CN113088503B - 一种o-琥珀酰巯基转移酶突变体及其在l-甲硫氨酸合成中的应用 - Google Patents

一种o-琥珀酰巯基转移酶突变体及其在l-甲硫氨酸合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种O‑琥珀酰巯基转移酶突变体及其在L‑甲硫氨酸合成中的应用，本发明以含metZ基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂，以O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸为底物，以甲硫醇钠盐为甲硫基供体，合成L‑甲硫氨酸，工业成本较低。在最优体系下，对100‑300mM底物的转化率达达到90％‑95％，与野生型相比较，对底物转化率分别提高了50％‑80％。

Description

一种O-琥珀酰巯基转移酶突变体及其在L-甲硫氨酸合成中的 应用
(一)技术领域
本发明涉及一种来源于紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)的O-琥珀酰巯基转移酶突变体、工程菌及其在催化合成L-甲硫氨酸中的应用。
(二)背景技术
L-甲硫氨酸人体和动物所必需的唯一含硫氨基酸，体内无法合成，必须通过食物获取，具有非常重要的生理功能，在医药、食品、饲料等行业应用广泛。近年来，蛋氨酸的全球市场年需求量逐年递增，其产业步入市场黄金期，同时也带来生产技术和成本等方面的挑战。目前蛋氨酸的主要生产方法为化学合成，然而过程中使用氢氰酸等高挥发有毒底物，反应条件苛刻，且关键核心技术被国外巨头垄断，较高的技术壁垒和资金壁垒阻碍其他企业进入。随着合成生物学的快速发展，构建微生物细胞工厂成为天冬氨酸家族氨基酸绿色高效生产的重要手段。但是目前，以葡萄糖为原料，从头合成L-甲硫氨酸的生产强度和糖酸转化率都还处于较低水平，无法满足工业化需求。
L-甲硫氨酸的发酵-酶法路线是以葡萄糖为底物，发酵生产前体O-琥珀酰-L-高丝氨酸，在O-琥珀酰巯基转移酶作用下与甲硫醇反应生成L-甲硫氨酸。而在该合成过程中，O-琥珀酰-高丝氨酸巯基转移酶的催化性能是直接影响L-甲硫氨酸合成效率的关键。本发明筛选挖掘来源于紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)的O-琥珀酰巯基转移酶(metZ)，并通过分子改造技术，对O-琥珀酰巯基转移酶催化性能进行调控，以提高对L-甲硫氨酸的合成效率。
(三)发明内容
本发明提供一种O-琥珀酰巯基转移酶突变体及其在L-甲硫氨酸合成中的应用，通过分子改造技术，筛选来源于紫色杆菌的O-琥珀酰巯基转移酶(metZ)的有益突变体，以O-琥珀酰-L-高丝氨酸和甲硫醇钠为底物，活力显著提高，应用于L-甲硫氨酸的高效合成。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种O-琥珀酰巯基转移酶metZ突变体(记为metZm)，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第113位、第212位进行单突变或双突变获得的；优选将SEQID NO.2所示氨基酸序列的第113位丝氨酸突变为丙氨酸，同时第212位赖氨酸突变为色氨酸，该突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.1：
atggcatccgacgcgccgcatcttccgctgcaccctgaaaccctggccatccgggccgggttggaaaccagccagttcaacgagcacagccagggcctgttcctgacgtccagcttcacctacgaatcggccgcgcaggcggcggcgatgttcctgggcgagatcgacggctacacctattcccgcttcaccaatccgaccgtcgccgcgttccagcataggctggcgcagatggagggcggggagcgcgccatcgccaccgccaccggcatggcggcgatccaggccatcatgatgactttgctgcaggctggcgaccacatcgtgtcgtcgcaaagcctgttcggctccaccaccaatctgttcgccaaccagttggccaagttcgccgtggccaccgacttcgtcgacgcgcgcgacctgtccgcctggcgggaggcgctgcggccgaacaccaagctgctgttcctggagacgccgtccaatcccttgaccgaagtggccgacatcgcggccatcgccgacatcgcccacgcgcatggcgcgctgctggtggtggacaacagcttctgttcgccggccttgcagcagccgttgaaactgggcgccgatctggtcatgcattccgccaccaagttcatcgacggccatggccgggtgatgggcggggcggtggtcggcagcgacaagctggtcgagcaggtctatttgcacgtgcgcgccgccggtccctcgctggcgccgttcaatgcctggacgctgctgtccggtttggagacgctgcacctgcggatggagaagcacagcgccaacgcgctggagctggcgcgctggctggaggcgcagcccaatgtggagcgcgtctattacccgggcctggagagccacccccagcacgagctggcgctgcgccagcagaagagcggcggagcggtggtgtccttcgtggtcaagggcggccgcaaggccgcgtggaaagtggtggacgcggtcagggtgatctcgcgcaccgccaatctgggcgatgtgaaaaccaccctcactcatccggccagcaccacccacgcccgcgtgacgcaggaggcgcgcgagcgcgccggcatcgtcgaggggctgttgcgcgtcagcgtcggcctggaaaatgtacgggaccttcaacaagatctgttgcggggccttgactaa。
