KR102414743B1 - 신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법 - Google Patents

신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 신규 O-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 시스테인의 유도체의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

신규 O-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법{Novel O-phosphoserine exhaust proteins and methods for producing O-phosphoserine, cysteine and derivatives thereof using the same}
본 출원은 신규 O-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 시스테인의 유도체의 생산 방법에 관한 것이다.
L-시스테인은 모든 생물체의 황 대사에 있어서 중요한 아미노산으로, 모발의 케라틴 등 생체 내 단백질, 글루타치온, 바이오틴, 메치오닌 및 기타 황을 함유한 대사산물의 합성에 사용될 뿐만 아니라 코엔자임 A 생합성의 전구 물질로 사용된다.
미생물을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 방법으로, 1) 미생물을 이용하여 D,L-ATC(D,L-2-amino-2-thiazoline- 4-carboxylate)를 생물학적으로 전환하는 방법 , 2) 대장균을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 직접 발효 방법(유럽 등록특허 EP0885962B; Wada M andTakagi H , Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006), 3) 미생물을 이용하여 O -포스포세린(O-phosphoserine, 이하 "OPS")을 발효 생산한 후, O-포스포세린 설피드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, 이하 "OPSS")의 촉매작용 하에 황화물과 반응하여 L-시스테인으로 전환시키는 방법(한국등록특허 제 1381048 호) 등이 알려져 있다.
이 때, 상기 3) 방법으로 고수율의 시스테인을 생산하기 위해서 전구체인 OPS를 과량 생산하여야 할 필요가 존재하였다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 OPS 생산 균주에서 생산된 O-포스포세린이 세포 밖으로 원활하게 배출시킬 수 있는 적절한 배출 인자를 규명하고, OPS의 생산을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 신규한 OPS 배출 단백질을 발굴함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 이용한 O-포스포세린의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 이용한 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태로, 본 출원은 mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 제공한다.
본 출원에서 용어, "O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)"은 세린의 인산(phosphoric acid) 에스테르로서, 여러 단백질의 구성요소이다. 상기 OPS는 L-시스테인의 전구체로서, OPS 설피드릴라아제(OPS sulfhydrylase, OPSS)의 촉매 작용 하에 황화물과 반응하여 시스테인으로 전환될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(한국등록특허 제1381048호).
구체적으로, 본 출원의 재조합 미생물은 O-포스포세린 배출 활성이 내재적 활성에 비하여 강화될 수 있다. 본 출원의 mdtH 단백질은 O-포스포세린 을 세포 밖으로 배출할 수 있는 활성을 가질 수 있으며, 이러한 활성은 본 출원에서 최초로 규명하였다.
일 예로, 본 출원의 mdtH 단백질은 막 단백질일 수 있으며, 본 출원의 mdtH 단백질은 대장균(Escherichia coli) 유래일 수 있다.
또한, 본 출원의 mdtH 단백질은 MFS(major facilitator superfamily)에 속하는 트랜스포터일 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 mdtH 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 O-포스포세린 배출 활성을 가지면서 상기 서열번호 1과 95% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 예컨대, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 mdtH 단백질과 동일하거나 상응하는 OPS 배출 활성을 나타내는 단백질이라면 제한없이 포함된다.
보다 구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 99.75% 이상, 및 100% 미만의 동일성을 가지는 서열일 수 있다.
또한, 본 출원의 mdtH 단백질은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열에서 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 단백질 변이체도 실질적으로 O-포스포세린 배출 활성을 가지는 한 본 출원의 범위 내에 포함될 수 있다.
또한, 본 출원의 mdtH 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 O-포스포세린 배출 활성을 가지면서 상기 서열번호 1과 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열의 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 또는 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 포함할 수 있음은 당업자에게 자명할 수 있다.
본 출원에서 용어 '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 염기 서열 또는 아미노산 서열의 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 염기 서열 또는 아미노산 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
염기 서열 또는 아미노산 서열의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 염기 서열 또는 아미노산 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원에서 용어 "O-포스포세린(OPS) 생산 재조합 미생물"은, 자연적으로 약한 OPS 생산능을 가지고 있는 미생물 혹은 OPS 생산능이 없는 모균주에 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어나 OPS 생산능이 부여된 미생물을 의미할 수 있다. 본 출원에서 상기 "OPS 생산 재조합 미생물"은 "OPS 생산능을 갖는 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 목적상, 상기 OPS 생산 미생물의 경우, mdtH 단백질의 활성이 강화됨에 따라, OPS의 생산량이 야생형 또는 변형 전 미생물에 비해 증가한 것일 수 있다. 이는 야생형 또는 변형 전 미생물이 OPS를 생산하지 못하거나, OPS를 생산하더라도 극미량을 생산할 수 있는 것에 반해, 본 출원의 미생물은 mdtH 단백질의 활성을 강화함으로써 OPS 생산능을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있을 수 있다.
상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드 또는 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드 또는 단백질의 활성에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 활성 "강화" 또는 "증가"는 외래의 폴리펩티드 또는 단백질을 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드 또는 단백질의 활성 강화를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 활성의 강화 여부는 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드 또는 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 해당 폴리펩티드 또는 단백질의 활성 정도, 농도, 발현량 또는 해당 단백질로부터 생산 또는 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.본 출원에서 용어, "변형 전 균주" 또는 "변형 전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 상기 "변형 전 균주" 또는 "변형 전 미생물"은 "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다. 본 출원에 있어서, 상기 기준 미생물은 OPS를 생산하는 알려진 미생물인 KCCM11212P(한국등록특허 제10-1381048호; 미국공개특허 제2012-0190081호) 및 serA(3-포스포글리세레이트 디하드로제네이즈, D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)와 serC(3-포스포세린 아미노트랜스퍼 레이즈, 3-phosphoserine aminotransferase)의 활성을 강화시킨 OPS 생산 균주인 KCCM11103P(한국 공개특허 제2012-0041115호)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리펩티드 또는 단백질의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드 또는 단백질의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않을 수 있다. 상기 방법은 이로 제한되는 것은 아니나, 유전자 공학 또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있다.
상기 유전자 공학을 이용하여 폴리펩티드 또는 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면,
1) 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가,
2) 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법,
3) 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법,
4) 상기 폴리펩티드 또는 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티스 서열을 변형시키는 방법,
5) 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
6) 상기 방법들의 조합 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 공학을 이용하여 폴리펩티드 또는 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 해당 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있다. 또는, 상기 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드 또는 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로 pCL, pSKH130, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 변이형 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 목적 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드 또는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
상기 2) 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 방법은 구체적으로 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터를 연결시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 프로모터(한국등록특허 제0620092호), lac 프로모터, Trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터 및 tet 프로모터가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드 또는 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 내재적 개시코돈을 상기 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 또는 단백질 발현율이 더 높은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 상기 폴리펩티드 또는 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 상기 유전자를 염색체내로 삽입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 5) 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리펩티드 또는 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드 또는 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드 또는 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
마지막으로, 6) 상기 방법들의 조합은 상기 1) 내지 5) 중 어느 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 재조합 미생물은 상기 mdtH 단백질을 코딩하는 유전자/폴리뉴클레오티드가 도입된 미생물, 상기 mdtH 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수가 증가된 미생물, 상기 mdtH 단백질 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물, 상기 mdtH 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열이 활성이 강력한 서열로 교체된 미생물 또는 상기 mdtH 단백질을 코딩하는 염색체상의 프로모터가 활성이 강력한 프로모터로 교체된 미생물일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 mdtH 단백질을 코딩하는 유전자는 mdtH 유전자일 수 있다. 또한, 상기 mdtH 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 서열번호 1 및 서열번호 2는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다.
