用L-天冬氨酸氧化酶生产出1.5g/L的喹啉酸,由L-天冬氨酸至喹啉酸的酶转换收率为44.9%,与此相比,将L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶经多个接头连接表达为融合蛋白的pNBHL1A、pNBHL2A、pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A及pNBFL4A生产出2.2~3.2g/L的喹啉酸,由L-天冬氨酸至喹啉酸的酶转换收率显示为65.9~95.8%。
该结果表明,与这些酶分别单独表达时相比,当L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶以单个融合蛋白表达时,能够以更高的收率转换为喹啉酸。此外,导入各种接头的所有菌株均显示出高的酶转换率,这表明在由L-天冬氨酸生物合成喹啉酸中,将L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶经接头表达为单一融合蛋白更加有效。此外,以LA(EAAAK)4~5AAA接头的形式导入pNBHL4A和pNBHL5A,显示出最高的至喹啉酸的转换率,这表明在制备喹啉酸中,LA(EAAAK)4~5AAA是最为有效的融合蛋白接头。
实施例3.生产喹啉酸的菌株的制备及评价
<3-1>生产喹啉酸菌株的制备
为了比较含有各种接头的融合蛋白的由葡萄糖至喹啉酸的生物合成能力,通过CaCl2方法将<实施例1-4>中制备的pCPA质粒转化到<实施例1-5>中制备的W3110△nadC菌株中,然后将菌株涂抹在LB-SP平板培养基(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、壮观霉素50μg/L)上,在37℃下过夜培养。之后,筛选耐壮观霉素的菌落。
将<实施例1-2>及<实施例1-3>中制备的pPro-NBA、pNBHL1A、pNBHL2A、pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A及pNBFL4A质粒,通过CaCl2方法转化到上述制备的含有pCPA的W3110△nadC菌株后,将菌株涂抹在LB-Km-Sp平板培养基(酵母提取物10g/L、NaCl5g/L、胰蛋白胨10g/L、壮观霉素50μg/L、卡那霉素25μg/L)上,在37℃下过夜培养。之后,分别筛选各10个耐卡那霉素及耐壮观霉素的菌落。将如此制得的生产喹啉酸的菌株分别命名为CV01-0600、CV01-0601、CV01-0602、CV01-0603、CV01-0604、CV01-0605、CV01-0606及CV01-0607。表3示出了宿主菌的基因型、所含的质粒及L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的接头的氨基酸序列。
表3
<3-2>生产喹啉酸的菌株的评价
为了确认由葡萄糖生产喹啉酸的能力,实施下述喹啉酸滴定度确认实验。将上述<实施例3-1>中制得的生产喹啉酸的菌株,在37℃培养箱中的LB-SP-Km平板培养基中过夜培养获得单一菌落,将其通过1个白金环接种到25ml的喹啉酸滴定度培养基中,在37℃下、以250rpm培养24~72小时。表4显示了用于生产喹啉酸的培养基的成分。
表4
成分 | 浓度(每升) |
葡萄糖 | 70g |
硫酸铵 | 17g |
KH2PO4 | 1.0g |
MgSO4·7H2O | 0.5g |
FeSO4·7H2O | 5mg |
MnSO4·8H2O | 5mg |
ZnSO4 | 5mg |
碳酸钙 | 30g |
酵母提取物 | 2g |
通过HPLC对发酵液中的喹啉酸进行分析,结果示于表5,其指示了菌株由葡萄糖生产喹啉酸的产率。
表5
菌株 | 喹啉酸(g/L) | 收率(%)※ |
CV01-0600 | 5.5 | 7.9 |
CV01-0601 | 7.0 | 10.0 |
CV01-0602 | 6.5 | 9.3 |
CV01-0603 | 7.5 | 10.7 |
CV01-0604 | 9.7 | 13.9 |
CV01-0605 | 10.3 | 14.7 |
CV01-0606 | 6.5 | 9.3 |
CV01-0607 | 6.0 | 8.6 |
※收率(%)=生成的喹啉酸(g)/添加的葡萄糖(g)
通过从大肠杆菌W3110中去除喹啉酸磷酸核糖基转移酶以抑制喹啉酸磷酸核糖基转移酶导致的细胞内喹啉酸的分解,,以及增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、L-天冬氨酸转氨酶、L-天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合成酶的表达而制备的CV01-0600菌株,生产出5.5g/L的喹啉酸,与此相比,表达由多种接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的CV01-0601、CV01-0602、CV01-0603、CV01-0604、CV01-0605、CV01-0606及CV01-0607菌株,分别生产出6.0~10.3g/L的喹啉酸。
该结果与从上述<实施例2>中的L-天冬氨酸至喹啉酸的酶转化结果相同,这表明将L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶作为单个融合蛋白表达时,通过增加不稳定的中间代谢产物α-亚氨基丁二酸和喹啉酸合成酶的反应,从而将α-亚氨基丁二酸至草酰乙酸转化的副反应最小化,使喹啉酸的生产量增大。此外,导入多种接头的所有菌株均表现出相对高的喹啉酸生产率,这表明将L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶经接头连接表达为单一融合蛋白时,对于喹啉酸的生物合成更加有效。
此外,与上述<实施例2>的结果相同,导入LA(EAAAK)4~5AAA形式接头的pNBHL4A和pNBHL5A表现出最高的喹啉酸生产率,这表明在制备喹啉酸中,LA(EAAAK)4~5AAA是最为有效的融合蛋白接头。
此外,确认了与现有菌株相比,当通过组合L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白形式表达而带来的反应速率的增强和喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性的去除及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和L-天冬氨酸转氨酶表达的增强来使L-天冬氨酸的生物合成途径得到增强时,能够以更高的效率生产喹啉酸。
国际表
用于专利申请的布达佩斯条约下的微生物保藏证明
由国际保藏单位根据规则第7条第1款发布的原始保藏情况下的收据
致:CJ第一制糖株式会社
大韩民国首尔中区双林洞292CJ第一制糖中心
