DE69929264T2

DE69929264T2 - Methode zur Herstellung von L-Serin mittels Fermentation

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Publication number: DE69929264T2
Application number: DE69929264T
Authority: DE
Inventors: c/o Ajinomoto Co. Inc. Mikiko Kawasaki-shi Suga; c/o Ajinomoto Co. Inc. Masakazu Kawasaki-shi Sugimoto; c/o Ajinomoto Co. Inc. Tsuyoshi Osumi; c/o Ajinomoto Co. Inc. Tsuyoshi Kawasaki-shi Nakamatsu; c/o Ajinomoto Co. Inc. Wataru Kawasaki-shi Hibino; c/o Ajinomoto Co. Inc. Mika Yokkaichi-shi Ito
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-01-12
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2019-01-13
Also published as: EP0943687A2; US20030008358A1; EP0943687B1; DE69929264D1; EP0943687A3; US6258573B1; JPH11266881A; CA2256757C; CA2256757A1; JP3997631B2

Description

ERFINDUNGSGEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von L-Serin zur Verwendung bei der Produktion von Aminosäuregemischen, die im Bereich der Pharmazeutika, Chemikalien und Kosmetika verwendet werden, und coryneforme Bakterien, die das Verfahren bilden, und D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase (nachfolgend manchmal als "3-PGDH" bezeichnet) sowie DNA, die für 3-PGDH kodiert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Als konventionelles Verfahren zum Herstellen von L-Serin durch Fermentieren ist ein Verfahren beschrieben worden, bei dem ein bakterieller Stamm, der in der Lage ist Glycin und Zucker in L-Serin umzuwandeln, in einem Medium verwendet wird, das 30 g/l Lycin enthält, um höchstens 14 g/l L-Serin herzustellen. Die Umwandlungsrate von Glycin in L-Serin durch dieses Verfahren erreichte bis zu 46% (Kubota K. Agricultural Biological Chemistry, 49, 7–12 (1985)). Durch die Verwendung eines bakteriellen Stammes, der in der Lage ist, Glycin und Methanol in L-Serin umzuwandeln, kann 53 g/l L-Serin aus 100 g/l Glycin hergestellt werden (T. Yoshida et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, Bd. 79, Nr. 2, 181–183, 1995). In dem Verfahren, bei dem ein Bakterium verwendet wird., das zum Genus Nocardia gehört, ist bekannt gewesen, dass die L-Serin-Produktivität des Bakteriums durch das Züchten solcher Stämme verbessert werden kann, die gegenüber Serinhydroxamat, Azaserin oder ähnliche resistent sind (japanische Patentveröffentlichung Nr. 57–1235). Diese Verfahren schließen jedoch die Verwendung von Glycin ein, welches ein Vorläufer von L-Serin ist, und sie enthalten einen komplizierten Arbeitsschritt und sind vom Standpunkt der Kosten aus nachteilig.
Als Stämme, die L-Serin direkt aus einem Zucker fermentieren können und nicht die Zugabe des Vorläufers von L-Serin vom Medium benötigen, ist Corynebacterium glutamicum bekannt gewesen, das gegen D-Serin, α-Methylserin, o-Methylserin, Isoserin, Serinhydroxamat und 3-Chloralanin resistent ist, aber die Anhäufung von L-Serin ist nur 0,8 g/l gering (Nogei Kagakukaisha, Bd. 48, Nr. 3, S. 201–208, 1974). Dem gemäß werden für einen weiteren Stamm Verbesserungen für die direkte Fermentierung von L-Serin in industriellem Maßstab benötigt.
Andererseits sind im Hinblick auf coryneforme Bakterien ein Vektorplasmid offenbart worden, das zur autonomen Replikation in der Zelle in der Lage ist und ein Medikamentenresistenz-Markergen hat (siehe US-Patent 4,514,502) sowie ein Verfahren zum Einschleusen eines Gens in die Zelle (japanische Patentveröffentlichung Nr. 2–207791), und die Möglichkeit des Züchtens von L-Threonin- oder L-Isoleucin-produzierenden Bakterien (US-Patente 4,452,890 und 4,442,208). Auch hinsichtlich des Wachstums von L-Lysin-produzierenden Bakterien ist eine Technologie bekannt gewesen, die die Inkorporation eines Gens, das an der Biosynthese von L-Lysin teil hat, in ein Vektorplasmid bekannt gewesen, und die Amplifizierung des Plasmids in der Zelle (japanische Patentanmeldungsoffenlegung Nr. 56–16997).
Im Fall von Escherichia coli schließen die Enzyme, die an der Biosynthese von L-Serin teil haben ein Enzym ein, das gegenüber einer Rückkopplungsinhibierung, bezogen auf die L-Serin-Produktion im Wildtyp, empfindlich ist und ein Beispiel ist bekannt gewesen, bei dem die Einschleusung eines mutierten Gens, das so mutiert worden ist, dass die Rückkopplungsinhibierung desensibilisiert werden könnte und zu einer Erhöhung des L-Serins führte (japanisches Patent Nr. 2584409). Als derartige Gene sind insbesondere das 3-PGDH-Gen (nachfolgend wird das Gen, das für 3-PGDH-Protein kodiert, ebenfalls als "serA" bezeichnet werden).
Des weiteren ist im Fall von coryneforme Bakterien ein Beispiel gezeigt worden, bei dem die Amplifizierung des 3-PGDH-Gens die Produktionsfähigkeit von L-Tryptophan beeinflusst (japanische Patentveröffentlichung nr. 3–7591).
WO 93/12235 betrifft eine D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase aus Escherichia coli.
Des weiteren offenbart US 461 982 einen Brevibacterium flavum-Stamm, der in der Lage ist, in einem Minimalmedium ohne L-Serin zu wachsen. Dieser Stamm ist in der Lage, L-Serin herzustellen, da er in einem Medium ohne selbiges wächst. Dieser Stamm ist jedoch nicht in der Lage, das hergestellte L-Serin anzuhäufen.
