DE3826041A1 - Verfahren zur herstellung von chinolinsaeure - Google Patents
Verfahren zur herstellung von chinolinsaeureInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von Chinolinsäure (Pyridin-2,3-dicarbonsäure) mit
Hilfe gentechnisch modifizierter Mikroorganismen.
Chinolinsäure ist ein wichtiges Zwischenprodukt für
zahlreiche Pharmazeutika und Pflanzenschutzmittel. Sie
wird großtechnisch hergestellt durch
Oxidationsverfahren von Chinolin oder
Chinolinderivaten gemäß z. B. EP-B 82 542 oder
EP-A 1 49 857. Ein Nachteil dieser Verfahren ist es,
daß die verfügbare Rohstoffmenge nicht ausreicht, um
den stetig wachsenden Bedarf an Chinolinsäure zu
decken.
Es ist daher Aufgabe vorliegender Erfindung, ein
Verfahren zur Herstellung von Chinolinsäure
bereitzustellen, bei dem diese aus völlig anderen
unbegrenzt verfügbaren Rohstoffen in einem einfachen,
kostengünstigen und umweltfreundlichen Verfahren
gewonnen wird.
Aus einer älteren Anmeldung der Anmelderin (P 37 03 255.0)
ist ein Verfahren zur Herstellung von
Chinolinsäure mit Hilfe gentechnisch modifizierter
Mikroorganismen bekannt. Dabei wird der folgende
Metabolismus benutzt:
Im Stoffwechsel von Mikroorganismen erfolgt die
Chinolinsäuresynthese in zwei Reaktionsschritten:
Diese Reaktion wird durch L-Aspartatoxidase
katalysiert. Die Cyclisierung von Iminoaspartat mit
Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) zu Chinolinsäure wird
durch das Enzym Chinolinsäuresynthase katalysiert.
Nach dem in P 37 03 255.0 beschriebenen Verfahren
werden zur genetischen Modifizierung aus
Mikroorganismen, die die Chinolinsäuresynthese als
Teil des Stoffwechsels durchführen, DNA-Sequenzen
gewonnen, die für die Enzyme Chinolinsäuresynthase
(nadA) und L-Aspartatoxidase (nadB) codieren.
Die Isolierung kann z. B. aus folgenden
Mikroorganismen erfolgen:
Escherichia coli
Salmonella typhimurium
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium bovis
Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae
Salmonella typhimurium
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium bovis
Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae
In der Literatur sind nadA- und nadB-Mutanten von
E. coli K 12 beschrieben. Mutanten dieser Spezies
wurden auch von der Anmelderin zur Isolierung
entsprechender DNA-Sequenzen nadA und nadB verwendet.
Zur Modifikation geeigneter Mikroorganismen werden
folgende Schritte durchgeführt:
- - Identifizierung, Isolierung und Sequenzierung der DNA-Sequenz nadB, die für das Enzym L-Aspartatoxidase codiert
- - Identifizierung, Isolierung und Sequenzierung der DNA-Sequenz nadA, die für das Enzym Chinolinsäuresynthase codiert
- - Einbau der DNA-Sequenzen nadA und nadB in Plasmide, so daß jede DNA-Sequenz mit einer Expressions-Kontroll-Sequenz verbunden ist
- - Einbringen der so hergestellten modifizierten Plasmide in einen transformierbaren Wirtsorganismus.
Die so hergestellten Mikroorganismen produzieren in
einem Nährmedium mit organischer C-Quelle und
anorganischer oder organischer N-Quelle Chinolinsäure,
die nicht mehr dem ursprünglichen Metabolismus gemäß
umgesetzt, sondern bevorzugt ausgeschieden wird.
Nach dem in P 37 03 255.0 beschriebenen Verfahren
wurden Plasmide konstruiert, die DNA-Sequenzen nadB
mit der folgenden Nukleotidsequenz enthalten:
Diese Nukleotidssequenz ist für die Bildung von
L-Aspartatoxidase verantwortlich.