兹证明上述翻译与原文无出入。
2012年01月6日
代理人 孙敏
国际表
用于专利申请的布达佩斯条约下的微生物保藏证明
由国际保藏单位根据规则第7条第1款发布的原始保藏情况下的收据
致:CJ第一制糖株式会社
大韩民国首尔中区双林洞292CJ第一制糖中心
兹证明上述翻译与原文无出入。
2012年01月6日
代理人 孙敏
Claims (14)
1.一种生产喹啉酸的重组微生物,其表达由接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组微生物,其中所述L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶具有分别由SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43表示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的重组微生物,其中所述接头由5~30个氨基酸组成。
4.根据权利要求1所述的重组微生物,其中所述接头具有LA(EAAAK)nAAA(n为1~5的整数)或L(GGGS)nAAA(n为1~5的整数)的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的重组微生物,其中所述接头具有选自SEQ ID NO.54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的重组微生物,其中所述融合蛋白具有选自SEQ ID NO.47、48、49、50、51、52和53的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的重组微生物,其中喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性与天然微生物中的内在活性相比被进一步弱化。
8.根据权利要求7所述的重组微生物,其中所述喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性通过选自以下的方法减弱:1)编码酶的基因的部分或全部缺失,2)对表达调控序列进行修饰以减少所述基因的表达,3)对染色体上的所述基因序列进行修饰,以使所述蛋白质的活性减弱,以及4)它们的组合。
9.根据权利要求1所述的重组微生物,其中选自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、L-天冬氨酸转氨酶及所述融合蛋白中的一种或多种蛋白质的活性被进一步增强。
10.根据权利要求9所述的重组微生物,其中所述蛋白质活性通过选自以下的方法增强:1)增加编码所述酶的基因的拷贝数,2)对表达调控序列进行修饰以增加所述基因的表达,3)对染色体上的所述基因序列进行修饰,以增强所述酶的活性,以及4)它们的组合。
11.根据权利要求1所述的重组微生物,其中所述微生物选自肠杆菌(Enterbacter sp.)、埃希氏菌(Escherichia sp.)、欧文氏菌(Erwiniasp.)、沙雷氏菌(Serratia sp.)、普罗威登斯菌(Providencia sp.)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.)及短杆菌(Brevibacterium sp.)。
12.根据权利要求1所述的重组微生物,其中所述微生物为大肠杆菌(E.coli)。
13.根据权利要求1所述的重组微生物,其中所述微生物的识别登录号为KCCM11235P或KCCM11236P。
14.生产喹啉酸的方法,包括:
(a)在含有碳源的培养基中培养重组微生物,所述重组微生物表达由接头连接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白;以及
(b)回收在所述培养过程中产生的喹啉酸。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020120001845A KR101359844B1 (ko) | 2012-01-06 | 2012-01-06 | 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 퀴놀린산의 생산 방법 |
KR10-2012-0001845 | 2012-01-06 | ||
PCT/KR2013/000030 WO2013103246A2 (ko) | 2012-01-06 | 2013-01-03 | 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 퀴놀린산의 생산 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104160015A true CN104160015A (zh) | 2014-11-19 |
CN104160015B CN104160015B (zh) | 2018-01-05 |
Family
ID=48745513
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201380009522.1A Active CN104160015B (zh) | 2012-01-06 | 2013-01-03 | 生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物的喹啉酸生产方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9534240B2 (zh) |
EP (1) | EP2801612B1 (zh) |
KR (1) | KR101359844B1 (zh) |
CN (1) | CN104160015B (zh) |
BR (1) | BR112014016748B1 (zh) |
ES (1) | ES2656892T3 (zh) |
MY (1) | MY171877A (zh) |
WO (1) | WO2013103246A2 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106636024A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-05-10 | 苏州埃德蒙生物技术有限公司 | 一种l‑天冬氨酸氧化酶包涵体纯化复性方法 |
CN107278225A (zh) * | 2015-02-03 | 2017-10-20 | Cj第制糖株式会社 | 能够产生喹啉酸的微生物及使用该微生物产生喹啉酸的方法 |
