JP2012518432A - メチルメルカプタンとジメチルスルフィドの混合物を使用してメチオニン生産能を増加させる方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、Ｌ−メチオニンおよび有機酸生産効率を増進させる方法に関するものである。
【解決手段】より詳細には、メチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリン、およびメチオニン転換活性を有する酵素に適正な割合で混合されたメチルメルカプタンとジメチルスルフィドの混合物を添加して酵素反応を行うことによって、Ｌ−メチオニン前駆体からＬ−メチオニンおよび有機酸の転換率を向上させて従来方法に比べて高い収率でＬ−メチオニンを生産できる方法に関するものである。
【選択図】図１
【解決手段】より詳細には、メチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリン、およびメチオニン転換活性を有する酵素に適正な割合で混合されたメチルメルカプタンとジメチルスルフィドの混合物を添加して酵素反応を行うことによって、Ｌ−メチオニン前駆体からＬ−メチオニンおよび有機酸の転換率を向上させて従来方法に比べて高い収率でＬ−メチオニンを生産できる方法に関するものである。
【選択図】図１
Description
本発明は、Ｌ−メチオニンおよび有機酸生産効率を増進させる方法に関する。
メチオニンは、生体内の必須アミノ酸の一種類で、飼料および食品添加剤として広く使用され、医薬用として輸液剤、医薬品の合成原料としても使用される。メチオニンは、コリン(レシチン)とクレアチンのような化合物の前駆体として作用し、システインとタウリンの合成原料としても使われる。また、硫黄(sulfur)を提供する役割を果たす。Ｓ−アデノシル−メチオニン(S-adenosyl-methionine)は、Ｌ−メチオニンから由来し、生体内でメチル基を提供する役割を果たし、脳の様々な神経伝達物質(neurotransmitter)の合成に関連している。メチオニンおよび／またはＳ−アデノシル−メチオニン(ＳＡＭ)は、生体内で肝と動脈において脂肪蓄積を抑制し、うつ病、炎症、肝疾患、筋肉痛を緩和するなどの様々な役割を果たす(Jeon BR et al.，J Hepatol.，2001 Mar;34(3):395-401)。
メチオニンの化学合成は、主に、５−（β−メチルメルカプトエチル）−ヒダントイン(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)の加水分解反応によってＬ−メチオニンを生産する方法を用いる。しかし、このような化学合成を介して生産されたメチオニンは、Ｌ型とＤ型が混合された形態で生産されるという短所がある。ゆえに本発明者らは、生物学的方法を用いてＬ−メチオニンを選択的に生産できる技術を開発して特許を出願したことがある(ＷＯ２００８／０１３４３２)。この方法は、簡単に２段階の工法と命名した方法であり、発酵によるＬ−メチオニン前駆体生産工程、および前記Ｌ−メチオニン前駆体を酵素によってＬ−メチオニンに転換する工程から構成されている。前記のＬ−メチオニン前駆体は、好ましくはＯ−アセチルホモセリンとＯ−スクシニルホモセリンを含む。このような２段階工法を開発することによって、従来問題になっていた硫化物特有の基質毒性問題、メチオニンとＳＡＭｅによる菌株のフィードバック調節問題、シスタチオニンγシンターゼ(cystathionine gamma synthase)、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ(O-succinylhomoserine sulfhydrylase)およびＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)特有の中間産物分解活性問題を全て解決することができた。また、Ｌ−メチオニンのみを選択的に生産できてＬ型メチオニンとＤ型メチオニンを同時に生産する既存の化学合成工程に比べて優れた工程であり、さらに、同様の反応を通じて副産物として有機酸、より具体的には、コハク酸、酢酸を同時に生産できる非常に優れた工程である。前記のコハク酸は、ペイントや化粧品、医薬品の原料として使用され、酢酸は、酢酸ビニルの製造をはじめとして染色、アスピリンなどの医薬品、写真の定着液に使われるなど工業的に非常に有用であるといえる。
