TWI817193B - 新穎o-磷絲胺酸輸出蛋白及使用其生產o-磷絲胺酸、半胱胺酸及其衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明是有關於新穎
O-磷絲胺酸輸出蛋白，以及使用其生產
O-磷絲胺酸、半胱胺酸及半胱胺酸衍生物的方法。
Description
本發明是有關於O-磷絲胺酸輸出蛋白(export protein)，以及使用其生產O-磷絲胺酸、半胱胺酸及半胱胺酸衍生物的方法。
左旋半胱胺酸(L-Cysteine)係在所有活體生物中之硫代謝(sulfur metabolism)扮演重要角色的胺基酸，不僅用於生物蛋白諸如頭髮角蛋白等、麩胱甘肽(glutathione)、生物素、甲硫胺酸及其他含硫代謝物的合成中，亦使用作為輔酶A之生物合成的前驅物。
本技術領域中已知之使用微生物生產左旋半胱胺酸的方法包括：1)使用微生物將D,L-2-胺基-2-噻唑啉-4-羧酸(D,L-2-amino-2-thiazoline-4-carboxylic acid，D,L-ATC)生物性地(biologically)轉化成左旋半胱胺酸的方法、2)使用大腸桿菌(E.coli)藉由直接發酵法生產左旋半胱胺酸的方法(EP 0885962 B；Wada M and Takagi H,Appl.Microbiol.Biochem.,73：48-54,2006)及3)使用微生物藉由發酵作用生產O-磷絲胺酸(O-phosphoserine，此後
稱為「OPS」)，且接著藉由使O-磷絲胺酸與硫化物在O-磷絲胺酸巰基化酶(O-phosphoserine sulfhydrylase，此後稱為「OPSS」)之催化作用下反應而將O-磷絲胺酸轉化成左旋半胱胺酸的方法(歐洲發明專利第2444481號)。
特別是，為了在高產率下藉由方法3)生產半胱胺酸，OPS，該前驅物，需在過量(excess amount)下被生產。
在這些情形下，本發明之發明人等已進行深入研究以辨識能夠平順地將在生產OPS之菌株中所生產之O-磷絲氨酸輸出至細胞外且增加OPS生產的合適的輸出參數。結果，他們研發出一種新穎的OPS輸出蛋白，藉此完成本發明。
本發明的一個目的是提供一種用於生產O-磷絲胺酸的重組微生物，其中與其內生活性(endogenous activity)相比，mdtH蛋白的活性被增強。
本發明的另一個目的是提供使用本發明之用於生產O-磷絲胺酸的重組微生物生產O-磷絲胺酸的方法。
本發明的再另一個目的是提供使用本發明之用於生產O-磷絲胺酸的重組微生物生產半胱胺酸或其衍生物的方法。
本發明將於以下內容中被詳細敘述。同時，此處所揭露的各說明內容及實施例可分別被應用於其他說明內容及實施例。也就是說，此處所揭露之
各種元件的所有組合落於本發明的範圍內。再者，本發明的範圍不受以下所敘述之具體說明所限制。
為了達到上述目的之本發明的一個態樣中，本發明提供用以生產O-磷絲胺酸之重組微生物，其中與其內生活性相比，mdtH蛋白的活性被增強。
如此處所述，該用語「O-磷絲胺酸」(此後稱為「OPS」)是指絲胺酸的一磷酸酯(phosphoric acid ester)，其作為許多蛋白質的建構成分。特別是，該OPS為左旋半胱胺酸的前驅物且可藉由與一硫化物在OPS巰基化酶(O-phosphoserine sulfhydrylase，此後稱為「OPSS」)之催化作用下反應而轉化成半胱胺酸，但不限於此(歐洲發明專利第2444481號)。
具體而言，本發明之重組微生物可具有與其內生活性相比經增強之O-磷絲胺酸輸出活性(exporting activity)。本發明之該mdtH蛋白可具有將O-磷絲胺酸輸出至細胞外的活性，且此活性於本發明中第一次被辨認。
於一實例中，本發明之該mdtH蛋白可為一膜蛋白，且可衍生自大腸桿菌(Escherichia coli)。
另外，本發明之該mdtH蛋白可為屬於主要協助轉運蛋白超家族(Major facilitator superfamily，MFS)的轉運蛋白(transporter)。
具體而言，本發明之該mdtH蛋白可為包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO：1至少95%之相等性的胺基酸序列的蛋白質，同時具有該O-磷絲胺酸輸出活性。舉例而言，包括具有與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少95%相等性之胺基酸的蛋白質可包括任何表現與包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列的該mdtH蛋白相等或對應之OPS輸出活性的蛋白質而不受限制。
更具體而言，具有與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少95%相等性的該胺基酸可為具有與該SEQ ID NO：1之胺基酸序列96%或更高、97%或更高、
98%或更高、99%或更高、99.5%或更高，或99.75%或更高，及100%或更低之相等性的序列。
另外，本發明之該mdtH蛋白可包括蛋白質變異體，其中該序列的一部份被刪除、修飾、取代、保留取代，或添加於SEQ ID NO：1之胺基酸序列中或具有與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少95%相等性的胺基酸序列中，只要其等具有O-磷絲胺酸輸出活性，且可實質地落於本發明的範圍內。
另外，對於所屬技術領域中具有通常知識者為顯見的是，本發明之該mdtH蛋白可包括在具有該O-磷絲胺酸輸出活性下的SEQ ID NO：1之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少95%相等性的胺基酸序列之上游或下游之無意義序列添加、自然發生突變，或其沉默突變。
如此處所使用的，該等用語「同源性(homology)」或「相等性(identity)」是指在兩個給定的胺基酸序列或核苷酸序列(nucleotide sequence)之間的相關度(degree of relatedness)，且可被以百分比表示。該用語「同源性」及「相等性」通常可被彼此互換使用。
保留核苷酸(conserved nucleotide)序列或胺基酸序列之序列同源性或相等性可藉由標準對位演算法(standard alignment algorithms)而決定，且可與藉由程式所確立的預設空位罰分(default gap penalty)一起使用。實質上，同源或相等的序列一般被預期與該整個序列或該序列的全長之至少約50%、60%、70%、80%或90%，在中等或高度嚴密條件下雜交。於多核苷酸之雜交，包含簡併密碼子而不是密碼子的多核苷酸亦可被考量。
任何兩個核苷酸序列或胺基酸序列是否具有同源性、相似性或相等性可以，例如，藉由已知的電腦演算法，諸如「FASTA」程式使用預設參數而
