KR20100097782A - 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합물을 사용하여 메치오닌 생산능을 증가시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 L-메치오닌 및 유기산 생산 효율을 증진시키는 방법에 관한 것이다.　 더욱 상세하게는 메치오닌 전구체인 O-아세틸 호모세린 또는 O-숙시닐 호모세린, 및 메치오닌 전환 활성을 가진 효소에 적정한 비율로 혼합된 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합물을 첨가하여 효소 반응을 수행함으로써 L-메치오닌 전구체로부터 L-메치오닌 및 유기산의 전환율을 향상시켜 종래 방법에 비하여 높은 수율로 L-메치오닌을 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
메치오닌, 메치오닌 효소 전환, 메치오닌 전구체, O-아세틸 호모세린, O-숙시닐 호모세린, 메칠머캅탄, 디메칠설파이드

Description

메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합물을 사용하여 메치오닌 생산능을 증가시키는 방법{A method of enhancing the L-methionine production using a mixture of methylmercaptan and dimethyl sulfide}
본 발명은 L-메치오닌 및 유기산 생산 효율을 증진시키는 방법에 관한 것이다.　 더욱 상세하게는 메치오닌 전구체인 O-아세틸 호모세린 또는 O-숙시닐 호모세린, 및 메치오닌 전환 활성을 가진 효소에 적정한 비율로 혼합된 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합물을 첨가하여 효소 반응을 수행함으로써 L-메치오닌 전구체로부터 L-메치오닌 및 유기산의 전환율을 향상시켜 종래 방법에 비하여 높은 수율로 L-메치오닌을 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
메치오닌은 생체내의　필수 아미노산의 한 종류로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며, 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다.　메치오닌은 콜린(레시틴)과 크레아틴과 같은 화합물의 전구체로 작용하며 시스테인과 타우린의 합성원료로도 쓰인다.　 또한, 황을 제공하는 역할을 한다. S-아데노실-메치오닌은 L-메치오닌으로부터 유래하며 생체내에서 메칠기를 제공하는 역할을 하며 뇌의 다양한 신경전달물질(neurotransmitter) 합성에 관련되어 있다.　메치오닌 및/또는 S-아데노실-L-메치오닌(SAM)은 생체 내에서 간과 동맥에서 지방축적을 억제하고 우울, 염증, 간질환, 근육통을 완화하는 등의 다양한 역할을 한다(Jeon BR et al., J Hepatol., 2001 Mar; 34(3): 395-401).
메치오닌의 화학합성은 주로 5-(β-메틸머캅토에틸)하이단토인(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)을 가수분해시키는 반응을 통하여 L-메치오닌을 생산하는 방법을 이용한다.　그러나 이런 화학합성을 통하여 생산된 메치오닌은 L-형과 D-형이 혼합된 형태로 생산된다는 단점이 있다. 이에 본 발명자들은 생물학적 방법을 이용하여 L-메치오닌을 선택적으로 생산할 수 있는 기술을 개발하여 특허를 출원한 바 있다(WO2008/013432). 이 방법은 간편하게 2단계 공법으로 명명하며 발효에 의한 L-메치오닌 전구체 생산 공정, 및 상기 L-메치오닌 전구체를 효소에 의하여 L-메치오닌으로 전환하는 공정으로 구성되어 있다. 상기의 L-메치오닌 전구체는 바람직하게 O-아세틸호모세린과 O-숙시닐 호모세린을 포함한다. 이러한 2단계 공법을 개발함으로서, 기존에 문제가 되었던 황화물 특유의 기질 독성 문제, 메치오닌과 SAMe에 의한 균주의 피드백 조절 문제, 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase), O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 특유의 중간 산물 분해 활성 문제를 모두 해결할 수 있었다. 또한 L-메치오닌만을 선택적으로 생산할 수 있어 DL-메치오닌을 동시에 생산하는 기존의 화학 합성 공정에 비하여 우수한 공정이며, 추가적으로 동일한 반응을 통하여 부산물로서 유기산, 보다 구체적으로는 숙신산, 아세트산을 동시에 생 산 할 수 있는 매우 우수한 공정이다.