SEQ ID NO.2：
MASDAPHLPLHPETLAIRAGLETSQFNEHSQGLFLTSSFTYESAAQAAAMFLGEIDGYTYSRFTNPTVAAFQHRLAQMEGGERAIATATGMAAIQAIMMTLLQAGDHIVSSQSLFGSTTNLFANQLAKFAVATDFVDARDLSAWREALRPNTKLLFLETPSNPLTEVADIAAIADIAHAHGALLVVDNSFCSPALQQPLKLGADLVMHSATKFIDGHGRVMGGAVVGSDKLVEQVYLHVRAAGPSLAPFNAWTLLSGLETLHLRMEKHSANALELARWLEAQPNVERVYYPGLESHPQHELALRQQKSGGAVVSFVVKGGRKAAWKVVDAVRVISRTANLGDVKTTLTHPASTTHARVTQEARERAGIVEGLLRVSVGLENVRDLQQDLLRGLD。
SEQ ID NO.3：
atggcatccgacgcgccgcatcttccgctgcaccctgaaaccctggccatccgggccgggttggaaaccagccagttcaacgagcacagccagggcctgttcctgacgtccagcttcacctacgaatcggccgcgcaggcggcggcgatgttcctgggcgagatcgacggctacacctattcccgcttcaccaatccgaccgtcgccgcgttccagcataggctggcgcagatggagggcggggagcgcgccatcgccaccgccaccggcatggcggcgatccaggccatcatgatgactttgctgcaggctggcgaccacatcgtgtcgtcgcaagcactgttcggctccaccaccaatctgttcgccaaccagttggccaagttcgccgtggccaccgacttcgtcgacgcgcgcgacctgtccgcctggcgggaggcgctgcggccgaacaccaagctgctgttcctggagacgccgtccaatcccttgaccgaagtggccgacatcgcggccatcgccgacatcgcccacgcgcatggcgcgctgctggtggtggacaacagcttctgttcgccggccttgcagcagccgttgaaactgggcgccgatctggtcatgcattccgccacctggttcatcgacggccatggccgggtgatgggcggggcggtggtcggcagcgacaagctggtcgagcaggtctatttgcacgtgcgcgccgccggtccctcgctggcgccgttcaatgcctggacgctgctgtccggtttggagacgctgcacctgcggatggagaagcacagcgccaacgcgctggagctggcgcgctggctggaggcgcagcccaatgtggagcgcgtctattacccgggcctggagagccacccccagcacgagctggcgctgcgccagcagaagagcggcggagcggtggtgtccttcgtggtcaagggcggccgcaaggccgcgtggaaagtggtggacgcggtcagggtgatctcgcgcaccgccaatctgggcgatgtgaaaaccaccctcactcatccggccagcaccacccacgcccgcgtgacgcaggaggcgcgcgagcgcgccggcatcgtcgaggggctgttgcgcgtcagcgtcggcctggaaaatgtacgggaccttcaacaagatctgttgcggggccttgactaa。
SEQ ID NO.4：
MASDAPHLPLHPETLAIRAGLETSQFNEHSQGLFLTSSFTYESAAQAAAMFLGEIDGYTYSRFTNPTVAAFQHRLAQMEGGERAIATATGMAAIQAIMMTLLQAGDHIVSSQALFGSTTNLFANQLAKFAVATDFVDARDLSAWREALRPNTKLLFLETPSNPLTEVADIAAIADIAHAHGALLVVDNSFCSPALQQPLKLGADLVMHSATWFIDGHGRVMGGAVVGSDKLVEQVYLHVRAAGPSLAPFNAWTLLSGLETLHLRMEKHSANALELARWLEAQPNVERVYYPGLESHPQHELALRQQKSGGAVVSFVVKGGRKAAWKVVDAVRVISRTANLGDVKTTLTHPASTTHARVTQEARERAGIVEGLLRVSVGLENVRDLQQDLLRGLD。
本发明所述O-琥珀酰巯基转移酶metZ突变体是针对metZ原始序列，进行人工设计、合成，连接于pET-28b质粒后，成功转化于大肠杆菌进行基因表达。进一步使用易错PCR方法对metZ的核苷酸序列进行突变，获得的扩增产物纯化后同样连接于pET-28b后，在大肠杆菌中进行诱导表达，通过筛选获得活力提高的突变体，提高其对于O-琥珀酰-L-高丝氨酸的催化活力。
本发明还涉及O-琥珀酰巯基转移酶metZ突变体基因、O-琥珀酰巯基转移酶metZ突变体基因构建的重组载体以及重组载体转化的重组基因工程菌。