２段階工程の酵素転換工程においては、シスタチオニンγシンターゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼおよびＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼの活性を有する酵素を用い、Ｌ−メチオニンの前駆体であるＯ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリンをメチルメルカプタンと混合しながら酵素反応を起こすことによって、Ｌ−メチオニンと有機酸を生産する。
メチルメルカプタンは、常温でガス(gas)で存在し、水によく溶けない性質を有しており、アルカリ溶液で高い溶解度を有する物質である。Ｌ−メチオニンを生産するための酵素転換反応は、水溶液中で起きるので、メチルメルカプタンが水溶液中でより高い溶解度を有することができるようにすれば、メチオニン生産性を大きく増進させ得ると期待される。
そこで、本発明者は、前記のような点を考慮してＬ−メチオニン生産性を極大化するために、酵素転換工程においてメチルメルカプタンの溶解度を増加させるための方法を探そうと鋭意努力した結果、適正な割合で混合されたメチルメルカプタンとジメチルスルフィド混合溶液を使用することによって、Ｌ−メチオニン前駆体からＬ−メチオニンおよび有機酸への転換率を向上させ、既存の方法に比べて高い収率でＬ−メチオニンを生産できることを確認することによって本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、Ｌ−メチオニンの前駆体であるＯ−アセチルホモセリンあるいはＯ−スクシニルホモセリンを用いた酵素転換反応において、基質として使われる硫化物であるメチルメルカプタンに、また他の硫化物であるジメチルスルフィドを添加することによってメチオニンへの転換率を向上させる方法を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、一つの態様として、１）メチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリン、前記メチオニン前駆体をメチオニンに転換する転換酵素およびメチルメルカプタンとジメチルスルフィドとの混合液を含む反応溶液を製造する段階および、２）前記反応溶液を攪拌しながら、酵素転換反応を行う段階を含むメチオニン生産方法を提供する。
本願発明において、用語“２段階工法”とは、国際特許ＷＯ２００８／０１３４３２号に開示された方法であって、製作された発酵菌株を用いたグルコース発酵を介してＯ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリンを生成する１段階および、前記Ｏ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリンをメチルメルカプタンと共に混合して酵素転換反応させ、メチオニンに転換してＬ−メチオニンを生産する２段階を含むＬ−メチオニン生産方法をいう。
以下、本発明の構成を詳細に説明する。
本発明は、一つの態様として、
１）メチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリン；前記メチオニン前駆体をメチオニンに転換する転換酵素；およびメチルメルカプタンとジメチルスルフィドとの混合液を含む反応溶液を製造する段階；および、
２）前記反応溶液を攪拌しながら、酵素転換反応を行う段階を含むメチオニン生産方法を提供する。
本発明は、一つの態様として、
１）メチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリン；前記メチオニン前駆体をメチオニンに転換する転換酵素；およびメチルメルカプタンとジメチルスルフィドとの混合液を含む反応溶液を製造する段階；および、
２）前記反応溶液を攪拌しながら、酵素転換反応を行う段階を含むメチオニン生産方法を提供する。
前記段階２）の攪拌は、５００〜１０００ｒｐｍ、好ましくは６００〜９００ｒｐｍ、より好ましくは７００〜８００ｒｐｍで行うことができる。