본 출원의 특정 서열번호의 아미노산 서열 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩티드는 상기 특정 서열번호의 아미노산 서열 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질/폴리펩티드 또는 상기 특정 서열번호의 아미노산 서열 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진/필수적으로 이루어진(consisting essentially of) 단백질/폴리펩티드일 수 있다. 또한, 본 출원의 특정 서열번호의 염기 서열 또는 특정 서열번호로 기재된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 상기 특정 서열번호의 염기 서열 또는 특정 서열번호로 기재된 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 특정 서열번호의 염기 서열 또는 특정 서열번호로 기재된 염기 서열로 이루어진/필수적으로 이루어진(consisting essentially of) 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 출원의 미생물은 OPS를 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하나, 구체적으로 원핵세포일 수 있다. 일예로 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Seratia) 속, 프로비덴시아(Providencia)속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주를 포함할 수 있으며, 구체적으로 에스케리키아 속 미생물, 보다 구체적으로 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속 미생물의 경우, OPS 및 L-세린을 생산할 수 있음이 알려져 있다(Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, vol 3, 2012 October; Wendisch V F et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):268-74; Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;7 1( l l):7 139-44.).
본 출원의 재조합 미생물은 추가적으로 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것일 수 있다.
상기 SerB는 OPS를 L-세린(L-serine)으로 전환시키는 활성을 지니므로, 상기 SerB 활성이 약화되도록 변이된 미생물은 OPS를 축적하는 특징을 지녀 OPS의 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 SerB는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 SerB는 SerB의 활성을 나타내는 한, 상기 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열과 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다. 또한, 상기 SerB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 3에 기재된 아미노산을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어 질 수 있다. 상기 SerB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이와 동일성이 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상인 염기서열을 포함할 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "내재적 활성에 비해 약화" 는 본래 미생물이 천연의 상태에서 가지고 있는 단백질의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 감소된 것을 의미하며, 활성이 제거된 경우도 포함할 수 있다.
상기 약화는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 변이 등으로 단백질 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질 활성 정도가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 유전자의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및 발현이 되더라도 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다.
이러한 단백질 활성의 약화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 단백질의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소 되도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 변형하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 방법; 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사 되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법; 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균 내 염색체 삽입용 백터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이의 일례로 상동재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다. 또한, 상기에서 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로 1 내지 300개, 바람직하게는 1 내지 100개, 더욱 바람직하게는 1 내지 50개 일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 발현 조절서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로서 열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
또한, 본 출원의 재조합 미생물은 추가적으로 포스포글리세라이트디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA), 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC) 또는 이들의 조합 중 어느 하나의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된 것 일 수 있다.
상기 SerA는 3-포스포글리세라이트(3-phosphoglycerate)를 3-포스포하이드록시피루베이트(3-phospho-hydroxypymvate)로 전환하는 활성을 가지는 단백질이며, 상기 SerC는 3-포스포하이드록시피루베이트를 OPS로 전환하는 활성을 가지는 단백질이다. 따라서, 상기 SerA 또는/및 SerC의 활성이 강화된 미생물은 OPS 생산 균주로서 유용하게 사용될 수 있다.
상기 SerA는 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 5는 야생형 SerA의 서열이며, 서열번호 6은 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체의 서열이다. 또한, 야생형 SerA의 활성 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체의 활성을 나타내는 한, 상기 SerA는 서열번호 5 또는 6으로 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체는 상기 SerA를 코딩하는 유전자에 삽입, 치환 등의 방법으로 변이를 도입하여 세린 혹은 글리신에 의한 피드백 저해로부터 그 활성을 유지하거나, 강화된 경우를 의미하며, 상기 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체는 이미 잘 알려져 있다(Grant GA et al., J. Biol. Chem., 39: 5357-5361, 1999; Grant GA et al., Biochem., 39: 7316-7319, 2000; Grant GA et al., J. Biol. Chem., 276:17844-17850, 2001;Peters-Wendisch P et al., Appl. Microbiol. BiotechnoL, 60:37-441, 2002; 유럽등록특허 EP 0943687 B).
또한, 상기 SerA의 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 5 내지 6에 기재된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어 질 수 있다. 상기 SerA의 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 서열번호 7 또는 8의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 이와 상동성이 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 SerC는 예를 들어서 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, SerC의 활성을 나타내는 한, 상기 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열과 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 더 구체적으로 95% 이상, 보다 더 구체적으로 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 SerC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 9에 기재된 아미노산을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 SerC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 서열번호 10의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이와 상동성이 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상인 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서 용어, "내재적 활성에 비해 강화" 및 강화 방법은 전술한 바와 같다.
또한, 본 출원의 재조합 미생물은 추가로 OPS의 세포 안으로의 유입 또는 분해 능력을 감소시킨 미생물일 수 있다.
상기와 같은 OPS 생산 미생물에 대한 내용은 상기에서 기술된 내용 외에도 한국등록특허 제1381048호 또는 미국공개공보 제2012-0190081호 등에 개시된 내용이 본 출원의 참고자료로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법을 제공한다.
상기 mdtH 단백질, 내재적 활성, 강화, O-포스포세린 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 SerB 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 재조합 미생물의 배양은, 상기 미생물의 세린 요구성이 유도되어 배지에 글리신 또는 세린이 추가로 포함될 수 있다. 글리신은 정제된 글리신, 글리신을 포함하는 이스트 추출물, 트립톤의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 10g/L, 구체적으로 0.5 내지 3g/L일 수 있다. 또한 세린은 정제된 세린, 세린을 함유하는 이스트 추출물, 트립톤 등의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 5g/L, 구체적으로 0.1 내지 1g/L 일 수 있다.
상기 배지에 포함되는 탄소원은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함될 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 인원으로서 인사이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐 함유염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 배지는 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있고, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화학물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리클리콜에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 25℃ 내지 40℃, 구체적으로 30℃ 내지 35℃ 일 수 있다. 배양물의 배양기간은 원하는 유용물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로 10 내지 100 시간일 수 있다. 그러나 이들 예시에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 O-포스포세린의 생산 방법은 본 출원의 mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물 및/또는 상기 재조합 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 O-포스포세린의 생산 방법은 배양된 배지 또는 미생물에서 OPS를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 회수는 배양 방법, 예를 들어서 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 OPS를 분리 및 정제하여 수집함으로써 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 a) mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 O-포스포세린을 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및 b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 포함하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공한다.