本发明可通过本领域常规方法将所述O-琥珀酰巯基转移酶突变体的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。本发明的重组载体没有限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持其复制或自主复制，所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28b。较佳地，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体：将metZ突变体基因产物插入到载体pET-28b的BamHI和HindIII酶切位点，构建本发明的重组表达质粒pET28b-metZm。
引入编码本发明的metZ突变体的DNA的宿主细胞没有限制，只要已经为其建立了重组表达系统，满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的metZ突变基因可以有效表达。例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、曲霉菌，以及动物细胞和高等植物细胞。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将重组质粒pET28b-metZm转化至E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-metZm。
本发明对含有metZ突变体序列的重组大肠杆菌进行诱导培养，以实现metZ突变体的表达。所述的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的metZ的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生菌体即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组E.coli BL21(DE3)/pET28b-metZm接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD600达到0.4～1(优选0.4)时，在终浓度为0.1～1.0mM(优选1mM)异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的metZ突变体蛋白。
本发明还提供一种所述O-琥珀酰巯基转移酶metZ突变体在合成L-甲硫氨酸中的应用，所述的应用是：以含O-琥珀酰巯基转移酶metZ突变体基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂，以O-琥珀酰-L-高丝氨酸为底物，以甲硫醇钠盐为甲硫基供体，以pH5.0～9.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度20～45℃(优选30℃)条件下进行转化反应，获得L-甲硫氨酸。所述湿菌体提取的粗酶液是将湿菌体用pH5.0～9.0的缓冲液重悬后，超声破碎，离心，收集上清液即为粗酶液；所述pH5.0～9.0的缓冲液优选20-200mM、pH 5.0-9.0的PBS缓冲液，更优选50-100mM、pH 8.0-8.5的PBS缓冲液。
进一步，所述催化剂按如下方法制备：
1)斜面培养：将含O-琥珀酰巯基转移酶metZ突变体编码基因的重组基因工程菌接种至含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB培养基，在37℃培养16h，获得斜面菌体；所述LB培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；
2)种子培养：将斜面菌体接种至含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；所述LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；
3)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种到含终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，置于37℃下培养至OD600值为0.4，加入终浓度1mM异丙基-β-D-半乳糖苷，置于22℃继续培养12h，离心，收集湿菌体；
4)湿菌体破碎：将湿菌体悬浮于pH5.0～9.0的缓冲液，置于超声破碎仪中，10-50KHz频率下(优选20KHz)破碎5-30min(优选破碎2min，间隔10s，破碎10min)，离心(优选12000rpm离心5min)，收集上清液，即获得粗酶液；所述pH5.0～9.0的缓冲液体积用量以湿菌体湿重计为10mL/g。
进一步，反应体系中，底物加入终浓度为50-500mM(优选100mM-300mM)，甲硫基供体加入终浓度为100mM-1M(优选200-600mM)；催化剂(其中粗酶液以破碎前湿菌体重量计)加入量以湿菌体的量计算，则催化剂在反应体系中的终浓度为20-100g/L(优选50g/L)。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明以含metZ突变体的重组菌或其破碎粗酶液为催化剂，以O-琥珀酰-L-高丝氨酸为底物，以甲硫醇钠盐为甲硫基供体，合成L-甲硫氨酸，工业成本较低。在最优体系下，对100-300mM底物的转化率达达到90％-95％，与野生型相比较，对底物转化率分别提高了50％-80％。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述LB培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。
所述LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。