Des weiteren offenbart EP A 0 931 833 ein coryneformes Bakterium, das gegenüber L-Serin-Analoga resistent ist, und eine erhöhte Produktivität von L-Serin hat, das aus Glucose hergestellt wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, einen Mikroorganismus bereitzustellen, der einen Zucker in L-Serin umwandelt, und ein Verfahren bereitzustellen, um L-Serin in einem Kulturmedium anzuhäufen, wobei die Fähigkeit des Mikroorganismus benutzt wird, den Zucker in L-Serin umzuwandeln, d.h., ein Verfahren zum Herstellen von L-Serin, das beim Durchführen in einem industriellen Maßstab vorteilhaft ist.
Als ein Ergebnis der intensiven Untersuchungen über das Verfahren zum Herstellen von L-Serin im Hinblick auf das Erreichen des oben genannten Ziels, ist jetzt durch die vorstelligen Erfinder entdeckt worden, dass das Durchmustern eines coryneformen Bakteriums mit L-Serin-Produktivität, insbesondere bevorzugt eines Mutantenstammes, der eine Resistenz gegenüber Azaserin oder β-(2-Thienyl)-DL-alanin aufweist, welcher von einem Stamm des coryneformen Bakteriums als Parentalstamm abstammt, aber hinsichtlich seiner L-Serin-Zersetzungsfähigkeit defizient ist, und das Durchführen der L-Serin-Fermentierung unter Verwendung des durch Screening erhaltenen Stammes die Anhäufung von L-Serin drastisch steigert. Die vorliegende Erfindung ist auf Grundlage dieser Entdeckung vollendet worden.
D.h., dass die vorliegende Erfindung ein coryneformes Bakterium bereitstellt, das unter der Hinterlegungsnummer FERM BP 6577 hinterlegt worden ist.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase, die aus einem coryneformen Bakterium stammt, das die Hinterlegungsnummer FERM BP-6577 hat und das die Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 14 der Sequenzliste angegeben ist.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA, die für die D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase, die oben beschrieben worden ist, kodiert, d.h., die DNA, die oben beschrieben ist und eine Basensequenz hat, die in SEQ ID NO: 13 der Sequenzliste gezeigt ist.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein coryneformes Bakterium, das eine rekombinante DNA beherbergt, die die oben beschriebene DNA enthält.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von L-Serin, umfassend die Schritte des Kultivierens des oben beschriebenen Bakteriums in einem Medium, um die Anhäufung von L-Serin in dem Medium zu ermöglichen, und das Einsammeln des L-Serins aus dem Medium.
Die vorliegende Erfindung stellt ein coryneformes Bakterium bereit, das L-Serin aus Zucker herstellt. Das coryneforme Bakterium kann in einem Verfahren zum Herstellen von L-Serin benutzt werden, das industriell vorteilhaft ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt die Art der Rückkopplungsinhibierung der 3-PGDH dar, die aus verschiedenen Stämmen von L-Serin abstammen. Die horizontale Achse gibt die Konzentrationen L-Serin in der Enzymlösung wieder. Die vertikale Achse gibt den Prozentsatz der 3-PGDH-Aktivität in Gegenwart von L-Serin an, verglichen mit der in Abwesenheit von L-Serin. Das Symbol ♦ stellt die Art der Rückkopplungsinhibierung von 3-PGDH dar, die aus dem ATCC14067-Stamm durch L-Serin herrührt. Das Symbol ∎ stellt die Art der Rückkopplungsinhibierung der 3-PGDH durch L-Serin dar, die aus dem AJ13377-Stamm stammt. Das Symbol
stellt die Art der Rückkopplungsinhibierung der 3-PGDH durch L-Serin dar, die aus dem AJ13324-Stamm stammt. Symbol X stellt die Art der Rückkopplungsinhibierung der 3-PGDH durch L-Serin dar, die aus dem AJ13325-Stamm stammt. Symbol * stellt die Art der Rückkopplungsinhibierung der 3-PGDH durch L-Serin dar, die aus dem AJ13327-Stamm stammt.
2 stellt die Herstellung von den Plasmiden pVK7 und pVK6 dar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die in der vorliegenden Erfindung genannten coryneformen Bakterien sind eine Gruppe von Mikroorganismen, die in Bergey's Manuel of Determinative Bacteriology, 8th. Ausgabe, S. 599 (1974) definiert sind, und welche aerobe Gramm positive Stäbchen sind, die keine Säureresistenz und keine Fähigkeit zur Sporenbildung besitzen. Die coryneformen Bakterien schließen Bakterien ein, die zum Genus Corynebacterium gehören, Bakterien, die zum Genus Brevibacterium gehören, welche bis dahin in den Genus Brevibacterium klassifiziert worden sind, aber als Bakterien die zum Genus Corynebacterium gehören, zusammengefasst wurden, und Bakterien, welche zum Genus Brevibacterium gehören, und die Bakterien, die zum Genus Corynebacterium gehören und Bakterien, die zum Genus Microbacterium gehören, nahe verwandt sind.
Erfindungsgemäße coryneforme Bakterien haben eine Resistenz gegenüber Azaserin oder β-(2-Thienyl)-DL-alanin und besitzt L-Serin-Produktivität, und sind solche Stämme dieser coryneforme Bakterien, denen die Zersetzungsfähigkeit für L-Serin fehlt, und die artifiziell mutiert wurden oder aus Wildtyp- oder L-Serin-produzierenden coryneforme Bakterien als Parentalstamm induziert worden sind.
Die coryneformen Bakterien, die eine Resistenz gegenüber Azaserin oder β-(2-thienyl)-DL-alanin haben, denen die L-Serin-Zersetzungsfähigkeit fehlt und die L-Serin-Produktivität besitzen, sind wie folgt gewonnen worden. Brevibacterium flavum ATCC 14067 wird einer Mutationsbehandlung durch ein konventionelles Verfahren (Kontakt mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin oder ähnlichen) unterworfen, um einen mutierten Stamm zu gewinnen, der in seiner L-Serin-Zersetzungsfähigkeit defizitär ist, und indem dieser Stamm als Parentalstamm verwendet wird, werden Stämme gewonnen, die gegen Azaserin oder β-(2-thienyl)-DL-alanin resistent sind. Aus den Mutantenstämmen, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, können Stämme gewonnen werden, die L-Serin in hohen Konzentrationen anhäufen.