In der gleichen Anmeldung ist weiterhin ein Verfahren
beschrieben zur Konstruktion von Plasmiden, die
DNA-Sequenzen nadA mit folgender Nukleotidsequenz
enthalten:
Diese Nukleotidsequenz ist für die Bildung von
Chinolinsäuresynthase verantwortlich.
Die isolierten DNA-Sequenzen nadA und nadB haben als
Expressions-Kontroll-Sequenzen genomische
Regulationssequenzen.
Die mitunter als rekombinante Expressionsplasmide
benannten Expressionsvektoren werden als Plasmide
bezeichnet. Sie werden in bekannter Weise erhalten
durch Ligation der einzelnen DNA-Fragmente und
Insertion der DNA-Fragmente in Plasmide.
Die erhaltenen Plasmide werden in üblicher Weise in
einen transformierbaren Wirtsorganismus, z. B. ein
E. coli-Bakterium, eingebracht. Anschließend werden die
mit einem oder mehreren Plasmiden transformierten
Mikroorganismen in bekannter Weise in einem geeigneten
Nährmedium kultiviert.
Die Produktion und Gewinnung von Chinolinsäure erfolgt
in bekannter Weise durch die mit den entsprechenden
DNA-Sequenzen transformierten Mikroorganismen unter
geeigneten Bedingungen, wie Batch-, Fed-batch- oder
kontinuierliche Fermentation in Rühr- oder Airlift
oder ähnlichen Bioreaktoren, wobei einem
Mikroorganismus in einem Nährmedium eine organische
Kohlenstoffquelle und eine anorganische oder
organische Stickstoffquelle unter Wachstumsbedingungen
zur Verfügung gestellt werden.
Wie aus den Beispielen der Anmeldeschrift
P 37 03 255.0 zu ersehen ist, wird durch die
genetische Modifikation der Mikroorganismen bei allen
durchgeführten Versuchen eine erhöhte
Chinolinsäureausscheidung erzielt. Nachteilig sind
jedoch die noch sehr geringen Ausbeuten.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur
Herstellung von Chinolinsäure durch gentechnisch
modifizierte Mikroorganismen bereitzustellen, bei dem
bei verschiedenen, analogen Ansätzen hohe
reproduzierbare Ausscheidungsmengen erzielt werden
können.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt durch ein Verfahren
gemäß Anspruch 1 sowie durch dazu notwendige
Mikroorganismen gemäß Anspruch 2.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die von den
modifizierten Mikroorganismen ausgeschiedene Menge
beeinflußt werden kann durch die Wahl der verwendeten
Plasmide, in die die DNA-Sequenzen nadA und nadB
eingefügt wurden. Nicht durch Plasmide, die die nadA
und nadB-Sequenzen gemeinsam tragen, werden die
höchsten Ausscheidungsraten erzielt, sondern durch
jeweils nur nadA bzw. nadB tragende Plasmide, die
gemeinsam in die Zelle eingebracht werden.
In der Bakterienzelle haben Plasmide die Eigenschaft,
sich selbst auf eine bestimmte Kopienzahl zu
regulieren, Tabelle 1 zeigt für einige Plasmide
charakteristische Kopienzahlen:
Eine reproduzierbare Steigerung der
Chinolinsäuresynthese kann, wie bereits dargelegt,
dann erreicht werden, wenn die zur Modifizierung
verwendeten Gen-Sequenzen auf unterschiedliche, zu
verschiedenen Kopienzahlen führende, miteinander in
der Zelle und mit dem Mikroorganismenstamm kompatible
Basisvektoren etabliert werden. Die Wahl der
verwendeten Plasmide wird neben der Kopienzahl in der
Zelle durch die Antibiotikaresistenz bestimmt, durch
die sie gegeneinander selektiert werden können.
Es wurde nun gefunden, daß die Ausscheidungsrate von
Chinolinsäure erhöht wird, wenn in einem
Mikroorganismus nadA und nadB tragende Plasmide mit
einem Verhältnis der Kopienzahl von 8 : 50, 8 : 200 oder
50 : 200 etabliert werden. Durch die Etablierung nadA
und nadB-tragender Plasmide in einem Verhältnis von
50 : 200 kann die Chinolinsäureausscheidungsrate
gegenüber derjenigen nicht modifizierter
Mikroorganismen von durchschnittlich 10 mg/l OD auf
durchschnittlich 27 mg/l × OD erhöht werden.