CN110982833A (zh) * | 2019-12-25 | 2020-04-10 | 江南大学 | 一种对香豆酸响应的动态调控系统及其构建方法 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101634582B1 (ko) * | 2013-07-25 | 2016-06-30 | 씨제이제일제당 주식회사 | 니코틴산 또는 nad에 대한 피드백 조절이 해제된 l-아스파르테이트 옥시다제 변이체 및 이를 이용한 퀴놀리네이트 또는 니코틴산 생산 방법 |
KR101656363B1 (ko) | 2014-07-07 | 2016-09-09 | 씨제이제일제당 주식회사 | 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 퀴놀린산의 생산 방법 |
EP3430156A1 (en) * | 2016-03-16 | 2019-01-23 | DSM IP Assets B.V. | Microbial production of nicotinic acid riboside |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3826041A1 (de) * | 1988-07-30 | 1990-02-08 | Ruetgerswerke Ag | Verfahren zur herstellung von chinolinsaeure |
EP0279273B1 (de) * | 1987-02-04 | 1993-12-15 | Rütgerswerke Aktiengesellschaft | DNA-Sequenzen, Plasmide und Mikroorganismen sowie Verfahren zur Herstellung von Chinolinsäure |
US6271031B1 (en) * | 1998-08-12 | 2001-08-07 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Quinolinate metabolism enzymes |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB332660A (en) * | 1926-11-06 | 1930-07-31 | Moritz Kugel | Method of producing and maintaining constant the necessary supply of phosphoric acidin the electrolyte of lead accumulators |
DE19513343C1 (de) * | 1995-04-08 | 1996-10-10 | Europ Accumulateurs | Verfahren zur Herstellung eines Bleiakkumulators |
JP2006172937A (ja) * | 2004-12-16 | 2006-06-29 | Zaisei Tomoda | 鉛蓄電池用固体電解質およびその製造方法、鉛蓄電池 |
HUE030881T2 (en) * | 2005-02-18 | 2017-06-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Meningitis / sepsis-associated escherichia coli proteins and nucleic acids |
EP1826860B1 (en) * | 2006-02-24 | 2018-07-18 | NGK Insulators, Ltd. | All-solid-state battery |
KR101223904B1 (ko) * | 2011-01-14 | 2013-01-21 | 씨제이제일제당 (주) | 니코틴산의 제조 방법 |
-
2012
- 2012-01-06 KR KR1020120001845A patent/KR101359844B1/ko active IP Right Grant
-
2013
- 2013-01-03 WO PCT/KR2013/000030 patent/WO2013103246A2/ko active Application Filing
- 2013-01-03 US US14/370,721 patent/US9534240B2/en active Active
- 2013-01-03 MY MYPI2014001994A patent/MY171877A/en unknown
- 2013-01-03 EP EP13733832.3A patent/EP2801612B1/en active Active
- 2013-01-03 ES ES13733832.3T patent/ES2656892T3/es active Active
- 2013-01-03 BR BR112014016748-6A patent/BR112014016748B1/pt active IP Right Grant
- 2013-01-03 CN CN201380009522.1A patent/CN104160015B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0279273B1 (de) * | 1987-02-04 | 1993-12-15 | Rütgerswerke Aktiengesellschaft | DNA-Sequenzen, Plasmide und Mikroorganismen sowie Verfahren zur Herstellung von Chinolinsäure |
DE3826041A1 (de) * | 1988-07-30 | 1990-02-08 | Ruetgerswerke Ag | Verfahren zur herstellung von chinolinsaeure |
US6271031B1 (en) * | 1998-08-12 | 2001-08-07 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Quinolinate metabolism enzymes |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JERRY LR. CHANDLER ET AL.: "De Novo Biosynthesis of Nicotinamide Adenine Dinucleotide in Escherichia coli: Excretion of Quinolinic Acid by Mutants Lacking Quinolinate Phosphoribosyl Transferase", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 * |