Die Stämme, die gegenüber Azaserin oder β-(2-Thienyl)-DL-alanin resistent sind, können ebenfalls durch das Einschleusen der unten beschriebenen Mutante serA in Parentalstämme oder Mutantenstämme gewonnen werden, die hinsichtlich der L-Serin-Zersetzungsfähigkeit defizitär sind.
Der Begriff "Azaserin-Resistenz" betrifft die Eigenschaft, dass ein Bakterium in einem Medium, das Azaserin enthält, schneller wächst als der Wildtyp. Beispielsweise wird von solchen Stämmen, die bei 30°C innerhalb von 4 bis 5 Tagen Kolonien auf Festmedium bilden, das 0,25 g/l Azaserin enthält, gesagt, dass sie eine Azaserin-Resistenz besitzen.
Gleichermaßen betrifft der Begriff "β-(2-Thienyl)-DL-alanin-Resistenz" die Eigenschaft, dass ein Bakterium schneller als der Wildtyp in einem Medium wächst, das β-(2-Thienyl)-DL-alanin enthält. Beispielsweise wird von solchen Stämmen, die auf Festmedium, enthaltend 0,25 g/l β-(2-Thienyl)-DL-alanin bei 30°C innerhalb von 4 bis 5 Tagen Kolonien bilden, gesagt, dass sie eine Resistenz gegenüber β-(2-Thienyl)-DL-alanin haben.
3-PGDH katalysiert eine Reaktion, bei der 3-Phosphoglycerat in 3-Phosphohydroxylpyruvatsäure in Gegenwart von Nikotinamidadenindinucleotid (NAD) als Coenzym oxidiert wird.
Die Aktivität der 3-PGDH kann beispielsweise durch Messung eines Abfalls an Coenzym NADH₂ in einer Umkehrreaktion gemessen werden (E. Sugimoto und L. I. Pizer, JBC, 243, 2081, 1968) oder durch die Synthese von Coenzym NADH2 in der Vorwärtsreaktion (Salach H. J. Method in Enzymology, Bd. 9, 216–220, 1966), bei der Absorption bei 340 nm.
3-PGDH kann durch Einsammeln von Zellen aus der Kulturflüssigkeit eines coryneformen Bakteriums gereinigt werden, wobei die eingesammelten Zellen durch Beschallung und anschließender Ultrazentrifugation fragmentiert werden, und in dem das avisierte Enzym aus dem Überstand durch ein konventionelles Verfahren isoliert wird. Genauer gesagt, kann 3-PGDH durch aufeinanderfolgendes Konzentrieren von Fraktionen mit 3-PGDH-Aktivität, durch Präzipitierung mit Ammoniumsulfat, Gelfiltration, Kationenaustauschharzchromatografie, Anionenaustauschharzchromatographie, Umkehrphasenchromatographie und ähnliche gereinigt werden.
3-PGDH, die aus einem coryneformen Wildtyp-Bakterium stammt, ist gegenüber einer Rückkopplungsinhibierung durch L-Serin empfindlich und seine Aktivität wird in Gegenwart von 10 mM L-Serin fast vollständig inhibiert. Unter dem Begriff "3-PGDH, deren Rückkopplungsinhibierung durch L-Serin desensibilisiert ist" ist eine 3-PGDH gemeint, die selbst in Gegenwart von 10 mM L-Serin 20% oder mehr, bevorzugt 40 oder mehr, noch bevorzugter 90% oder mehr der Aktivität in Abwesenheit von L-Serin aufweist. 3-PGDH, die aus Brevibacterium flavum AJ13327 stammt, welche in den nachfolgenden Beispielen beschrieben ist, bewahrt im wesentlichen 100% der Aktivität in Gegenwart von 80 mM L-Serin und deswegen ist sie eine der am meisten bevorzugten 3-PGDHs.
Die 3-PGDH, die aus einem coryneformen Wildtyp-Bakterium stammt (anschließend wird die DNA, die hierfür kodiert, ebenfalls als "Wildtyp-serA" bezeichnet) hat die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 12 in der Sequenzliste wiedergegeben ist. Spezifische Beispiele der 3-PGDH, bei der die Rückkopplungsinhibierung durch L-Serin desensibilisiert ist (nachfolgende wird die DNA, die hierfür kodiert, ebenfalls als "mutierte serA" bezeichnet) schließen D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase ein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase, mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 12 in der Sequenzliste wiedergegeben ist oder die gleiche Aminosäuresequenz wie oben, aber mit einer Substitution, Addition oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren, wobei die Aminosäurereste entsprechend dem 325. Glutaminsäurerest, der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 12 durch eine andere Aminosäure substituiert worden ist. Am meisten bevorzugt wird als anderer Aminosäurerest ein Lysinrest.
Das DNA-Fragment, das das serA-Gen aufweist, aus dem coryneformen Bakterium kodiert, kann isoliert werden, indem beispielsweise eine chromosomale DNA hergestellt wird, entsprechend dem Verfahren von Saito und Miura (H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)) oder durch ähnliche und indem dann das serA-Gen durch das Polymerasekettenreaktionsverfahren amplifiziert wird (PCR: Polymerasekettenreaktion; siehe White, T. J. et al.; Trends Genet. 5, 185 (1989)). Beispielsweise kann, um das DNA-Fragment zu amplifizieren, das den ORF (172 bis 1705) der SEQ ID NO: 11 enthält, irgendeine der 20 bis 30 Basen, die aus der Region ausgewählt wird, die von der ersten Base in SEQ ID NO: 11, bis zur Base direkt vor dem ATG reicht, ausgewählt werden, um einen Primer zu gewinnen. Des weiteren können irgendwelche der 20 bis 30 Basen, die aus der Region von der Base direkt nach dem Terminationskodon bis zur letzten Base in SEQ ID NO: 11 reicht ausgewählt werden, um einen weiteren Primer zu gewinnen.
Wenn serA aus einem Wildtyp-Stamm für 3-PGDH isoliert wird, wird Wildtyp-serA erhalten, und die Isolation von serA aus einer Mutante, die 3-PGDH beherbergt, bei der die Rückkopplungsinhibierung durch L-Serin desensiblisiert ist (3-PGDH-Mutante) ergibt mutierte serA. Genauer gesagt, hat die Wildtyp-serA die Sequenz, die in SEQ ID NO: 11 in der Sequenzliste wiedergegeben ist, und die mutierte serA, hat die Sequenz, die in der SEQ ID NO: 13 in der Sequenzliste wiedergegeben ist.