Bei einem Verhältnis von nadA- zu nadB-tragender
Plasmide von 8 : 50 wird eine Ausscheidungsmenge von
durchschnittlich 53 mg/l OD erzielt. Durchschnittlich
95 mg/l × OD werden erzielt bei einem Kopienverhältnis
von 8 : 200.
Offensichtlich werden durch die Wahl der verwendeten
Plasmide optimale nadA- und nadB-Plasmid-Verhältnisse
in den Wirtszellen eingestellt, die zu einer erhöhten
Chinolinsäureausscheidung führen.
Verwendete Abkürzungen:
Ap | |
Ampicillin | |
DNA | Desoxyribonukleinsäure |
E. coli | Escherichia coli |
HPLC | High Performance Liquid Chromatography |
kb | Kilobasenpaare |
Kn | Kanamycin |
LB | Luria-Bertani |
Tc | Tetracyclin |
Zusammensetzung der verwendeten Lösungen:
LB-Medium | |
10 g Caseinhydrolysat oder Pepton | |
5 g Hefeextrakt | |
5 g NaCl | |
ad 1000 ml H₂O, pH 7,4 | |
LB/Ap-Medium | LB mit 100 mg/l Ap |
LB/Tc-Medium | LB mit 2 mg/l Tetracyclin |
LB/Km-Medium | LB mit 25 mg/l Kanamycin |
30 mikro g nach Beispiel 1 der Anmeldung P 37 03 255.0
isolierter chromosomaler DNA werden 18 h bei 50°C mit
der Restriktionsendonuclease HindIII hydrolysiert und
anschließend auf einem 3,5% Polyacrylamidgel in
TBE-Puffer 20 h bei 30 mA elektrophoretisch
aufgetrennt.
Die DNA-Fragmente mit Größen zwischen 6 und 8 kbp
wurden aus dem Gel elektroeluiert, über eine
Anionenaustauschersäule (DE52
Diethylaminoethyl-Cellulose, Whatman) gereinigt und
mit Ethanol gefällt. 1 mikro g Fragment-DNA und 1 mikro g
HindIII-hydrolysierte und dephosphorylierte
pBR322-DNA werden in 20 mikro l Ligasepuffer (von
Gibco-BRL) mit 10 Units T4-DNA-Ligase zur Ligation
eingesetzt.
Transformation in die nadB-Mutante E. coli NK6042
(nadB::Tn10) und Selektion auf YP/Ap-Medium auf
Komplementation des nadB-Mangels ergibt 7 Klone, die
alle ein Plasmid der ungefähren Größe 13 kbp
enthalten. Wiederholte Retransformation dieses
Plasmids in NK6042 bestätigen die Komplementation des
nadB-Mangels. Das Plasmid wird mit pQAB510 bezeichnet
und wie bei Maniatis beschrieben auf
Restriktionsschnittstellen analysiert.
Subklonierung eines ca. 3,2 kbp großen
HindIII-NruI-Fragments in mit HindIII und NruI
hydrolysierten pBR322 ergibt ein weiteres Plasmid
pQAB520, welches nadB-Mangel in NK6042 komplementiert.
Weitere Subklonierung eines 2,5 kbp
SspI-NruI-Fragmentes aus pQAB520 in den Vektor pUC18,
der mit dem Restriktionsenzymen HincII linearisiert
worden ist, ergibt Plasmid pQAB203. Excision des 2,5 hbp
großen, nadB-tragenden Fragments aus diesem
Plasmid mit den Enzymen PstI und BanmHI und Klonierung
in den Vektor phT 234, der mit den Enzymen BamHI und
PstI hydrolysiert wird, ergeben das Plasmid pQAB104.