所述PBS缓冲液(50mM、pH 8.0)的配制方法为：称取K2HPO4·H2O 2.28g，加入200mL超纯水使其完全溶解；然后称取KH2PO4·H2O 1.36g于200mL超纯水，将两者相互混合。
实施例1 metZ重组菌的构建
从KEGG数据库，选择来源于紫色杆菌(Chromobacterium violaceum，KEGG编号CV-2725)的O-琥珀酰巯基转移酶(met Z)基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)在北京擎科生物科技有限公司进行全基因合成，连接于质粒pET-28b的BamHI/HindIII酶切位点，转入E.coliDH5感受态细胞，涂布含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜后，挑取阳性转化子并鉴定测序。将所验证的阳性单克隆接种至5mL含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，提取质粒进行验证后，将重组表达载体转入E.coliBL21(DE3)菌株中，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-MetZ(即为亲本菌株)，于37℃在含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB平板上培养过夜。挑取单克隆接种至5mL含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后，于4℃、8000rpm离心10min收集湿菌体，-80℃甘油贮存备用。
实施例2 metZ突变体的获得及含突变体重组菌的构建
1、突变文库的构建
以实施例1获得的重组表达载体pET28b-metZ为模板，通过易错PCR扩增，获得突变序列。扩增引物(5’-GCTGAGGATCCATGGCATCCGACGCGC-3’)和(5’-GCATCAAGCTTTTAGTCAAGGC CCCGCAACAG-3’)。
扩增体系为：50μl反应体系：10xTaq polymerase buffer：5μl；Mg2+(25mM)：5μl；Mm2+(25mM):3μl；10mMdNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)4μL；浓度为50μM的上游引物、下游引物各1μL，DNA模板：1μL；Taq DNA聚合酶：10U；用双蒸水补足体系。
PCR反应条件为：预变性95℃1min，然后进入温度循环95℃10s，56℃90s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析和切胶回收，由BamHI/HindIII进行双酶切，与同样进行酶切处理的pET28b连接，连接液电击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜，得到metZ的突变文库。
2、阳性突变体的筛选
按1mL/孔的将，在96孔板中加入含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，从突变文库中挑取单克隆，接种至96孔板中，37℃培养3h后，分别加入终浓度1mM异丙基-β-D-半乳糖苷，置于30℃继续培养12h，离心，收集湿菌体，进行催化合成L-甲硫氨酸的研究。湿菌体以10mL/g的量用PBS缓冲液(50mM、pH 8.0)重悬，置于超声波细胞破碎仪(型号：Sonics VC，宁波新芝生物科技股份有限公司)下，20KHz破碎10min，每破碎2min间隔10s，收集破碎混合液，即获得粗酶液，存储与-20℃备用。
反应体系为10mL，含终浓度100mM O-琥珀酰-L-高丝氨酸底物、终浓度为200mM的甲硫基供体、粗酶液(加入量以破碎前湿菌体重量计为50g/L)，体积用50mM、pH 8.0PBS缓冲液补足，在30℃反应4h后，取样采用液相色谱测定底物转化率，部分突变体结果如表1所示。筛选获得对底物催化活力提高的阳性克隆，将阳性突变体送至测序公司进行测序，经过测序分析，获得最佳突变体为双突变体S113A/K212W(即将SEQID NO.2氨基酸序列第113位丝氨酸突变为丙氨酸，同时第212位赖氨酸突变为色氨酸)，其氨基酸序列如SEQID NO.4所示，核苷酸序列如SEQID NO.3所示，即为重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-metZm。
其中液相色谱检测仪的型号为日本日立(HITACHI)公司Primaide。柱温40℃；液相柱型号：AminexHPX-87H色谱柱(300mm×7.8mm,0.25μm)，检测器：紫外检测器；检测波长：365nm，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相为甲醇-水相(1：1，v/v)，其中水相由1.5mL乙酸和2.05g无水乙酸钠溶于1L的超纯水组成。
表1 metZ及其突变体的转化率
Figure BDA0003040767900000071
实施例3 met Z野生型及突变体湿菌体的制备
1)斜面培养：分别将含metZ和突变体的重组菌
E.coliBL21(DE3)/pET28b-metZ和E.coliBL21(DE3)/pET28b-metZm接种至含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB培养基，在37℃培养16h，获得斜面菌体；所述LB培养基使用前加入50μg/ml卡那霉素。
2)种子培养：将斜面菌体接种至含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；所述LB液体培养基使用前加入50μg/ml卡那霉素。