2단계 공정의 효소 전환 공정에서는 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase), O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase)의 활성을 가진 효소를 이용하며, L-메치오닌의 전구체인 O-아세틸 호모세린 혹은 O-숙시닐 호모세린을 메칠머캅탄과 혼합하면서 효소 반응을 일으킴으로서 L-메치오닌과 유기산을 생산한다.
메칠머캅탄은 상온에서 gas로 존재하며 물에 잘 녹지 않는 성질을 가지고 있으며 알칼리 용액에서 높은 용해도를 갖는 물질이다. L-메치오닌을 생산하기 위한 효소 전환 반응은 수용액 상에서 일어나기 때문에 메틸머캅탄이 수용액 상에서 보다 높은 용해도를 가질 수 있게 한다면 메치오닌 생산성을 크게 증진시킬 수 있을 것으로 기대된다.
이에 본 발명자는 상기와 같은 점을 고려하여 L-메치오닌 생산성을 극대화하기 위하여 효소 전환공정에서 메칠머캅탄의 용해도를 증가시키기 위한 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 적정한 비율로 혼합된 메칠머캅탄과 디메칠설파이드 혼합용액을 사용함으로서 L-메치오닌 전구체로부터 L-메치오닌 및 유기산의 전환율을 향상시킴으로서, 기존의 방법에 비하여 높은 수율로 L-메치오닌을 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 L-메치오닌의 전구체인 O-아세틸 호모세린 혹은 O-숙시닐 호모세린을 이용한 효소 전환 반응에서 기질로 사용되는 황화합물인 메칠머캅탄에 또 다른 황화합물인 디메칠설파이드를 첨가함으로써 메치오닌으로의 전환율을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 메치오닌 전구체인 O-아세틸 호모세린 또는 O-숙시닐 호모세린, 메치오닌 전환 활성을 가진 효소, 및 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합물을 혼합하여 효소 반응을 수행하는 단계를 포함하는 메치오닌 생산방법을 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 메치오닌 전구체인 O-아세틸 호모세린 또는 O-숙시닐 호모세린, 메치오닌 전환 활성을 가진 효소, 및 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합물로부터 생성되는 메치오닌 수용액 및 그 유래의 메치오닌 분말을 제공한다.
본 발명에서, 메칠머캅탄은 기체형의 메칠머캅탄 가스 또는 액체형의 메칠머캅탄으로서 소디움 메칠머캅탄 용액이 모두 사용될 수 있다. 이는 소디움 메칠머캅탄 용액과 메칠머캅탄 gas는 수용성의 반응액 상에서 동일한 반응 특성을 나타내기 때문이다. 그러므로, 상기한 바와 같이 메칠머캅탄은 직접 사용되거나, 가성소다에 용해되어 소디움메칠머캅탄 용액의 형태로 사용될 수 있으나, 메칠머캅탄은 상온에 서 가스로 존재하기 때문에 메칠머캅탄을 가성소다에 용해시킨 소디움메칠머캅탄 용액의 형태로 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서, 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합비율은 메칠머캅탄:디메칠설파이드가 1:0.05(mol:mol) 내지 1:1(mol:mol)의 비율, 바람직하게는 1: 0.20(mol:mol) 내지 1:1(mol:mol)의 비율, 더욱 바람직하게는 1:0.25(mol:mol) 내지 1:0.5(mol:mol)의 비율이 되도록 한다.　한편, 디메칠설파이드는 메칠머캅탄 몰농도에 대비하여 10% 이상의 비율, 바람직하게는 10% 내지　25%의 비율, 더욱 바람직하게는 20% 내지　25%의 비율이 되도록 혼합하여 사용된다.　
이러한 메칠머캅탄 혼합물을 사용함으로써, 기질로부터의 메치오닌 전환율을, 메칠머캅탄을 단독으로 사용한 경우에 비하여 증가시킬 수 있다.