Es wird bevorzugt, dass serA durch das PCR-Verfahren amplifiziert und mit Vektor-DNA ligiert wird, die autonom in Zellen von Escherichia coli und/oder coryneforme Bakterien replizierbar ist, um rekombinante DNA herzustellen, und die rekombinante DNA wird in die Zellen von Eschericha coli zuvor eingeschleust. Diese Voraussetzung macht die folgenden Arbeitsschritte leicht. Der Vektor, der in Escherichia coli-Zellen autonom replizierbar ist, ist bevorzugt ein Plasmidvektor, der bevorzugt autonom in Zellen eines Wirts replizierbar ist, einschließlich beispielweise pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 und RSF1010.
Rekombinante DNA kann durch die Verwendung eines Transposons (WO 02/02627) internationale Veröffentlichungsblatt WO 93/18151 internationales Veröffentlichungsblatt, europäische Patentveröffentlichung Nr. 0445385, japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-46867, Vertes, A. A. et al., Mol. Microbiol., 11, 739–746 (1994), Bonamy, C., et al., Mol Microbiol., 14, 571–581 (1994), Verters, A. A. et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397–405 (1994), Jagar W., FEMS Microbioloy Letters, 126, 1–6 (1995), japanische Patentveröffentlichung Nr. 7-107976, japanische Patentveröffentlichung Nr. 7-327680, etc.), Phagenvektoren, Rekombination von Chromosomen (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. und Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)) und ähnliche hergestellt werden.
Wenn ein DNA-Fragment mit der Fähigkeit, die einem Plasmid erlaubt in coryneformen Bakterien autonom replizierbar zu sein, in diese Vektoren inseriert wird, können sie als sogenannte Shuttle-Vektoren verwendet werden, die autonom sowohl in Escherichia coli und coryneformen Bakterien replizierbar sind.

Ein solcher Shuttle-Vektor schließt folgendes ein. Mikroorganismen, die irgendeinen der Vektoren beherbergen und die Hinterlegungsnummer in den internationalen Hinterlegungsstellen werden in Klammern angegeben.

pHC4:	Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3521)
pAH655:	Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136) Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135)
pAJ1844:	Escheriachia coli AJ11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39136)
pAJ611:	Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)
pAJ3148:	Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 29317)
pAJ440:	Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140)

Diese Vektoren können aus den hinterlegten Mikroorganismen wie folgt gewonnen werden. Zellen, die in der logarithmischen Wachstumsphase eingesammelt wurden, wurden unter Verwendung von Lysozym und SDS lysiert, gefolgt durch die Abtrennung aus dem Lysat durch Zentrifugieren bei 30.000 × g, um einen Überstand zu gewinnen, zu dem Polyethylenglycol hinzugegeben wird, gefolgt von der Fraktionierung und Aufreinigung mit Hilfe eines Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gleichgewichtsgradienten-Zentrifugierungsschritts.
Escherichia coli kann durch das Einschleusen eines Plasmids in Übereinstimmung mit beispielsweise dem Verfahren von D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)) oder einem Verfahren transformiert werden, bei dem die Empfängerzellen mit Kalziumchlorid behandelt werden, um die Permeabilität für die DNA zu erhöhen (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
Die Einschleusung von Plasmiden in coryneforme Bakterien, um eine Transformation zu verursachen, kann durch das Elektropulsverfahren (Sugimoto et al., japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-207791) durchgeführt werden.
Für die L-Serin-Produktion unter Verwendung des erfindungsgemäßen Stammes können die folgenden Verfahren verwendet werden. Als zu verwendendes Medium können konventionelle Flüssigmedien verwendet werden, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und, falls notwendig, gegebenenfalls organische Spurenelemente, wie Aminosäuren, Vitamine, etc., enthalten.
Als Kohlenstoffquellen ist es möglich Zucker zu verwenden, beispielsweise Glucose, Sucrose, Fructose, Galactose, saccharifizierte Stärkelösungen, Süßkartoffelmolassen, Zuckerrübenmolassen und Hightest Molassen, die die oben beschriebenen Zucker einschließen; organische Säuren, wie beispielsweise Essigsäure; Alkohole, wie beispielsweise Ethanol; Glycerol und ähnliche.
Als Stickstoffquellen ist es möglich, Ammoniakgas, wässriges Ammoniak, Ammoniumsalze, Harnstoff, Nitrate und ähnliche zu verwenden. Des weiteren können organische Stickstoffquellen für die ergänzende Verwendung, beispielsweise Ölkuchen, Sojabohnenhydrolysatflüssigkeiten, zersetztes Kasein, andere Aminosäuren, Mais-Weiche-Liquor, Hefe oder Hefeextrakt, Peptide, wie beispielsweise Pepton und ähnliche verwendet werden.
Als anorganische Ionen können gegebenenfalls Phosphorionen, Magnesiumionen, Kalziumionen, Eisenionen, Manganionen und ähnliche hinzugegeben werden.
Im Fall der Verwendung des Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung, der Nährstoffe, wie Aminosäuren für sein Wachstum benötigt, sollten die benötigten Nährstoffe ergänzt werden.
Die Mikroorganismen werden für gewöhnlich unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 5 bis 8 und Temperaturbereichen von 25 bis 40°C inkubiert. Der pH-Wert des Kulturmediums wird auf einen vorherbestimmten Wert innerhalb der oben beschriebenen Bereiche in Abhängigkeit der Anwesenheit oder vom Vorhandensein anorganischer oder organischer Säuren, alkalischer Substanzen, Harnstoff, Kalziumcarbonat, Ammoniakgas und ähnliche kontrolliert.