本発明の方法は、さらに、酵素転換反応を終了する段階を含むことができ、本発明の具体的な態様では、２Ｎ ＨＣｌで処理して終了した。
また、本発明の方法は、さらに、反応溶液に存在するメチオニンを精製する段階を含むことができる。前記メチオニン精製過程は、具体的には、１）酵素転換反応液から菌体を分離する段階、２）前記菌体が分離された反応液を脱色およびろ過する段階および、３）前記ろ過液を決定化する段階から構成され得る。
前記菌体を分離する段階は、高速遠心分離機やメンブレン(Membrane)フィルターを用いて行うことができる。前記菌体が分離された反応液を脱色/ろ過する段階は、活性炭素を用いることができるが、これに制限されない。
メチオニン生産のための２段階工法では、Ｌ−メチオニンの前駆体であるＯ−アセチルホモセリンあるいはＯ−スクシニルホモセリンとメチルメルカプタン(Methyl mercaptan，CH3SH)を基質として使用した酵素転換反応でメチオニンを生産する(ＷＯ２００８／０１３４３２)。この場合、メチルメルカプタンが基質であるＯ−アセチルホモセリンあるいはＯ−スクシニルホモセリンと結合してメチオニンを生成するから、メチルメルカプタンの反応性がメチオニン生産効率を大きく左右し得る。しかし、メチルメルカプタンは、中性の水溶液で溶解度が非常に低い物質であって、速い速度で蒸発して溶液に残っていることができない。したがって、メチルメルカプタンの反応性を増大させ得る方法を探せば、メチルメルカプタンが蒸発する前に最大限多い量のメチルメルカプタンを反応させることによって、メチオニン生産収率を増大させ得ると期待できる。そこで、本発明者らは、第３の物質をメチルメルカプタンが含まれた反応液中に添加してメチルメルカプタンの反応性を高めようとした。その結果、本発明では、第３の物質としてジメチルスルフィド(ＤＭＳ：Dimethylsulfide)をメチルメルカプタンと一部混合して反応を誘導する場合、転換効率が増加することを確認することができた。
本発明の具体的な実施例では、ジメチルスルフィド単独では転換反応が成り立たなかったが、メチルメルカプタンにジメチルスルフィドを混合することによって、メチルメルカプタンを単独で使用した場合よりも転換率が増加することを確認した(表１、表４および図２参照)。また、前記ジメチルスルフィドとの混合によって生成された副産物である酢酸によるｐＨ下落速度で調べてみた酵素反応速度もメチルメルカプタン単独で使用した場合よりも早いことを確認した(図１参照)。合わせて、前記混合液を持続的に供給しながら転換率を比較したり(表２参照)、培養規模を大型に変えて比較した結果においても、単独で供給する場合よりも転換率が増加した(表３参照)。ゆえに、本発明の方法は、Ｏ−アセチルホモセリンあるいはＯ−スクシニルホモセリンからＬ−メチオニンへの転換速度を向上させるのに有用に使用され得るだろう。
メチオニン転換活性を有する酵素を用いた、メチオニン前駆体からメチオニンへの転換反応は、下記の反応式のように行われる。
メチルメルカプタン(CH3SH)＋Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン⇔コハク酸塩＋Ｌ−メチオニン
メチルメルカプタン(CH3SH)＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン⇔酢酸塩＋Ｌ−メチオニン
メチルメルカプタン(CH3SH)＋Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン⇔コハク酸塩＋Ｌ−メチオニン
メチルメルカプタン(CH3SH)＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン⇔酢酸塩＋Ｌ−メチオニン
前記の反応において、メチルメルカプタンのＣＨ３Ｓ-残基がＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンのコハク酸塩(succinate)または酢酸塩(acetate)残基と置換されてメチオニンを生成するようになる。
反応の時メチルメルカプタン(CH3SH)は、様々な形態で添加が可能である。好ましくは、メチルメルカプタンは、気体型のメチルメルカプタンガスまたは、液体型のメチルメルカプタンとしてメチルメルカプタンナトリウム溶液がいずれも使用され得る。メチルメルカプタンナトリウム溶液とメチルメルカプタンガスは、水溶性の反応液中で同一の反応特性を示すためである。したがって、前記したように、メチルメルカプタンは、直接使用されたり、苛性ソーダに溶解されてメチルメルカプタンナトリウム溶液の形態で使用され得るが、メチルメルカプタンは常温でガスとして存在するからメチルメルカプタンを苛性ソーダに溶解させたメチルメルカプタンナトリウム溶液の形態で使用するのがより好ましい。
本発明において、メチオニン転換活性を有する酵素としては、シスタチオニンγシンターゼ(cystathionine gamma synthase)、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ(O-succinylhomoserine sulfhydrylase)およびＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)からなる群から選択される１種以上を使用することができる。
前記の反応において、メチオニン生産反応に用いられるメチオニン転換活性を有する酵素は、エシェリキア属(Escherichia sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、サッカロミセス属(Saccharomycessp.)、クロモバクテリウム属(Chromobacteriumsp.)、ノルカジア属(Norcardiasp.)、ブラジリゾビウム属(Bradyrhizobiumsp.)、ヒホモナス属(Hyphomonassp.)、メチロコックス属(Methylococcussp.)、メチロバシルス属(Methylobacillussp.)、ニトロソモナス属(Nitrosomonassp.)、クレシエラ属(Klesiellasp.)、バシルス属(Bacillussp.)、シゲラ属(Shigellasp.)、コルウェリア属(Colwelliasp.)、サルモネラ属(Salmonellasp.)、酵母(yeast)または菌類(fungi)に属する微生物菌株に由来するものであり得る。
前記の転換反応において、Ｏ−スクシニルホモセリンを基質で使用する場合、好ましくはシュードモナス属、ノルカジア属、クロモバクテリウム属に属する微生物菌株、より好ましくは、シュードモナスアウロゲノサ(P．aurogenosa)、ノルカジアファルシニカ(N．Farcinica)、シュードモナスプチダ(P．putida)、クロモバクテリウムビオラシウム(C．Violaceum)に属する微生物菌株から由来した、シスタチオニンγシンターゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼおよびＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼからなる群から選択される１種以上の酵素が使用され得る。
前記の転換反応において、Ｏ−アセチルホモセリンを基質として使用する場合、好ましくはレプトスピラ属、クロモバクテリウム属、ヒポモナス属に属する微生物菌株、より好ましくは、レプトスピラメイエリ(L．meyeri)、シュードモナスアウロゲノサ(P．aurogenosa)、ヒポモナスネプチュニウム(H．Neptunium)、クロモバクテリウムビオラシウム(C．Violaceum)に属する微生物菌株から由来した、シスタチオニンγシンターゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼおよびＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼからなる群から選択される１種以上の酵素が使用され得る。
本発明の具体的な実施態様において、前記Ｌ−メチオニン生産転換反応に使用された基質であるＯ−アセチルホモセリンあるいはＯ−スクシニルホモセリンは、従来特許文献の国際特許ＷＯ２００８／０１３４３２号に明記されたように製作された微生物菌株を発酵することによって生産し、培養した発酵液からメタノール沈殿法を用いて基質であるＯ−アセチルホモセリンあるいはＯ−スクシニルホモセリンを精製して使用した。
また、前記Ｌ−メチオニン生産転換反応に使用された酵素は、クロモバクテリウムビオラシウム(Chromobacterium violaceum)由来のＯ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼとヒポモナスネプチュニウム(Hyphomonas Neptunium)由来のＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ遺伝子を発酵して国際特許ＷＯ２００８／０１３４３２号に明記されたように菌体を回収して破砕した後に使用した。
前記の方法で回収した基質であるＯ−アセチルホモセリンあるいはＯ−スクシニルホモセリンとメチオニン転換活性を有する酵素を混合して転換反応液を製造した。
また他の基質として使用されるメチルメルカプタンにジメチルスルフィドを適正比率で混合して転換反応液に投入することによって、Ｏ−アセチルホモセリンあるいはＯ−スクシニルホモセリンがメチオニンに転換される反応の転換率を比較してみた。その結果、メチルメルカプタンとジメチルスルフィドの混合比率は、メチルメルカプタン：ジメチルスルフィドが１：０．５(mol:mol)〜１：１(mol:mol)の比率、好ましくは１：０.２０(mol:mol)〜１：１(mol:mol)の比率、より好ましくは１：０.２５(mol:mol)〜１：０.５(mol:mol)の比率になるようにする。一方、ジメチルスルフィドは、メチルメルカプタンのモール濃度に対比して、好ましくは５％〜２５％の比率、より好ましくは２０％〜２５％の比率になるように混合して使用する。
他の一つの態様として、本発明は、前記方法で製造されたメチオニンを提供する。前記のメチオニンは、別の精製過程を経て精製された後に乾燥された粉末形態であるとか、水溶液に溶解している溶液状態であり得る。
本発明に応じてメチルメルカプタンとジメチルスルフィドの混合物を使用してＬ−メチオニン前駆体からＬ−メチオニンに転換する方法は、従来の方法に比べて高収率でＬ−メチオニンを生産することができ、このように生産されたメチオニンは、飼料および食品添加剤、医薬用および医薬品の原料などの多様な分野に広く使用することができる。
本発明は、転換反応の時メチルメルカプタンを単独で使用した場合に比べてメチオニン生成率を増加させ、生産物であるＬ−メチオニンと有機酸の純度を増加させることもできる。しかも、メチオニンの生産性を向上させて反応設備に対する投資費を減少させる経済的な効果も得ることができる。
以下、実施例を通じて本発明の構成および効果をより詳細に説明しようとする。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためだけのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるのではない。
実施例１：メチルメルカプタンとジメチルスルフィドの混合比によるＯ−アセチルホモセリンからのメチオニン転換率の比較
転換反応の時メチルメルカプタン溶液にジメチルスルフィドを適正比率で混合して転換反応液に投入し、Ｏ−アセチルホモセリンがメチオニンに転換される反応の転換率を比較してみた。
メチルメルカプタンは、常温でガスとして存在し、苛性ソーダ液にメチルメルカプタンを添加して液状のメチルメルカプタンナトリウム(sodium methyl mercaptan、ＣＨ３Ｓ−Ｎａ，２．１４Ｍ、１５％、日本東京化成工業株式会社)の状態で存在することができる。本実施例では、メチルメルカプタンナトリウム２.１４Ｍ溶液を用いて実験を行った。以後、メチルメルカプタンナトリウム２.１４Ｍ溶液をメチルメルカプタン溶液と通称した。メチルメルカプタン溶液とジメチルスルフィド液(１３．３８Ｍ、９９％、フランスアルケマ社)をそれぞれ適正モル比(mol:mol)で混合した後、攪拌して混合液を製造した。
転換反応液は、１ｍｌのＯ−アセチルホモセリン(500mM)溶液に転換酵素液を５０μｌ、酵素補助因子であるピリドキサールホスフェート(Pyridoxal 5'-phosphate、米国Sigma社)は０.１ｍＭの濃度で投入して製造した。Ｏ−アセチルホモセリン溶液は、発酵液から精製したＯ−アセチルホモセリンをｐＨ７.５のホスフェート(phosphate)緩衝液に溶解して使用した。
発酵菌株は、国際特許ＷＯ２００８／０１３４３２号に開示された方法で製作されたＣＪＭ−ＢＴＪＡ／ｐＣＪ−ｍｅｔＸｌｍｅ−ＣＬ菌株を使用した。前記ＣＪＭ−ＢＴＪＡ／ｐＣＪ−ｍｅｔＸｌｍｅ−ＣＬ菌株を５Ｌ発酵槽に接種して流加式培養(Fed batch)発酵法で５０〜１００時間培養した。培養した発酵液からメタノール沈殿法を用いてＯ−アセチルホモセリンを精製した。転換酵素は、ヒポモナスネプチュニウム(Hyphomonas Neptunium)由来のｐＣＪ−ＭｅｔＺ−ＣＬを形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０菌株を発酵して、国際特許ＷＯ２００８／０１３４３２号に明記されたように菌体を回収して破砕した後に使用した。製造された転換反応液にそれぞれメチルメルカプタンとジメチルスルフィドとの混合液を投入することによって酵素反応を開始した。この時、メチルメルカプタン量の最終投入量が０.０４ｍＭになるようにメチルメルカプタンとジメチルスルフィドとの混合液の投入量を調節した。反応温度は、３３℃、８００ｒｐｍで１０分間攪拌下で反応し、反応終了後に０.２Ｎ ＨＣｌ溶液を投入することによって反応を終了した。生成物であるメチオニンの濃度は、ＨＰＬＣ分析を介して分析した。分析条件は、国際特許ＷＯ２００８／０１３４３２号に明記された分析条件に基づいた。
Ｏ−アセチルホモセリンのメチオニン転換率(％)は、反応に使用された基質のモル数(mol/L)から生成されたメチオニンのモル数の％を計算して算定した。１ｍｏｌのＯ−アセチルホモセリンおよびメチルメルカプタンから１ｍｏｌのメチオニンが生成された場合、転換率(％)を１００％と計算した。分析結果を下記表１に示した。
前記表１から分かるように、メチルメルカプタン溶液とジメチルスルフィドとが１：０.２５(mol:mol)で混合されたメチルメルカプタンが投入された場合に、メチルメルカプタン単独で投入した場合よりも３４％のメチオニンの生成量増加を確認した。メチルメルカプタンとジメチルスルフィドとの混合比をそれぞれ１：０.２５以上と調整した場合にも、相対活性がこれ以上増加しなかったが、高い相対活性を維持することを確認した。
対照群として１：１比率のメチルメルカプタンとジメチルスルフィド混合液に含まれたものと同量のジメチルスルフィドのみを単独で転換反応液に混合した場合には、メチオニン生成が全く観察されず、これによりジメチルスルフィド単独ではメチオニンを全く生成できないことを確認した。したがって、ジメチルスルフィドがメチルメルカプタンとの混合によってメチルメルカプタンの反応性を増加させることによって、メチオニン生成を増加させると推定することができた。
実施例２：メチルメルカプタンとジメチルスルフィド混合液を用いたメチオニン転換反応
実施例１の条件と同様な条件で持続的なメチオニン生成促進反応を観察するために、メチルメルカプタンとジメチルスルフィド混合液を時間に応じて持続投入しながらメチオニン生成を確認した。同一の転換反応液を用いて１０分経過時ごとにそれぞれメチルメルカプタン溶液とジメチルスルフィド混合液を投入しながら３０分間反応を持続した。３０分後に反応を終了させ、ＨＰＬＣを用いて生成されたメチオニン量を測定した。ジメチルスルフィド混合比は実施例１で最も高いメチオニン生産増加を示したメチルメルカプタン溶液とジメチルスルフィド１：０.２５(mol:mol)混合を反応条件とした。結果は、下記表２に示した。
実施例１の条件と同様な条件で持続的なメチオニン生成促進反応を観察するために、メチルメルカプタンとジメチルスルフィド混合液を時間に応じて持続投入しながらメチオニン生成を確認した。同一の転換反応液を用いて１０分経過時ごとにそれぞれメチルメルカプタン溶液とジメチルスルフィド混合液を投入しながら３０分間反応を持続した。３０分後に反応を終了させ、ＨＰＬＣを用いて生成されたメチオニン量を測定した。ジメチルスルフィド混合比は実施例１で最も高いメチオニン生産増加を示したメチルメルカプタン溶液とジメチルスルフィド１：０.２５(mol:mol)混合を反応条件とした。結果は、下記表２に示した。
前記表２から分かるように、３０分後にメチルメルカプタンのみ単独で投入した場合に比べて、約１５％の転換率上昇の効果を示した。
実施例３：１Ｌ回分式反応器でのＯ−アセチルホモセリンの酵素転換反応