본 발명에서, 메치오닌 전환활성을 가진 효소로는 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase), O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제(O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
메치오닌 생산을 위한 2단계 공법에서는 L-메치오닌의 전구체인 O-아세틸 호모세린 혹은 O-숙시닐 호모세린과 메칠머캅탄 (Methyl mercaptan, CH3SH)을 기질로 사용한 효소전환반응으로 메치오닌을 생산(WO2008/013432)한다. 이 경우, 메칠머캅탄이 기질인 O-아세틸 호모세린 혹은 O-숙시닐 호모세린과 결합하여 메치오닌을 생성하기 때문에 메칠머캅탄의 반응성이 메치오닌 생산 효율을 크게 좌우할 수 있다. 그러나, 메칠머캅탄은 중성의 수용액에서 용해도가 매우 낮은 물질로서 빠른 속도로 증발되어 용액에 남아있지 못한다. 따라서, 메칠머캅탄의 반응성을 증대시킬 수 있는 방법을 찾는다면 메칠머캅탄이 증발하기 전에 최대한 많은 양의 메칠머캅탄을 반응시킴으로서 메치오닌 생산수율을 증대시킬 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 즉, 제3의 물질을 메칠머캅탄이 포함된 반응액 중에 첨가하여 메칠머캅탄의 반응성을 높이고자 하였다. 본 발명에서는 제3의 물질로서 디메칠설파이드 (DMS)를 메칠머캅탄과 일부 혼합하여 반응을 유도할 경우 전환효율이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
메치오닌 전환 활성을 가진 효소를 이용한, 메치오닌 전구체로부터 메치오닌으로의 전환반응은 하기 반응식과 같이 수행된다.
CH3SH + O-숙시닐-L-호모세린 ↔ 숙시네이트 + L-메치오닌
CH3SH + O-아세틸-L-호모세린 ↔ 아세테이트 + L-메치오닌
상기 반응에서 메칠머캅탄의 CH3S- 잔기가 O-숙시닐 호모세린 또는 O-아세틸 호모세린의 숙시네이트 (succinate) 또는 아세테이트 (acetate) 잔기와 치환되어 메치오닌을 생성하게 된다. 반응시 메칠머캅탄 (CH3SH)은 여러가지 형태로 첨가가 가능하다.
상기 반응에서 메치오닌 생산 반응에 이용되는 메치오닌 전환 활성을 가진 효소는 에스케리치아속(Escherichia Sp.), 슈도모나스속(Pseudomonas sp.), 렙토스피라속(Leptospira sp.), 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.), 사카로마이세스속(Saccharomyces sp.), 크로모박테리움속(Chromobacterium sp.), 노카디아속(Nocardia sp.), 브라디리조비움속(Bradyrhizobium sp.), 하이호모나스속(Hyphomonas sp.), 메틸로코커스속(Methylococcus sp.), 메틸로바실러스속(Methylobacillus sp.), 니트로소모나스속(Nitrosomonas sp.), 크렙시엘라속(Klesiella sp.), 바실러스속(Bacillus sp.), 쉬겔라속(Shigella sp.), 코웰리아속(Colwellia sp.), 살모넬라속(Salmonella sp.), 효모 (yeast) 또는 곰팡이 (fungi)에 속하는 미생물 균주로부터 유래된 것일 수 있다.
상기의 전환 반응에서 O-숙시닐호모세린을 기질로 사용하는 경우, 바람직하게는 슈도모나스속(Pseudomonas sp.), 노카디아속(Nocardia sp.) 크로모박테리움속(Chromobacterium sp.)에 속하는 미생물 균주,　보다 바람직하게는 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aurogenosa), 노카디아 파르시니카(Nocardia Farcinica), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 크로모박테리움 비오라슘(Chromobacterium Violaceum)에 속하는 미생물 균주로부터 유래된, 시스타치오닌 감마 신타아제, O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라 아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소가 사용될 수 있다.