L-Serin kann aus der Fermentationsflüssigkeit beispielsweise durch Auftrennen und Entfernen der Zellen, durch das Unterwerfen gegenüber einer Ionanaustauschharzbehandlung, durch Konzentrationsabkühlungskristallisierung, durch Membranauftrennung und andere bekannte Verfahren in irgendeiner geeigneten Kombination eingesammelt werden. Um die Unreinheiten zu entfernen, kann eine Aktivkohleabsorption und Rekristallisierung für die Reinigung verwendet werden.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
(BEISPIEL 1) Konstruktion der neuen L-Serin-produzierenden Bakterien Brevibacterium flavum AJ13324 und AJ13327
Brevibacterium flavum AJ13324 und AJ13327 wurden aus Brevibacterium flavum AJ13377 hergestellt, dessen L-Serin-Zersetzungsfähigkeit fehlt, und aus dem Wildtypstamm Brevibacterium flavum ATCC 14067 gewonnen wurde.
Um eine Mutante zu erhalten, wurden Zellen, die für 24 Stunden in einem Bouillonmedium (ein Medium, das 1 g Fischfleischextrakt, 1 g Polypepton, 0,5 g Hefeextrakt und 0,5 g Natriumchlorid in 1 1 Wasser enthält, der auf pH 7,0 eingestellt ist) in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert (enthaltend 109 bis 1010 Zellen/ml). NG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) wurde in einer Konzentration von 200 μg/ml zur Suspension hinzugegeben und bei 30°C für 30 Minuten stehengelassen. Die so NG-behandelten Zellen wurden mit dem oben beschriebenen Puffer ordentlich gewaschen.
Um Stämme einzusammeln, die keine L-Serin-abbauende Fähigkeit haben, von den NG-behandelten Zellen, wurden die NG-behandelten Zellen des Brevibacterium flavum ATCC 14067 nach dem Waschen auf einem Bouillon-Agar-Medium ausgebreitet und bei 30°C für 24 Stunden inkubiert, um eine Kolonienbildung zu ermöglichen. Dann wurden die Kolonien auf dem Bouillon-Agar-Medium als Negative verwendet und eine Replikabildung wurde auf einem Minimalmedium und einem Minimalmedium für die Selektion durchgeführt. Dann wurden Stämme ausgemustert, die auf dem Minimalmedium wachsen, aber nicht auf dem Minimalmedium für die Auswahl wachsen. Das Minimalmedium war ein Medium, das 20 g Glucose, 1 g Ammoniumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 2,5 g Harnstoff, 0,4 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01 g Eisen(II)sulfatheptahydrat, 0,01 g Mangansulfat-tetra- bis pentahydrat, 50 μg Biotin, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 200 μg Niktoinsäureamid und 2,0 g Agar je Liter destillierten Wassers enthält. Das Minimalmedium für die Selektion war ein Medium, das 1 g Ammoniumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 2,5 g Harnstoff, 0,4 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01 g Eisen(II)sulfatheptahydrat, 0,01 g Mangansulfattretra- bis pentahydrat, 50 μg Biotin, 200 μ Thiaminhydrochlorid, 200 μg Nikotinsäureamid, 0,5 g L-Serin und 2,0 g Agar je Liter destillierten Wassers enthält. Unter den durch dieses Verfahren gewonnenen Mutanten wurden viele Stämme gefunden, die keine L-Serin-Zersetzungsaktivität haben und Brevibacterium flavum AJ13377 wurde als einer solcher Stämme gewonnen.
Um Azaserin-resistente Stämme aus NG-behandelten Stämmen unter Verwendung von Brevibacterium flavum AJ13377 als Parentalstamm zu gewinnen, wurden NG-behandelte Brevibacterium flavum AJ13377-Zellen, nachdem sie gewaschen wurden, auf ein Minimalmedium für die Selektion inokuliert. Das Minimalmedium für die Selektion war ein Medium, das 20 g Glucose, 1 g Ammoniumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 2,5 g Harnstoff, 0,4 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01 g Eisen(II)sulfatheptahydrat, 0,01 g Mangansulfattetra- bis Pentahydrat, 50 μg Biotin, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 200 μg Nikotinsäureamid und 250 mg Azaserin je Liter destillierten Wassers enthält. Die NG-behandelte Mutante wurde in dem oben beschriebenen Medium bei 30°C für 5 bis 10 Tage inkubiert.
Die auf diese Weise gewonnene Zellkultur wurde auf Bouillon-Agar-Medium ausgestrichen und bei 30°C für 24 Stunden inkubiert, um die Kolonienbildung zu ermöglichen. Azaserinresistente Stämme wurden aus den Stämmen gewonnen, die Kolonien bildeten. Die so gewonnen Mutanten schließen viele Stämme ein, die L-Serin in beträchtlichen Mengen mit hoher Ausbeute akkumulierten. Aus den Stämmen wurden zwei Stämme gewonnen, d.h., Brevibacterium flavum AJ13324 und AJ13327. Es wurde bestätigt, dass diese Stämme in der Lage waren, in Gegenwart von 0,25 g/l Azaserin zu wachsen.
(BEISPIEL 2) Konstruktion des neuen L-Serin-produzierenden Bakteriums Brevibacterium flavum AJ13325
Brevibacterium flavum AJ13325 wurde aus Brevibacterium flavum AJ13377 konstruiert, dem die L-Serin-Zersetzungsfähigkeit fehlt, welches aus dem Wildtypstamm Brevibacterium flavum ATCC 14067 gewonnen wurde.
Um β-(2-Thienyl)-DL-alanin-resistente Stämme aus NG-behandelten Stämmen unter Verwendung von Brevibacterium flavum AJ13377 als Parentalstamm zu gewinnen, wurden Brevibacterium flavum AJ13377-Zellen NG-behandelt und gewaschen, bevor sie in ein Minimalmedium für die Selektion inokuliert wurden. Das Minimalmedium für die Selektion war ein Medium, das 20 g Glucose, 1 g Ammoniumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 2,5 g Harnstoff, 0,4 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01 g Eisen(II)sulfatheptahydrat, 0,01 g Mangansulfattetra- bis pentahydrat, 50 μg Biotin, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 200 μg Nikotinsäureamid und 250 mg (β-(2-Thienyl)-DL-alanin je Liter destillierten Wassers enthält. Die NG-behandelte Mutante wurde bei 30°C für 5 bis 10 Tage in dem oben beschriebenen Medium inkubiert. Die Zellkultur, die auf diese Weise gewonnen wurde, wurde auf einem Bouillon-Agar-Medium ausgebreitet und für 24 Stunden bei 30°C zur Kolonienbildung inkubiert. β-(2-Thienyl)-DL-alanin-resistente Stämme wurden aus den Stämmen gewonnen, die Kolonien bildeten. Die Mutanten, die auf diese Weise gewonnen wurden, schließen viele Stämme ein, die L-Serin in beträchtlichen Mengen mit hoher Ausbeute akkumulierten. Brevibacterium flavum AJ13325 wurde als einer solcher Stämme gewonnen. Es wurde bestätigt, dass diese Stämme in der Lage waren in Gegenwart von 0,25 g/l β-(2-Thienyl)-DL-alanin zu wachsen.