본 출원에서 미생물에 사용되는 용어, 특정 단백질을 "포함하는"은 목적하는 특정 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물 내에서 발현되는 상태를 의미한다.
상기 mdtH 단백질, 내재적 활성, 강화, O-포스포세린 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "유도체"는 어떤 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물로서, 대개 화합물 중 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다.
본 출원에서 용어, "시스테인 유도체"는 시스테인의 수소 원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다. 그 예로, 시스테인의 아민기(-NH2)의 질소 원자 또는 티올 기(-SH)의 황 원자에 다른 원자 또는 원자단이 부착된 형태일 수 있으며, 그 예로 NAC(N-acetylcysteine), SCMC(S-Carboxymetylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH,(R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2-Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-cystine, S-(2-Thiazolyl)-L-cysteine, S-(2-Thienyl)-L-cysteine, S-(4-Tolyl)-L-cysteine 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 방법에 따라 시스테인을 생산하기만 한다면, 시스테인 유도체로의 전환은 당업계에 널리 알려진 방법으로 용이하게 다양한 시스테인 유도체로의 전환이 가능할 수 있다.
구체적으로, 상기 시스테인 유도체의 생산 방법은 상기 b) 단계에서 생성된 시스테인을 시스테인 유도체로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 그 예로 시스테인을 아세틸레이션에이젼트(acetylation agent)와 반응시켜 NAC(N-acetylcysteine)를 합성하거나, 시스테인을 염기성 조건에서 할로아세틱에시드(haloacetic acid)와 반응시킴으로써 SCMC(S-Carboxymetylcysteine)를 합성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 시스테인 유도체는 주로 제약원료로서 진해제, 기침 완화제, 기관지염, 기관지 천식과 인후염 등의 치료제로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "O-포스포세린설피드릴라제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)"는 OPS에 티올그룹(thiol, group, SH 기)을 제공하여 상기 OPS를 시스테인으로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 효소는 애로피룸페닉스(Aeropymm pernix), 마이코박테리움투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움스메그마틱스(Mycobacterium smegmatics), 트리코모나스배기날리스(Trichomonas vaginalis)(Mino K and Ishikawa K, FEBSletters, 551:133-138, 2003; Bums K E et al., J. Am. Chem. Soc, 127: 11602-11603, 2005)에서 처음으로 밝혀진 것일 수 있다. 또한, 상기 OPSS는 야생형 OPSS 단백질뿐만 아니라, 상기 OPSS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부 서열이 결실, 치환 또는 부가된 서열로서, 야생형 OPSS 단백질의 생물학적 활성과 동등 또는 그 이상의 활성을 나타내는 변이체 단백질도 포함하며, 대한민국 공개특허 제2012-0041115호 및 대한민국 등록특허 제1208267호에 개시된 OPSS 단백질 및 이의 변이체 단백질도 모두 포함할 수 있다.
상기 황화물은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 고형뿐 아니라, pH, 압력, 용해도의 차이로 인해 액체 또는 기체의 형태로 제공되어 설파이드(sulfide, S2-), 티올설페이트(thiosulfate, S203 2-)등의 형태로 티올그룹(thiol group, SH 기)으로 전환될 수 있는 황화물이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 티올 그룹을 OPS에 제공하는 Na2S, NaSH, H2S, (NH4)2S 또는 Na2S203를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 반응은 하나의 OPS 반응기에 하나의 티올기를 제공하여 하나의 시스테인 또는 시스테인 유도체를 제조하는 반응으로, 상기 반응 시 황화물의 첨가량은 OPS 몰농도의 0.1 내지 3배일 수 있으며, 구체적으로, 1 내지 2배일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 출원에서는 추가로 상기 반응 단계를 통하여 생산된 시스테인을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 당해 분야에 공지된 적합한 반응을 이용하여 반응액으로부터 목적하는 시스테인을 분리 및 정제하여 수집할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물의 O-포스포세린, 시스테인 또는 시스테인의 유도체 생산 용도를 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태로, 본 출원은 mdtH 단백질의 O-포스포세린을 미생물로부터 배출하는 용도를 제공한다.
상기 mdtH 단백질, 내재적 활성, 강화, O-포스포세린, 시스테인, 시스테인의 유도체 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 이용하여, O-포스포세린을 생산하는 경우, 기존 비변형 균주를 이용하는 경우에 비해 고수율의 O-포스포세린 생산이 가능하다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1 : mdtH 막 단백질 동정
OPS의 배출에 관여하는 대장균의 막 단백질을 동정하기 위해 대장균 야생형 균주인 Escherichia coli W3110(ATCC27325)의 게놈 DNA 라이브러리를 이용하여 스크리닝을 수행하였다.
OPS에 의해 대장균의 생육이 저하되는 조건을 셋업(set-up)하기 위해 OPS를 생산하는 기반 균주를 제작하였다. 스크리닝 기반 균주는 W3110에서 내재적 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, serB)의 활성이 약화되도록 변이시킨 OPS 생산 균주로, CA07-0012(KCCM11212P, 한국등록특허 제10-1381048호; 미국공개특허 제2012-0190081호)라고 명명한 균주이다.
CA07-0012를 OPS를 포함하는 배지에서 배양시켜 생육 저하(growth inhibition)를 보이는 최적 스크리닝 조건을 수립하였다. W3110 게놈 라이브러리 플라스미드를 CA07-0012에 전기천공법으로 형질전환 시키고(van der Rest et al. 1999), 과량의 OPS가 첨가된 배지 조건에서 생육 저하가 해제되는 콜로니들을 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 플라스미드를 획득하여 시퀀싱 기법을 통해 염기서열을 분석하였다. 이로부터 과량의 OPS 첨가 조건에서 생육 저하를 해제시키는데 관여하는 대장균 막단백질 2종을 동정하였다.
그 결과, 상기 대장균 막단백질(서열번호 1)을 코딩하는 유전자는 MFS(major facilitator superfamily)에 속하는 mdtH 트랜스포터로 확인되었다.
실시예 2: mdtH 과발현 벡터 제작
OPS에 의한 생육 저하를 해제시키는데 관여하는 mdtH를 OPS 생산 균주에서 각각 강화시켜주었을 경우, OPS 배출능이 향상되는지 확인하기 위하여 각각 유전자의 과발현 벡터를 제작하였다. 또한, 포스포세린 배출자 yhhS를 OPS 생산 균주에 강화시켜 주었을 경우, OPS 농도가 상승하는 것을 확인하였기 때문에(WO 2016/024771 A1), 이를 양성 대조군(positive control)으로 이용하였다. 그리고 mdtH와 동일하게, MFS(major facilitator superfamily)에 속하는 대장균 막단백질 yfaV MFS 트랜스포터 또한 함께 평가하였다. mdtH를 코딩하는 DNA 단편은 W3110 게노믹 DNA을 주형으로 PCR을 통하여 획득하였다(서열번호 2). 각각의 막 단백질 유전자에 대한 과발현 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에서 표기한 바와 같다.