상기의 전환반응에서 O-아세틸호모세린을 기질로 사용하는 경우, 바람직하게는 렙토스피라속(Leptospira sp.), 크로모박테리움속(Chromobacterium sp.), 하이포모나스속(Hyphomonas sp.)에 속하는 미생물 균주,　보다 바람직하게는 렙토스피라 메에리(Leptospira meyeri), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aurogenosa), 하이포모나스 넵튜니움(Hyphomonas Neptunium), 크로모박테리움 비오라슘(Chromobacterium Violaceum)에 속하는 미생물 균주로부터 유래된, 시스타치오닌 감마 신타아제, O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소가 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적 실시 양태에서, 상기 L-메치오닌 생산 전환반응에 사용된 기질인 O-아세틸 호모세린 혹은 O-숙시닐 호모세린은 종래 특허문헌인 국제특허 제WO2008/013432호에 명기된 바대로 제작된 미생물 균주를 발효함으로서 생산하였으며 배양한 발효액으로부터 메탄올 침전법을 이용하여 기질인 O-아세틸 호모세린 혹은 O-숙시닐 호모세린을 정제하여 사용하였다.
또한 상기 L-메치오닌 생산 전환반응에 사용된 효소는 크로모박테리움 비올라슘(Chromobacterium violaceum) 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제와 하이포모나스 넵튜니움(Hyphomonas Neptunium) 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 유전자를 발효하여 종래 특허문헌인 국제특허 제WO2008/013432호에 명기된 바대로 균체를 회수하여 파쇄한 후 사용하였다.
상기의 방법으로 회수한 기질인 O-아세틸 호모세린 혹은 O-숙시닐 호모세린과 메치오닌 전환활성을 가진 효소를 혼합하여 전환 반응액을 제조하였다. 또 다른 기질로 사용되는 메칠머캅탄의 경우 메칠머캅탄용액에 디메칠설파이드를 적정비율로 혼합하여 전환 반응액에 투입함으로서 O-아세틸 호모세린이 메치오닌으로 전환되는 반응의 전환율을 비교해보았다.
본 발명에 따라 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합물을 사용하여 L-메치오닌 전구체로부터 L-메치오닌으로 전환하는 방법은 종래의 방법에 비하여 높은 수율로 L-메치오닌을 생산할 수 있으며 이와 같이 생산된 메치오닌은 사료 및 식품 첨가제, 의약용 및 의약품의 원료 등의 다양한 분야에 널리 사용할 수 있다.
본 발명은 O-아세틸 호모세린 혹은 O-숙시닐 호모세린을 효소 반응을 통하여 전환하는 과정에서 황화합물 기질인 메칠머캅탄에 제 3의 물질인 디메칠설파이드를 적절한 혼합비로 혼합하여 사용함으로써, 메칠머캅탄을 단독으로 사용하였을 경우에 비하여 메치오닌 생성율을 증가시킬 수 있는 방법을 제공할 수 있다. 또한 상기의 방법으로 메치오닌 생성율을 증가시킬 경우 효소 전환 반응 종료 후 반응액 상에 잔존하는 O-아세틸 호모세린 혹은 O-숙시닐 호모세린과 메칠머캅탄 잔량을 줄여줌으로써 생산물인 L-메치오닌과 유기산의 순도를 증가시킬 수도 있다. 더 나아가, 상기 방법으로 메치오닌으로의 전환율을 향상시켜 줌으로 생산성이 향상되게 되며 생산성의 향상은 동일한 생산량을 기준으로 상대비교 시 반응설비에 대한 투자비를 감소하는 경제적인 효과까지 얻을 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 메칠머캅탄과 디메칠설파이드 혼합비에 따른 O-아세틸 호모세린으로부터의 메치오닌 전환율 비교
전환 반응시 메칠머캅탄용액에 디메칠설파이드를 적정비율로 혼합하여 전환 반응액에 투입하고 O-아세틸 호모세린이 메치오닌으로 전환되는 반응의 전환율을 비교해보았다.