(BEISPIEL 3) Produktion von L-Serin durch ein neues L-Serin-produzierendes Bakterium Brevibacterium flavum AJ13324, AJ13325 und AJ13327
Brevibacterium flavum AJ13324, AJ13325 und AJ13327 wurden jeweils auf einem Bouillon-Agar-Medium bei 30°C für 24 Stunden inkubiert und eine Schlaufe jedes Mikroorganismus wurde in einen 500 ml-Schüttelkolben, enthaltend 20 ml eines Fermentationsmediums mit der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung, inokuliert. Als Kontrolle wurden die Parentalstämme Brevibacterium flavum ATCC 14067 und AJ13377 auf gleicher Weise wie oben beschrieben inokuliert. Das Medium wurde mit Kaliumhydroxid auf pH 7,0 eingestellt und bei 115°C für 15 Minuten autoklaviert. Nach der Sterilisierung und der Abkühlung wurde Kalziumcarbonat, das Trockenluft-Sterilisiert worden war, bei 180°C für 3 Stunden in einer Menge von 5 g/l hinzugefügt; hinzugegeben.
TABELLE 1
Die Bestimmung des L-Serin durch Verwendung der Hochleistungs-Flüssigchromatografie (Hitachi L-8500 Amino Acid Autoanalyszer) zeigte, dass Brevibacterium flavum AJ13324, AJ13325 und AJ13327 L-Serin im Medium in Mengen von 15,2 g/l, 14,3 g/l bzw. 15,4 g/l anhäuften. Andererseits häuften Brevibacterium flavum Stämme ATCC 14067 und AJ13377, die als Kontrolle inkubiert worden waren, L-Serin in Mengen von 0 g/l bzw. 5,0 g/l an.
Die Kulturflüssigkeit von Brevibacterium flavum AJ13324 wurde zentrifugiert, und die Überstande wurde einer Entsalzungsbehandlung unter Verwendung eines Kationenaustauschharzes unterworfen, gefolgt von einer chromatografischen Auftrennung mit einem Kationenaustauschharz und einem Anionenaustauschharz, um Nebenprodukte zu entfernen, und von einer Reinigung durch Kristallisierung, um L-Serin-Kristalle von mindestens 99 Reinheit bei einer Ausbeute aus der Flüssigkeit von 55% zu gewinnen.
(BEISPIEL 4) Messung der 3-PGDH-Aktivität
Brevibacterium flavum AJ13324, AJ13325 und AJ13327 wurden auf Bouillon-Agar-Medium für 24 Stunden bei 30°C inkubiert und eine Schlaufe jedes Mikroorganismus wurde in einem 500 ml Schüttelkolben, enthaltend 50 ml eines Fermentationsmediums mit der in Tabelle 2 gezeigten Zusammensetzung inokuliert. Als Kontrolle wurden die Parentalstämme Brevibacterium flavum ATCC 14067 und AJ13377 auf gleiche Weise, wie oben beschrieben, inokuliert. Das Medium für die Inokulation wurde mit Natriumhydroxid auf pH 5,5 eingestellt und für 15 Minuten bei 115°C autoklaviert.
TABELLE 2
Nach dem Einsammeln der Zellen aus der Kulturflüssigkeit jedes Stamms wurden die Zellen zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM Dithiotreitol, suspendiert. nach der Abkühlung in Eis, wurde die Suspension einem Beschallungsgerät ausgesetzt, um die Zellen zu fragmentieren und die erhaltene Flüssigkeit wurde ultrazentrifugiert. Die Ultrazentrifugation wurde bei 45.000 UPM für 1 Stunde laufengelassen, um eine Rohenzymlösung zu gewinnen.
Die Enzymaktivität der 3-PGDH wurde durch das Verfahren von Salach H. J. et al. (Method in Enzymology, Bd. 9, 216-220 (1966)) gemessen.
Genauer gesagt, wurden 0,4 ml 0,015 M NAD, 0,12 ml 0,25 M EDTA (pH 9, NaOH), 0,1 ml 0,05 M Glutathion (pH 6, KOH), 0,5 ml 1 M Hydrazin (pH 9, Acetat), 0,6 ml 1 M Tris (pH 9, HCl), eine geeignete Konzentration an L-Serin (0 bis 40 mM) und Wasser, um 2,3 ml zu ergeben, welches vorher auf 25°C aufgewärmt wurde, hinzugegeben. Dann wurden 0,2 ml der Rohenzymlösung hinzugegeben, und die Temperatur wurde für 5 Minuten gleichgehalten. Danach wurde 0,5 ml 0,1 M 3-PGA (3-Phosphoglyceratdinatriumsalz, pH 7, NaOH) hinzugegeben. Nach dem Umrühren wurde die Absorption bei 340 nm in der Reaktionsmischung für 30 Sekunden gemessen. Die Reaktion wurde bei 25°C durchgeführt.
Zur Messung der Aktivität wurde eine Hitachi U-2000A Spektrophotometer verwendet.
1 stellt die erhaltenen Ergebnisse dar. Der AJ13377-Stamm wurde im Vergleich mit dem Wildtypstamm ATCC 14067 von seiner L-Serin-Empfindlichkeit befreit. Der AJ13324-Stamm wurde noch mehr hinsichtlich seiner L-Serin-Empfindlichkeit befreit und der AJ13325-Stamm war auf dem gleichen Niveau wie der AJ13324-Stamm in dieser Hinsicht. Der AJ13327-Stamm wurde hinsichtlich seiner L-Serin-Empfindlichkeit stark erleichtert. Und die Inhibierung war selbst in Gegenwart von 80 mM L-Serin vollständig desensibilisiert.