決定(Pearson et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)。或者是，其可由Needleman-Wunsch演算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)決定，其使用EMBOSS組合的Needleman程式進行(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16：276-277)(較佳地，5.0.0或其後的版本)(GCG program package(Devereux,J.et al.,Nucleic Acids Research 12：387(1984)),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul,S.F.,et al.,J MOLEC BIOL 215：403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,and CARILLO et al.(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。舉例而言，該同源性、相似性或相等性可使用國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的BLAST或ClustalW來決定。
核苷酸序列或胺基酸序列的同源性、相似性或相等性可藉由使用例如GAP電腦程式比對序列資訊而決定，該GAP電腦程式舉例而言，諸如Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48：443，其揭示於Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2：482。總而言之，該GAP程式將同源性、相似性或相等性界定為相似的經對齊之符號(亦即核苷酸或胺基酸)之數量除以兩個序列之較短者中的符號之總數所獲得之值。該GAP程式的預設參數可包括：(1)二進位比較矩陣(包含表示相同的數值1及表示不同的數值0)以及揭露於Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)中的Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14：6745之加權比較矩陣(或EDNAFULL取代矩陣(NCBI NUC4.4之EMBOSS版本))；(2)對各空位(gap)之3.0的罰分(penalty)以及各空位中每個符號額外0.10的罰
分(或是一個空位開啟10罰分，且一空位延伸0.5罰分)；以及(3)對於終端空位無罰分。
再者，兩個核苷酸序列或胺基酸序列彼此是否具有同源性、相似性或相等性可藉由於南方雜交法實驗中，於經界定之嚴密條件下比較其等的序列而確認，且經界定之適當雜交條件是在本技術領域的範圍內且可由所屬技術領域具有通常知識者所熟知的方法界定(例如，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor，紐約，1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.，紐約)。
如此處所使用的，該用語「用以生產O-磷絲胺酸(OPS)之重組微生物」可指具有本質上較弱之OPS生產能力的微生物，或藉由對不具有OPS生產能力之母株進行自然或人工基因修飾而被提供有OPS生產能力的微生物。在本發明中，該「用以生產OPS之重組微生物」可與「具有OPS生產能力之微生物」互換使用。
為了本發明的目的，在生產OPS之微生物中，由於mdtH蛋白的活性被增強，相比於野生種或修飾前之微生物，其OPS生產量可被增加。較之野生種微生物或修飾前之微生物無法產生OPS或即使其能夠生產OPS亦僅可產生微量之OPS，OPS生產能力可藉由增強本發明之mdtH蛋白活性而增加係具有重大意義。
如此處所使用的，該用語「內生活性」是指當微生物的表徵(trait)由於自然或人工因素所致之基因修飾而被改變，由轉化前之母株或未經修飾之微生物原先具有之特定多肽或蛋白活性，且可與「修飾前之活性」互換使用。相較於其內生活性，多肽或蛋白之活性的「增強」或「增加」表示與在轉化前之母
株或一未經修飾之微生物原先所具有的特定多肽或蛋白之活性相比，其活性被增強。
活性的「增強」或「增加」可藉由導入外來多肽(foreign polypeptide)或蛋白，或增強該多肽或蛋白之內生活性而達成。多肽或蛋白活性的此增強可為基於在野生種或修飾前之微生物菌株中表現的多肽或蛋白活性或濃度，對目標多肽或蛋白之活性、濃度，及表現等級的增加，或可為自該目標蛋白所生產或釋放之產物之量的增加，但不限於此。如此處所使用的，「修飾前之菌株」或「修飾前之微生物」等用語未排除包含可能於微生物中自然發生的突變，且其可為本身為天然的菌株或其中表徵由於自然或人工因素所致之基因突變而改變的修飾前之菌株。該「修飾前之菌株」或「修飾前之微生物」可與「非突變菌株」、「非修飾菌株」、「非突變微生物」、「非修飾微生物」或「平台微生物(platform microorganism)」互換使用。在本發明中，該平台微生物可為KCCM11212P(歐洲發明專利第2444481號；US早期公開案第2012-0190081號)，其為生產OPS之已知微生物，以及KCCM11103P(US發明專利第9689009號)，係其中SerA(D-3-磷酸甘油酸脫氫酶，D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)及SerC(3-磷絲胺酸轉胺酶，3-phosphoserine aminotransferase)之活性被增強的生產OPS之菌株，但不限於此。
多肽或蛋白的活性增強可藉由所屬技術領域熟知的各種方法達成，且只要目標多肽或蛋白的活性與修飾前之微生物的活性相比被增強，其方法不受限制。該方法可包括基因工程或蛋白工程(protein engineering)，但不限於此。
使用基因工程增強多肽或蛋白之活性的方法可藉由，例如，下列方式達成：1)增加編碼該多肽或蛋白之基因或多核苷酸的細胞內複製數(intracellular copy number)的方法；2)以具有強活性之序列取代於染色體上編碼該多肽或蛋白的基因之表現調節序列的方法；3)對該多肽或蛋白之起始密碼子或5’-UTR區之核苷酸序列進行修飾的方法；4)修飾染色體上之多核苷酸序列使得該多肽或蛋白的活性被增強的方法；5)導入具有該多肽或蛋白之活性的外來多核苷酸或該多核苷酸之密碼子最佳化的經修飾之多核苷酸的方法；或6)其等之組合，但不限於此。
使用蛋白工程增強多肽或蛋白之活性的方法可藉由，例如，藉由分析多肽或蛋白之三級結構且接著選擇並修飾該暴露位置(exposed site)，或對其進行化學修飾而達成，但不限於此。
第1)項之增加編碼該多肽或蛋白之基因或多核苷酸的細胞內複製數的方法可藉由所屬技術領域中已知方法的方式而進行，舉例而言，藉由將可操作地連結至編碼該目標多肽或蛋白之基因或多核苷酸，且得以無視宿主細胞而複製及發揮功能的載體導入至該宿主細胞中而進行。或者是，該方法可藉由將得以插入該基因或多肽至宿主細胞之染色體中且該基因是操作性地連結至其上的載體至該宿主細胞中而進行，但不限於此。
如此處所使用的，該用語「載體」是指包含編碼可操作地連結至適當調節序列之目標多肽或蛋白之多核苷酸的核苷酸序列，使得其能夠於適當宿主細胞中表現該目標多肽或蛋白之DNA建構。該調節序列可包括能夠起始轉錄之啟動子、用以控制轉錄的任何操作子序列，用以編碼合適mRNA核醣體結合位置的序列，以及用以控制轉錄及轉譯之終止的序列。一旦轉化成合適的宿主細胞，該載體可進行複製或獨立於宿主基因組發揮功能，或可被整合至該基因組中。