より大型の反応器で転換反応効率を確認するために、１Ｌ規模の回分式反応器で７００ｍＭのＯ−アセチルホモセリン５００ｍＬを使って反応を行った。メチルメルカプタン溶液あるいはメチルメルカプタン溶液とジメチルスルフィド１：０.２５(mol:mol)で混合された混合液を３.０ｍＬ／ｍｉｎの流量で６０分間連続的に供給しながら酵素転換反応を行った。各溶液に含まれたメチルメルカプタン量は同一になるように調節した。反応温度は３３℃、攪拌は７００ｒｐｍに設定した。転換酵素液は、前記の実施例と同様な方法で製造して１０ｍＬ投入し、酵素補助因子であるピリドキサールホスフェート(pyridoxal 5'-phosphate)は、０.１ｍＭ濃度で投入した。約３時間後に生成されたメチオニンの量をＨＰＬＣを用いて測定した。その結果を下記表３に示した。
より大型の反応器で転換反応効率を確認するために、１Ｌ規模の回分式反応器で７００ｍＭのＯ−アセチルホモセリン５００ｍＬを使って反応を行った。メチルメルカプタン溶液あるいはメチルメルカプタン溶液とジメチルスルフィド１：０.２５(mol:mol)で混合された混合液を３.０ｍＬ／ｍｉｎの流量で６０分間連続的に供給しながら酵素転換反応を行った。各溶液に含まれたメチルメルカプタン量は同一になるように調節した。反応温度は３３℃、攪拌は７００ｒｐｍに設定した。転換酵素液は、前記の実施例と同様な方法で製造して１０ｍＬ投入し、酵素補助因子であるピリドキサールホスフェート(pyridoxal 5'-phosphate)は、０.１ｍＭ濃度で投入した。約３時間後に生成されたメチオニンの量をＨＰＬＣを用いて測定した。その結果を下記表３に示した。
前記表３から分かるように、メチルメルカプタン溶液とジメチルスルフィドが１：０.２５(mol:mol)で混合されたメチルメルカプタン溶液を供給した時の転換率がメチルメルカプタン溶液が単独で供給された場合の転換率よりも約１８％程度上昇する効果を確認した。
Ｏ−アセチルホモセリン転換反応の場合、生成物としてメチオニンの他にアセタートが生成されるようになり、これによってｐＨは落ちるようになる。反応開始後、メチルメルカプタン溶液およびジメチルスルフィド混合液が供給される時点まではメチルメルカプタンがＮａＯＨに溶けている液体状態で供給されるからｐＨが上昇するようになるが、供給が終了した以後の時点からはｐＨは下落するようになる。これは転換反応の副産物として、酢酸(Ｏ−アセチルホモセリンを基質として使った場合)、あるいはコハク酸(Ｏ−スクシニルホモセリンを基質として使った場合)である部分では、ｐＨの下落速度を酵素反応速度として看做し、図１でのように、ｐＨ下落速度で看做した酵素反応速度の場合、メチルメルカプタン溶液とジメチルスルフィド１：０.２５(mol:mol)混合液を使用した場合がメチルメルカプタン溶液のみを使用した場合よりも相対的に速いことを確認することができる。
実施例４：メチルメルカプタンへのジメチルスルフィド添加量別Ｏ−スクシニルホモセリンの酵素転換反応
メチオニンへの酵素転換反応にＯ−アセチルホモセリンの他にＯ−スクシニルホモセリンを基質として使用してメチオニンとコハク酸が生成される反応を行った。
メチオニンへの酵素転換反応にＯ−アセチルホモセリンの他にＯ−スクシニルホモセリンを基質として使用してメチオニンとコハク酸が生成される反応を行った。
実施例１のような１.５ｍＬチューブスケールでメチルメルカプタン溶液にジメチルスルフィド添加量別に区分してＯ−スクシニルホモセリンがメチオニンに転換される酵素反応の転換率を比較してみた。ジメチルスルフィドの添加量は、メチルメルカプタン溶液：ジメチルスルフィド比がそれぞれ１：０、１：０.２５、１：０.３５、１：１(mol:mol)になるように混合した。転換反応液は、１ｍＬのＯ−スクシニルホモセリン(５００ｍＭ)溶液に転換酵素液を５０μｌ、酵素補助因子であるピリドキサールホスフェート(pyridoxal 5'-phosphate)は、０.１ｍＭ濃度で投入して製造した。Ｏ−スクシニルホモセリン溶液は、発酵液から精製したＯ−スクシニルホモセリンをｐＨ７.５のホスフェート緩衝液に(phosphate)溶解して使用した。国際特許ＷＯ２００８／０１３４３２号に記載されたように製作されたＣＪＭ−ＢＴＪ／ｐＣＪ−ｍｅｔＡ−ＣＬ菌株を５Ｌ発酵槽で接種して流加式培養(Fed batch)発酵法で５０〜１００時間培養した。培養した発酵液からメタノール沈殿法を用いてＯ−スクシニルホモセリンを精製した。転換酵素は、クロモバクテリウムビオラセウム(Chromobacterium violaceum)由来のｐＣＪ−ＭｅｔＺ−ＣＬを形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０菌株を発酵して、国際特許ＷＯ２００８／０１３４３２号に明記されたように菌体を回収して破砕した後に使用し、酵素投入量は０.０５ｍＬにした。製造された転換反応液に様々な混合比のメチルメルカプタン溶液とジメチルスルフィドの混合液を０．０２ｍＬ投入することによって酵素反応を開始した。各溶液は同量のメチルメルカプタンを含有するように調節した。反応温度は３３℃、８００ｒｐｍで１０分間攪拌下で反応し、反応終了後に０.２Ｎ ＨＣｌ溶液を投入することによって反応を終了した。生成物であるメチオニン濃度はＨＰＬＣ分析を介して分析した。その結果を表４に示した。
前記表４から分かるように、ジメチルスルフィドがメチルメルカプタン溶液対比１：０．３５(mol:mol)で混合して添加された場合がメチルメルカプタンのみ単独で投入された場合よりも約１０％程度活性増加を示した。メチルメルカプタンとジメチルスルフィドを１：０．２５と１：１(mol:mol)で混合して投入した場合には、１：０．３５(mol:mol)の比で混合した後に投入した場合よりも酵素活性の増加幅が少なかったが、メチルメルカプタンが単独で投入された場合よりもそれぞれ約９％、７％の酵素活性増加を示した。
以上、前記実施例を通じて説明したように、本発明は、メチオニンへの転換率を増加させる方法を提供することができるので、飼料、食品添加剤および医薬品産業上、非常に有用な発明である。
Claims (11)
- メチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリン前記メチオニン前駆体をメチオニンに転換する転換酵素；およびメチルメルカプタンとジメチルスルフィドの混合液を含む反応溶液を製造する第１の段階；および
前記反応溶液を攪拌しながら、酵素転換反応を行う第２の段階を含むメチオニン生産方法。 - 前記メチルメルカプタンは、メチルメルカプタンガスまたはメチルメルカプタンナトリウム溶液である請求項１に記載のメチオニン生産方法。
- 前記メチルメルカプタンとジメチルスルフィドの混合比率は、メチルメルカプタン：ジメチルスルフィドが１：０．０５〜１：１の比率である請求項１に記載のメチオニン生産方法。
- 前記メチルメルカプタンとジメチルスルフィドの混合比率は、メチルメルカプタン：ジメチルスルフィドが１：０．２０〜１：１の比率である請求項３に記載のメチオニン生産方法。
- 前記メチルメルカプタンとジメチルスルフィドの混合比率は、メチルメルカプタン：ジメチルスルフィドが１：０．２５〜１：０．５の比率である請求項４に記載のメチオニン生産方法。
- 前記メチオニン転換活性を有する酵素は、シスタチオニンγシンターゼ(cystathionine gamma synthase)、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ(O-succinylhomoserine sulfhydrylase)およびＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)からなる群から選択される１種以上である請求項１に記載のメチオニン生産方法。
- 前記方法は、酵素転換反応を終了する段階を更に含む請求項１に記載のメチオニン生産方法。
- 前記方法は、前記酵素転換反応によって形成された反応液に存在するメチオニンを精製する段階を更に含む請求項１に記載のメチオニン生産方法。
- 前記メチオニンを精製する方法は、１）酵素転換反応液から菌体を分離する段階；２）前記菌体が分離した反応液を脱色およびろ過する段階；および３）前記ろ過液を決定化する段階を含む請求項８に記載のメチオニン生産方法。
- 請求項１〜９のうち、いずれか一つの方法で製造されたメチオニン。
- 前記メチオニンは、粉末または溶液状態である請求項１０に記載のメチオニン。
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