서열번호 서열명 프라이머 유전자 벡터
11 yhhS_ Ptrc_F CGGGGATCCTCTAGACGCTTGCTGCAACTCTCTCA yhhS pCL_Ptrc-yhhS
12 yhhS_ Ptrc_R TACGGGTTCGGGcatGATATCTTTCCTGTGTGAAA
13 yhhS_F CACAGGAAAGATATCatgCCCGAACCCGTAGCCGA
14 yhhS_R GATTACGCCAAGCTTttaAGATGATGAGGCGGCCT
15 mdtH_ Ptrc_F CGGGGATCCTCTAGACGCTTGCTGCAACTCTCTCA mdtH pCL_Ptrc-mdtH
16 mdtH_ Ptrc_R CGACACGCGGGAcatGATATCTTTCCTGTGTGAAA
17 mdtH_F CACAGGAAAGATATCatgTCCCGCGTGTCGCAGGC
18 mdtH_R GATTACGCCAAGCTTtcaGGCGTCGCGTTCAAGCA
19 yfaV_ Ptrc_F CGGGGATCCTCTAGACGCTTGCTGCAACTCTCTCA yfaV pCL_Ptrc-yfaV
20 yfaV_ Ptrc_R CAAAGCGGTGCTcatGATATCTTTCCTGTGTGAAA
21 yfaV_F CACAGGAAAGATATCatgAGCACCGCTTTGCTTGA
22 yfaV_R GATTACGCCAAGCTTttaATGATGTGCCACGTCGG
pCL_Ptrc-yhhS를 제작하기 위해 주형으로 pCL_Ptrc-gfp(WO 2016/024771 A1)을 사용하고 서열번호 11 및 서열번호 12를 이용하여 PCR을 진행하여 Ptrc DNA 단편을 수득하였다. yhhS DNA 단편은 W3110를 주형으로 사용하여 서열번호 13 및 서열번호 14로 PCR을 진행하여 수득하였다. 증폭된 단편은 XbaI과 HindIII로 제한효소 처리된 pCL1920 벡터와 IST를 진행하여 pCL_Ptrc-yhhS를 확보하였다. IST(DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝하는 방법을 의미하며, 이하에서 계속적으로 IST로 표기하였다.
pCL_Ptrc-mdtH도 pCL_Ptrc-gfp를 주형으로 사용하되, 서열번호 15 및 서열번호 16을 이용하여 Ptrc DNA 단편을 확보하였다. W3110를 주형으로 서열번호 17 및 서열번호 18를 이용하여 mdtH DNA 단편을 확보하였고, pCL_Ptrc-yhhS와 동일하게 IST를 통해서 pCL_Ptrc-mdtH를 제작하였다.
pCL_Ptrc-yfaV도 상기 두 가지 플라즈미드를 제작했던 방법과 동일하게 클로닝하였으며, Ptrc DNA 단편은 pCL_Ptrc-gfp를, yfaV DNA 단편은 W3110를 주형으로 하여 확보하였다. 프라이머는 Ptrc는 서열번호 19 및 서열번호 20을 사용하였고, yfaV는 서열번호 21 및 서열번호 22를 이용하여 PCR을 진행하였다.
실시예 3: mdtH MFS 트랜스포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
3-1. CA07-0012를 이용한 mdtH MFS 트랜트포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
실시예 2에서 제작된 3종의 플라스미를 각각 OPS 생산주인 CA07-0012에 도입한 균주를 제작하여 OPS의 생산능을 평가하였다.
각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후, 33도 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 하기 표 2의 25ml 역가 배지에 접종한 다음, 이를 33도, 200rpm의 배양기에서 48시간 배양하였으며, 이의 OPS 생산능을 표 3에 나타내었다.
배지성분 조제량
포도당 40g
KH2PO4(KP1) 6g
(NH4)2SO4 17g
MgSO4.7H2O 1g
MnSO4.4H2O 5mg
FeSO4.7H2O 10mg
L-글리신 2.5g/L
호모액기스 3g/L
CaCO3 30g/L
pH 6.8
균주명 OD562nm 소모당(g/L) O-포스포세린(g/L)
CA07-0012/pCL1920 50.6 40 1.3
CA07-0012/pCL_Ptrc-yhhS 45.1 40 2.3
CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH 38.2 40 2.4
CA07-0012/pCL_Ptrc-yfaV 39.5 40 1.3
상기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 대장균 유래의 CA07-0012 균주에 대장균 막 단백질 유전자를 추가로 도입한 경우 중, yhhS와 mdtH 강화주의 경우 OPS의 생산량이 CA07-0012에 비하여 증가한 결과를 나타내었고, 특히 본 출원의 mdtH 강화주의 경우 OPS 농도가 2배값에 가깝게 상승하는 것을 확인하였다. 반면, 비교군인 yfaV 강화주의 경우에는 OPS의 생산량을 증가시키지 못하는 결과를 나타내었다.
상기 CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH는 CA07-0354로 명명하였다. CA07-0354균주는 부다페스트 조약 하에 한국미생물센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2020년 8월 28일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM 12781P를 부여받았다.
3-2. serA 및 serC 강화 균주를 이용한 mdtH MFS 트랜스포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
OPS 생합성 경로인 serA(3-포스포글리세레이트 디하드로제네이즈, D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)와 serC(3-포스포세린 아미노트랜스퍼 레이즈, 3-phosphoserine aminotransferase)의 활성을 강화시켜 OPS 생산능이 증가된 OPS 생산 균주인 CA07-0022(KCCM11103P, 한국 공개특허 제2012-0041115호)를 이용하여 상기의 대장균 막 단백질 유전자의 효과를 파악하기 위해, serA, serC와 함께 막단백질 유전자에 대한 과발현 벡터를 제작하였다. 사용한 프라이머 서열은 하기 표 4에서 표기한 바와 같다.
서열번호 서열명 프라이머 유전자 벡터
23 serA*,serC_ Ptrc_F CGGGGATCCTCTAGAGGTACCCGCTTGCTGCAACT serA*,serC pCL_Ptrc-
serA*C
24 serA*,serC_ Ptrc_R CGATACCTTTGCCATGATATCTTTCCTGTGTGAAA
25 serA*,serC_F CACAGGAAAGATATCATGGCAAAGGTATCGCTGGA
26 serA*,serC_R GATTACGCCAAGCTTTTAACCGTGACGGCGTTCGA
27 serA*,serC,yhhS_ Ptrc-yhhS_F CACGGTTAAAAGCTTCGCTTGCTGCAACTCTCTCA serA*,serC,yhhS pCL_Ptrc-serA*C_
Ptrc-yhhS
28 serA*,serC,yhhS_ Ptrc-yhhS_R GATTACGCCAAGCTTttaAGATGATGAGGCGGCCT
29 serA*,serC,mdtH_ Ptrc-mdtH_F CACGGTTAAAAGCTTCGCTTGCTGCAACTCTCTCA serA*,serC,mdtH pCL_Ptrc-serA*C_
Ptrc-mdtH
30 serA*,serC,mdtH_ Ptrc-mdtH_R GATTACGCCAAGCTTtcaGGCGTCGCGTTCAAGCA
31 serA*,serC,mdtH_ Ptrc-yfaV_F CACGGTTAAAAGCTTCGCTTGCTGCAACTCTCTCA serA*,serC,yfaV pCL_Ptrc-serA*C_
Ptrc-yfaV
32 serA*,serC,mdtH_ Ptrc-yfaV_R GATTACGCCAAGCTTttaATGATGTGCCACGTCGG
우선, serA와 serC가 도입된 음성 대조군 플라즈미드를 제작하기 위해서 pCL_Ptrc-serA*C를 제작하였다. 서열번호 23 및 서열번호 24를 이용하고 주형을 pCL_Ptrc-gfp로 하여 Ptrc DNA 단편을 확보하였다. pC_Prmf-serA*C(WO 2016/024771 A1)을 주형으로 하고 서열번호 25 및 서열번호 26을 이용하여 PCR을 진행하여 serA*C DNA 단편을 확보하였다. 증폭된 단편은 XbaI과 HindIII로 제한효소 처리된 pCL1920 벡터와 IST를 진행하여 pCL_Ptrc-serA*C를 확보하였다.
pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS 제작을 위해서 서열번호 27 및 서열번호 28를 사용하고, 주형으로 상위에 제작된pCL_Ptrc-yhhS 사용하여 PCR를 진행하였다. 이로부터 Ptrc-yhhS DNA 단편을 확보하였다. 증폭된 단편은 HindIII로 제한효소 처리된 pCL_Ptrc-serA*C 벡터와 IST를 진행하여 pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS를 확보하였다.
pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-mdtH와 pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yfaV도 pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS와 동일한 방법으로 벡터를 제작하였다. 서열번호 29 및 서열번호 30를 이용하여 pCL_Ptrc-mdtH를 주형으로 하여 Ptrc-mdtH DNA 단편을 확보하였고, 서열번호 31 및 서열번호 32를 이용하여 pCL_Ptrc-yfaV를 주형으로 하여 Ptrc-yfaV DNA 단편을 확보하였다.
OPS 생산 균주인 CA07-0022에 상기 제작된 플라즈미드를 도입하여 OPS 생산능을 확인하였고 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
균주명 OD562nm 소모당(g/L) O-포스포세린(g/L)
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C(serA*(G336V)-(RBS)serC 45.0 40 3.5
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS 35.1 40 7.6
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-mdtH 30.0 40 7.8
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yfaV 25.9 40 3.2
상기 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 대장균 유래의 CA07-0012 균주보다 OPS 생산능이 향상된 CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C에 대장균 막 단백질 유전자를 추가로 도입한 균주 중, 양성 대조군인 yhhS 강화주의 경우 OPS의 생산량이 대조군 대비 증가하는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다. 특히, 본 출원에 따른 mdtH 강화주의 경우 상기 표 3의 결과와 유사하게 OPS 농도가 상승하는 결과를 나타내었다. 반면, 비교군인 yfaV 강화군의 경우에는 대조군 대비 OPS 생산량이 감소한 결과를 나타내었다.
3-3. 염색체상 프로모터 세기에 따른 mdtH 트랜트포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
염색체상에서 mdtH의 프로모터를 더 강한 프로모터로 바꿔주었을 경우, 배출능이 향상되는지 확인해보기 위해 자가 프로모터가 trc 프로모터로 치환된 균주를 제작하여 O-포스포세린의 생산능을 평가하였다. trc 프로모터를 대장균의 염색체에 도입하는 방법은 통상적으로 이용되는 하기의 방법으로 제작하였다. 염색체상 삽입을 위해서 PI 단백질(pir 유전자)에 의존성을 가지는 R6K 리플리콘(replicon)을 가지고 있으며, sacB(레반수크라아제, Levansucrase) 유전자가 도입되어 있는 pSKH130 벡터를 이용하였다. 또한 상기 벡터는 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자를 포함하고 있으며, 이는 균주 제작의 선택 마커로 사용되었다. 상기 벡터를 이용한 1차 교차에서 R6K 및 카나마이신을 이용하여 원하는 균주를 확보한 후, 수크로스(sucrose)가 있는 배지에서 항생제를 제거하는 작업을 진행하여 균주를 제작하였다. CA07-0022에서 mdtH의 프로모터를 trc로 교체하기 위해서 pSKH130_Ptrc-mdtH 벡터를 제작하였고, 사용한 프라이머 염기서열은 하기 표 6에 나타내었다.
서열번호 서열명 프라이머 유전자 벡터
33 mdtHUP_F CAGGAATTCGATATCTAATCTCTTTTTCGTCCGGG mdtH pSKH130_mdtHUP_Ptrc-mdtH
34 mdtHUP_R GAGTTGCAGCAAGCGTTCCCCTCCCGGGAAATAAA
35 Ptrc-mdtH_F TTCCCGGGAGGGGAACGCTTGCTGCAACTCTCTCA
36 Ptrc-mdtH_R GACTAGCGTGATATCCAGACCAGGCGAAAGTCGTA
37 Ptrc-mdtH_conf_F CACCGCTGCGTTTATTGT
38 Ptrc-mdtH_conf_R AAACGCTTGTCACGCATCA
pSKH130_Ptrc-mdtH를 제작하기 위해 주형으로 W3110를 사용하되, 서열번호 33 및 서열번호 34로 PCR를 진행하여 mdtHUP DNA 단편을 확보하였다. 서열번호 35 및 서열번호 36를 이용하고, 주형으로는 상기에 제작된 pCL_Ptrc-mdtH로 PCR을 진행하여 Ptrc-mdtH의 DNA 단편을 확보하였다. 증폭된 단편들은 EcoRV로 제한효소 처리된 pSKH130 벡터와 IST를 진행하여 pSKH_mdtHUP_Ptrc-mdtH를 확보하였다. 확보된 플라즈미드는 CA7-0022 균주에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 재조합(교차)에 의해 카나마이신이 있는 LB 고체배지에서 염색체에 도입된 균주가 선택된 후, 수크로스가 있는 배지에서 2차 재조합(교체)을 통해 염색체로부터 플라스미드 부위의 절제가 일어났다. 상기 2차 재조합이 완료된 균주는 서열번호 37 및 서열번호 38의 프라이머를 이용하여 확보되었다(CA07-0022::Ptrc-mdtH).
제작된 OPS 생산 균주의 효과를 파악하고자 하였고, OPS 생산능을 하기 표 7에 나타내었다.
균주명 OD562nm 소모당(g/L) O-포스포세린(g/L)
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C 42.4 40 3.5
CA07-0022::Ptrc-mdtH/pCL_Ptrc-serA*C 38.2 40 4.0
그 결과, 상기 표 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 프로모터를 강화하여 대장균 막 단백질의 발현을 증가시켰을 경우, 대조군 대비 OPS 농도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 3-포스포글리세라이트(3-phosphoglycerate) 배출 비교
OPS는 포스페이트(phosphate)를 포함하고 있는 물질로 화학 구조적으로 3-포스포글리세라이트(3-phosphoglycerate, 이하 3PG로 표기)와 유사한 형태를 가지고 있으므로, OPS 배출자가 3PG를 배출할 수도 있다고 가정하고, OPS 배출자가 강화된 균주에서 3PG 생산능을 함께 측정하였다. 3PG는 HPLC(high performance liquid chromatography) 기기를 이용하여 측정하였으며, 3PG 생산능을 표 8에 나타내었다.