只要其能夠在宿主細胞中複製，使用於本發明之該載體不特別限制，且任何所屬技術領域中所熟知的載體可被使用。經常使用之載體的實例可包括天然或重組質體、黏接質體(cosmids)、病毒及噬菌體(bacteriophages)。舉例而言，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A及Charon21A可被使用作為噬菌體載體或質體載體；且基於pBR(pBR-based)、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL，及pET之載體可被使用作為質體載體。具體而言，pCL、pSKH130、pDZ、pACYC177、pACYC184、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118，及pCC1BAC載體可被使用。
將該多核苷酸插入至染色體中可藉由所屬技術領域中任何已知方法而進行，舉例而言，同源重組，但不限於此。
該載體可進一步包括一選擇標記(selection marker)用於確認染色體中的插入。選擇標記係用以選擇以該載體轉化之細胞，即，用以確認該目標核酸分子是否已被插入，且提供可選擇之表型(例如，抗藥性、營養缺陷性(auxotrophy)、對細胞毒劑的抗性、表面修飾蛋白之表現等)的標記可被使用。在經選擇性試劑處理的環境下，只有表現該選擇標記的細胞可存活或表現其他表型特徵，藉此得以選擇經轉化的細胞。
如此處所使用的，「轉化作用(transformation)」之用語是指導入包括編碼目標多肽或蛋白之多核苷酸的載體至宿主細胞中，藉此使由該多核苷酸所編碼的多肽或蛋白被表現於該宿主細胞中的方法。只要經轉化的多核苷酸可於該宿主細胞中表現，該多核苷酸是否被插入且位於該宿主細胞的染色體中或位於該染色體外並没有影響，且兩種情況皆可被包括。另外，該多核苷酸可包括編碼該目標多肽或蛋白之DNA及RNA。
只要可被導入至宿主細胞中並在其中被表現，該多核苷酸可以任何形式導入。舉例而言，該多核苷酸可以表現匣(expression cassette)的形式被導入至宿主細胞中，其是包括對於其自我表現(self-expression)為必須的所有元素的基因建構(gene construct)。該表現匣一般可包括可操作地連結至該多核苷酸的啟動子、終止子(terminator)、核醣體結合位置，及終止密碼子。該表現匣可呈得以自我複製之表現載體的形式。另外，該多核苷酸可以其當下的形式被導入至宿主細胞並可操作地連結至對於其在宿主細胞中之表現所需的序列，但不限於此。
再者，如以上所使用的，該用語「可操作地連結(operably linked)」是指該基因序列及一啟動子序列之間的功能性連結(functional linkage)，以起始及調解(mediates)編碼本發明之目標多肽或蛋白之該多核苷酸的轉錄。
第2)項之以具有強活性之序列取代於染色體上編碼該多肽或蛋白的基因之表現調節序列的方法可藉由所屬技術領域中已知的方法進行，舉例而言，藉由通過核酸序列之刪除、插入、非保留或保留取代，或其等之組合而於該序列上誘發修飾，以進一步增強該表現調節序列的活性，或藉由以具有較強活性之核酸序列取代該多核苷酸序列。該表現調節序列可包括，但不特別限制於，一
啟動子、一操作子序列、編碼核醣體結合位置的序列，及調節轉錄及轉譯之終止的序列。具體而言，該方法可包括將強異源性(heterologous)啟動子替代原始啟動子連結，但不限於此。
所屬技術領域中強啟動子的實例可包括cj1啟動子(美國發明專利第7662943號)、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、λ噬菌體PR啟動子(lambda phage PR promoter)、PL啟動子及tet啟動子，但不限於此。
第3)項之對該多肽或蛋白之起始密碼子或5’-UTR區之核苷酸序列進行修飾的方法可藉由所屬技術領域中已知的方法進行，舉例而言，藉由以相較於內生起始密碼子具有該多肽或蛋白之較高表現率的另一起始密碼子取代該多肽或蛋白之內生起始密碼子，但不限於此。
第4)項之修飾染色體上之多核苷酸序列使得該多肽或蛋白的活性被增強的方法可藉由所屬技術領域中已知的方法進行，舉例而言，藉由通過該核苷酸序列之刪除、插入、非保留或保留取代，或其等之組合而誘發對表現調節序列的修飾，以進一步增強該多核苷酸序列的活性，或是藉由以被修飾以具有較強活性的多核苷酸序列取代該多核苷酸序列。該取代可具體地藉由以同源重組將基因插入至該染色體而達成，但不限於此。
此處所使用的載體可進一步包括一選擇標記用於確認染色體中的插入。該選擇標記是與以上所述者相同。
第5)項之導入具有該多肽或蛋白之活性的外來多核苷酸的方法可藉由所屬技術領域中已知的方法進行，舉例而言，藉由將編碼表現與該多肽或蛋白相同或相似之活性的多肽或蛋白之外來多核苷酸，或其密碼子最佳化經修飾之多核苷酸導入一宿主細胞。該外來多核苷酸可無論其來源或序列而不受限地
被使用，只要其表現與該多肽或蛋白相同或相似的活性。另外，為了最佳化所導入之外來多核苷酸於宿主細胞中之轉錄及轉譯，其密碼子可被最佳化並導入至宿主細胞中。該導入可由所屬技術領域具有通常知識者藉由選擇所屬技術領域中合適的轉化方法進行，且宿主細胞中之經導入的多核苷酸的表現使得該多肽或蛋白的生產變得可行，藉此增加其活性。
最後，第6)項之上述方法的組合可藉由組合應用1)至5)之方法的一或多者而進行。
具體而言，本發明之該重組微生物可為導入有編碼該mdtH蛋白之基因/多核苷酸的微生物；其中編碼該mdtH蛋白之多核苷酸的胞內複製數被增加的微生物；以包含編碼該mdtH蛋白之多核苷酸之載體轉化的微生物；其中編碼該mdtH蛋白之染色體上之基因的表現調節序列被以具有較強活性之序列取代的微生物；或其中編碼該mdtH蛋白之染色體上的啟動子是以具有較強活性之啟動子取代的微生物。
更具體而言，編碼該mdtH蛋白之基因可為一mdtH基因。另外，編碼該mdtH蛋白之該多核苷酸可為包括SEQ ID NO：2之核苷酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2之序列可自NCBI之GenBank(已知資料庫)而獲得。
包括特定序列號之胺基酸序列或由一特定序列號所敘述之胺基酸序列的蛋白/多肽可為具有該特定序列號之胺基酸序列或由該特定序列號所敘述之胺基酸序列的蛋白/多肽，或可為(實質上)由該特定序列號之胺基酸序列或由該特定序列號所敘述之胺基酸序列所組成之蛋白/多肽。另外，包括該特定序列號之核苷酸序列或由該特定序列號所敘述之核苷酸序列的多核苷酸可為具有該特定序列號之核苷酸序列或由該特定序列號所敘述之核苷酸序列的多核
苷酸，或可為(實質上)由該特定序列號之核苷酸序列或由該特定序列號所敘述之核苷酸序列所組成之多核苷酸。
只要其可生產OPS，本發明之微生物不受限於其種類，且可為任何原核(prokaryotic)或真核(eukaryotic)微生物，具體而言為原核微生物。原核微生物之實例可包括屬於大腸桿菌屬、伊文氏桿菌(Erwinia)屬、鋸桿菌(Serratia)屬、普羅威登斯(Providencia)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬及短桿菌(Brevibacterium)屬的微生物菌株，具體而言屬於大腸桿菌屬的微生物，更具體而言大腸桿菌，但不限於此。特別是，當該微生物屬於大腸桿菌或棒狀桿菌屬，OPS及左旋絲胺酸可被生產(Ahmed Zahoor,Computational and structural biotechnology journal,Vol.3,2012 October；Wendisch,V.F.et al.,Curr Opin Microbiol.2006 Jun；9(3)：268-74；Peters-Wendisch,P.et al.,Appl Environ Microbiol.2005 Nov；7 1(ll)：7 139-44.)。