Obwohl einige Beispiele der Desensibilisierung der Inhibierung von 3-PGDH durch L-Serin bei Escherichia coli beschrieben worden waren (Tosa und Pizer, J. Bacteriol. 106: 972–982 (1971) oder japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-510911) ist kein Beispiel einer vollständigen Desensibilisierung der Inhibierung in Gegenwart einer so hohen Konzentration von L-Serin bekannt gewesen.
(BEISPIEL 5) Klonierung der aus coryneformen Bakterien stammenden Wildtyp- und Mutanten-serA
Wie in Beispiel 4 gezeigt ist, wurde die Rückkopplungsinhibierung durch L-Serin in dem AJ13327-Stamm vollständig desensiblisiert. Dementsprechend wurde die Klonierung des serA-Gens, das für die Wildtyp-3-PGDH kodiert, die aus dem ATCC 14067-Stamm stammt, und der mutierten 3-PGDH, die aus dem AJ13327-Stamm stammt, versucht, um herauszufinden, worin die Variation lag, und die Amplifikationswirkung der 3-PGDH zu bestätigen.
Um serA vom Chromosom vom Brevibacterium flavum unter Verwendung eines PCR-Verfahrens zu amplifizieren, ist es notwendig, einen entsprechenden Primer herzustellen. Da es keinen Bericht über die Klonierung und die Nucleotidsequenz von serA in Brevibacterium flavum gegeben hat, wurde die Sequenz von serA, die aus Corynebacterium stammt, verwendet. Plasmid pDTS9901 wurde aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum K82 (siehe FERM BP-2444 und japanische Patentanmeldungsoffenlegung Nr. 3-7591) in der das serA-Fragment, das aus Corynebacterium stammt unter Verwendung von Wizard Minipreps DNA Purification System kloniert worden war (hergestellt von Promega), und ein DNA-Fragment von ungefähr 1,4 kb, enthaltend serA, wurde mit dem Restiktionsenzym BamHI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) aufgespalten.
Als Vektor zum Klonieren des Genfragments wurde ein neu konstruierter Klonierungsvektor pVK7 für coryneforme Bakterien verwendet.
pVK7 wurde durch Ligieren (eines Klonierungsvektors für Escherichia coli) pHSG299 (Kmr; Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63–74 (1987), japanische Patentveröffentlichung Nr. 10-215883) mit pAM330, einem kryptischen Plasmid aus Brevibacterium lactofermentum, auf die unten beschriebene Weise hergestellt. pHSG299 wurde mit dem monospezifischen Restriktionsenzym AvaII (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten, und mit T4-DNA-Polymerase wurden glatte Enden hergestellt. Dieses wurde mit pAM330 ligiert, das mit HindIII gespalten worden war (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und mit T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen wurde. Die zwei Arten von Plasmiden, die gewonnen wurden, wurden in Abhängigkeit von der Richtung der pAm330-Insertion, bezüglich pHSG299 als pVK6 und pVK7 bezeichnet, und pVK7 wurde in den folgenden Experimenten verwendet. pVK7 war zur autonomen Replikation in Escherichia coli und Brevibacterium lactofermentum in der Lage und bewahrt die multiple Klonierungsstelle und LacZ', das aus pHSG299 stammt. 2 stellt den Prozess des Herstellen von pVK6 und pVK7 dar.
In den so hergestellten Shuttle-Vektor pVK7 wurde ein DNA-Fragment von ungefähr 1,4 kb, enthaltend serA, ligiert. pDTS9901 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI geschnitten (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und mit pVK7 ligiert, das ebenfalls mit dem Restriktionsenzym BamHI geschnitten worden war. Die Ligierung der DNA wurde unter Verwendung eines Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß dem vorgeschriebenen Verfahren durchgeführt.
Für die Sequenzierungsreaktion wurde der PCR-Thermo-Cycler vom MP-Typ verwendet (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und der Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (hergestellt von Perkin Elmer). Als DNA-Primer wurden M13(-21), RV-Primer (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet. SEQ ID NO: 1 in der Sequenzliste zeigt die so erhaltene Sequenz. SEQ ID NO: 2 zeigt eine Aminosäuresequenz, die durch diese Sequenz kodiert sein kann.
Ein Primer wurde auf Grundlage dieser Basensequenz, die so bestimmt worden war, synthetisiert und serA wurde durch das PCR-Verfahren unter Verwendung von chromosomaler DNA des mutierten Brevibacterium flavum AJ13327 als Schablone amplifiziert. Die SEQ ID NOS: 3 und 4 in der Sequenzliste zeigen, dass die Sequenzen des N-terminalen Endes bzw. des C-terminalen Endes der DNA-Primer, die für die Genamplifizierung synthetisiert worden war.
Bei der Herstellung chromosomaler DNA aus Brevibacterium flavum wird der Genomic DNA Purification Kit (Bacterial) (hergestellt von Advanced Genetic Technologies Corp.) verwendet und das Herstellungsverfahren war das, das dem beigefügten Protokoll entsprach.
Für die PCR-Reaktion wird von einem PCR Thermal Cycler MP Type (Takara Shuzo Co., Ltd.) und vom TaKaRa Taq (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) Gebrauch gemacht.
Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des Original TA Cloning Kit (hergestellt von Invitrogen) direkt in den Plasmid pCR2.1-Vektor ligiert und die Transformation wurde unter Verwendung von kompetenten Zellen INVαF' durchgeführt. Die transformierten Zellen wurden auf L-Medium ausplattiert (10 g/l Bactotrypton, 5 g/l Bactohefeextrakt, 15 g/l NaCl und 15 g/l Agar), welches weiter 40 μg/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) und 25 μg/ml Kanamycin enthält, und über Nacht inkubiert. Die weißen Kolonien, die auftraten, wurden eingesammelt und in einzelne Kolonien separiert, um einen transformierten Stamm zu gewinnen.
Plasmide wurden aus dem transformierten Stamm extrahiert und die Plasmide, bei denen die Insertion des serA-Fragments mit dem PCR-Verfahren bestätigt worden war, wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI behandelt und in dem Shuttle-Vektor pVK ligiert. Die Bestimmung der Basensequenz des Produktes lässt vermuten, dass keine Sequenz vollständiger Länge auf der C-terminalen Seite enthalten sein kann. Die so gewonnene Sequenz entspricht der Region der 277 Basen aufwärts SEQ ID NO: 13 auf der 5'-Seite bis zur 1134. Base von SEQ ID NO: 13 in der Sequenzliste auf der 3'-Seite.