3)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种到含终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，置于37℃下培养至OD600值为0.4，加入终浓度1mM异丙基-β-D-半乳糖苷，置于28℃继续培养12h，离心，收集湿菌体后，储存与-20℃备用。
实施例4 met Z野生型及突变体粗酶液的制备
将实施例3获得的野生型及其突变体湿菌体解冻，分别按10mL/g的量加入PBS缓冲液(50mM、pH 8.0)，用移液枪反复吹打，直至湿菌体溶解。置于超声波细胞破碎仪下20KHz破碎10min(破碎2min，间隔10s)，12000rpm离心5min后，去除细胞碎片等沉淀，取上清液获得各自的粗酶液，存储与-20℃备用。
实施例5 metZ及其突变体催化合成L-甲硫氨酸
1)在10mL反应体系中依次加入终浓度为100mM的底物O-琥珀酰-L-高丝氨酸，终浓度为200mM的甲硫醇钠盐，实施例4方法制备的粗酶液(包括野生型和突变体，加入量以破碎前湿菌体重量计，终浓度为20g/L)，其余体积用PBS缓冲液(pH 8.0、50mM)补足。将该反应体系在30℃的条件下反应8h，取样，采用高效液相色谱法(同实施例2)检测样品中的L-甲硫氨酸的生成量，野生型metZ对O-琥珀酰-L-高丝氨酸的转化率为52％；突变体metZm对O-琥珀酰-L-高丝氨酸的转化率达79％。
2)在10mL反应体系中依次加入终浓度为100mM的底物O-琥珀酰-L-高丝氨酸，终浓度为200mM的甲硫醇钠盐，实施例4方法制备的粗酶液(包括野生型和突变体，加入量以破碎前湿菌体重量计，终浓度为50g/L)，其余体积用PBS缓冲液(pH 8.0、50mM)补足。将该反应体系在30℃的条件下反应8h，取采用高效液相色谱法(同实施例2)检测样品中的L-甲硫氨酸的生成量，野生型metZ对O-琥珀酰-L-高丝氨酸的转化率为67％；突变体metZm对O-琥珀酰-L-高丝氨酸的转化率达95％。
3)在10mL反应体系中依次加入终浓度为150mM的底物O-琥珀酰-L-高丝氨酸，终浓度为300mM的甲硫醇钠盐，实施例4方法制备的粗酶液(包括野生型和突变体，加入量以破碎前湿菌体重量计，终浓度为50g/L)，其余体积用PBS缓冲液(pH 8.0、50mM)补足。将该反应体系在30℃的条件下反应10h，取采用高效液相色谱法(同实施例2)检测样品中的L-甲硫氨酸的生成量，野生型metZ对O-琥珀酰-L-高丝氨酸的转化率为57％；突变体metZ对O-琥珀酰-L-高丝氨酸的转化率达92％。
4)在10mL反应体系中依次加入终浓度为200mM的底物O-琥珀酰-L-高丝氨酸，终浓度为400mM的甲硫醇钠盐，实施例4方法制备的粗酶液(包括野生型和突变体，加入量以破碎前湿菌体重量计，终浓度为60g/L)，其余体积用PBS缓冲液(pH 8.0、50mM)补足。将该反应体系在30℃的条件下反应10h，取采用高效液相色谱法(同实施例2)检测样品中的L-甲硫氨酸的生成量，野生型metZ对O-琥珀酰-L-高丝氨酸的转化率为55％；突变体metZ对O-琥珀酰-L-高丝氨酸的转化率达91％。
5)在10mL反应体系中依次终浓度为300mM的底物O-琥珀酰-L-高丝氨酸，终浓度为600mM的甲硫醇钠盐，实施例4方法制备的粗酶液(包括野生型和突变体，加入量以破碎前湿菌体重量计，终浓度为60g/L)，其余体积用PBS缓冲液(pH 8.0、50mM)补足。将该反应体系在30℃的条件下反应12h，取采用高效液相色谱法(同实施例2)检测样品中的L-甲硫氨酸的生成量，野生型metZ对O-琥珀酰-L-高丝氨酸的转化率为43％；突变体metZ对O-琥珀酰-L-高丝氨酸的转化率达90％。
本发明不受上述具体文字描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内作各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种O-琥珀酰巯基转移酶突变体及其在L-甲硫氨酸合成中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1185
<212> DNA
<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)
<400> 1
atggcatccg acgcgccgca tcttccgctg caccctgaaa ccctggccat ccgggccggg 60
ttggaaacca gccagttcaa cgagcacagc cagggcctgt tcctgacgtc cagcttcacc 120
tacgaatcgg ccgcgcaggc ggcggcgatg ttcctgggcg agatcgacgg ctacacctat 180
tcccgcttca ccaatccgac cgtcgccgcg ttccagcata ggctggcgca gatggagggc 240
ggggagcgcg ccatcgccac cgccaccggc atggcggcga tccaggccat catgatgact 300
ttgctgcagg ctggcgacca catcgtgtcg tcgcaaagcc tgttcggctc caccaccaat 360
ctgttcgcca accagttggc caagttcgcc gtggccaccg acttcgtcga cgcgcgcgac 420
ctgtccgcct ggcgggaggc gctgcggccg aacaccaagc tgctgttcct ggagacgccg 480
tccaatccct tgaccgaagt ggccgacatc gcggccatcg ccgacatcgc ccacgcgcat 540
ggcgcgctgc tggtggtgga caacagcttc tgttcgccgg ccttgcagca gccgttgaaa 600
ctgggcgccg atctggtcat gcattccgcc accaagttca tcgacggcca tggccgggtg 660
atgggcgggg cggtggtcgg cagcgacaag ctggtcgagc aggtctattt gcacgtgcgc 720
gccgccggtc cctcgctggc gccgttcaat gcctggacgc tgctgtccgg tttggagacg 780
ctgcacctgc ggatggagaa gcacagcgcc aacgcgctgg agctggcgcg ctggctggag 840
gcgcagccca atgtggagcg cgtctattac ccgggcctgg agagccaccc ccagcacgag 900
ctggcgctgc gccagcagaa gagcggcgga gcggtggtgt ccttcgtggt caagggcggc 960
cgcaaggccg cgtggaaagt ggtggacgcg gtcagggtga tctcgcgcac cgccaatctg 1020
ggcgatgtga aaaccaccct cactcatccg gccagcacca cccacgcccg cgtgacgcag 1080
gaggcgcgcg agcgcgccgg catcgtcgag gggctgttgc gcgtcagcgt cggcctggaa 1140
aatgtacggg accttcaaca agatctgttg cggggccttg actaa 1185
<210> 2
<211> 394
<212> PRT
<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)
<400> 2
Met Ala Ser Asp Ala Pro His Leu Pro Leu His Pro Glu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ile Arg Ala Gly Leu Glu Thr Ser Gln Phe Asn Glu His Ser Gln Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Thr Ser Ser Phe Thr Tyr Glu Ser Ala Ala Gln Ala Ala
35 40 45
Ala Met Phe Leu Gly Glu Ile Asp Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Phe Thr
50 55 60
Asn Pro Thr Val Ala Ala Phe Gln His Arg Leu Ala Gln Met Glu Gly
65 70 75 80
Gly Glu Arg Ala Ile Ala Thr Ala Thr Gly Met Ala Ala Ile Gln Ala
85 90 95
Ile Met Met Thr Leu Leu Gln Ala Gly Asp His Ile Val Ser Ser Gln
100 105 110
Ser Leu Phe Gly Ser Thr Thr Asn Leu Phe Ala Asn Gln Leu Ala Lys
115 120 125
Phe Ala Val Ala Thr Asp Phe Val Asp Ala Arg Asp Leu Ser Ala Trp
130 135 140
Arg Glu Ala Leu Arg Pro Asn Thr Lys Leu Leu Phe Leu Glu Thr Pro
145 150 155 160
Ser Asn Pro Leu Thr Glu Val Ala Asp Ile Ala Ala Ile Ala Asp Ile
165 170 175
Ala His Ala His Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Asn Ser Phe Cys Ser
180 185 190
Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Lys Leu Gly Ala Asp Leu Val Met His
195 200 205
Ser Ala Thr Lys Phe Ile Asp Gly His Gly Arg Val Met Gly Gly Ala
210 215 220
Val Val Gly Ser Asp Lys Leu Val Glu Gln Val Tyr Leu His Val Arg
225 230 235 240
Ala Ala Gly Pro Ser Leu Ala Pro Phe Asn Ala Trp Thr Leu Leu Ser
245 250 255
Gly Leu Glu Thr Leu His Leu Arg Met Glu Lys His Ser Ala Asn Ala
260 265 270
Leu Glu Leu Ala Arg Trp Leu Glu Ala Gln Pro Asn Val Glu Arg Val
275 280 285
Tyr Tyr Pro Gly Leu Glu Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Leu Arg
290 295 300
Gln Gln Lys Ser Gly Gly Ala Val Val Ser Phe Val Val Lys Gly Gly
305 310 315 320
Arg Lys Ala Ala Trp Lys Val Val Asp Ala Val Arg Val Ile Ser Arg
325 330 335
Thr Ala Asn Leu Gly Asp Val Lys Thr Thr Leu Thr His Pro Ala Ser
340 345 350
Thr Thr His Ala Arg Val Thr Gln Glu Ala Arg Glu Arg Ala Gly Ile
355 360 365
Val Glu Gly Leu Leu Arg Val Ser Val Gly Leu Glu Asn Val Arg Asp
370 375 380
Leu Gln Gln Asp Leu Leu Arg Gly Leu Asp
385 390
<210> 3
<211> 1185
<212> DNA
<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)
<400> 3
atggcatccg acgcgccgca tcttccgctg caccctgaaa ccctggccat ccgggccggg 60
ttggaaacca gccagttcaa cgagcacagc cagggcctgt tcctgacgtc cagcttcacc 120
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tcccgcttca ccaatccgac cgtcgccgcg ttccagcata ggctggcgca gatggagggc 240
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ctgttcgcca accagttggc caagttcgcc gtggccaccg acttcgtcga cgcgcgcgac 420
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ggcgcgctgc tggtggtgga caacagcttc tgttcgccgg ccttgcagca gccgttgaaa 600
ctgggcgccg atctggtcat gcattccgcc acctggttca tcgacggcca tggccgggtg 660
atgggcgggg cggtggtcgg cagcgacaag ctggtcgagc aggtctattt gcacgtgcgc 720
gccgccggtc cctcgctggc gccgttcaat gcctggacgc tgctgtccgg tttggagacg 780
ctgcacctgc ggatggagaa gcacagcgcc aacgcgctgg agctggcgcg ctggctggag 840
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ctggcgctgc gccagcagaa gagcggcgga gcggtggtgt ccttcgtggt caagggcggc 960
cgcaaggccg cgtggaaagt ggtggacgcg gtcagggtga tctcgcgcac cgccaatctg 1020
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aatgtacggg accttcaaca agatctgttg cggggccttg actaa 1185
<210> 4
<211> 394
<212> PRT
<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)
<400> 4
Met Ala Ser Asp Ala Pro His Leu Pro Leu His Pro Glu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ile Arg Ala Gly Leu Glu Thr Ser Gln Phe Asn Glu His Ser Gln Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Thr Ser Ser Phe Thr Tyr Glu Ser Ala Ala Gln Ala Ala
35 40 45
Ala Met Phe Leu Gly Glu Ile Asp Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Phe Thr
50 55 60
Asn Pro Thr Val Ala Ala Phe Gln His Arg Leu Ala Gln Met Glu Gly
65 70 75 80
Gly Glu Arg Ala Ile Ala Thr Ala Thr Gly Met Ala Ala Ile Gln Ala
85 90 95
Ile Met Met Thr Leu Leu Gln Ala Gly Asp His Ile Val Ser Ser Gln
100 105 110
Ala Leu Phe Gly Ser Thr Thr Asn Leu Phe Ala Asn Gln Leu Ala Lys
115 120 125
Phe Ala Val Ala Thr Asp Phe Val Asp Ala Arg Asp Leu Ser Ala Trp
130 135 140
Arg Glu Ala Leu Arg Pro Asn Thr Lys Leu Leu Phe Leu Glu Thr Pro
145 150 155 160
Ser Asn Pro Leu Thr Glu Val Ala Asp Ile Ala Ala Ile Ala Asp Ile
165 170 175
Ala His Ala His Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Asn Ser Phe Cys Ser
180 185 190
Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Lys Leu Gly Ala Asp Leu Val Met His
195 200 205
Ser Ala Thr Trp Phe Ile Asp Gly His Gly Arg Val Met Gly Gly Ala
210 215 220
Val Val Gly Ser Asp Lys Leu Val Glu Gln Val Tyr Leu His Val Arg
225 230 235 240
Ala Ala Gly Pro Ser Leu Ala Pro Phe Asn Ala Trp Thr Leu Leu Ser
245 250 255
Gly Leu Glu Thr Leu His Leu Arg Met Glu Lys His Ser Ala Asn Ala
260 265 270
Leu Glu Leu Ala Arg Trp Leu Glu Ala Gln Pro Asn Val Glu Arg Val
275 280 285
Tyr Tyr Pro Gly Leu Glu Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Leu Arg
290 295 300
Gln Gln Lys Ser Gly Gly Ala Val Val Ser Phe Val Val Lys Gly Gly
305 310 315 320
Arg Lys Ala Ala Trp Lys Val Val Asp Ala Val Arg Val Ile Ser Arg
325 330 335
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340 345 350
Thr Thr His Ala Arg Val Thr Gln Glu Ala Arg Glu Arg Ala Gly Ile
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Val Glu Gly Leu Leu Arg Val Ser Val Gly Leu Glu Asn Val Arg Asp
370 375 380
Leu Gln Gln Asp Leu Leu Arg Gly Leu Asp
385 390

Claims (7)

1.一种O-琥珀酰巯基转移酶metZ突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第113位丝氨酸突变为丙氨酸，同时第212位赖氨酸突变为色氨酸。
2.一种权利要求1所述O-琥珀酰巯基转移酶metZ突变体的编码基因构建的重组基因工程菌。
3.如权利要求2所述的重组基因工程菌，其特征在于所述重组基因工程菌以E. coliBL21(DE3)为宿主菌。
4.一种权利要求1所述O-琥珀酰巯基转移酶metZ突变体在L-甲硫氨酸合成中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用是：以含O-琥珀酰巯基转移酶metZ突变体基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂，以O-琥珀酰-L-高丝氨酸为底物，以甲硫醇钠盐为甲硫基供体，以pH5.0~9.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度20~45℃条件下进行转化反应，反应液分离纯化，获得L-甲硫氨酸；所述粗酶液是将湿菌体用pH5.0~9.0的缓冲液重悬超声破碎，离心，取上清液即为粗酶液。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物加入终浓度为50-500mM，甲硫基供体加入终浓度为100 mM-1 M；催化剂以湿菌体重量计在反应体系中的加入终浓度为20-100 g/L。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：
1）斜面培养：将含O-琥珀酰巯基转移酶metZ突变体基因的重组基因工程菌接种至含50μg/ml 卡那霉素的LB培养基，在37℃培养16 h，获得斜面菌体；所述LB培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15 g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；
2）种子培养：将斜面菌体接种至含50 μg/ml 卡那霉素的LB液体培养基，在37℃培养8~10h，获得种子液；所述LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；
3）发酵培养：将种子液以体积浓度1%的接种量接种到含50 μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，置于37℃下培养至OD600值为0.4，加入终浓度1 mM异丙基-β-D-半乳糖苷，置于22℃继续培养12h，离心，收集湿菌体；
4）湿菌体破碎：将湿菌体悬浮于pH5.0~9.0的缓冲液，置于超声破碎仪中，10-50KHz频率下，破碎2 min，间隔10 s，破碎5-30 min，离心，收集上清液即获得粗酶液；所述pH5.0~9.0的缓冲液体积用量以湿菌体湿重计为10 mL/g。
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