本發明之該重組微生物可為其中磷絲胺酸磷酸酶(SerB)之活性與其內生活性相比被進一步弱化者。
本發明之該SerB具有將OPS轉化成左旋絲胺酸的活性，且因此，被修飾使得該SerB活性被弱化之微生物具有在其中累積OPS的特性，且因此對OPS之生產為有益的。本發明之該SerB可為包括由SEQ ID NO：3所敘述之胺基酸序列的蛋白，但不限於此。另外，只要其顯示SerB活性，該SerB可包括具有與由SEQ ID NO：3所敘述之胺基酸序列80%或更高，具體而言90%或更高，更具體而言95%或更高，或甚至更具體而言99%或更高的相等性的胺基酸序列，但不限於此。另外，編碼該SerB之多核苷酸可具有編碼由SEQ ID NO：3所敘述之胺基酸的核苷酸序列。編碼本發明之SerB之多核苷酸可由於密碼子簡併或考量蛋白將被表現之生物中所偏好的密碼子，在不改變該蛋白之胺基酸序列的範圍內於該編
碼區進行各種修飾。編碼本發明之SerB之多核苷酸可例如包括SEQ ID NO：4之核苷酸序列，或具有與SEQ ID NO：4之核苷酸序列80%或更高，具體而言90%或更高，更具體而言95%或更高，或甚至更具體而言99%或更高之相等性的核苷酸序列，但不限於此。
如此處所使用的，該用語「相比於其內生活性之弱化的活性」表示相比於由自然狀態中之微生物之蛋白原先具有的活性，該蛋白活性被減低，且可包括其中活性被移除的情形。
特別是，該「弱化」亦可包括其中與由微生物所原始具有的蛋白活性相比，由於編碼該蛋白之基因的突變所致而蛋白活性本身被降低或移除的情形；其中與天然菌株相比，由於編碼該蛋白之基因的表現被抑制或轉譯被抑制等而胞內蛋白活性之整體水準降低的情形；其中基因完全未被表現的情形；或其中即使在表現時無法觀察到活性的情形。
此種蛋白活性的弱化可藉由所屬技術領域中所熟知的各種方法達成。方法的實例可包括：以被突變以具有降低之酵素活性的基因取代染色體上編碼該蛋白之基因，包括其中蛋白活性被移除之情形的方法；對編碼該蛋白之基因的表現調節序列進行修飾的方法；將染色體上編碼該蛋白之基因的部分或全部刪除的方法；導入經由互補結合至染色體上之基因的轉錄而抑制自mRNA轉譯成蛋白的一反股寡核苷酸(antisense oligonucleotide，例如，反股RNA)的方法；藉由人工添加互補序列至編碼該蛋白之基因的夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno，SD)序列之前端上的SD序列而形成二級結構，使核醣體之附接(attachment)無法達成的方法；以及反轉錄工程(reverse transcription engineering，RTE)的方法，其添加啟動子以在該序列之開讀框(open reading frame，ORE)之3’端進行反轉錄等；且其可由其等之組合達成，但該等方法並不特別限制於此。
具體而言，刪除編碼該蛋白之基因的部分或全部之方法可藉由使用用以對細菌進行染色體插入之載體，以具有部分刪除之核酸序列的多核苷酸或標記基因取代染色體內之編碼該內生目標蛋白的多核苷酸而進行。舉例而言，藉由同源重組刪除基因的方法可被使用。另外，如此處所使用，該用語「部分」雖然依據不同種類之多核苷酸而有變化，惟可具體表示係1至300個核苷酸，較佳係1至100個核苷酸，且更佳係1至50個核苷酸，但不特別限於此。
另外，修飾該表現調節序列的方法可藉由經由刪除、插入、保留取代、非保留取代，或其等之組合而在表現調節序列中誘導修飾而進行，以進一步弱化該表現調節序列的活性；或藉由以具有較弱活性之核酸序列取代該序列而進行。該表現調節序列可包括一啟動子、一操作子序列、編碼核醣體結合位置的序列，及調節轉錄及轉譯之終止的序列。
再者，修飾染色體上之基因序列的方法可藉由透過刪除、插入、保留取代、非保留取代或其等之組合而在序列中誘發修飾而進行，以進一步弱化蛋白之活性；或藉由以被修飾而具有較弱活性之基因序列或被修飾而完全不具有活性之基因序列取代該序列而進行。
另外，本發明之該重組微生物可為其中與其內生活性相比，磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)、磷絲胺酸轉胺酶(SerC)或其等之組合之任一者的活性被進一步增強者。
本發明之SerA為具有將3-磷酸甘油酸鹽轉化成3-磷酸-羥基丙酮酸之活性的蛋白。本發明之SerC為具有將3-磷酸-羥基丙酮酸轉化成OPS之活性的蛋白。因此，任何具有增強之SerA及/或SerC活性之微生物可被有效地用作生產OPS之微生物。
本發明之SerA可為包括SEQ ID NO：5或6之胺基酸序列的蛋白。SEQ ID NO：5之胺基酸序列為野生種SerA之序列，且SEQ ID NO：6之胺基酸序列為其中對絲胺酸之回饋抑制(feedback inhibition on serine)被釋放之SerA變異體的序列。另外，只要其顯示野生種SerA之活性或其中絲胺酸之回饋抑制被釋放之SerA變異體的活性，SerA可包括具有與由SEQ ID NO：5或6敘述之胺基酸序列具有80%或更高，具體而言90%或更高，更具體而言95%或更高，或甚至更具體而言99%或更高之相等性的胺基酸序列，但不限於此。其中絲胺酸之回饋抑制被釋放之SerA變異體是指其中藉由插入、取代等而將修飾導入於由SerA編碼之基因，藉此由絲胺酸或甘胺酸之回饋抑制維持活性或具有增強之活性的該等蛋白，且該等其中絲胺酸之回饋抑制被釋放之SerA變異體為已熟知的(Grant,G.A.et al.,J.Biol.Chem.,39：5357-5361,1999；Grant,G.A.et al.,Biochem.,39：7316-7319,2000；Grant,G.A.et al.,J.Biol.Chem.,276：17844-17850,2001；Peters-Wendisch,P.et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol,60：37-441,2002；EP 0943687 B)。
另外，編碼野生種SerA或其中絲胺酸之回饋抑制被釋放之SerA變異體的多核苷酸可包括編碼由SEQ ID NO：5或6之胺基酸序列的任一者的核苷酸序列，但不限於此。編碼野生種SerA或其中絲胺酸之回饋抑制被釋放之SerA變異體的多核苷酸序列可由於密碼子簡併或考量該多肽將被表現之生物中所偏好的密碼子，在不改變該多肽之胺基酸序列的範圍內於編碼區中進行各種修飾。編碼野生種SerA或其中絲胺酸之回饋抑制被釋放之SerA變異體的多核苷酸可為，例如，包括SEQ ID NO：7或8之核苷酸序列的多核苷酸，或可為包括具有與SEQ ID NO：7或8之核苷酸序列80%或更高，具體而言90%或更高，更具體而言95%或更高，或甚至更具體而言99%或更高之同源性的核苷酸序列的多核苷酸，但不限於此。
該SerC可為，例如，包括由SEQ ID NO：9敘述之胺基酸序列的蛋白，但不限於此。另外，只要其顯示SerC活性，該SerC可包括具有與由SEQ ID NO：9所敘述之序列80%或更高，具體而言90%或更高，更具體而言95%或更高，或甚至更具體而言99%或更高的相等性的胺基酸序列，但不限於此。