Um ein Fragment zu gewinnen, welches das serA-Gen in voller Länge enthält, wurde eine Klonierung des deletierten Teils der chromosomalen DNA aus Brevibacterium flavum AJ13327-Stamm gemäß dem beigefügten Protokoll unter Verwendung des TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt.
Zuerst wurde die so hergestellte chromosomale DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen vollständig verdaut und mit Kassetten ligiert, die entsprechende Restriktionsenzymschnittstellen haben, die diesen entsprechen. Der Kassetten-Primer (C1) (SEQ ID NO: 5 in der Sequenzliste) und der komplementäre Primer einer bekannten Region der DNA (51) (SEQ ID NO: 6 in der Sequenzliste) wurden verwendet, um die erste PCR durchzuführen. Unter Verwendung eines Teils des Reaktionsgemisches wurde eine zweite PCR mit dem inneren Primer C2 (SEQ ID NO: 7 in der Sequenzliste) und S2 (SEQ ID NO: 8 in der Sequenzlist) durchgeführt, um nur die anvisierte DNA zu amplifizieren.
Wenn EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) als Restriktionsenzym verwendet wurde, wurde die Amplifizierung der gewünschten DNA bestätigt und die Basensequenz des PCR-Produktes wurde direkt bestimmt. Auf Grundlage der so erhaltenen Basensequenz, wurde ein Primer, der für das C-terminale Ende kodiert, hergestellt und die Fragmente, die die serA in vollständiger Länge enthalten, wurden aus Brevibacterium flavum ATCC 14067 als Wildtypstamm und Brevibacterium flavum AJ13327 als mutiertem Stamm eingesammelt. SEQ ID NOS: 9 und 10 in der Sequenzliste zeigen die Sequenzen der Primer der N-terminalen Seite bzw. der C-terminalen Seite.
Die Genfragmente, die jeweils Wildtyp-serA bzw. mutiertes serA enthalten, wurden in ihrer vollen Länge in den EcoRI-geschnittenen Shuttle-Vektor pVK7 unter Verwendung des Original TA Cloning Kit (hergestellt von Invitrogen) ligiert. Plasmide, die die entsprechenden Genfragmente beherbergen wurden abgetrennt und ihre Basensequenzen wurden bestimmt. SEQ ID NOS: 11 und 13 geben die Sequenzen des Wildtyps bzw. der Mutante wieder. SEQ ID NOS: 12 und 14 geben die Aminosäuresequenzen wieder, für die diese Sequenzen kodieren können. Beim Vergleich der so gewonnenen Basensequenzen, wurde bestätigt, dass in der mutierten serA die 1087ste Base, G, in ein A mutiert worden war und infolgedessen wurde die 325ste Aminosäure, Glutaminsäure, in Lysin geändert.
(BEISPIEL 6) Einschleusung des Plasmids, enthaltend 3-PGDH- Gen in Brevibacterium flavum
Plasmide, die Wildtyp-serA oder mutiertes serA beherbergen, wurden jeweils in Brevibacterium flavum AJ13377 eingeschleust. Die Plasmide wurden durch das Elektropulsverfahren eingeschleust (Sumimoto et al., japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-207791).
Transformierte Zellen wurden in Komplettmedium, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin, selektiert.
(BEISPIEL 7) Herstellung von L-Serin durch transformierte Zellen
Transformierte Zellen, die jeweils hierin eingeschleuste Plasmide haben, die Genfragmente beherbergen, die Wildtyp-serA oder mutiertes serA in ihrer vollen Länge enthalten, wurden in einem 500 ml Schüttelkolben gemäß Beispiel 3 inkubiert, und das hergestellte L-Serin wurde bestimmt. Als Kontrolle wurde der AJ13377-Stamm als Wirt auf gleiche Weise inkubiert.
In der transformierten Zelle mit darin eingeschleustem Wildtyp-serA wurde kein Einfluss auf die L-Serin-Produktivität beobachtet, während in der transformierten Zelle mit darin eingeschleusten mutierten serA ein Anstieg in der L-Serin-Produktivität bestätigt wurde. TABELLE 3

SerA*:: Mutiertes serA-Gen

Brevibacterium flavum AJ13377 ist seit dem 15. Oktober 1997 beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums für International Trade and Industry (Zip-Code: 305-8566, 1–3 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) unter der Hinterlegungsnummer FERM P-16471 hinterlegt worden und von der Ursprungs-Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung auf Grundlage des Budapester Vertrages vom 20. November 1998 überführt und unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6576 hinterlegt worden.
Des weiteren wurde das Plasmid, das das mutierte serA enthält, in Brevibacteirum flavum ATCC 14067 beherbergt. Der Plasmid-haltige Stamm wurde als Brevibacterium flavum AJ13378 bezeichnet und ist seit 15. Oktober 1997 beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums von International Trade and Industry (Zip-Code: 305-8566, 1-3 Higaschi 1-Chome, Tsukuba-schi, Ibaraki-ken, Japan) unter der Hinterlegungsnummer FERM P-16472 hinterlegt, und aus der Ursprungs-Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung auf Grundlage des Budapester Vertrages am 20. November 1998 überführt und unter der Hinterlegungsnummer FERM-BP-6577 hinterlegt worden.

Claims

D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase, die von einem Bakterium mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6577 beherbergt wird und eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14 im Sequenzprotokoll aufweist.
DNA, die eine Basensequenz gemäß SEQ ID NO: 13 im Sequenzprotokoll aufweist.
Plasmid, umfassend eine DNA gemäß Anspruch 2.
Koryneformes Bakterium, das die DNA, die in Anspruch 2 beschrieben wird, beherbergt.
Koryneformes Bakterium gemäß Anspruch 4, das unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6577 hinterlegt wurde.
Verfahren zur Erzeugung von L-Serin, umfassend die Schritte der Kultivierung des Bakteriums gemäß Anspruch 4 oder 5 in einem Medium, um eine Anhäufung von L-Serin in dem Medium zu erlauben, und Sammeln des L-Serins aus dem Medium.