JP2014518078A

JP2014518078A - 発酵による天然ｌ−システインの製造方法

Info

Publication number: JP2014518078A
Application number: JP2014517634A
Authority: JP
Inventors: アンネリーゼ、ロイター−マイアー; マルクス、ブルンナー; トビアス、ダスラー
Original assignee: Wacker Chemie AG
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-25
Publication date: 2014-07-28
Anticipated expiration: 2032-06-25
Also published as: DE102011078481A1; WO2013000864A1; CN103732755B; JP5788593B2; CN103732755A; EP2726625A1; EP2726625B1; US8802399B2; KR20140007504A; US20140141474A1; KR101589361B1

Abstract

製造発酵槽中で微生物菌株を発酵培地において培養し、天然Ｌ−システインを製造する方法であって、前記発酵培地中で製造される化合物Ｌ−システイン、Ｌ−シスチンおよびチアゾリジンの画分が、前記発酵培地中において最大８ｍｇ／ｌの鉄濃度により、標的とする様式で制御される方法を提供する。

Description

本発明は、発酵により天然Ｌ−シスチンを製造する方法に関する。

アミノ酸Ｌ−システインは、例えば食品添加物(特に製パン工業において)としてや化粧品の原料として、さらには活性製薬成分(特にＮ−アセチルシステインおよびＳ−カルボキシメチルシステイン)を製造するための出発物質としても使用されており、経済的に重要である。

Ｌ−システインは、全ての生物における硫黄代謝において重要な役割を果たし、タンパク質、グルタチオン、ビオチン、リポ酸、メチオニンおよび他の硫黄含有代謝生成物の合成に使用される。さらに、Ｌ−システインは補酵素Ａを生合成するための前駆物質として有用である。Ｌ−システインの生合成は、細菌、とりわけ腸内細菌（Enterobacteria）で詳細に研究されており、Kredich(1996、Biosynthesis of cysteine、p.514-527. F.C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H.E. Umbarger (ed.), Eschericia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed. ASM Press, ワシントンD.C.)に詳細に記載されている。

Ｌ−システインの製造方法は、毛髪、剛毛、角、ひずめおよび羽等のケラチン含有材料からの抽出、あるいは前駆物質の酵素転化を利用した生体内変化による古典的な製法に加えて、発酵による製造方法も数年前に開発された。微生物を使用する発酵によるＬ−システインの製造に関する先行技術は、例えば米国特許第６２１８１６８Ｂ１号、米国特許第５９７２６６３Ａ号、米国特許出願公開第２００４０３８３５２Ａ２号、加国特許第２３８６５３９Ａ２号、欧州特許第１７６９０８０号および欧州特許第２１３８５８５号に記載されている。ここで使用されている細菌性ホスト生物は、とりわけ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉまたはＰａｎｔｏｅａａｎａｎａｔｉｓの代表である。

突然変異および選択による改良されたＬ−システイン生産菌に到達する古典的な手順に加えて、菌株に対する標的遺伝子修飾も、効果的なＬ−システイン過生産を達成するために行われている。

例えば、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を低減させたセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥ対立遺伝子の挿入によってシステイン生産を増加させている（米国特許第６２１８１６８Ｂ１号）。フィードバック耐性のＣｙｓＥ酵素により、Ｌ−システインの直接前駆物質であるＯ−アセチル−Ｌ−セリンの形成が、細胞内でＬ−システインレベルから大きくデカップリングされる。

Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンは、Ｌ−セリンおよびアセチル−ＣｏＡから形成される。従って、Ｌ−システイン製造のために十分な量でＬ−セリンを提供することが非常に重要である。これは、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害を低下させた３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素をコードするｓｅｒＡ対立遺伝子の導入により達成される。その結果、Ｌ−セリンの前駆物質である３−ヒドロキシピルビン酸の形成は、細胞内でＬ−セリンレベルから大きくデカップリングされる。そのようなＳｅｒＡ酵素の例は、欧州特許第０６２０８５３号、米国特許第７５８２４６０Ｂ２号および欧州特許第０９３１８３３号に記載されている。

さらに、Ｌ−システイン−分解酵素、例えばトリプトファナーゼＴｎａＡまたはシスタチオニン−β−リアーゼＭａｌＹ若しくはＭｅｔＣをコードする弱体化または破壊遺伝子により、発酵におけるＬ−システイン収率を増加させ得ることが知られている（欧州特許第１５７１２２３号）。

細胞からのＬ−システインの搬送を増加することも、培地中における生成物の収率を増加させるさらなる可能性である。これは、いわゆるエフラックス遺伝子の過発現により達成される。これらの遺伝子は、細胞からのＬ−システインの搬送を仲介する膜結合型タンパク質をコードする。Ｌ−システイン搬送用の様々なエフラックス遺伝子が知られている（米国特許第５９７２６６３Ａ号、米国特許出願公開第２００４００３８３５２Ａ２号、米国特許第２００５２２１４５３号、国際公開第２００４１１３３７３号パンフレット）。

米国特許第６２１８１６８Ｂ１号米国特許第５９７２６６３Ａ号米国特許出願公開第２００４０３８３５２Ａ２号加国特許第２３８６５３９Ａ２号欧州特許第２１３８５８５号欧州特許第０６２０８５３号米国特許第７５８２４６０Ｂ２号欧州特許第０９３１８３３号米国特許第２００５２２１４５３号国際公開第２００４１１３３７３号パンフレット

Kredich(1996、Biosynthesis of cysteine、p.514-527. F.C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H.E. Umbarger (ed.), Eschericia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed. ASM Press, ワシントンD.C.)