另外，編碼該SerC之多核苷酸可包括編碼由SEQ ID NO：9所敘述之胺基酸序列的核苷酸序列。編碼本發明之SerC之多核苷酸可由於密碼子簡併或考量多肽將被表現之生物中所偏好的密碼子，在不改變該多肽之胺基酸序列的範圍內於該編碼區進行各種修飾。編碼SerC的多核苷酸可包括，例如，SEQ ID NO：10之核苷酸序列，或具有與SEQ ID NO：10之胺基酸序列80%或更高，具體而言90%或更高，更具體而言95%或更高，甚至更具體而言99%或更高之同源性的核苷酸序列，但不限於此。
如此處所使用的，該用語「相比於其內生活性之增強」及該增強方法是如上所述。
另外，本發明之該重組微生物可為於其中導入OPS至細胞中或分解OPS的能力被進一步弱化之微生物。
關於生產OPS之微生物的內容，除了以上所述者，歐洲發明專利第2444481號或美國發明專利申請公開案第2012-0190081號的揭露內容可被作為本發明的參考。
於本發明的另一態樣中，本發明提供用以生產O-磷絲胺酸的方法，包括在一培養基中培養其中與其內生活性相比，mdtH蛋白之活性被增強之生產O-磷絲胺酸的重組微生物。
該mdtH蛋白、內生活性、增強、O-磷絲胺酸，及微生物是如上所述。
如此處所使用的，該用語「培養」表示該微生物在適當控制之環境條件下生長。本發明之培養過程可於本技術領域中已知之合適的培養基及培養條件中進行。此培養過程可由所屬技術領域中具有通常知識者根據將被選擇之菌株而輕易調整使用。具體而言，該培養可為批次培養、連續培養，及進料-批次(fed-batch)培養，但不限於此。
在其中與其內生活性相比，SerB活性被弱化之重組微生物之培養中，由於該微生物之絲胺酸需求被誘發，該培養基可進一步包含甘胺酸或絲胺酸。甘胺酸可以純化之甘胺酸、含甘胺酸之酵母萃取，或胰腖(tryptone)的形式提供。被包含於培養基中之甘胺酸之濃度通常為0.1g/L至10g/L，且具體而言為0.5g/L至3g/L。另外，絲胺酸可以純化之絲胺酸、含絲胺酸之酵母萃取，或胰腖的形式提供。被包含於培養基中之絲胺酸之濃度通常為0.1g/L至10g/L，且具體而言為0.1g/L至1g/L。
被包含於培養基中之碳源的實例可包括醣類及碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖，澱粉，及纖維素；油類及脂肪諸如大豆油、葵花油、蓖麻油，及椰子油；脂肪酸諸如棕櫚酸、硬酯酸，及亞麻油酸；醇類諸如甘油及乙醇；及有機酸諸如醋酸。這些碳源可被單獨使用或以其組合使用，但不限於此。
被包含於培養基中之氮源的實例可包括有機氮源諸如蛋白腖(peptone)、酵母萃取、肉汁(meat gravy)、麥芽精(malt extract)、玉米浸液(corn steep liquor)及大豆粉(bean flour)；及無機氮源諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸胺、碳酸胺及硝酸銨。這些氮源可被單獨使用或以其組合使用，但不限於此。
被包含於培養基中的磷源可包括磷酸二氫鉀(potassium dihydrogen phosphate)、磷酸氫二鉀(dipotassium hydrogen phosphate)，及對應其等的含鈉之鹽類，但不限於此。
另外，培養基可包括金屬鹽，諸如硫酸鎂或硫酸鐵，且可進一步包含胺基酸、維生素，及適當的前驅物。該等培養基或前驅物可被以批次培養或連續培養的形式添加至培養物(culture)，但不限於此。
該培養物之pH值可藉由在培養期間以合適方式添加化合物，諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸及硫酸而調整。另外，培養期間可藉由使用諸如脂肪酸聚乙二醇酯(fatty acid polyglycol ester)之消泡劑而預防泡沫形成。再者，氧氣或含氧氣體可被注入該培養物以維持該培養物的好氧狀態(aerobic state)；或是，為了維持厭氧(anaerobic)或微氧(microaerobic)狀態，可不注入氣體，或注入氮氣、氫氣或二氧化碳。培養物的溫度可為介於自25℃至40℃，且具體而言自30℃至35℃的範圍內。該培養可持續進行直到所欲材料之生產可被獲得，且具體而言可被進行10小時至100小時，但不限於這些說明性實例。
本發明之生產O-磷絲胺酸之方法可進一步包括製備其中與內生活性相比mdtH蛋白之活性被增強的用以生產O-磷絲胺酸之重組微生物，及/或用以培養該重組微生物之培養基的步驟。
本發明之用以生產O-磷絲胺酸之方法可進一步包括自該經培養之培養基或微生物回收OPS的步驟。所欲的OPS可根據該培養方法，例如批次培養、連續培養及給料-批次培養(fetch culture)，藉由使用所屬技術領域中已知之適當方法分離及純化而自培養物回收，但不限於此。
於本發明的再另一態樣中，本發明提供用以生產半胱胺酸或其衍生物的方法，包括：
a)藉由於一培養基中培養用於生產O-磷絲胺酸之一重組微生物而生產O-磷絲胺酸或包含O-磷絲胺酸之一培養基，該重組微生物中與其內生活性相比，mdtH蛋白之活性被增強；以及b)將步驟a)中所生產之該O-磷絲胺酸或包含其之該培養基與一硫化物在O-磷絲胺酸巰基化酶(OPSS)或包含其之一微生物的存在下反應。
如此處所使用的，對微生物而言「包括(include/including)」一特定蛋白表示其中一特定目標蛋白(protein of interest)被導入至該微生物中或表現於該微生物中的狀態。
該mdtH蛋白、內生活性、增強、O-磷絲胺酸，及微生物是如上所述。
如此處所使用，該用語「衍生物」是指由化學修飾任何化合物之一部分而獲得的相似化合物。該用語通常是指其中氫原子或特定原子團被以另一原子或原子團所取代的化合物。
如此處所使用的，用語「半胱胺酸衍生物」是指半胱胺酸中氫原子或特定原子團被以另一原子或原子團取代的化合物。舉例而言，半胱胺酸衍生物可具有半胱胺酸中胺基(-NH2)之氮原子或硫醇基(thiol group，-SH)之硫原子具有連接於其的另一原子或原子團的形式，且半胱胺酸衍生物的實例可包括NAC(N-acetylcysteine，N-乙醯基半胱胺酸)、SCMC(S-carboxymethylcysteine，S-羧甲基半胱氨酸)、Boc-Cys(Me)-OH、(R)-S-(2-胺基-2-羧乙基)-L-同半胱胺酸((R)-S-(2-amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine)、(R)-2-胺基-3-磺基丙酸、D-2-胺基-4-(乙硫基)丁酸、3-亞硫基-L-丙胺酸、Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH、硒基-L-半胱胺酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱胺酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱胺酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱胺酸等，但不限於此。
只要半胱胺酸根據本發明之方法生產，半胱胺酸可被轉化成各種半胱胺酸衍生物，且成為半胱胺酸之轉化可藉由所屬技術領域中熟知的方法輕易達成。