메칠머캅탄은 상온에서 가스로 존재하기 때문에, 가성소다액에 메칠머캅탄을 첨가하여 액상인 소디움메칠머캅탄 (sodium methyl mercaptan, CH3S - Na, 2.14M, 15%, 일본 Tokyo chemical industry) 상태로 존재할 수 있다. 본 실시예에서는 소디움메칠머캅탄 2.14 M 용액을 이용하여 실험을 진행하였다. 이후 소디움메칠머캅탄 2.14 M 용액을 메칠머캅탄 용액으로 통칭하였다.　 메칠머캅탄 용액과 디메칠설파이드액(13.38M, 99%, 프랑스 arkema 사)을 각각 적정 몰비(mol:mol)로 혼합한 후 교반하여 혼합액을 제조하였다.
전환반응액은 1ml의 O-아세틸 호모세린 (500mM) 용액에 전환 효소액을 50 ul, 효소보조인자인 피리독살포스페이트 (pyridoxal 5'-phosphate, 미국 Sigma 사)는 0.1 mM 농도로 투입하여 제조하였다. O-아세틸 호모세린 용액은 발효액으로부터 정제한 O-아세틸 호모세린을 pH 7.5의 포스페이트 완충액에 (phosphate) 용해하여 사용하였다.
발효균주는 국제특허 제WO2008/013432호에 개시된 방법으로 제작된 CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL 균주를 사용하였다. 상기 CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL 균주를 5L 발효조에서 접종하여 유가식 배양(Fed batch) 발효법으로 50~100시간 배양하였다. 배양한 발효액에서 메탄올 침전법을 이용하여 O-아세틸 호모세린을 정제하였다.　 전환 효소는 하이포모나스 넵튜니움(Hyphomonas Neptunium) 유래의 pCJ-MetZ-CL을 형질전환한 E. coli W3110 균주를 발효하여 국제특허 제WO2008/013432호에 명기된 바대로 균체를 회수하여 파쇄한 후 사용하였다.　 제조된 전환 반응액에 각 메칠머캅탄과 디메칠서파이드 혼합액을 투입함으로서 효소 반응을 개시하였다. 이때 메칠머캅탄과 디메칠설파이드 혼합액의 투입량은 메칠머캅탄 양의 최종 투입량이 0.04mM 이 되도록 조절하였다. 반응 온도는 33℃, 800 rpm 에서 10분간 교반하에 반응하였으며, 반응 종료 후 0.2N HCl 용액을 투입함으로서 반응을 종료하였다. 생성물인 메치오닌의 농도는 HPLC 분석을 통하여 분석하였다. 분석 조건은 국제특허 제WO2008/013432호에 명기된 분석 조건에 의거하였다.
O-아세틸 호모세린의 메치오닌 전환율(%)은 반응에 사용된 기질의 몰수 (mol/L)로부터 생성된 메치오닌 몰수의 %를 계산하여 산정하였다. 1mol의 O-아세틸 호모세린 및 메칠머캅탄으로부터 1mol의 메치오닌이 생성된 경우 전환율(%)을 100% 로 계산하였다. 분석 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
메칠머캅탄 용액(SMM)과 디메칠설파이드(DMS) 혼합비별 O-아세틸 호모세린의 전환율 비교
몰비 met 생성량
[met-g]/[10min]		 전환율　 (%) 상대활성 (%)
SMM DMS 　
1 0 4.44　 74.5 100　
1 0.05　 4.52　 75.7 102　
1 0.10　 4.62　 77.6 104　
1 0.20　 5.07　 85.1 114　
1 0.25　 5.95　 100 134　
1 0.35　 5.60　 94.0 126　
1 0.70　 5.70　 95.6 128　
1 1.00　 5.88　 98.7 132　
상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 메칠머캅탄 용액과 디메칠설파이드가 1:0.25 (mol:mol)로 혼합된 메칠머캅탄이 투입된 경우에 메칠머캅탄만 단독으로 투입한 경우보다 34% 메치오닌 생성량 증가를 확인하였다. 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합비를 각각 1:0.25 이상으로 조정하였을 경우에도 상대활성이 더 이상 증가하지 않으며 높은 상대 활성을 유지함을 확인하였다.