균주명 OD562nm OPS(g/L) 3PG(g/L)
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C 45.0 3.5 0.2
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS 35.1 7.6 2.6
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-mdtH 30.0 7.8 0.3
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yfaV 25.9 3.2 0.3
상기 표 8에서 볼 수 있는 바와 같이, yhhS 강화 균주에서는 3PG가 축적되는 결과를 보였으나, mdtH 막단백질이 강화된 균주에서는 3PG가 증가하지 않는 결과를 확인할 수 있었다. 즉, mdtH가 도입된 균주는 OPS 배출능이 증가되었으며, 또한 OPS 특이적 배출능이 증가된 것으로 나타났다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12781P 20200828
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel O-phosphoserine exhaust proteins and methods for producing O-phosphoserine, cysteine and derivatives thereof using the same <130> KPA191340-KR <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 402 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> mdtH <400> 1 Met Ser Arg Val Ser Gln Ala Arg Asn Leu Gly Lys Tyr Phe Leu Leu 1 5 10 15 Ile Asp Asn Met Leu Val Val Leu Gly Phe Phe Val Val Phe Pro Leu 20 25 30 Ile Ser Ile Arg Phe Val Asp Gln Met Gly Trp Ala Ala Val Met Val 35 40 45 Gly Ile Ala Leu Gly Leu Arg Gln Phe Ile Gln Gln Gly Leu Gly Ile 50 55 60 Phe Gly Gly Ala Ile Ala Asp Arg Phe Gly Ala Lys Pro Met Ile Val 65 70 75 80 Thr Gly Met Leu Met Arg Ala Ala Gly Phe Ala Thr Met Gly Ile Ala 85 90 95 His Glu Pro Trp Leu Leu Trp Phe Ser Cys Leu Leu Ser Gly Leu Gly 100 105 110 Gly Thr Leu Phe Asp Pro Pro Arg Ser Ala Leu Val Val Lys Leu Ile 115 120 125 Arg Pro Gln Gln Arg Gly Arg Phe Phe Ser Leu Leu Met Met Gln Asp 130 135 140 Ser Ala Gly Ala Val Ile Gly Ala Leu Leu Gly Ser Trp Leu Leu Gln 145 150 155 160 Tyr Asp Phe Arg Leu Val Cys Ala Thr Gly Ala Val Leu Phe Val Leu 165 170 175 Cys Ala Ala Phe Asn Ala Trp Leu Leu Pro Ala Trp Lys Leu Ser Thr 180 185 190 Val Arg Thr Pro Val Arg Glu Gly Met Thr Arg Val Met Arg Asp Lys 195 200 205 Arg Phe Val Thr Tyr Val Leu Thr Leu Ala Gly Tyr Tyr Met Leu Ala 210 215 220 Val Gln Val Met Leu Met Leu Pro Ile Met Val Asn Asp Val Ala Gly 225 230 235 240 Ala Pro Ser Ala Val Lys Trp Met Tyr Ala Ile Glu Ala Cys Leu Ser 245 250 255 Leu Thr Leu Leu Tyr Pro Ile Ala Arg Trp Ser Glu Lys His Phe Arg 260 265 270 Leu Glu His Arg Leu Met Ala Gly Leu Leu Ile Met Ser Leu Ser Met 275 280 285 Met Pro Val Gly Met Val Ser Gly Leu Gln Gln Leu Phe Thr Leu Ile 290 295 300 Cys Leu Phe Tyr Ile Gly Ser Ile Ile Ala Glu Pro Ala Arg Glu Thr 305 310 315 320 Leu Ser Ala Ser Leu Ala Asp Ala Arg Ala Arg Gly Ser Tyr Met Gly 325 330 335 Phe Ser Arg Leu Gly Leu Ala Ile Gly Gly Ala Ile Gly Tyr Ile Gly 340 345 350 Gly Gly Trp Leu Phe Asp Leu Gly Lys Ser Ala His Gln Pro Glu Leu 355 360 365 Pro Trp Met Met Leu Gly Ile Ile Gly Ile Phe Thr Phe Leu Ala Leu 370 375 380 Gly Trp Gln Phe Ser Gln Lys Arg Ala Ala Arg Arg Leu Leu Glu Arg 385 390 395 400 Asp Ala <210> 2 <211> 1209 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mdtH <400> 2 atgtcccgcg tgtcgcaggc gaggaacctg ggtaaatatt tcctgctcat cgataatatg 60 ctggtcgtgc tggggttctt tgttgtcttc ccgctgatct ctatccgctt cgttgatcaa 120 atgggctggg ccgccgtcat ggtcggtatt gctctcggtc tacgccaatt tattcagcaa 180 ggtctgggta ttttcggcgg tgcaattgcc gaccgctttg gtgccaaacc gatgattgtt 240 accggtatgc tgatgcgcgc cgccggattc gccacaatgg gtatcgccca cgaaccgtgg 300 ctattgtggt tttcatgcct gctctcggga ctcggtggca cgttgtttga tccgccgcgt 360 tcggcgctgg tggtgaaatt aatccgtcca cagcagcgtg gtcgtttttt ctcgctgttg 420 atgatgcagg acagtgccgg tgcggtcatt ggcgcattgt tggggagctg gctgttgcaa 480 tacgactttc gcctggtctg cgccacaggg gcagttctat ttgtgctatg tgcggcgttc 540 aatgcgtggt tgttaccagc atggaaactc tccaccgtac gcacgcccgt tcgcgaaggc 600 atgacccgcg tgatgcgtga caagcgtttt gtcacctatg ttctgacgct ggcgggttac 660 tacatgctgg ctgtacaagt gatgctgatg ctgccaatta tggtcaacga cgtggctggc 720 gcgccctctg ccgttaaatg gatgtatgcc attgaagcgt gtctgtcgtt aacgttgctc 780 taccctatcg cccgctggag tgaaaagcat tttcgtctgg aacaccggtt gatggctggg 840 ctgttgataa tgtcattaag catgatgccg gtgggcatgg tcagcggcct gcaacaactt 900 ttcaccctga tttgtctgtt ttatatcggg tcgatcattg ccgagcctgc gcgtgaaacc 960 ttaagtgctt cgctggcgga cgcaagagct cgcggcagct atatggggtt tagccgtctg 1020 ggtctggcga ttggcggcgc tattggttat atcggtggcg gctggctgtt tgacctgggc 1080 aaatcggcgc accagccaga gcttccgtgg atgatgctgg gcattattgg catcttcact 1140 ttccttgcgc tgggttggca gtttagccag aaacgcgccg cgcgtcgttt gcttgaacgc 1200 gacgcctga 1209 <210> 3 <211> 322 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> serB <400> 3 Met Pro Asn Ile Thr Trp Cys Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Leu Trp 1 5 10 15 Pro Gly Leu Pro Leu Ser Leu Ser Gly Asp Glu Val Met Pro Leu Asp 20 25 30 Tyr His Ala Gly Arg Ser Gly Trp Leu Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Asp 35 40 45 Lys Gln Arg Leu Thr Gln Tyr Gln Ser Lys Leu Gly Ala Ala Met Val 50 55 60 Ile Val Ala Ala Trp Cys Val Glu Asp Tyr Gln Val Ile Arg Leu Ala 65 70 75 80 Gly Ser Leu Thr Ala Arg Ala Thr Arg Leu Ala His Glu Ala Gln Leu 85 90 95 Asp Val Ala Pro Leu Gly Lys Ile Pro His Leu Arg Thr Pro Gly Leu 100 105 110 Leu Val Met Asp Met Asp Ser Thr Ala Ile Gln Ile Glu Cys Ile Asp 115 120 125 Glu Ile Ala Lys Leu Ala Gly Thr Gly Glu Met Val Ala Glu Val Thr 130 135 140 Glu Arg Ala Met Arg Gly Glu Leu Asp Phe Thr Ala Ser Leu Arg Ser 145 150 155 160 Arg Val Ala Thr Leu Lys Gly Ala Asp Ala Asn Ile Leu Gln Gln Val 165 170 175 Arg Glu Asn Leu Pro Leu Met Pro Gly Leu Thr Gln Leu Val Leu Lys 180 185 190 Leu Glu Thr Leu Gly Trp Lys Val Ala Ile Ala Ser Gly Gly Phe Thr 195 200 205 Phe Phe Ala Glu Tyr Leu Arg Asp Lys Leu Arg Leu Thr Ala Val Val 210 215 220 Ala Asn Glu Leu Glu Ile Met Asp Gly Lys Phe Thr Gly Asn Val Ile 225 230 235 240 Gly Asp Ile Val Asp Ala Gln Tyr Lys Ala Lys Thr Leu Thr Arg Leu 245 250 255 Ala Gln Glu Tyr Glu Ile Pro Leu Ala Gln Thr Val Ala Ile Gly Asp 260 265 270 Gly Ala Asn Asp Leu Pro Met Ile Lys Ala Ala Gly Leu Gly Ile Ala 275 280 285 Tyr His Ala Lys Pro Lys Val Asn Glu Lys Ala Glu Val Thr Ile Arg 290 295 300 His Ala Asp Leu Met Gly Val Phe Cys Ile Leu Ser Gly Ser Leu Asn 305 310 315 320 Gln Lys <210> 4 <211> 969 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> serB <400> 4 atgcctaaca ttacctggtg cgacctgcct gaagatgtct ctttatggcc gggtctgcct 60 ctttcattaa gtggtgatga agtgatgcca ctggattacc acgcaggtcg tagcggctgg 120 ctgctgtatg gtcgtgggct ggataaacaa cgtctgaccc aataccagag caaactgggt 180 gcggcgatgg tgattgttgc cgcctggtgc gtggaagatt atcaggtgat tcgtctggca 240 ggttcactca ccgcacgggc tacacgcctg gcccacgaag cgcagctgga tgtcgccccg 300 ctggggaaaa tcccgcacct gcgcacgccg ggtttgctgg tgatggatat ggactccacc 