具體而言，生產半胱胺酸衍生物的方法可進一步包括將步驟b)中所生產之半胱胺酸轉化成半胱胺酸衍生物。舉例而言，半胱胺酸可藉由與乙醯化劑(acetylation agent)進行反應而合成為N-乙醯半胱胺酸(NAC)，或其可藉由與鹵化乙酸在鹼性條件下進行反應而合成為S-羧甲基半胱氨酸(SCMC)，但該方法不限於此。
這些半胱胺酸衍生物主要作為鎮咳劑(antitussive agents)、止咳劑(cough-relieving agents)及對於氣管炎(bronchitis)、支氣管性氣喘(bronchial asthma)、咽喉炎(laryngopharyngitis)等的藥學材料，但不限於此。
如此處所使用的，該用語「O-磷絲胺酸巰基化酶(OPSS)」是指藉由將一硫醇基(SH基)提供給OPS而催化OPS被轉化成半胱胺酸之反應的酵素。該酵素已首先於Aeropyrum pernix,Mycobacterium tuberculosis,Mycobacterium smegmatis,and Trichomonas vaginalis(Mino,K.and Ishikawa,K.,FEBS Letters,551：133-138,2003；Burns,K.E.et al.,J.Am.Chem Soc.,127：11602-11603,2005)中發現。另外，該OPSS可不僅包括野生種OPSS蛋白，亦包括包含編碼該OPSS之多核苷酸序列中之序列的一部分之刪除、取代，或添加的變異體蛋白，其顯示與野生種OPSS蛋白之生物活性相等或更高之活性，且亦可包括揭露於歐洲發明專利第2444481號及美國發明專利第9127324號中之所有OPSS蛋白及其等之蛋白變異體。
該硫化物可為任何硫化物，條件在於不僅是本技術領域中通常使用的固體形式，基於不同的pH值、壓力及溶解度，亦可為液體或氣體形式，且
因此可被轉化成呈硫化物(S2-)或硫代硫化物(S2O3 2-)之形式的巰基(SH)基團。具體而言，該硫化物可包括Na2S、NaSH、H2S、(NH4)2S，及Na2S2O3，其可將巰基基團提供至OPS，但不限於此。在反應中，單一巰基基團被提供至單一反應性OPS基團以生產單一半胱胺酸或其衍生物。於此反應中，硫化物是特別被以基於OPS之莫耳濃度之0.1至3莫耳當量，且具體而言係1至2莫耳當量的量被添加，但不限於此。
再者，本發明之該方法可進一步包括回收在上述反應步驟中生產之半胱胺酸的步驟。特別是，所欲的半胱胺酸可藉由使用本技術領域中合適之反應自反應溶液分離及純化而回收。
在本發明的又另一態樣中，本發明提供用於生產O-磷絲胺酸之重組微生物的用於生產O-磷絲胺酸、半胱胺酸，或半胱胺酸衍生物之用途，該重組微生物中與其內生活性相比，mdtH蛋白之活性被增強。
於本發明的再另一態樣中，本發明提供自一微生物輸出該mdtH蛋白之O-磷絲胺酸的用途。
該mdtH蛋白、內生活性、增強、O-磷絲胺酸、半胱胺酸、半胱胺酸衍生物，及微生物是如上所述。
當O-磷絲胺酸是使用其中與其內生活性相比，mdtH蛋白之活性被增強的用於生產O-磷絲胺酸之重組微生物生產時，與使用現有的未修飾菌株相比，其可導致O-磷絲胺酸的高產率生產。
此後，本發明將藉由實例詳細敘述。然而，對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言乃顯而易知的是，這些實例係僅提供作為說明之目的，且因此並非意欲限制本發明的範圍於此等實例。
為了辨識涉及於OPS之輸出的E.coli膜蛋白，使用大腸桿菌W3110(ATCC27325)，一E.coli野生種菌株之基因DNA庫進行篩選。
為了設置E.coli的生長由OPS抑制的條件，用以生產OPS的參考菌株被製備。該篩選參考菌株為經突變以弱化W3110中之內生磷絲胺酸磷酸酶(SerB)的活性的生產OPS之菌株，且被命名為CA07-0012(KCCM11212P，歐洲發明專利第2444481號；美國發明專利申請公開案第2012-0190081號)。
CA07-0012於包含OPS的培養基中培養以建立顯示生長抑制之最佳化篩選條件。該W3110基因組資料庫質體藉由電穿孔法(electroporation，van der Rest et al.1999)而轉化至CA07-0012中，且其中生長抑制被釋放於補充有過量OPS之培養基條件中的菌落被選擇。自經選擇之菌落獲得質體，且核苷酸序列通過定序技術而分析。自此，涉及於在補充有過量OPS之條件下釋放生長抑制的兩種E.coli膜蛋白被辨識。
結果，編碼E.coli膜蛋白的基因(SEQ ID NO：1)被辨識為mdtH傳輸蛋白，其屬於主要協助轉運蛋白超家族(MFS)。
當涉及於由OPS所導致之生長抑制的釋放之mdtH在各生產OPS之菌株中被增強時，對各基因製備過表現載體以確認該OPS輸出能力是否被改善。另外，當磷絲胺酸傳輸蛋白之yhhS於生產OPS之菌株中被增強時，被確認的是OPS濃度被增加(WO2016/024771A)，且因此，此被作為正向控制組。再者，屬於主要協助轉運蛋白超家族(MFS)之E.coli膜蛋白yfaV MFS傳輸蛋白亦以與mdtH相同的方式評估。編碼mdtH之DNA片段通過PCR使用W3110基因DNA作為模板而獲得(SEQ ID NO：2)。被用於製備用於各膜蛋白基因之過表現載體的引子序列顯示於下表1中。
為了製備pCL_Ptrc-yhhS，pCL_Ptrc-gfp(WO 2016/024771 A1)被作為模板，且PCR使用SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12進行以獲得Ptrc DNA片段。該yhhS DNA片段經由PCR使用基於W3110之SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14作為模板而獲得。經放大之片段以通過限制酵素XbaI及HindIII處理的pCL1920載體承受IST，藉此獲得pCL_Ptrc-yhhS。IST(Gibson,D.G.et al.,NATURE METHODS,Vol.6 No.5,MAY 2009,NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)是指使用吉卜森組件方法(Gibson assembly method)之複製方法，且以下將繼續稱為IST。
為了製備pCL Ptrc-mdtH，pCL_Ptrc-gfp亦作為模板，且Ptrc DNA片段使用SEQ ID NOS：15及16獲得。該mdtH DNA片段使用SEQ ID NO：17及SEQ
ID NO：18基於W3110作為模板而獲得，且pCL_Ptrc-mdtH通過IST以與pCL_Ptrc-yhhS相同的方式製備。
pCL_Ptrc-yfaV亦以與兩種質體之製備的相同方式複製，且該Ptrc DNA片段使用pCL_Ptrc-gfp作為模板而獲得，且yfaV DNA片段使用W3110作為模板而獲得。作為引子，對於Ptrc使用SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20進行PCR，對於yfaV使用SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22進行PCR。
實例2中製備之三種質體各自被導入至生產OPS之菌株CA07-0012的菌株被製備，且其OPS生產能力被評估。
各菌株被放置於固體LB培養基上，且接著在33℃之培養器中隔夜培養。於該固體LC培養基中隔夜培養的菌株被接種至表2中所示之25毫升滴度培養基(titer medium)中且接著於33℃之培養器中以200rpm之速率培養48小時。其OPS生產能力顯示於表3中。
如表3中所示，在該等案例中，其中E.coli膜蛋白基因被額外導入至衍生自E.coli之CA07-0012菌株者，與CA07-0012相比，OPS之生產在經yhhS及
mdtH增強之菌株中被增加。尤其經確認的是在本發明之經mdtH增強的菌株中，OPS濃度被增加大約2倍。相對的，在比較組之經yfaV增強之菌株的案例中，OPS的生產未被增加。
因此，CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH被命名為CA07-0354。該CA07-0354菌株在2020年8月28日依照布達佩斯條約寄存於韓國微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)，且具有存取編號KCCM12781P。
CA07-0022(KCCM11103P，美國發明專利第9689009號)係經由OPS生物合成途徑之serA(3-磷酸甘油酸脫氫酶)及SerC(3-磷絲胺酸轉胺酶)之活性被增強而具有經增強之OPS生產能力的生產OPS之菌株，其被用於決定E.coli膜蛋白基因之效果，以及用於膜蛋白基因的過表現載體與serA及serC組合而製備。被使用之引子序列顯示於下表4中。
首先，pCL_Ptrc-serA*C被製備以便製備serA及serC被導入其中的負面控制組(negative control)質體。該Ptrc DNA片段使用SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24基於pCL_Ptrc-gfp作為模板而獲得。使用SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26基於pC_Prmf-serA*C(WO 2016/024771 A1)作為模板進行PCR以獲得serA*C DNA片段。經放大之片段以通過限制酵素XbaI及HindIII處理的pCL1920載體承受IST，藉此獲得pCL_Ptrc-serA*C。
為了製備pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS，使用SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28基於以上製備之pCL_Ptrc-yhhS作為模板進行PCR。自此，Ptrc-yhhS DNA片段被獲得。經放大之片段以經HindIII處理之pCL_Ptrc-serA*C載體承受IST以獲得pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS。
pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-mdtH及pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yfaV亦以與pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS相同方式製備。該Ptrc-mdtH DNA片段基於pCL_Ptrc-mdtH作為模板使用SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30而獲得，且Ptrc-yfaV DNA片段基於pCL_Ptrc-yfaV作為模板使用SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32而獲得。
OPS生產能力藉由將經製備之質體導入生產OPS之菌株CA07-0022而確認，且結果顯示於下表5中。
如上表5中所示，在其中E.coli膜蛋白基因被額外導入與衍生自E.coli之CA07-0012菌株相比具有改善之OPS生產能力的CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C的菌株中，經再次確認的是與控制組相比，作為正向控制組的經yhhS增強之菌株中的OPS生產被增加。特別是，在根據本發明之經mdtH增強之菌株的案例中，OPS濃度被增加，與表3中所示的結果相似。相對地，在yfaV經增強之群組，其為比較組的案例中，與控制組相比，OPS生產被減低。
為了確認當染色體上之mdtH之啟動子被以較強啟動子取代時輸出能力是否增加，其中自體啟動子被以trc啟動子取代之菌株被製備，且其等之OPS生產能力被評估。將trc啟動子導入E.coli之染色體中的方法藉由下列常用方
法進行。對於染色體插入，具有依賴PI蛋白(pir基因)之R6K複製子(replicon)及sacB(聚果糖蔗糖酶，Levansucrase)基因被導入其中的pSKH130載體被使用。另外，該載體包含康黴素(kanamycin)抗性基因，其被作為製備菌株之選擇標記。在使用該載體於第一次互換時使用R6K及康黴素獲得所欲的菌株後，抗生素自包含蔗糖之培養基移除以製備菌株。為了將mdtH之啟動子以CA07-0022中之trc取代，pSKH130_Ptrc-mdtH載體被製備，且使用的引子序列顯示於下表6中。
為了製備pSKH130_Ptrc-mdtH，mdtHUP DNA片段藉由基於W3110使用SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34進行PCR而獲得。另外，Ptrc-mdtH DNA片段藉由基於以上製備之pCL_Ptrc-mdtH使用SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36進行PCR而獲得。經放大的片段通過限制酵素EcoRV處理的pSKH130載體承受IST，以獲得pSKH_mdtHUP_Ptrc-mdtH。因此獲得之質體經由電穿孔法轉化成CA7-0022菌株。在經由重組(交換)選擇導入補充有康黴素之LB固體培養基中之染色體中的菌株後，質體區域通過在包含蔗糖之培養基中的二次重組(取代)而自染色體切除(excised)。其中二次重組被完成之菌株使用SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38之引子獲得(CA07-0022：：Ptrc-mdtH)。
為了決定經製備之生產OPS之菌株的效果，OPS生產能力顯示於下表7中。
結果，如表7中所示，當E.coli膜蛋白之表現藉由增強啟動子而增加，被確認的是與控制組相比，OPS濃度被增加。
OPS為包含磷酸鹽(phosphate)的物質且具有與3-磷酸甘油酸(此後稱為3PG)相似的化學結構。因此，想當然爾OPS輸出蛋白可釋放3PG，且3PG生產能力在以該OPD輸出蛋白增強之菌株中被量測。使用高效能液相層析法(HPLC)儀器量測3PG，且3PG生產能力顯示於表8中。
如表8中所示，3PG於經yhhS增強之菌株中累積，但3PG在經mdtH膜蛋白增強之菌株中未增加。即，經確認的是，mdtH被導入其中的菌株具有增加的OPS輸出能力，且對於OPS特定之輸出能力亦被增加。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者將能夠了解本發明可以其他具體形式實施而不背離本發明之技術精神或必要特徵。所敘述之實施例被認為在所有方面僅是說明性而非限制性的。本發明的範圍因此由所附之申請專利範圍而不是由前述說明表示。在申請專利範圍之等效的意義及範圍內的所有改變被涵蓋於本發明的範圍內。
寄存機構：韓國微生物保藏中心(國際寄存單位)
存取編號：KCCM12781P
寄存日期；20200828
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（無）
Claims (11)
- 一種用於生產O-磷絲胺酸的重組微生物的用途，在該重組微生物中與其內生活性相比，mdtH蛋白之活性被增強，其中該重組微生物為大腸桿菌(Escherichia)屬之微生物，其中該mdtH蛋白具有O-磷絲胺酸輸出活性，其中該mdtH蛋白包含SEQ ID NO：1之一胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO：1至少95%相等性的一胺基酸序列。
- 如請求項1所述之用途，其中與其內生活性相比，O-磷絲胺酸輸出活性被增強。
- 一種用於生產O-磷絲胺酸的重組微生物，其中與其內生活性相比，mdtH蛋白之活性被增強，其中該重組微生物為大腸桿菌屬之微生物，其中該mdtH蛋白具有O-磷絲胺酸輸出活性，其中與其內生活性相比，磷絲胺酸磷酸酶(SerB)之活性被進一步弱化，其中該mdtH蛋白包含SEQ ID NO：1之一胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO：1至少95%相等性的一胺基酸序列。
- 一種用於生產O-磷絲胺酸的重組微生物，其中與其內生活性相比，mdtH蛋白之活性被增強，其中該重組微生物為大腸桿菌屬之微生物，其中該mdtH蛋白具有O-磷絲胺酸輸出活性，其中與其內生活性相比，磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)、磷絲胺酸轉胺酶(SerC)，或其等之組合的至少一者之活性被進一步增強， 其中該mdtH蛋白包含SEQ ID NO：1之一胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO：1至少95%相等性的一胺基酸序列。
- 一種用於生產O-磷絲胺酸的方法，其包含於一培養基中培養用以生產O-磷絲胺酸的一重組微生物，該重組微生物中與其內生活性相比，mdtH蛋白之活性被增強，其中該重組微生物為大腸桿菌屬之微生物，其中該mdtH蛋白具有O-磷絲胺酸輸出活性，其中該mdtH蛋白包含SEQ ID NO：1之一胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO：1至少95%相等性的一胺基酸序列。
- 如請求項5所述之方法，其中該方法進一步包含回收經培養之該培養基或該重組微生物中的O-磷絲胺酸。
- 一種用於生產半胱胺酸的方法，其包含：a)藉由於一培養基中培養用於生產O-磷絲胺酸之一重組微生物而生產O-磷絲胺酸或包含O-磷絲胺酸之一培養基，該重組微生物中與其內生活性相比，mdtH蛋白之活性被增強；以及b)將步驟a)中所生產之該O-磷絲胺酸或包含其之該培養基與一硫化物在O-磷絲胺酸巰基化酶(OPSS)或包含其之一微生物的存在下反應，其中該重組微生物為大腸桿菌屬之微生物，其中該mdtH蛋白具有O-磷絲胺酸輸出活性，其中該mdtH蛋白包含SEQ ID NO：1之一胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO：1至少95%相等性的一胺基酸序列。
- 一種用於生產半胱胺酸衍生物的方法，包含： 藉由請求項7所述之方法產生半胱胺酸；以及將所生產之半胱胺酸轉化成半胱胺酸衍生物，其中該半胱胺酸衍生物為選自由下述所組成群組之至少一者：NAC(N-acetylcysteine，N-乙醯基半胱胺酸)、SCMC(S-carboxymethylcysteine，S-羧甲基半胱氨酸)、Boc-Cys(Me)-OH、(R)-S-(2-胺基-2-羧乙基)-L-同半胱胺酸((R)-S-(2-amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine)、(R)-2-胺基-3-磺基丙酸、D-2-胺基-4-(乙硫基)丁酸、3-亞硫基-L-丙胺酸、Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH、硒基-L-胱胺酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱胺酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱胺酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱胺酸。
- 如請求項7所述之方法，其中該硫化物是選自於由Na2S、NaSH、(NH4)2S、H2S，及Na2S2O3所組成之群組的至少一者。
- 一種將用於生產O-磷絲胺酸之重組微生物用於生產O-磷絲胺酸、半胱胺酸或半胱胺酸之衍生物的用途，其中與其內生活性相比，一mdtH蛋白之活性被增強，其中該重組微生物為大腸桿菌屬之微生物，其中該mdtH蛋白具有O-磷絲胺酸輸出活性，其中該mdtH蛋白包含SEQ ID NO：1之一胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO：1至少95%相等性的一胺基酸序列，其中該半胱胺酸衍生物為選自由下述所組成群組之至少一者：NAC(N-acetylcysteine，N-乙醯基半胱胺酸)、SCMC(S-carboxymethylcysteine，S-羧甲基半胱氨酸)、Boc-Cys(Me)-OH、(R)-S-(2-胺基-2-羧乙基)-L-同半胱胺酸((R)-S-(2-amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine)、(R)-2-胺基-3-磺基丙酸、D-2-胺基-4- (乙硫基)丁酸、3-亞硫基-L-丙胺酸、Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH、硒基-L-胱胺酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱胺酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱胺酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱胺酸。
- 一種mdtH蛋白的用途，用以自大腸桿菌屬之微生物輸出O-磷絲胺酸，其中該mdtH蛋白具有O-磷絲胺酸輸出活性，其中該mdtH蛋白包含SEQ ID NO：1之一胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO：1至少95%相等性的一胺基酸序列。
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Patent Citations (1)
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