대조군으로서 1: 1 비율의 메칠머캅탄과 디메칠서파이드 혼합액에 함유된 것과 동일한 양의 디메칠서파이드만을 단독으로 전환반응액에 혼합한 경우에는 메치오닌 생성이 전혀 관찰되지 않았으며, 이로부터 디메칠설파이드 단독으로는 메치오닌을 전혀 생성할 수 없음을 확인하였다. 따라서 디메칠설파이드가 메칠머캅탄과의 혼합에 의하여 메칠머캅탄의 반응성을 증가시킴으로서 메치오닌 생성을 증가시키는 것으로 추정할 수 있었다.
실시예 2:　 메칠머캅탄과 디메칠설파이드 혼합액을 이용한 메치오닌 전환 반응
실시예 1의 조건과 동일한 조건에서 지속적인 메치오닌 생성 촉진 반응을 관찰하기 위하여 메칠머캅탄과 디메칠설파이드 혼합액을 시간에 따라 지속 투입하면서 메치오닌 생성을 확인하였다. 동일한 전환 반응액을 이용하여 매 10분 경과시마다 각각 메칠머캅탄용액과 디메칠설파이드 혼합액을 투입하면서 30분간 반응을 지속하였다. 30분후 반응을 종료시키고 HPLC를 이용하여 생성된 메치오닌 양을 측정하였다. 디메칠설파이드 혼합비는 실시예 1에서 가장 높은 메치오닌 생산 증가를 보였던 메칠머캅탄 용액과 디메칠설파이드 1:0.25 (mol:mol) 혼합을 반응 조건으로 하였다. 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
1.5 튜브 스케일에서 메칠머캅탄용액 혹은 디메칠설파이드 혼합액의 지속적 공급에 따른 전환율 비교
　 메칠머캅탄 용액
(100%)		 메칠머캅탄:디메칠파이드 혼합액
(1:0.25 혼합)
메치오닌 [g/L] 12.84 14.69
전환율 [%] 66.88 76.51
상대활성 [%] 100.00　 114.41　
상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 30분후 메칠머캅탄만 단독으로 투입해준 경우에 비해 약 15%의 전환율 상승의 효과를 보였다.
실시예 3: 1 L 회분식 반응기에서의 O-아세틸 호모세린의 효소 전환 반응
보다 대형의 반응기에서 전환반응 효율을 확인하기 위하여 1L 규모의 회분식 반응기에서 700 mM의 O-아세틸 호모세린 500 mL을 사용하여 반응을 수행하였다. 메칠머캅탄 용액 혹은 메칠머캅탄 용액과 디메칠설파이드 1:0.25 (mol:mol)로 혼합된 혼합액을 3.0 mL/min의 유량으로 60 min 동안 연속적으로 공급하면서 효소전환반응을 수행하였다. 각 용액에 포함된 메칠머캅탄 양은 동일하도록 조절하였다. 반응 온도는 33℃, 교반은 700 rpm으로 설정하였다. 전환 효소액은 상기와 실시예와 동등한 방법으로 제조하여 10 mL 투입하였으며 효소보조인자인 피리독살포스페이트(pyridoxal 5'-phosphate)는 0.1mM 농도로 투입하였다. 약 3시간 후 생성된 메치오닌의 양을 HPLC 를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
1L 회분식 반응기에서 메칠머캅탄 혹은 디메칠설파이드 혼합액 공급에 따른 전환율 비교
　 SMM　
(100%)		 SMM 1 :DMS 0.25 (mol:mol)
　
메치오닌 [g/L] 65.6 75.5
전환율 [%] 85　 100　
상대활성 [%] 100　 118
상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 메칠머캅탄 용액과 디메칠설파이드가 1:0.25 (mol:mol)로 혼합된 메칠머캅탄 용액을 공급하였을 때의 전환율이 메칠머캅탄 용액이 단독적으로 공급된 경우의 전환율 보다 약 18% 정도 상승되는 효과를 확인하였다.
O-아세틸 호모세린 전환반응의 경우 생성물로 메치오닌 외에 아세테이트가 생성되게 되고 이에 따라 pH는 떨어지게 된다. 반응 시작 후 메칠머캅탄 용액 및 디메칠설파이드 혼합액이 공급되는 시점까지는 메칠머캅탄이 NaOH에 녹아있는 액체 상태로 공급되기 때문에 pH가 상승되게 되나 공급이 종료된 이 후 시점부터는 pH는 하락하게 된다. 이는 전환 반응의 부산물로 아세트산 (O-아세틸 호모세린을 기질로 사용한 경우), 혹은 숙신산 (O-숙시닐 호모세린을 기질로 사용한 경우) 이 부분에서는 pH의 하락 속도를 효소반응속도로 볼 수 있으며 도 1에서와 같이 pH 하락 속도로 본 효소반응속도의 경우 메칠머캅탄 용액과 디메칠설파이드 1:0.25 (mol:mol) 혼합액을 사용하였을 경우가 메칠머캅탄 용액만을 사용했을 경우보다 상대적으로 빠름을 확인할 수 있다.
실시예 4: 메칠머캅탄에 디메칠설파이드 첨가량별 O-숙시닐 호모세린의 효소 전환 반응
메치오닌으로의 효소전환반응에 O-아세틸 호모세린 외에 O-숙시닐 호모세린을 기질로 사용하여 메치오닌과 숙신산이 생성되는 반응을 수행하였다.
실시예 1과 같은 1.5 mL 튜브 스케일에서 메칠머캅탄 용액에 디메칠설파이드 첨가량별로 구분하여 O-숙시닐 호모세린이 메치오닌으로 전환되는 효소반응의 전환율을 비교해 보았다. 디메칠설파이드의 첨가량은 메칠머캅탄 용액 대 디메칠설파이드 비가 각각 1:0, 1:0.25, 1:0.35, 1:1 (mol:mol)이 되도록 혼합하였다. 전환반응액은 1ml의 O-숙시닐 호모세린 (500mM) 용액에 전환 효소액을 50 ul, 효소보조인자인 피리독살포스페이트 (pyridoxal 5'-phosphate)는 0.1 mM 농도로 투입하여 제조하였다. O-숙시닐 호모세린 용액은 발효액으로부터 정제한 O-숙시닐 호모세린을 pH 7.5의 포스페이트 완충액에 (phosphate) 용해하여 사용하였다. 국제특허 제WO2008/013432호에 기재된 바와 같이 제작된 CJM-BTJ/pCJ-metA-CL균주를 5L 발효조에서 접종하여 유가식 배양(Fed batch) 발효법으로 50~100시간 배양하였다. 배양한 발효액에서 메탄올 침전법을 이용하여 O-숙시닐 호모세린을 정제하였다.　 전환 효소는 크로모박테리움 비올라슘(Chromobacterium violaceum) 유래의 pCJ-MetZ-CL을 형질전환한 E.coli W3110 균주를 발효하여 국제특허 제WO2008/013432호에 명기된 바대로 균체를 회수하여 파쇄한 후 사용하였다.　 효소 투입량은 0.05 mL으로 하였으며 효소보조인자인 피리독살포스페이트는 0.1 mM 농도로 투입하였다. 제조된 전환 반응액에 메칠머캅탄용액과 디메칠서파이드의 혼합액을 0.02 mL 투입함으로서 효소 반응을 개시하였다. 각 용액은 동량의 메칠머캅탄을 함유하도록 조절하였다. 반응 온도는 33℃, 800 rpm 에서 10분간 교반하에 반응하였으며, 반응 종료 후 0.2N HCl 용액을 투입함으로서 반응을 종료하였다. 생성물인 메치오닌 농도는 HPLC 분석을 통하여 분석하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
첨가량 별 O-숙시닐 호모세린의 전환율 비교
메칠머캅탄 : 디메칠설파이드 혼합비 (mol:mol) 1:0 1:0.25 1:0.35 1:1
메치오닌 [g/L] 4.3 4.6 4.7 4.5
전환율 [%] 86　 94 95 92
상대활성 [%] 100 109 110 107
상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이 디메칠설파이드가 메칠머캅탄 용액 대비 1:0.35 (mol:mol)로 혼합하여 첨가된 경우가 메칠머캅탄만 단독으로 투입된 경우보다 약 10% 정도 활성 증가를 보였다. 메칠머캅탄과 디메칠설파이드를 1:0.25 와 1:1 (mol:mol)로 혼합하여 투입하였을 경우에는 1:0.35 (mol:mol)의 비로 혼합 후 투입하였을 경우 보다 효소 활성의 증가 폭이 적었으나 메칠머캅탄이 단독으로 투입된 경우보다는 각각 약 9%, 7 %의 효소활성 증가를 보였다.
이상 상기 실시예를 통해 설명한 바와 같이, 본 발명은 메치오닌 전환 활성을 가진 효소를 이용하여 메치오닌 전구체로서 O-아세틸 호모세린 또는 O-숙시닐 호모세린을 디메칠설파이드가 혼합된 메칠머캅탄과 반응시킴으로써 메치오닌으로의 전환율을 증가시키는 방법을 제공할 수 있으므로 사료, 식품 첨가제 및 의약품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1은 1L 회분식 반응기에서 메칠머캅탄 용액 혹은 디메칠설파이드 혼합액 공급에 따른 pH 변화에 따른 효소전환반응속도의 비교를 나타낸 도이다.
도 2는 메칠머캅탄 용액(SMM)과 디메칠설파이드(DMS) 혼합비 별 상대활성을 비교한 도이다.

Claims (9)

  1. 메치오닌 전구체인 O-아세틸 호모세린 또는 O-숙시닐 호모세린, 메치오닌 전환 활성을 가진 효소, 및 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합물을 혼합하여 효소 반응을 수행하는 단계를 포함하는 메치오닌 생산방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 메칠머캅탄은 메칠머캅탄 가스 또는 소디움 메칠머캅탄 용액인, 메치오닌 생산방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합비율은 메칠머캅탄:디메칠설파이드가 1:0.05(mol:mol) 내지 1:1(mol:mol)의 비율인, 메치오닌 생산방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합비율은 메칠머캅탄:디메칠설파이드가 1: 0.20(mol:mol) 내지 1:1(mol:mol)의 비율인, 메치오닌 생산방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합비율은 메칠머캅탄:디메칠설파이드가 1:0.25(mol:mol) 내지 1:0.5(mol:mol)의 비율인, 메치오닌 생산방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 디메칠설파이드는 메칠머캅탄 몰농도에 대비하여 5% 내지　25%의 비율인, 메치오닌 생산방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 디메칠설파이드는 메칠머캅탄 몰농도에 대비하여 20% 내지　25%의 비율인, 메치오닌 생산방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 메치오닌 전환활성을 가진 효소는 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase), O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제(O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 메치오닌 생산방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 메치오닌 전환활성을 가진 효소는 에스케리치아속(Escherichia Sp.), 슈도모나스속(Pseudomonas sp.), 렙토스피라속(Leptospira sp.), 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.), 사카로마이세스속(Saccharomyces sp.), 크로모박테리움속(Chromobacterium sp.), 노카디아속(Nocardia sp.), 브라디리조비움속(Bradyrhizobium sp.), 하이호모나스속(Hyphomonas sp.), 메틸로코커스속(Methylococcus sp.), 메틸로바실러스속(Methylobacillus sp.), 니트로소모나스속(Nitrosomonas sp.), 크렙시엘라속(Klesiella sp.), 바실러스속(Bacillus sp.), 쉬겔라속(Shigella sp.), 코웰리아속(Colwellia sp.) 또는 살모넬라속(Salmonella sp.)에 속하는 미생물 균주로부터 유래된 것인, 메치오닌 생산방법.
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