SATOSHI NASU ET AL.: "L-Aspartate Oxidase,a Newly Discovered Enzyme of Escherichia coli, Is the B Protein of Quinolinate Synthetase", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107278225A (zh) * | 2015-02-03 | 2017-10-20 | Cj第制糖株式会社 | 能够产生喹啉酸的微生物及使用该微生物产生喹啉酸的方法 |
CN106636024A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-05-10 | 苏州埃德蒙生物技术有限公司 | 一种l‑天冬氨酸氧化酶包涵体纯化复性方法 |
CN110982833A (zh) * | 2019-12-25 | 2020-04-10 | 江南大学 | 一种对香豆酸响应的动态调控系统及其构建方法 |
CN110982833B (zh) * | 2019-12-25 | 2021-09-28 | 江南大学 | 一种对香豆酸响应的动态调控系统及其构建方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104160015B (zh) | 2018-01-05 |
US20150037850A1 (en) | 2015-02-05 |
ES2656892T3 (es) | 2018-02-28 |
MY171877A (en) | 2019-11-05 |
WO2013103246A2 (ko) | 2013-07-11 |
WO2013103246A3 (ko) | 2013-09-26 |
BR112014016748A2 (pt) | 2020-11-17 |
KR101359844B1 (ko) | 2014-02-25 |
BR112014016748B1 (pt) | 2022-04-19 |
EP2801612A4 (en) | 2015-07-29 |
KR20130080944A (ko) | 2013-07-16 |
US9534240B2 (en) | 2017-01-03 |
EP2801612B1 (en) | 2017-11-22 |
EP2801612A2 (en) | 2014-11-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104334728B (zh) | 利用具有产生l-赖氨酸能力的微生物产生l-赖氨酸的方法 | |
JP5210391B2 (ja) | 乳酸生産細菌及び乳酸生産方法 | |
EP1792976B1 (en) | Microorganism of corynebacterium genus having enhanced L-lysine production ability and method of producing L-lysine using the same | |
CN104245921B (zh) | 可利用木糖的棒状杆菌微生物和利用其产生l-赖氨酸的方法 | |
US20070202571A1 (en) | Method for microbial production of amino acids of the spartate and/or glutamate family and agents which can be used in said method | |
CN104160015A (zh) | 生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物的喹啉酸生产方法 | |
CN1989239A (zh) | 生产琥珀酸的细菌和生产琥珀酸的方法 | |
CN104066835A (zh) | 提高腐胺生产能力的重组微生物以及利用其制备腐胺的方法 | |
WO2007099867A1 (ja) | 有機酸生産菌及び有機酸の製造法 | |
CN104185679A (zh) | 能够产生l-氨基酸的微生物及使用其产生l-氨基酸的方法 | |
CN105492593A (zh) | 用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法 | |
CN104561163A (zh) | 生产l-氨基酸的方法 | |
JP2018518977A (ja) | L−リジンを生産する微生物及びそれを用いたl−リジン生産方法 | |
CN103370421B (zh) | 制备烟酸的方法 | |
CN105377878B (zh) | 新的RhtB蛋白变体和使用其产生O-磷酸丝氨酸的方法 | |
CN104450638A (zh) | L-天冬氨酸氧化酶变体和使用所述变体生产喹啉酸或烟酸的方法 | |
CN106029869A (zh) | 具有l-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物及利用该微生物生产l-苏氨酸的方法 | |
CN105829529B (zh) | 生产o-琥珀酰高丝氨酸的微生物和通过使用其生产o-琥珀酰高丝氨酸的方法 | |
CN103476922A (zh) | 用来源于埃希氏菌(Escherichia sp.)的果糖激酶基因转化的棒杆菌(Corynebacterium sp.)及使用该棒杆菌制备L-氨基酸的方法 | |
US20230220430A1 (en) | Recombinant vector for transformation improving glutamine productivity, and strain employing same | |
JP6502515B2 (ja) | キノリン酸生産能を有する微生物及びそれを用いてキノリン酸を生産する方法 | |
KR20150028121A (ko) | Nad+ 의존성 포르메이트 데히드로게나제 유전자를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 c4 디카르복실산 생산 방법 | |
US20150031101A1 (en) | Bacterial cell having enhanced succinic acid production and a method for producing the succinic acid using the same | |
JP4627039B2 (ja) | アミダーゼ活性を有するポリペプチド及びその遺伝子 | |
CN116555136A (zh) | 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |