JP7450712B2 - 外来ｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質が導入されたＬ－メチオニン生産微生物及びそれを用いたＬ－メチオニン生産方法 - Google Patents
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Description
本出願は、外来ｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質が導入されたＬ－メチオニン生産微生物及びそれを用いたＬ－メチオニン生産方法に関する。
Ｌ－メチオニン（L-methionine）は、生体内の必須アミノ酸の一種であり、飼料、輸液剤、医薬品の合成原料などの医薬原料、及び食品添加剤として用いられる。メチオニンは、生体内でメチル基転移反応に関与する重要なアミノ酸であり、硫黄を供給する役割を果たす。
メチオニンの化学合成は、主に５－（β－メチルメルカプトエチル）ヒダントイン（5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin）を加水分解する反応により、Ｌ型・Ｄ型混合形態でメチオニンを生産する方法が用いられている。しかし、前記化学合成は、Ｌ型とＤ型が混合した形態で生産するものである。
一方、生物学的方法によってもＬ－メチオニンを生産することができる。より具体的には、微生物がＬ－メチオニンを生産する一方法として、Ｏ－アシルホモセリン（Ｏ－アセチルホモセリン又はＯ－スクシニルホモセリン）及び硫化水素（hydrogen sulfide）を基質として用いて、ダイレクトスルフヒドリレーションによりメチオニンを生産するものが挙げられる。例えば、コリネ型微生物内のｍｅｔＹ遺伝子がコードする酵素がダイレクトスルフヒドリレーション機能を行うことが知られている。微生物がＬ－メチオニンを生産する他の方法として、Ｏ－アシルホモセリン（Ｏ－アセチルホモセリン又はＯ－スクシニルホモセリン）及びシステインを基質として用いて、トランススルフレーションによりメチオニンを生産するものが挙げられる。例えば、コリネ型微生物内のｍｅｔＢ遺伝子がコードする酵素がトランススルフレーション機能を行うことが知られている。しかし、ｍｅｔＢがコードする酵素は副産物を多く生成し、ｍｅｔＹ遺伝子はフィードバック阻害を受けるという欠点があるので、産業的にＬ－メチオニンを大量生産するために用いることは困難な現状である（非特許文献１、２など）。
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本発明者らは、前述したタンパク質を代替することのできるタンパク質を見出すべく鋭意努力した結果、ｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質を導入した微生物がＬ－メチオニンを高収率で生産することを確認し、本出願を完成するに至った。
本出願は、外来ｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質を導入したＬ－メチオニン生産微生物を提供することを目的とする。
また、本出願は、前記微生物をチオ硫酸塩含有培地で培養するステップを含むＬ－メチオニン製造方法を提供することを目的とする。
さらに、本出願は、前記微生物及びチオ硫酸塩を含むＬ－メチオニン生産用組成物を提供することを目的とする。
本出願のｍｅｔＺによりコードされるタンパク質の活性が導入された微生物は、ｍｅｔＹに比べて生成される副産物が少ないので収率が高く、メチオニンによりフィードバック阻害を受けるｍｅｔＢとは異なり、フィードバック阻害を受けないので、高収率でＬ－メチオニンを生産することができ、Ｌ－メチオニンの産業的生産に有用である。
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。
本出願の一態様は、外来ｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質が導入されたＬ－メチオニン生産微生物を提供する。
本出願の他の態様は、前記Ｌ－メチオニン生産微生物をチオ硫酸塩含有培地で培養するステップを含むＬ－メチオニン製造方法を提供する。
本出願における「ｍｅｔＺ遺伝子」とは、アシルホモセリンを基質としてスルフヒドレーション（sulfhydration）に関与する酵素をコードする遺伝子である。
本出願における「アシルホモセリン」とは、ホモセリン（homoserine）にアシル基（acyl）が結合した化合物を意味し、スクシニルホモセリンとアセチルホモセリンの両方が含まれる。例えば、前記アシルホモセリンは、Ｏ－スクシニルホモセリン又はＯ－アセチルホモセリンであるが、これらに限定されるものではない。
本出願における前記ｍｅｔＺ遺伝子がコードする酵素は、スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ（succinylhomoserine sulfhydrylase）、アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（acetylhomoserine sulfhydrylase）又はＯ－スクシニルホモセリンを基質としてスルフヒドレーションに関与する酵素をコードすることが知られている遺伝子であるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「スルフヒドレーション（sulfhydration）」とは、「スルフヒドリレーション（sulfhydrylation）」と相互交換的に用いられる用語であり、スルフヒドリル（－ＳＨ）官能基を特定分子に提供する反応を意味する。前述した用語は、本出願の目的上、メチオニン合成過程における反応を意味するものであるが、これに限定されるものではない。前記「スルフヒドレーション」に関与する酵素は、「スルフヒドリラーゼ（sulfhydrylase）」ともいうが、これに限定されるものではない。
従来、メチオニン発酵反応において、ｍｅｔＺ遺伝子が発現する酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで次の反応に用いられていた。
ＣＨ３ＳＨ＋Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン⇒酢酸塩＋メチオニン
ＣＨ３ＳＨ＋Ｏ－スクシニル－Ｌ－ホモセリン⇒コハク酸塩＋メチオニン
ＣＨ３ＳＨ＋Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン⇒酢酸塩＋メチオニン
ＣＨ３ＳＨ＋Ｏ－スクシニル－Ｌ－ホモセリン⇒コハク酸塩＋メチオニン
すなわち、微生物を用いてメチオニン前駆体を作製する第１ステップと、メチオニン前駆体を含む発酵液にメチルメルカプタン及びメチオニン変換酵素を添加してｉｎ ｖｉｔｒｏで酵素反応を行う第２ステップとを含むメチオニン製造方法において、ｍｅｔＺ遺伝子が発現する酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでメチオニン変換酵素として用いられていた（特許文献１参照）
一方、コリネバクテリウム属微生物におけるメチオニン発酵は、２種類のスルフヒドレーション経路（sulfhydrylation step）を用いる（非特許文献３）。一方は、ｍｅｔＢという遺伝子によりコードされる酵素を用いて、Ｏ－アセチルホモセリン（acetyl homoserine: AH）をシスタチオニン（cystathionine）に変換するものであり、この場合はシステイン（cysteine）を硫黄源として用いる。すなわち、アシルホモセリンとシステインを反応物としてシスタチオニンに変換する反応を「トランススルフレーション（transsulfuration）」といい、それに関与する酵素を「トランススルフラーゼ（transsulfurase）」という。他方は、ｍｅｔＹという遺伝子によりコードされる酵素を用いて、Ｏ－アセチルホモセリンをホモシステイン（homocysteine）に変換するものであり、この場合は硫化水素（hydrogen sulfide）などの無機（inorganic）硫黄化合物を硫黄源として用いる。このようにアシルホモセリンと硫化水素を反応物としてホモシステインに変換する反応は、前述したトランススルフレーションとは異なり、メチオニンの前駆体であるホモシステインが生成される過程で中間産物であるシスタチオニンが生成されないので、これをダイレクトスルフヒドレーション（direct sulfhydrylation）という。
すなわち、前記スルフヒドレーション経路とは、アシルホモセリンと硫黄源の反応により他の物質に変換する反応経路を意味し、トランススルフレーションとダイレクトスルフヒドレーションに大別される。
しかし、コリネバクテリウム菌株において前記スルフヒドレーションに関与する２つの酵素には、どちらも欠点がある。例えば、ｍｅｔＢ遺伝子によりコードされるタンパク質は、シスタチオニン以外にも、アセチルホモセリンとホモシステインを用いることにより、ホモランチオニン（homolanthionine）という副産物を生成する（非特許文献１）。また、ｍｅｔＹ遺伝子は、メチオニンにより受けるフィードバック阻害（feedback inhibition）が大きいことが知られている（非特許文献２）。
本出願は、前記外来ｍｅｔＺ遺伝子をコリネバクテリウム菌株に導入し、単一段階反応でメチオニンを生物学的に製造する場合に、前記ｍｅｔＺ遺伝子の導入がメチオニン発酵に有用であることを解明したことに特徴がある。
本出願のｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質が関与するメチオニン合成経路においては、副産物生成量が減少する。前記副産物は、ホモランチオニンであってもよい。前記副産物生成量の減少とは、野生型微生物に比べて、又はｍｅｔＢによりコードされるタンパク質が関与する合成経路における副産物生成量に比べて減少することを意味するが、これらに限定されるものではない。
よって、本出願の外来ｍｅｔＺ遺伝子が導入された微生物及びそれを培養するステップを含むメチオニン生産方法は、外来ｍｅｔＺ遺伝子が導入されていないメチオニン生産微生物及びそれを用いたメチオニン生産方法に比べて、副産物生成量が減少するものであってもよい。本出願のｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質は、メチオニンによりフィードバック阻害を受けないものであってもよい。
本出願のｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質は、Ｏ－アシルホモセリンスルフヒドリラーゼ（acylhomoserine sulfhydrylase）であって、硫化水素（hydrogen sulfide）を硫黄源として用いるものであってもよく、Ｏ－アシルホモセリントランススルフラーゼ（acylhomoserine transsulfurase）であって、ｃｙｓｔｅｉｎｅを硫黄源として用いるものであってもよい。より具体的には、前記タンパク質は、Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼであってもよく、Ｏ－アセチルホモセリントランススルフラーゼであってもよく、Ｏ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼであってもよく、Ｏ－スクシニルホモセリントランススルフラーゼであってもよい。よって、本出願におけるｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質は、Ｏ－アシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性を有するタンパク質であってもよく、具体的には、Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、Ｏ－アセチルホモセリントランススルフラーゼ、Ｏ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ及びＯ－スクシニルホモセリントランススルフラーゼのうち１つ以上の活性を有するタンパク質であってもよい。
例えば、本出願の外来ｍｅｔＺ遺伝子は、前記遺伝子が導入されるＬ－メチオニン生産微生物とは異なる由来の遺伝子であってもよく、前記遺伝子が導入されるＬ－メチオニン生産微生物に内在する遺伝子とは異なるものであってもよい。具体的には、前記遺伝子は、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）、ヒポモナス・ネプツニウム（Hyphomonas neptunium）又はロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）由来のｍｅｔＺという遺伝子であるが、これらに限定されるものではなく、本出願の目的上、前記遺伝子は、Ｌ－メチオニン生産能を強化することができるものであればいかなるものでもよい。前記ｍｅｔＺ遺伝子は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列が得られ、当該配列を確保する方法として、当該分野で周知の様々な方法を用いることができる。
本出願における外来ｍｅｔＺによりコードされるタンパク質は、配列番号６０、６１及び６２のいずれかのポリペプチド配列、並びにそれと９０％以上の相同性又は同一性を有するポリペプチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列（ポリペプチド配列）を含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。例えば、前記タンパク質は、配列番号６０、６１及び６２のいずれかのポリペプチド配列と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９７．７％、９７．８％、９８％、９８．５％、９８．７％、９８．８％、９９％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、又はそれ以上１００％未満の相同性又は同一性を有するポリペプチド配列を含むものであり、例えば配列番号６６～７１のいずれかのポリペプチド配列、及びそれと９０％以上の相同性又は同一性を有するポリペプチド配列から選択される配列を含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願のｍｅｔＺ遺伝子は、配列番号６３、６４及び６５から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と９０％以上の相同性又は同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むものであってもよい。例えば、前記遺伝子は、配列番号６３、６４及び６５から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９７．７％、９７．８％、９８％、９８．５％、９８．７％、９８．８％、９９％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、又はそれ以上１００％未満の相同性又は同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むものであってもよい。
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ鎖を意味する。
本出願におけるｍｅｔＺ遺伝子が、配列番号６３、６４及び６５から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質、又は配列番号６０、６１及び６２のうち少なくとも１つのアミノ酸配列を有するタンパク質に相当する効果を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むものであれば、前記配列の一部が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むものであっても、本出願に含まれることは言うまでもない。
一例において、前記ｍｅｔＺ遺伝子は、配列番号６０、６１及び６２のいずれかのアミノ酸配列の一部、例えば１～２０個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列をコードするものであってもよい。他の例において、前記ｍｅｔＺ遺伝子は、前記アミノ酸配列の前後に２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個又は１１個以下のアミノ酸配列が付加された配列をコードする配列であってもよい。さらに他の例において、前記ｍｅｔＺ遺伝子は、前述した置換及び付加を全て含むアミノ酸配列をコードする配列であってもよいが、これに限定されるものではない。
また、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであればいかなるものでもよい。
すなわち、本出願において、特定配列番号の塩基配列を含むポリヌクレオチド、特定配列番号の塩基配列からなるポリヌクレオチド、特定配列番号の塩基配列を有するポリヌクレオチドと記載されていても、前記配列番号のポリヌクレオチドから構成される塩基配列によりコードされるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであっても本出願に含まれることは言うまでもない。例えば、アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にタンパク質の機能を変更しない配列の付加、自然に発生し得る突然変異、その非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられる。
前記「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。
本出願における「相同性（homology）」及び「同一性（identity）」とは、２つの与えられた塩基配列が関連する程度を意味し、百分率で表される。
相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられる。
保存されている（conserved）ポリヌクレオチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリッドすることができる。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドが一般のコドンの代わりに縮退を考慮したコドンを有するようにするものも含まれることは言うまでもない。
任意の２つのポリヌクレオチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献４のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献５）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献６）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献８、９及び１０）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献１１に開示されているように、非特許文献６などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献１２に開示されているように、非特許文献１３の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。
また、任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献１４、１５）で決定される。
さらに、本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記ポリヌクレオチドを発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、ポリペプチド配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。さらに、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、導入する微生物内に天然に存在する配列ではなく、Ｌ－メチオニン生産能を向上させることのできるポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、様々な文献（例えば、非特許文献１４）に具体的に記載されており、当該技術分野で周知である。例えば、相同性（homology）もしくは同一性（identity）の高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性もしくは同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つのポリヌクレオチドが相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似するポリヌクレオチド配列だけでなく、全配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド断片が含まれてもよい。
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献１６参照）。
本出願における「タンパク質の導入」とは、微生物が本来持っていなかった特定タンパク質の活性が現れるようにすること、又は当該タンパク質の内在性活性もしくは改変前の活性に比べて向上した活性が現れるようにすることを意味する。例えば、特定タンパク質が導入されることや、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドが微生物中の染色体に導入されることや、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが微生物内に導入されてその活性が現れることであってもよい。本出願におけるタンパク質の導入は、特定のタンパク質活性のない微生物におけるタンパク質の活性強化ともいえる。
前記タンパク質の導入は、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すタンパク質をコードする外来ポリヌクレオチド、又はそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することにより行われる。前記外来ポリヌクレオチドは、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列が限定されるものではない。また、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、導入された前記外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化して宿主細胞内に導入してもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現することにより、タンパク質が産生されてその活性が増加する。
前記導入されたタンパク質の活性強化は、１）前記タンパク質をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させる方法、２）前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域を活性が強力な配列に置換する方法、３）前記タンパク質の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域の塩基配列を改変する方法、４）前記タンパク質の活性が増加するように染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法、５）前記方法の組み合わせなどにより行われるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的遺伝子を導入できるように、好適な調節配列に作動可能に連結された標的ポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、染色体内で標的ポリヌクレオチドを変異したポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができるが、これに限定されるものではない。
本出願のベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されるものでもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
さらに、本出願における「作動可能に連結」されたものとは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。
本出願のベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本出願の微生物には、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれ、本出願において説明する外来ｍｅｔＺ遺伝子が導入された微生物や、前記遺伝子を含有する微生物であればいかなるものでもよい。
前記微生物は、本出願の外来ｍｅｔＺ遺伝子と、それによりコードされるタンパク質と、前記ｍｅｔＺ遺伝子を含むベクターの少なくとも１つを含み、Ｌ－メチオニンを生産する微生物であってもよい。
本出願における「Ｌ－メチオニン生産微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするＬ－メチオニン生産のために遺伝的変異（modification）を起こした微生物を意味する。
前記Ｌ－メチオニン生産微生物は、本出願の外来ｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質を含み、親株又は非改変微生物に比べてＬ－メチオニン生産能が向上した微生物であってもよい。
本出願における「改変前の菌株」又は「改変前の微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株もしくは天然菌株自体、又は自然要因もしくは人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する前の菌株を意味する。前記「改変前の菌株」又は「改変前の微生物」は、「非変異菌株」、「非改変菌株」、「非変異微生物」、「非改変微生物」又は「基準微生物」と混用される。あるいは、Ｌ－メチオニン生合成経路に関与する遺伝子の発現量が調節されていない微生物であってもよく、内在的に存在しないｍｅｔＺ遺伝子が導入されていない微生物であってもよい。
本出願のＬ－メチオニン生産微生物は、Ｌ－メチオニン生合成経路のタンパク質の一部の活性が強化されるか、Ｌ－メチオニン分解経路のタンパク質の一部の活性が弱化されることにより、Ｌ－メチオニン生産能が強化された微生物であってもよい。
一例として、本出願のＬ－メチオニン生産微生物は、ｍｅｔＺ導入以外にも、シスタチオニンγ－シンターゼの活性弱化又は不活性化と、Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼの活性弱化又は不活性化と、メチオニン－システイン生合成抑制因子の活性弱化又は不活性化と、メチオニンシンターゼの活性強化と、亜硫酸レダクターゼの活性強化とからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝的改変を含むものであってもよい。あるいは、前記遺伝的改変は、ｍｅｔＢ遺伝子の欠失／発現抑制と、ｍｅｔＹ遺伝子の欠失と、ｍｃｂＲ遺伝子の欠失／発現抑制と、ｍｅｔＨの発現強化及びｃｙｓＩ遺伝子の発現強化とからなる群から選択される少なくとも１つの変異がさらに導入されたものであってもよく、さらに、前記ｍｅｔＢ遺伝子は配列番号２５、ｍｅｔＹ遺伝子は配列番号２６、ｍｃｂＲ遺伝子は配列番号１、ｍｅｔＨ遺伝子は配列番号３９、ｃｙｓＩ遺伝子は配列番号４０のポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性又は同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。前述した相同性又は同一性についての説明は、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＹ、ｍｃｂＲ、ｍｅｔＨ及びｃｙｓＩ遺伝子においても同様である。
ただし、前述した遺伝子は一例であり、これらに限定されるものではなく、様々な公知のＬ－メチオニン生合成経路のタンパク質活性を強化するか、分解経路のタンパク質活性を不活性化／弱化させた微生物であってもよい。
本出願におけるポリペプチド又はタンパク質の活性の「強化」とは、ポリペプチド又はタンパク質の活性を内在性活性に比べて増加させることを意味する。前記強化は、上方調節（up-regulation）、過剰発現（overexpression）、増加（increase）などと混用される。ここで、増加には、本来なかった活性を示すようになることや、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することが全て含まれる。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチド又はタンパク質の活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用されてもよい。ポリペプチド又はタンパク質の活性が内在性活性に比べて「強化」又は「増加」するとは、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチド又はタンパク質の活性に比べて向上することを意味する。前記「活性の増加」は、外来ポリペプチド又はタンパク質の導入により達成してもよく、内在性ポリペプチド又はタンパク質の活性の強化により達成してもよい。具体的には、内在性ポリペプチド又はタンパク質の活性の強化により達成してもよい。前記ポリペプチド又はタンパク質の活性が強化されたか否かは、当該ポリペプチド又はタンパク質の活性の程度、発現量、又は当該タンパク質から生産される産物の量の増加により確認することができる。
前記ポリペプチド又はタンパク質の活性の強化には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができ、標的ポリペプチド又はタンパク質の活性を改変前の微生物より強化できるものであれば、いかなるものでもよい。前記方法は、これらに限定されるものではないが、分子生物学における通常の方法であり、当該技術分野における通常の技術者に周知の遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を用いたものであってもよい（非特許文献１７、１８など）。
前記遺伝子工学を用いてポリペプチド又はタンパク質の活性を強化する方法は、例えば１）前記ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させる方法、２）前記ポリペプチド又はタンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域を活性が強力な配列に置換する方法、３）前記ポリペプチド又はタンパク質の開始コドン又は５’ＵＴＲ地域の塩基配列を改変する方法、４）前記ポリペプチド又はタンパク質の活性が増加するように染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法、５）前記ポリペプチド又はタンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドや、前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを導入する方法、６）前記方法の組み合わせなどにより行われるが、これらに限定されるものではない。
前記タンパク質工学を用いてポリペプチド又はタンパク質の活性を強化する方法は、例えばポリペプチド又はタンパク質の三次構造を分析し、露出部位を選択して改変する方法や、化学的に修飾する方法などにより行われるが、これらに限定されるものではない。
前記１）ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させる方法は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば当該ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターを宿主細胞内に導入することにより行われてもよい。あるいは、前記遺伝子が作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体に前記遺伝子又はポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞内に導入することにより行われてもよいが、これらに限定されるものではない。前記ベクターについては前述した通りである。
前記２）ポリペプチド又はタンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域（又は発現調節配列）を活性が強力な配列に置換する方法は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば前記発現調節領域の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行われるか、より強い活性を有する核酸配列に置換することにより行われる。前記発現調節領域には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれてもよい。前記方法は、具体的には、本来のプロモーターに代えて強力な異種プロモーターを連結するものであってもよいが、これに限定されるものではない。
公知の強力なプロモーターの例としては、ｃｊ１～ｃｊ７プロモーター（特許文献２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献３）、Ｏ２プロモーター（特許文献４）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記３）ポリペプチド又はタンパク質の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域の塩基配列を改変する方法は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば前記ポリペプチド又はタンパク質の内在性開始コドンを前記内在性開始コドンに比べてポリペプチド又はタンパク質の発現率が高い他の開始コドンに置換するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記４）ポリペプチド又はタンパク質の活性が増加するように染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行われるか、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行われる。前記置換は、具体的には相同組換えにより前記遺伝子を染色体に挿入するものであってもよいが、これに限定されるものではない。
ここで、用いられるベクターは、染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーについては前述した通りである。
前記５）ポリペプチド又はタンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドを導入する方法は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば前記ポリペプチド又はタンパク質と同一／類似の活性を示すポリペプチド又はタンパク質をコードする外来ポリヌクレオチドや、そのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより行われてもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチド又はタンパク質と同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列が限定されるものではない。また、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、導入された前記外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化して宿主細胞に導入してもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現することにより、ポリペプチド又はタンパク質が産生されてその活性が増加する。
最後に、６）前記方法の組み合わせは、前記１）～５）の少なくとも１つの方法を共に適用することにより行われる。
このようなポリペプチド又はタンパク質の活性の強化は、対応するポリペプチド又はタンパク質の活性又は濃度が野生型微生物や改変前の微生物の菌株で発現したポリペプチド又はタンパク質の活性又は濃度に比べて増加するものであるか、当該ポリペプチド又はタンパク質から生産される産物の量が増加するものであるが、これらに限定されるものではない。
本出願におけるポリペプチド又はタンパク質の「不活性化」又は「弱化」は、内在性活性に比べて活性が低下することや、活性がなくなることが全て含まれる概念である。前記不活性化又は弱化は、下方調節（down-regulation）、減少（decrease）、低下（reduce）などと混用される。前記不活性化又は弱化には、前記タンパク質をコードする遺伝子の変異などによりタンパク質自体の活性が本来微生物が有するタンパク質の活性に比べて減少又は除去される場合や、それをコードする遺伝子の発現阻害や翻訳（translation）阻害などにより細胞内での全体的なタンパク質活性の程度が天然菌株に比べて低下する場合や、前記遺伝子の発現が全くない場合や、発現があったとしてもその活性がない場合が含まれる。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチド又はタンパク質の活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用される。ポリペプチド又はタンパク質の活性が内在性活性に比べて「減少」するとは、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチド又はタンパク質の活性に比べて低下することを意味する。
このようなタンパク質の不活性化又は活性の弱化は、これらに限定されるものではないが、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる（非特許文献１８、１９など）。
前記方法の例として、１）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、２）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（又は発現調節配列）を改変する方法、３）前記タンパク質の活性が欠失又は弱化するようにタンパク質をコードする前記遺伝子配列を改変する方法、４）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の転写産物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、５）前記タンパク質をコードする前記遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、６）前記タンパク質をコードする前記遺伝子のポリヌクレオチド配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加する方法（Reverse transcription engineering, RTE）などが挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、上記例に特に限定されるものではない。
具体的には、前記タンパク質をコードする前記遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法は、微生物中の染色体導入用ベクターを用いて、染色体内の内在性標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部のヌクレオチド配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行うことができる。このようなポリヌクレオチドの全部又は一部を欠失させる方法の一例として、相同組換えによりポリヌクレオチドを欠失させる方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
また、前記遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法は、紫外線などの光又は化学物質を用いて突然変異を誘発し、得られた突然変異体から標的遺伝子が欠失した菌株を選択することにより行うことができる。前記遺伝子欠失方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれる。前記ＤＮＡ組換え技術は、例えば標的遺伝子に相同性を有するヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列又はベクターを前記微生物に導入して相同組換え（homologous recombination）を起こすことにより行うことができる。また、前記導入されるヌクレオチド配列又はベクターには、優性選択マーカーが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。
さらに、前記発現調節配列を改変する方法は、当該分野で公知の様々な方法を適用することにより達成することができる。前記方法の例として、前記発現調節領域（又は発現調節配列）の活性がさらに弱化するように、ポリヌクレオチド配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節領域（又は発現調節配列）上の変異を誘導して行うこともでき、より活性が弱いポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
さらに、前記遺伝子配列を改変する方法は、前記ポリペプチドの活性がさらに弱化するように、遺伝子配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、活性がさらに弱化するように改良された遺伝子配列又は活性がなくなるように改良された遺伝子配列に置換することにより行うこともできるが、これらに限定されるものではない。
例えば、遺伝子配列における変異を導入して終止コドンを形成することにより、遺伝子の発現を阻害又は弱化させることができる。
ただし、前述した方法は一例であり、タンパク質の活性強化又は不活性化方法及び遺伝子操作方法は当該技術分野で公知であるので、前記Ｌ－メチオニン生産微生物は公知の様々な方法を適用して製造することができる。
本出願の微生物は、コリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本出願における「コリネバクテリウム属微生物」は、コリネバクテリウム属微生物であればいかなるものでもよい。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）であり、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムである。
本出願の微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常のコリネバクテリウム属微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、具体的には好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性又は嫌気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。
本出願における前記炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的にはグルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
前記硫黄源としては、メタンスルホン酸塩（methanesulfonate）、エタンスルホン酸塩（ethanesulfonate）をはじめとするアルカンスルホン酸塩（alkanesulfonate）、硫酸塩、亜硫酸塩（sulfite）、Ｈ２Ｓなどの硫化水素、スルフィド、スルフィド誘導体、チオグリコール酸塩、チオシアン酸塩、チオ尿素などの有機及び無機硫黄含有化合物とチオ硫酸塩の混合物の形態を用いてもよく、硫黄源としてチオ硫酸塩以外の物質を用いなくてもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願のＬ－メチオニン製造方法は、前記微生物をチオ硫酸塩含有培地で培養するステップを含んでもよい。具体的には、本出願の微生物は、外来ｍｅｔＺを含み、チオ硫酸塩を硫黄源として用いるものであり、前記チオ硫酸塩は、微生物の硫黄源として用いられるが、これらに限定されるものではない。
無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、炭酸カルシウムなどを用いることができる。それ以外に、前記培地は、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを含有してもよい。前記培地又は前駆体は、培養物に回分式又は連続式で添加することができるが、これらに限定されるものではない。
本出願において、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培養物に好適な方式で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培養物の好気状態を維持するために、培養物中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。
培養物の温度は、２５℃～４０℃、より具体的には２８℃～３７℃であるが、これらに限定されるものではない。培養期間は、有用物質の所望の生成量が得られるまで続けられ、具体的には１時間～１００時間であるが、これらに限定されるものではない。
本出願のメチオニン製造方法は、前記微生物又は培地からＬ－メチオニンを回収するステップを含んでもよい。
本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて培地から目的とする硫黄含有アミノ酸又は硫黄含有アミノ酸誘導体を回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記方法は、さらなる精製工程を含んでもよい。前記精製工程は、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて行うことができる。
本出願のさらに他の態様は、前記微生物及びチオ硫酸塩を含むＬ－メチオニン生産用組成物を提供する。
本出願の組成物は、Ｌ－メチオニン生産用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本出願のさらに他の態様は、微生物に外来ｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質を導入するステップを含むＬ－メチオニン生産微生物製造方法を提供する。
本出願のさらに他の態様は、外来ｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質が導入された微生物のＬ－メチオニン生産における使用を提供する。
前記微生物、外来ｍｅｔＺ遺伝子及びそれによりコードされるタンパク質、タンパク質の導入については前述した通りである。
以下、実施例を挙げて本出願を詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１：プラスミドの作製
コリネバクテリウム染色体への遺伝子の挿入及び置換のためのプラスミド（ｐＤＣＭ２，図１，配列番号８１）を設計し、バイニックス（株）の遺伝子合成（Gene-synthesis）サービスを用いてプラスミドを合成した。一般に知られているｓａｃＢ系に関する論文［非特許文献２０］を参考にして、クローニングに活用することが容易な制限酵素（restriction enzyme）を含むようにプラスミドを設計した。このように合成したｐＤＣＭ２プラスミドは、次のような特性を有する。
コリネバクテリウム染色体への遺伝子の挿入及び置換のためのプラスミド（ｐＤＣＭ２，図１，配列番号８１）を設計し、バイニックス（株）の遺伝子合成（Gene-synthesis）サービスを用いてプラスミドを合成した。一般に知られているｓａｃＢ系に関する論文［非特許文献２０］を参考にして、クローニングに活用することが容易な制限酵素（restriction enzyme）を含むようにプラスミドを設計した。このように合成したｐＤＣＭ２プラスミドは、次のような特性を有する。
１）大腸菌においてのみ作用する複製起点（replication origin）を有するので、大腸菌内では自己複製（self-replication）が可能であるが、コリネバクテリウムでは自己複製が不可能であるという特性を有する。
２）選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を有する。
３）２次陽性選択（positive-selection）マーカーとしてレバンスクラーゼ（Levan sucrase）遺伝子（ｓａｃＢ）を有する。
４）最終的に作製された菌株には、ｐＤＣＭ２プラスミドに由来するいかなる遺伝子情報も残っていない。
実施例１：ｍｃｂＲ遺伝子の欠損のための組換えベクターの作製
本実施例においては、メチオニン生産菌株を作製するために、野生型ＡＴＣＣ１３０３２菌株を用いて、公知のメチオニン－システイン生合成抑制因子をコードするｍｃｂＲ（非特許文献２１）を不活性化するベクターを作製した。
本実施例においては、メチオニン生産菌株を作製するために、野生型ＡＴＣＣ１３０３２菌株を用いて、公知のメチオニン－システイン生合成抑制因子をコードするｍｃｂＲ（非特許文献２１）を不活性化するベクターを作製した。
具体的には、ｍｃｂＲ遺伝子をコリネバクテリウムＡＴＣＣ１３０３２染色体上で欠損させるために、次の方法で組換えプラスミドベクターを作製した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に報告されている塩基配列に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカムのｍｃｂＲ遺伝子及び周辺配列（配列番号１）を確保した。
ｍｃｂＲ遺伝子を欠損させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２及び３、配列番号４及び５のプライマーを用いてＰＣＲを行った（表１）。
ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれ７００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＣＭ２ベクターと前述したように増幅したｍｃｂＲ遺伝子断片を染色体導入用制限酵素ｓｍａＩで処理し、次いでｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇ反応後に、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得て、ｐＤＣＭ２－ΔｍｃｂＲと命名した。
実施例２：ｍｃｂＲ遺伝子が欠損した菌株の作製及び培養
実施例１で作製したｐＤＣ－ΔｍｃｂＲベクターを染色体上での相同組換えによりＡＴＣＣ１３０３２菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献２２）。その後、スクロースを含む固体培地で２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号６、７（表２）を用いたＰＣＲ法によりｍｃｂＲ遺伝子が欠損した菌株を確認し、本組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＭ０２－０６１８と命名した。
実施例１で作製したｐＤＣ－ΔｍｃｂＲベクターを染色体上での相同組換えによりＡＴＣＣ１３０３２菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献２２）。その後、スクロースを含む固体培地で２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号６、７（表２）を用いたＰＣＲ法によりｍｃｂＲ遺伝子が欠損した菌株を確認し、本組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＭ０２－０６１８と命名した。
前記ＣＭ０２－０６１８は、ブダペスト条約上の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１９年１月４日付けで受託番号ＫＣＣＭ１２４２５Ｐとして寄託した。
前述したように作製したＣＭ０２－０６１８のＬ－メチオニン生産能を分析するために、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株と共に次の方法で培養した。
次の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２と発明菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＣＭ０２－０６１８を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。生産培地において、硫黄源としてはチオ硫酸塩の一種である（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３を用いた。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３１２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ，シアノコバラミン（Vitamin B12）１μｇ（蒸留水１リットル中）
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３１２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ，シアノコバラミン（Vitamin B12）１μｇ（蒸留水１リットル中）
上記培養方法で培養し、培養液中のＬ－メチオニン濃度を分析した。それを表３に示す。
その結果、ｍｃｂＲ単独除去菌株において、Ｌ－メチオニンが生産されることが確認された。
実施例３－１：３種の外来ｍｅｔＺ遺伝子導入のためのベクターの作製
コリネバクテリウム菌株に外来ｍｅｔＺを導入し、従来のメチオニン生合成方法の欠点を補完すると共にメチオニン生産を強化することを目的とした。具体的には、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium Violaceum）、ヒポモナス・ネプツニウム（Hyphomonas Neptunium）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）由来ｍｅｔＺを導入するためのベクターを作製した。
コリネバクテリウム菌株に外来ｍｅｔＺを導入し、従来のメチオニン生合成方法の欠点を補完すると共にメチオニン生産を強化することを目的とした。具体的には、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium Violaceum）、ヒポモナス・ネプツニウム（Hyphomonas Neptunium）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）由来ｍｅｔＺを導入するためのベクターを作製した。
より具体的には、３種の外来ｍｅｔＺ遺伝子をそれぞれコリネバクテリウムＡＴＣＣ１３０３２染色体上に追加挿入するために、次の方法で組換えプラスミドベクターを作製した。
まず、ｍｅｔＺを挿入するために、Ｎｃｇｌ１０２１（Transposase）を除去するベクターを作製した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に報告されている塩基配列に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカムのＮｃｇｌ１０２１及び周辺配列（配列番号８）を確保した。Ｎｃｇｌ１０２１遺伝子を欠損させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２のプライマー（表４）を用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれＤＮＡ断片が得られた。コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＣＭ２ベクターと前述したように増幅したＮｃｇｌ１０２１遺伝子断片を染色体導入用制限酵素ｓｍａＩで処理し、次いでｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇ反応後に、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得て、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１と命名した。
ｍｅｔＺ（クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium Violaceum）、ヒポモナス・ネプツニウム（Hyphomonas Neptunium）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）由来）遺伝子を得るために、それぞれクロモバクテリウム・ビオラセウム、ヒポモナス・ネプツニウム、ロドバクター・スフェロイデスの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８を用いてＰＣＲを行った。また、３種のｍｅｔＺ遺伝子をそれぞれ発現するために、Ｐｓｐｌ１プロモーターを用い、Ｐｓｐｌ１においては、公知のｓｐｌ１－ＧＦＰ（特許文献５）ベクターＤＮＡを鋳型とし、それぞれ配列番号１９及び２０、配列番号１９及び２１、配列番号１９及び２２を用いてＰＣＲを行った（表５）。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。
その結果、３種の外来ｍｅｔＺ遺伝子断片（配列番号６３～６５）、及び３種のｍｅｔＺ遺伝子を発現するための各ｓｐｌ１プロモーター断片が得られた。コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１ベクターを制限酵素ｓｃａＩで処理し、次いで前述したように増幅したｓｐｌ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ断片及びｍｅｔＺ断片と共に、各菌株のｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇ反応後に、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法により計３種のプラスミドを得て、それぞれｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＣｖｉｍｅｔＺ（クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium Violaceum）ｍｅｔＺ）、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＨｎｅｍｅｔＺ（ヒポモナス・ネプツニウム（Hyphomonas Neptunium）ｍｅｔＺ）、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ（ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）ｍｅｔＺ）と命名した。
実施例３－２：ｍｅｔＺ遺伝子導入のためのベクターの作製
周知の６つのロドバクター・スフェロイデス由来ｍｅｔＺ遺伝子の配列に対するベクターをさらに作製した（特許文献６及び７参照）。前述した実施例３－１の方法と同様に、配列番号６６～７１のアミノ酸配列をコードするｍｅｔＺ遺伝子がそれぞれ導入されたベクターを作製した。各ｍｅｔＺ遺伝子をＲｓｐｍｅｔＺ＿ｌｏｎｇ、ＲｓｐｍｅｔＺ＿３、ＲｓｐｍｅｔＺ＿６５、ＲｓｐｍｅｔＺ＿１０４、ＲｓｐｍｅｔＺ＿１９６、ＲｓｐｍｅｔＺ＿３＿６５＿１０４と命名した。各遺伝子の導入のために用いたプライマーは次の通りである。
周知の６つのロドバクター・スフェロイデス由来ｍｅｔＺ遺伝子の配列に対するベクターをさらに作製した（特許文献６及び７参照）。前述した実施例３－１の方法と同様に、配列番号６６～７１のアミノ酸配列をコードするｍｅｔＺ遺伝子がそれぞれ導入されたベクターを作製した。各ｍｅｔＺ遺伝子をＲｓｐｍｅｔＺ＿ｌｏｎｇ、ＲｓｐｍｅｔＺ＿３、ＲｓｐｍｅｔＺ＿６５、ＲｓｐｍｅｔＺ＿１０４、ＲｓｐｍｅｔＺ＿１９６、ＲｓｐｍｅｔＺ＿３＿６５＿１０４と命名した。各遺伝子の導入のために用いたプライマーは次の通りである。
まず、ＲｓｐｍｅｔＺ＿ｌｏｎｇを得るために、ロドバクター・スフェロイデスの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１９及び２２、配列番号７２及び１８を用いてＰＣＲを行った。
その結果、遺伝子断片及びｓｐｌ１プロモーター断片が得られた。
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１ベクターを制限酵素ｓｃａＩで処理し、次いで前述したように増幅したｓｐｌ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ断片及びｍｅｔＺ断片と共に、各菌株のｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇ反応後に、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得て、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿ｌｏｎｇと命名した。
ＲｓｐｍｅｔＺ＿３、ＲｓｐｍｅｔＺ＿６５、ＲｓｐｍｅｔＺ＿１０４、ＲｓｐｍｅｔＺ＿１９６、ＲｓｐｍｅｔＺ＿３＿６５＿１０４を得るために、それぞれｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿ｌｏｎｇベクターＤＮＡを鋳型とし、配列番号７２及び７３、配列番号７４及び１８（ＲｓｐｍｅｔＺ＿３）、配列番号７２及び７５、配列番号７６及び１８（ＲｓｐｍｅｔＺ＿６５）、配列番号７２及び７７、配列番号７８及び１８（ＲｓｐｍｅｔＺ＿１０４）、配列番号７１及び７９、配列番号８０及び１８（ＲｓｐｍｅｔＺ＿１９６）、配列番号７２及び７３、配列番号７４及び７５、配列番号７６及び７７、配列番号７７及び１８（ＲｓｐｍｅｔＺ＿３＿６５＿１０４）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。
その結果、計１０個の断片が得られた。
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１ベクターを制限酵素ｓｃａＩで処理し、次いでそれぞれＲｓｐｍｅｔＺ＿３は断片１、断片２、ＲｓｐｍｅｔＺ＿６５は断片３、断片４、ＲｓｐｍｅｔＺ＿１０４は断片５、断片６、ＲｓｐｍｅｔＺ＿１９６は断片７、断片８、ＲｓｐｍｅｔＺ＿３＿６５＿１０４は断片１、断片１１、断片１２、断片６と共に、ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇ反応後に、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法により計６種のプラスミドを得て、それぞれｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿ｌｏｎｇ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿３、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿６５、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿１０４、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿１９６、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿３＿６５＿１０４と命名した。
実施例４：外来ｍｅｔＺが導入された菌株の作製及び培養
実施例２で作製したメチオニン生産菌株であるＣＭ０２－０６１８菌株に９種の外来ｍｅｔＺを導入した。
実施例２で作製したメチオニン生産菌株であるＣＭ０２－０６１８菌株に９種の外来ｍｅｔＺを導入した。
具体的には、実施例３で作製したｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＣｖｉｍｅｔＺ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＨｎｅｍｅｔＺ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿ｌｏｎｇ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿３、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿６５、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿１０４、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿１９６及びｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿３＿６５＿１０４ベクターを染色体上での相同組換えにより、実施例２で作製したメチオニン生産菌株であるＣＭ０２－０６１８菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献２２）。
その後、スクロースを含む固体培地で２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号２３、２４を用いたＰＣＲ法によりＮｃｇｌ１０２１が欠損した菌株、及びＮｃｇｌ１０２１が欠損すると共にｍｅｔＺ遺伝子が挿入された菌株を確認した。ＣＭ０２－０６１８に前述した９種のベクターがそれぞれ導入された組換え菌株をＣＭ０２－０６１８／ΔＮｃｇｌ０２１、ＣＭ０２－０７５７、ＣＭ０２－０７５８、ＣＭ０２－０７５９－１、ＣＭ０２－０７５９－２、ＣＭ０２－０７５９－３、ＣＭ０２－０７５９－４、ＣＭ０２－０７５９－５、ＣＭ０２－０７５９と命名した。
前述したように作製した菌株のＬ－メチオニン生産能を分析するために、親株であるＣＭ０２－０６１８菌株と共に次の方法で培養した。
次の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに前記菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３１２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ，コバラミン（Vitamin B12）１μｇ（蒸留水１リットル中）
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３１２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ，コバラミン（Vitamin B12）１μｇ（蒸留水１リットル中）
また、従来からメチオニン酵素変換で用いられている硫黄源との比較のために、前記生産培地において硫黄源をチオ硫酸塩（Ｓ２Ｏ３）からメチルメルカプタン（ＣＨ３ＳＨ）に変更し、前記菌株を同様に培養した。各培養終了後に、培養液中のＬ－メチオニン濃度を分析した。それを表８に示す。
その結果、９種のｍｅｔＺ遺伝子がそれぞれ導入されることにより、対照群の菌株に比べて、Ｌ－メチオニン生産能が２６６％以上増加することが確認された。よって、本出願の外来ｍｅｔＺがｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌａｔｉｏｎによりメチオニン生産能を大幅に向上させ、特にメチルメルカプタンを硫黄源として用いる従来の方法に比べて、効率に優れることが確認された。従って、コリネバクテリウム・グルタミカムｍｅｔＢ及びｍｅｔＹとは異なり、本出願の外来ｍｅｔＺは、フィードバック阻害を受けず、メチオニン収率が増加するものと解釈される。
前記ＣＭ０２－０７５７、ＣＭ０２－０７５８、ＣＭ０２－０７５９菌株は、ブダペスト条約上の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１９年５月２日付けでそれぞれ受託番号ＫＣＣＭ１２５０６Ｐ、ＫＣＣＭ１２５０７Ｐ、ＫＣＣＭ１２５０８Ｐとして寄託した。
実施例５：ｍｅｔＢ及びｍｅｔＹ遺伝子を欠損させるための組換えベクターの作製
本出願のｍｅｔＺがコードするタンパク質の機能（活性）を確認し、それをｍｅｔＹ及びｍｅｔＢ活性と比較するために、Ｃ．ｇｌが有するｍｅｔＢ及びｍｅｔＹをそれぞれｄｅｌｅｔｉｏｎした。具体的には、ｍｅｔＢ及びｍｅｔＹ遺伝子をそれぞれ欠損させるために、次の方法で組換えプラスミドベクターを作製した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に報告されている塩基配列に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカムのｍｅｔＢ及びｍｅｔＹ遺伝子及び周辺配列（配列番号２５，２６）を確保した。
本出願のｍｅｔＺがコードするタンパク質の機能（活性）を確認し、それをｍｅｔＹ及びｍｅｔＢ活性と比較するために、Ｃ．ｇｌが有するｍｅｔＢ及びｍｅｔＹをそれぞれｄｅｌｅｔｉｏｎした。具体的には、ｍｅｔＢ及びｍｅｔＹ遺伝子をそれぞれ欠損させるために、次の方法で組換えプラスミドベクターを作製した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に報告されている塩基配列に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカムのｍｅｔＢ及びｍｅｔＹ遺伝子及び周辺配列（配列番号２５，２６）を確保した。
ｍｅｔＢ及びｍｅｔＹ遺伝子をそれぞれ欠損させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０（ｍｅｔＢ）のプライマーと、配列番号３１及び３２、配列番号３３及び３４（ｍｅｔＹ）のプライマーを用いてＰＣＲを行った（表９）。
ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれ７００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＣＭ２ベクターと前述したように増幅したｍｅｔＢ及びｍｅｔＹ遺伝子断片をそれぞれ染色体導入用制限酵素ｓｍａＩで処理し、次いでＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得た。得られたプラスミドをそれぞれｐＤＣＭ２－ΔｍｅｔＢ及びｐＤＣＭ２－ΔｍｅｔＹと命名した。
実施例６：３種のｍｅｔＺがそれぞれ強化された菌株からｍｅｔＢ及びｍｅｔＹ遺伝子をそれぞれ除去した菌株の作製及び培養
前述したように作製したｐＤＣＭ２－ΔｍｅｔＢ及びｐＤＣＭ２－ΔｍｅｔＹベクターを染色体上での相同組換えによりＣＭ０２－０６１８、ＣＭ０２－０７５７、ＣＭ０２－０７５８、ＣＭ０２－０７５９菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献２２）。その後、スクロースを含む固体培地で２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、それぞれ配列番号３５及び３６（ｍｅｔＢ）、配列番号３７及び３８（ｍｅｔＹ）を用いて、ｍｅｔＢ及びｍｅｔＹが遺伝子がそれぞれ欠損したか否かを確認した（表１０）。
前述したように作製したｐＤＣＭ２－ΔｍｅｔＢ及びｐＤＣＭ２－ΔｍｅｔＹベクターを染色体上での相同組換えによりＣＭ０２－０６１８、ＣＭ０２－０７５７、ＣＭ０２－０７５８、ＣＭ０２－０７５９菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献２２）。その後、スクロースを含む固体培地で２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、それぞれ配列番号３５及び３６（ｍｅｔＢ）、配列番号３７及び３８（ｍｅｔＹ）を用いて、ｍｅｔＢ及びｍｅｔＹが遺伝子がそれぞれ欠損したか否かを確認した（表１０）。
本組換え菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＣＭ０２－０６１８／ΔｍｅｔＢ、ＣＭ０２－０７５７／ΔｍｅｔＢ、ＣＭ０２－０７５８／ΔｍｅｔＢ、ＣＭ０２－０７５９／ΔｍｅｔＢ、ＣＭ０２－０６１８／ΔｍｅｔＹ、ＣＭ０２－０７５７／ΔｍｅｔＹ、ＣＭ０２－０７５８／ΔｍｅｔＹ、ＣＭ０２－０７５９／ΔｍｅｔＹと命名した。
前述したように作製したＣＭ０２－０６１８／ΔｍｅｔＢ、ＣＭ０２－０７５７／ΔｍｅｔＢ、ＣＭ０２－０７５８／ΔｍｅｔＢ、ＣＭ０２－０７５９／ΔｍｅｔＢ、ＣＭ０２－０６１８／ΔｍｅｔＹ、ＣＭ０２－０７５７／ΔｍｅｔＹ、ＣＭ０２－０７５８／ΔｍｅｔＹ、ＣＭ０２－０７５９／ΔｍｅｔＹ菌株のＬ－メチオニン生産能を分析するために、次の方法で培養した。
次の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、親株であるＣＭ０２－０６１８、ＣＭ０２－０７５７、ＣＭ０２－０７５８、ＣＭ０２－０７５９と、前述したように作製したＣＭ０２－０６１８／ΔｍｅｔＢ、ＣＭ０２－０７５７／ΔｍｅｔＢ、ＣＭ０２－０７５８／ΔｍｅｔＢ、ＣＭ０２－０７５９／ΔｍｅｔＢ、ＣＭ０２－０６１８／ΔｍｅｔＹ、ＣＭ０２－０７５７／ΔｍｅｔＹ、ＣＭ０２－０７５８／ΔｍｅｔＹ、ＣＭ０２－０７５９／ΔｍｅｔＹをそれぞれ接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３１２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ，コバラミン（Vitamin B12）１μｇ（蒸留水１リットル中）
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３１２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ，コバラミン（Vitamin B12）１μｇ（蒸留水１リットル中）
上記培養方法で培養し、培養液中のＬ－メチオニン及び副産物であるホモランチオニンの濃度を分析した。それを表１１に示す。
よって、外来ｍｅｔＺは、ｍｅｔＢなどのＦｕｎｃｔｉｏｎを行うこと、すなわちシステイン（cysteine）を硫黄源としてトランススルフレーション（transsulfuration）を行うことにより、メチオニン（methionine）を生産することが確認された。すなわち、ｍｅｔＢやｍｅｔＹが欠失していても、ｍｅｔＺを用いることにより高収率のメチオニン生産が維持されるので、従来のコリネバクテリウムのｍｅｔＢ及び／又はｍｅｔＹの欠点を補完するために、前記遺伝子を外来ｍｅｔＺで代替することができる。
また、ｍｅｔＢが存在し、外来ｍｅｔＺが導入された菌株において、メチオニン生産量は増加し、ホモランチオニン生成量は対照群（ＣＭ０２－０６１８）の２０％程度であり、ｍｅｔＺを強化すると副産物であるホモランチオニン生成量が減少することが確認された。ホモランチオニンはＯ－アセチルホモセリンを消費して合成される物質であり、ホモランチオニンの生成はメチオニン生産を減少させるので、このような副産物生成を抑制する外来ｍｅｔＺはｍｅｔＢの欠点を補完し、副産物生成を抑制し、メチオニン合成量を増加させることが分かる。
これらの結果から、本出願のｍｅｔＺがシステインを用いてトランススルフレーションを行うことができるという事実が明らかになり、メチオニン生産を増加させるだけでなく、コリネバクテリウム属菌株のｍｅｔＢの欠点を補完するために本出願のｍｅｔＺを用いることができることが確認された。
実施例７：ｍｅｔＨ、ｃｙｓＩを同時に強化する組換えベクターの作製
本実施例においては、ｍｃｂＲが欠損していないメチオニン生産菌株を作製するために、メチオニンシンターゼをコードするｍｅｔＨ（Ｎｃｇｌ１４５０）、亜硫酸レダクターゼをコードするｃｙｓＩ（Ｎｃｇｌ２７１８）を同時に強化するベクターを作製した。
本実施例においては、ｍｃｂＲが欠損していないメチオニン生産菌株を作製するために、メチオニンシンターゼをコードするｍｅｔＨ（Ｎｃｇｌ１４５０）、亜硫酸レダクターゼをコードするｃｙｓＩ（Ｎｃｇｌ２７１８）を同時に強化するベクターを作製した。
具体的には、ｍｅｔＨ及びｃｙｓＩ遺伝子をコリネバクテリウムＡＴＣＣ１３０３２染色体上に追加挿入するために、次の方法で組換えプラスミドベクターを作製した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に報告されている塩基配列に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカムのｍｅｔＨ遺伝子及び周辺配列（配列番号３９）とｃｙｓＩ遺伝子及び周辺配列（配列番号４０）を確保した。
次に、ｍｅｔＨ及びｃｙｓＩ遺伝子を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４１及び４２、配列番号４３及び４４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。また、ｍｅｔＨ遺伝子の発現強化のためにＰｃｊ７プロモーターを用い、ｃｙｓＩ遺伝子の発現強化のためにＰｓｐｌ１プロモーターを用いた。各プロモーターを得るために、Ｐｃｊ７においては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４５、４６を用いてＰＣＲを行い、Ｐｓｐｌ１においては、公知のｓｐｌ１－ＧＦＰ（特許文献５）ベクターＤＮＡを鋳型とし、配列番号４７、４８を用いてＰＣＲを行った。用いたプライマー配列を表１２に示す。
ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で４分間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ｍｅｔＨ遺伝子及びｃｙｓＩ、Ｐｃｊ７プロモーター及びＰｓｐｌ１プロモーターＤＮＡ断片が得られた。
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１ベクターを制限酵素ｓｃａＩで処理し、次いで前述したように増幅した４つのＤＮＡ断片を染色体導入用制限酵素ｓｃａＩで処理し、次いでＩＳＴ反応後に、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得て、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩと命名した。
実施例８：ｍｅｔＨ、ｃｙｓＩを同時に強化する菌株の作製及びそれを用いたＬ－メチオニンの生産
前述したように作製したｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１及びｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩベクターを染色体上での相同組換えによりＡＴＣＣ１３０３２菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献２２）。その後、スクロースを含む固体培地で２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号２３、２４を用いて、Ｎｃｇｌ１０２１遺伝子が欠損してＰｃｊ７－ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩ遺伝子が適切に挿入されたか否かを確認した。本組換え菌株を１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１、ＣＭ０２－０７５３と命名した。
前述したように作製したｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１及びｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩベクターを染色体上での相同組換えによりＡＴＣＣ１３０３２菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献２２）。その後、スクロースを含む固体培地で２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号２３、２４を用いて、Ｎｃｇｌ１０２１遺伝子が欠損してＰｃｊ７－ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩ遺伝子が適切に挿入されたか否かを確認した。本組換え菌株を１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１、ＣＭ０２－０７５３と命名した。
前述したように作製した１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１、ＣＭ０２－０７５３菌株のＬ－メチオニン生産能を分析するために、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株と共に次の方法で培養した。
次の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２と、前述したように作製した菌株１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１、ＣＭ０２－０７５３を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３１２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ，コバラミン（Vitamin B12）１μｇ（蒸留水１リットル中）
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３１２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ，コバラミン（Vitamin B12）１μｇ（蒸留水１リットル中）
上記培養方法で培養し、培養液中のＬ－メチオニン濃度を分析した。それを表１３に示す。
その結果、ｍｃｂＲがそのまま存在し、ｍｅｔＨ及びｃｙｓＩを過剰発現する菌株は、対照群の菌株に比べて、Ｌ－メチオニン生産能が０．０３ｇ／ｌ向上することが確認された。
実施例９－１：Ｎｃｇｌ１０２１ ｓｉｔｅではない、他のｓｉｔｅにおけるｍｅｔＺ遺伝子強化のためのベクターの作製
３種の外来ｍｅｔＺ遺伝子をそれぞれコリネバクテリウムＡＴＣＣ１３０３２染色体上の従来とは異なる位置に挿入するために、次の方法で組換えプラスミドベクターを作製した。
３種の外来ｍｅｔＺ遺伝子をそれぞれコリネバクテリウムＡＴＣＣ１３０３２染色体上の従来とは異なる位置に挿入するために、次の方法で組換えプラスミドベクターを作製した。
まず、ｍｅｔＺを挿入するために、Ｎｃｇｌ２７４８（Transposase）を除去するベクターを作製した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に報告されている塩基配列に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカムのＮｃｇｌ２７４８及び周辺配列（配列番号４９）を確保した。Ｎｃｇｌ２７４８遺伝子を欠損させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５０及び５１、配列番号５２及び５３のプライマー（表１４）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれＤＮＡ断片が得られた。
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＣＭ２ベクターと、前述したように増幅したＮｃｇｌ２７４８遺伝子断片を染色体導入用制限酵素ｓｍａＩで処理し、次いでＩＳＴ反応後に、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得て、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８と命名した。
次に、３種のｍｅｔＺ（クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium Violaceum）、ヒポモナス・ネプツニウム（Hyphomonas Neptunium）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides））遺伝子を得るために、それぞれ前述したように作製したｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＣｖｉｍｅｔＺ（クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium Violaceum）ｍｅｔＺ）、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＨｎｅｍｅｔＺ（ヒポモナス・ネプツニウム（Hyphomonas Neptunium）ｍｅｔＺ）、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ（ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）ｍｅｔＺ）ベクターを鋳型とし、配列番号５４及び５５、配列番号５４及び５６、配列番号５４及び５７を用いてＰＣＲを行った（表１５）。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、３種のＰＣＲ断片が得られた。
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８ベクターを制限酵素ｓｃａＩで処理し、次いで前述したように増幅した断片と共に、各菌株のＩＳＴ反応後に、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法により計３種のプラスミドを得て、それぞれｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＣｖｉｍｅｔＺ（クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium Violaceum）ｍｅｔＺ）、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＨｎｅｍｅｔＺ（ヒポモナス・ネプツニウム（Hyphomonas Neptunium）ｍｅｔＺ）、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ（ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）ｍｅｔＺ）と命名した。
実施例９－２：Ｎｃｇｌ１０２１ ｓｉｔｅではない、他のｓｉｔｅにおけるｍｅｔＺ遺伝子強化のためのベクターの作製
また、９９％以上の配列相同性を有するｍｅｔＺ遺伝子が導入された菌株においてもメチオニン生産量が増加するか否かを確認するために、実施例３－２の５つのｍｅｔＺ遺伝子に対するベクターをさらに作製した。
また、９９％以上の配列相同性を有するｍｅｔＺ遺伝子が導入された菌株においてもメチオニン生産量が増加するか否かを確認するために、実施例３－２の５つのｍｅｔＺ遺伝子に対するベクターをさらに作製した。
前述した実施例９－１の方法と同様に、前記６つのｍｅｔＺ遺伝子がそれぞれ導入されたベクターを作製した。
計６個のベクターを作製した。それらをｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿ｌｏｎｇ、ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿３、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿６５、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿１０４、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿１９６及びｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿３＿６５＿１０４と命名した。上記ベクターを作製するために、ＤＮＡ鋳型としては、それぞれ実施例４で作製したΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿ｌｏｎｇ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿３、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿６５、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿１０４、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿１９６及びｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１０２１－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿３＿６５＿１０４を用い、プライマーとしては、共通して配列番号５４、５７を用いた。他の過程は、実施例９－１と同様である。
実施例１０：ｍｃｂＲが存在するＬ－メチオニン生産株ベースの外来ｍｅｔＺ強化菌株の開発及びそれを用いたＬ－メチオニンの生産
前述したように作製したｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＣｖｉｍｅｔＺ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＨｎｅｍｅｔＺ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿ｌｏｎｇ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿３、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿６５、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿１０４、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿１９６及びｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿３＿６５＿１０４ベクターを染色体上での相同組換えによりＣＭ０２－０７５３菌株にエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献２２）。その後、スクロースを含む固体培地で２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号５８、５９（表１６）を用いて、Ｎｃｇｌ２７４８の位置にそれぞれ外来ｍｅｔＺ遺伝子が適切に挿入されたか否かを確認した。
前述したように作製したｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＣｖｉｍｅｔＺ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＨｎｅｍｅｔＺ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿ｌｏｎｇ、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿３、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿６５、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿１０４、ｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿１９６及びｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ２７４８－ＰｓｐｌＲｓｐｍｅｔＺ＿３＿６５＿１０４ベクターを染色体上での相同組換えによりＣＭ０２－０７５３菌株にエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献２２）。その後、スクロースを含む固体培地で２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号５８、５９（表１６）を用いて、Ｎｃｇｌ２７４８の位置にそれぞれ外来ｍｅｔＺ遺伝子が適切に挿入されたか否かを確認した。
本組換え菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２／ΔＮｃｇｌ２７４８、ＣＭ０２－０７６５、ＣＭ０２－０７６６、ＣＭ０２－０７６７－１、ＣＭ０２－０７６７－２、ＣＭ０２－０７６７－３、ＣＭ０２－０７６７－４、ＣＭ０２－０７６７－５、ＣＭ０２－０７６７－６、ＣＭ０２－０７６７と命名した。
前述したように作製した菌株のＬ－メチオニン生産能を分析するために、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＭ０２－０７５３菌株と共に次の方法で培養した。
次の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３１２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ，コバラミン（Vitamin B12）１μｇ（蒸留水１リットル中）
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３１２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ，コバラミン（Vitamin B12）１μｇ（蒸留水１リットル中）
上記培養方法で培養し、培養液中のＬ－メチオニン濃度を分析した。それを表１７に示す。
その結果、ｍｃｂＲが存在するメチオニン生産菌株においても、外来ｍｅｔＺをそれぞれ導入した場合に、メチオニン収率が増加することが確認された。
前記ＣＭ０２－０７６５、ＣＭ０２－０７６６、ＣＭ０２－０７６７は、ブダペスト条約上の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１９年５月２日付けでそれぞれ受託番号ＫＣＣＭ１２５０９Ｐ、ＫＣＣＭ１２５１０Ｐ、ＫＣＣＭ１２５１１Ｐとして寄託した。
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
Claims (9)
- 外来ｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質が導入されたコリネバクテリウム属微生物をチオ硫酸塩含有培地で培養するステップを含むＬ－メチオニン製造方法。
- 前記タンパク質は、Ｏ－アシルホモセリントランススルフラーゼ（acylhomoserine transsulfurase）活性を有するものである、請求項１に記載のＬ－メチオニン製造方法。
- 前記タンパク質は、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）、ヒポモナス・ネプツニウム（Hyphomonas neptunium）又はロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）由来のものである、請求項１に記載のＬ－メチオニン製造方法。
- 前記タンパク質は、配列番号６０、６１及び６２のいずれかのポリペプチド配列、並びにそれと９０％以上の同一性を有するポリペプチド配列からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載のＬ－メチオニン製造方法。
- 前記微生物は、シスタチオニンγ－シンターゼの活性弱化又は不活性化と、Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼの活性弱化又は不活性化と、メチオニン－システイン生合成抑制因子の活性弱化又は不活性化と、メチオニンシンターゼの活性強化と、亜硫酸レダクターゼの活性強化とからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝的改変を含む、請求項１に記載のＬ－メチオニン製造方法。
- 前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１に記載のＬ－メチオニン製造方法。
- 前記製造方法は、Ｌ－メチオニンを前記微生物又は培地から回収するステップを含む、請求項１に記載のＬ－メチオニン製造方法。
- 前記方法は、ホモランチオニン生成量が減少するものである、請求項１に記載のＬ－メチオニン製造方法。
- 外来ｍｅｔＺ遺伝子によりコードされるタンパク質が導入された、コリネバクテリウム属微生物及びチオ硫酸塩を含む、Ｌ－メチオニン生産用組成物。
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