360 gccatccaga ttgaatgtat tgatgaaatt gccaaactgg ccggaacggg cgagatggtg 420 gcggaagtaa ccgaacgggc gatgcgcggc gaactcgatt ttaccgccag cctgcgcagc 480 cgtgtggcga cgctgaaagg cgctgacgcc aatattctgc aacaggtgcg tgaaaatctg 540 ccgctgatgc caggcttaac gcaactggtg ctcaagctgg aaacgctggg ctggaaagtg 600 gcgattgcct ccggcggctt tactttcttt gctgaatacc tgcgcgacaa gctgcgcctg 660 accgccgtgg tagccaatga actggagatc atggacggta aatttaccgg caatgtgatc 720 ggcgacatcg tagacgcgca gtacaaagcg aaaactctga ctcgcctcgc gcaggagtat 780 gaaatcccgc tggcgcagac cgtggcgatt ggcgatggag ccaatgacct gccgatgatc 840 aaagcggcag ggctggggat tgcctaccat gccaagccaa aagtgaatga aaaggcggaa 900 gtcaccatcc gtcacgctga cctgatgggg gtattctgca tcctctcagg cagcctgaat 960 cagaagtaa 969 <210> 5 <211> 410 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> SerA wild type <400> 5 Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val 1 5 10 15 Glu Gly Val His Gln Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Gly Tyr 20 25 30 Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu Gln Leu Lys 35 40 45 Glu Ser Ile Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Leu Arg Ser Arg Thr His 50 55 60 Leu Thr Glu Asp Val Ile Asn Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Ile Gly 65 70 75 80 Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Lys 85 90 95 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Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser 305 310 315 320 Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu His Gly 325 330 335 Gly Arg Arg Leu Met His Ile His Glu Asn Arg Pro Gly Val Leu Thr 340 345 350 Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu Gln Gly Val Asn Ile Ala Ala Gln 355 360 365 Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Gln Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu 370 375 380 Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Ala Met Lys Ala Ile 385 390 395 400 Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr 405 410 <210> 6 <211> 410 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SerA mutant type <400> 6 Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val 1 5 10 15 Glu Gly Val His Gln Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Gly Tyr 20 25 30 Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu Gln Leu Lys 35 40 45 Glu Ser Ile Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Leu Arg Ser Arg Thr His 50 55 60 Leu Thr Glu Asp Val Ile Asn Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Ile Gly 65 70 75 80 Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Lys 85 90 95 Arg Gly Ile Pro Val Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val 100 105 110 Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Val Pro 115 120 125 Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu Ala Ala 130 135 140 Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly 145 150 155 160 His Ile Gly Thr Gln Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr 165 170 175 Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Thr 180 185 190 Gln Val Gln His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser 195 200 205 Leu His Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys 210 215 220 Glu Ile Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg 225 230 235 240 Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser Lys 245 250 255 His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro Ala Thr 260 265 270 Asn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp Asn Val Leu 275 280 285 Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gln Glu Ala Gln Glu Asn Ile 290 295 300 Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser 305 310 315 320 Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu His Val 325 330 335 Gly Arg Arg Leu Met His Ile His Glu Asn Arg Pro Gly Val Leu Thr 340 345 350 Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu Gln Gly Val Asn Ile Ala Ala Gln 355 360 365 Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Gln Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu 370 375 380 Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Ala Met Lys Ala Ile 385 390 395 400 Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr 405 410 <210> 7 <211> 1233 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> SerA wild type <400> 7 atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60 caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120 gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180 tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240 tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300 gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360 ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420 aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480 catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540 gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600 ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660 atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa tgcttcgcgc 720 ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780 gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840 ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900 caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960 acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacggtgg gcgtcgtctg 1020 atgcacatcc acgaaaaccg tccgggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgccgag 1080 cagggcgtca acatcgccgc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140 attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200 ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233 <210> 8 <211> 1233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SerA mutant type <400> 8 atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60 caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120 gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180 tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240 tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300 gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360 ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420 aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480 catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540 gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600 ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660 atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa 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Ile Asp Asn