75 mikro g chromosomaler DNA aus E. coli (Beispiel 1)
werden mit 300 Units der Restriktionsendonuclease
BamHI bei 37°C 2 h hydrolysiert und mit 10 mikro g
des ebenfalls mit 10 Units BamHI hydrolysierten
Plasmids pLG339 zur Ligation eingesetzt. Es erfolgt
Transformation in den neu konstruierten Stamm E. coli
RF1 und Selektion auf YP/Ap-Medium auf Komplementation
des nadA-Mangels. Es wird ein Klon isoliert, der ein
Plasmid (pQAA12) mit einem ca. 12 kbp großen Insert
enthält. Retransformation in die nadA-Mutante E. coli
431 bestätigt nadA-Komplementation.
Das Plasmid pQAA 12 wird einer partiellen Hydrolyse mit
der Restriktionsendonuclease AluI unterworfen. Das
Hydrolysat wird in das mit HincII hydrolysierte
Plasmid pUC18 ligiert. Es folgt Transformation in den
Stamm 431 und Selektion auf YP/Ap-Medium. Es wird ein
Plasmid (pQAA166) mit einem 1,4 kbp großen Insert
isoliert. Durch Hydrolyse mit den
Restriktionsendonukleasen BamHI und PstI wird das 1,4 kbp-Insert
aus pQAA166 gewonnen.
Das nadA-tragende PstI/EcoRI-Fragment aus pQAA166
wurde in pBR322 (PstI und EcoRI hydrolysiert) zu
Plasmid pQAA169 subkloniert.
Zur Konstruktion eines weiteren Plasmids pQAA170 wurde
das nadA-Gen als SmaI/HindIII-Fragment aus pQAA166 in
den "low-copy-number" Vektor pLG339 (SmaI und HindIII
hydrolysiert und dephosphoryliert) kloniert.
Kompetente Zellen der nadC-Mutante W4546 wurden mit
den Plasmiden pQAB104 bzw. pQAB520 transformiert. Von
dem Stamm W 4546/pQAB104 wurden kompetente Zellen
hergestellt und diese sowohl mit pQAA170 als auch mit
pQAA169 transformiert. Die Stämme W 4546/pQAB104 +
pQAA170 und W4546/pQAB104 + pQAA169 wurden auf
LB-Km-Tc-Platten ausplattiert und selektioniert.
Analog wurde aus dem Stamm W4546/pQAB520 ein weiteres
2-Plasmid-System mit pQAA170 konstruiert. Dieser Stamm
wächst auf LB-Ap-Tc-Medium.
Die in Beispiel 4 beschriebenen Stämme wurden in einem
Medium, enthaltend 5 g/l Glycerin, 0,5 g/l Na-citrat,
5 g/l Casamino acids, 1 g/l NH₄NO₃, 0,4 g/l MgSO₄ × 7 H₂O,
7 g/l K₂HPO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 10-6 Mol/l
Nicotinsäure sowie die erforderlichen Antibiotika
(vergl. Tabelle), 24 h bei 37°C unter Schütteln
kultiviert. Danach wurde zur Bestimmung der Zellmasse
die optische Dichte bei 578 nm bestimmt, sodann die
Zellen durch Zentrifugation sedimentiert.
Die im klaren Überstand befindliche Chinolinsäure
wurde mittels HPLC quantitativ bestimmt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von Chinolinsäure durch
genetisch modifizierte Mikroorganismen, die
nadA- und nadB-DNA-Sequenzen tragende Plasmide
enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die
Mikroorganismen für nadA und nadB codierende
Plasmide im Verhältnis 50 : 200, 8 : 50 oder 8 : 200
enthalten.
2. Mikroorganismen zur Herstellung von Chinolinsäure
nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie
für Chinolinsäuresynthase und für
L-Aspartatoxidase codierende DNA-Sequenzen nadA
und nadB tragende Plasmide enthalten, die sich
mit einem Kopienverhältnis von 50 : 200, 8 : 50 oder
8 : 200 in der Zelle etablieren.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19883826041 DE3826041A1 (de) | 1988-07-30 | 1988-07-30 | Verfahren zur herstellung von chinolinsaeure |
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Publications (2)
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DE3826041A1 true DE3826041A1 (de) | 1990-02-08 |
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ID=6359977
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DE19883826041 Granted DE3826041A1 (de) | 1988-07-30 | 1988-07-30 | Verfahren zur herstellung von chinolinsaeure |
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