Ser Asp Phe Tyr Arg Asn 275 280 285 Asp Val Ala Lys Ala Asn Arg Ser Arg Met Asn Val Pro Phe Gln Leu 290 295 300 Ala Asp Ser Ala Leu Asp Lys Leu Phe Leu Glu Glu Ser Phe Ala Ala 305 310 315 320 Gly Leu His Ala Leu Lys Gly His Arg Val Val Gly Gly Met Arg Ala 325 330 335 Ser Ile Tyr Asn Ala Met Pro Leu Glu Gly Val Lys Ala Leu Thr Asp 340 345 350 Phe Met Val Glu Phe Glu Arg Arg His Gly 355 360 <210> 10 <211> 1089 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> SerC <400> 10 atggctcaaa tcttcaattt tagttctggt ccggcaatgc taccggcaga ggtgcttaaa 60 caggctcaac aggaactgcg cgactggaac ggtcttggta cgtcggtgat ggaagtgagt 120 caccgtggca aagagttcat tcaggttgca gaggaagccg agaaggattt tcgcgatctt 180 cttaatgtcc cctccaacta caaggtatta ttctgccatg gcggtggtcg cggtcagttt 240 gctgcggtac cgctgaatat tctcggtgat aaaaccaccg cagattatgt tgatgccggt 300 tactgggcgg caagtgccat taaagaagcg aaaaaatact gcacgcctaa tgtctttgac 360 gccaaagtga ctgttgatgg tctgcgcgcg gttaagccaa tgcgtgaatg gcaactctct 420 gataatgctg cttatatgca ttattgcccg aatgaaacca tcgatggtat cgccatcgac 480 gaaacgccag acttcggcgc agatgtggtg gtcgccgctg acttctcttc aaccattctt 540 tcccgtccga ttgacgtcag ccgttatggt gtaatttacg ctggcgcgca gaaaaatatc 600 ggcccggctg gcctgacaat cgtcatcgtt cgtgaagatt tgctgggcaa agcgaatatc 660 gcgtgtccgt cgattctgga ttattccatc ctcaacgata acggctccat gtttaacacg 720 ccgccgacat ttgcctggta tctatctggt ctggtcttta aatggctgaa agcgaacggc 780 ggtgtagctg aaatggataa aatcaatcag caaaaagcag aactgctata tggggtgatt 840 gataacagcg atttctaccg caatgacgtg gcgaaagcta accgttcgcg gatgaacgtg 900 ccgttccagt tggcggacag tgcgcttgac aaattgttcc ttgaagagtc ttttgctgct 960 ggccttcatg cactgaaagg tcaccgtgtg gtcggcggaa tgcgcgcttc tatttataac 1020 gccatgccgc tggaaggcgt taaagcgctg acagacttca tggttgagtt cgaacgccgt 1080 cacggttaa 1089 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yhhS_Ptrc_F <400> 11 cggggatcct ctagacgctt gctgcaactc tctca 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yhhS_Ptrc_R <400> 12 tacgggttcg ggcatgatat ctttcctgtg tgaaa 35 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yhhS_F <400> 13 cacaggaaag atatcatgcc cgaacccgta gccga 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yhhS_R <400> 14 gattacgcca agcttttaag atgatgaggc ggcct 35 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mdtH_Ptrc_F <400> 15 cggggatcct ctagacgctt gctgcaactc tctca 35 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mdtH_Ptrc_R <400> 16 cgacacgcgg gacatgatat ctttcctgtg tgaaa 35 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mdtH_F <400> 17 cacaggaaag atatcatgtc ccgcgtgtcg caggc 35 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mdtH_R <400> 18 gattacgcca agctttcagg cgtcgcgttc aagca 35 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yfaV_Ptrc_F <400> 19 cggggatcct ctagacgctt gctgcaactc tctca 35 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yfaV_Ptrc_R <400> 20 caaagcggtg ctcatgatat ctttcctgtg tgaaa 35 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yfaV_F <400> 21 cacaggaaag atatcatgag caccgctttg cttga 35 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yfaV_R <400> 22 gattacgcca agcttttaat gatgtgccac gtcgg 35 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serA*,serC_Ptrc_F <400> 23 cggggatcct ctagaggtac ccgcttgctg caact 35 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serA*,serC_Ptrc_R <400> 24 cgataccttt gccatgatat ctttcctgtg tgaaa 35 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serA*,serC_F <400> 25 cacaggaaag atatcatggc aaaggtatcg ctgga 35 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serA*,serC_R <400> 26 gattacgcca agcttttaac cgtgacggcg ttcga 35 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serA*,serC,yhhS_Ptrc-yhhS_F <400> 27 cacggttaaa agcttcgctt gctgcaactc tctca 35 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serA*,serC,yhhS_Ptrc-yhhS_R <400> 28 gattacgcca agcttttaag atgatgaggc ggcct 35 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serA*,serC,mdtH_Ptrc-mdtH_F <400> 29 cacggttaaa agcttcgctt gctgcaactc tctca 35 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serA*,serC,mdtH_Ptrc-mdtH_R <400> 30 gattacgcca agctttcagg cgtcgcgttc aagca 35 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serA*,serC,mdtH_Ptrc-yfaV_F <400> 31 cacggttaaa agcttcgctt gctgcaactc tctca 35 <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serA*,serC,mdtH_Ptrc-yfaV_R <400> 32 gattacgcca agcttttaat gatgtgccac gtcgg 35 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mdtHUP_F <400> 33 caggaattcg atatctaatc tctttttcgt ccggg 35 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mdtHUP_R <400> 34 gagttgcagc aagcgttccc ctcccgggaa ataaa 35 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptrc-mdtH_F <400> 35 ttcccgggag gggaacgctt gctgcaactc tctca 35 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptrc-mdtH_R <400> 36 gactagcgtg atatccagac caggcgaaag tcgta 35 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptrc-mdtH_conf_F <400> 37 caccgctgcg tttattgt 18 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptrc-mdtH_conf_R <400> 38 aaacgcttgt cacgcatca 19

Claims (11)

  1. mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, O-포스포세린 생산 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 O-포스포세린 배출 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 mdtH 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 O-포스포세린 배출 활성을 가지면서 상기 서열번호 1과 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된, 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 포스포글리세라이트 디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA), 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC) 또는 이의 조합 중 어느 하나의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된, 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 에스케리키아 속(the genus of Escherichia)인, 미생물.
  7. mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 방법은 배양된 배지 또는 미생물에서 O-포스포세린을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법.
  9. a) mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 O-포스포세린을 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및
    b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 포함하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인의 생산 방법.
  10. 제9항의 생산 방법으로 시스테인을 생산하는 단계; 및
    상기 생산된 시스테인을 시스테인 유도체로 전환시키는 단계를 포함하는, 시스테인 유도체의 생산 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 황화물은 Na2S, NaSH, (NH4)2S, H2S 및 Na2S2O3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 시스테인의 생산 방법.
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