Ｌ−システインを細胞から発酵培地へ搬送することには、幾つかの利点がある、すなわち、
１）Ｌ−システインは、細胞内反応平衡から連続的に抽出され、その結果、このアミノ酸のレベルが、細胞中で低く抑えられ、従って、Ｌ−システインによる酵素に敏感なフィードバック阻害が起こらない、すなわち
（１）Ｌ−システイン(細胞内)←→Ｌ−システイン(培地)
２）培地中に放出されたＬ−システインは、培養の際に培地中に導入された酸素の存在下でジスルフィドＬ−シスチンに酸化される（米国特許第５９７２６６３Ａ号）、すなわち
（２）２Ｌ−システイン＋１／２Ｏ_２←→Ｌ-シスチン＋Ｈ_２Ｏ
水溶液中の中性ｐＨにおけるＬ−シスチンの溶解度は、特にＬ−システインと比較して非常に低いので、ジスルフィドは低濃度でも沈殿し、白色沈殿を形成する、すなわち
（３）Ｌ−シスチン(溶解)←→Ｌ−シスチン(沈殿)
Ｌ−シスチンの沈殿により、培地中に溶解した生成物のレベルは低下し、その結果、(1)および(2)の反応平衡は、それぞれの場合に生成物側に引き寄せられる。
３）アミノ酸が発酵培地から直接得られるなら、生成物が細胞内に蓄積し、最初に細胞破壊を行わなければならない場合よりも、生成物の精製に関わる技術的な労力は著しく低い。

Ｌ−システイン２分子の酸化の際に、ジスルフィドＬ−シスチンが形成される。この反応は可逆的である、つまり、還元によりＬ−シスチンをＬ−システインに転化して戻すことができる。細胞から分離した後(例えばデカンターを使用して)、Ｌ−シスチンが電気分解によりＬ−システインに再び還元される場合、この化学的転化は、そのようなＬ−システインが、香料規則により天然とは見なされないことを意味する。

ＥＵ香料規則(食品法律による商標規則を改善する規則の１３３４／２００８条）によれば、天然香料は、以下の通りに規定されている、すなわち、「天然」香料は、天然に産出される自然界に存在する、香料特性を有する化学的に定義された物質である。これらの物質は、好適には物理的、酵素的、または微生物学的な調製方法により、植物、動物または微生物学的出発材料から得られ、それ自体としてまたは処理されて、一種以上の従来の食品調製方法（例えば発酵を含む微生物学的方法の付録IIを参照)により人間の消費用に使用される。

用語「天然」とは、本明細書ではこの意味にも使用される。香料の製造には天然原料の使用に大きな関心がある。しかし、これまで発酵によって天然システインを製造する方法は存在しない。

ＳＨ基の酸化に触媒作用することができる一連の化合物があり、例えば重金属塩、例えば鉄塩または亜鉛塩は、発酵における不可欠な添加剤であり、これらの成分は、システインからシスチンへの酸化に効果的に触媒作用し得ることが知られている（米国特許出願公開第２００８１９０８５４Ａ２号）。

米国特許第６２１８１６８Ｂ１号には、Ｌ−システインおよびその誘導体を製造するための発酵培地は、１５ｍｇ／ｌの鉄濃度（７５ｍｇ／ｌ硫酸鉄七水和物）を含むことが記載されている。欧州特許出願公開第１３８９４２７Ａ１号には、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチンおよびチアゾリジンの発酵による製造のための培地が開示されているが、そこでは、鉄濃度が１４．９ｍｇ／ｌ（７４ｍｇ／ｌ硫酸鉄七水和物）である。

米国特許出願公開第２０１０／００９３０４５Ａ１号には、２ｍｇ／ｌの鉄（１０ｍｇ／ｌ硫酸鉄七水和物）のみを含むＬ−システインの製造用培地が記載されている。しかし、この培地は実験室規模（培地容積２０ｍｌ）の振とうフラスコでのみ使用されており、製造用発酵槽における発酵用ではない。欧州特許出願公開第２１３３４２９Ａ１号には、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、その誘導体またはそれらの混合物を製造するための、０．３４ｍｇ／ｌの鉄（１．７ｍｇ／ｌ硫酸鉄七水和物）のみを含む培地が記載されている。この培地も発酵用ではなく、小さな管（培地容積２ｍｌ）での培養に使用することが記載されているにすぎない。通常、これらの培養条件下（バッチ培養、乏しい酸素供給、ｐＨ調整なし）では、非常に低い細胞密度（約０．５〜２ｇ／ｌの乾燥バイオマス）および僅かな生成物収率しか達成できない。これは、０．２５ｇ／ｌ（米国特許出願公開第２００３／００７７７６６Ａ１号）、０．３ｇ／ｌ（欧州特許出願公開第２１３３４２９Ａ１号）および１．２ｇ／ｌ（米国特許出願公開第２０１０／００９３０４５Ａ１号）の、振とうフラスコまたは小さな管で達成されるＬ−システイン収率を見れば明らかである。

しかしながら、製造用発酵槽では、バイオマスに特異的な生成物形成速度の結果、工業的規模の経済的な調製方法でのみ可能な高い体積収率を対応して達成するために、高い細胞密度が望ましい。微生物学的物質を製造するための工業的方法の品質は、一般的に生産性を基準に評価される。このパラメーターは、形成された生成物の総量／培地のリットル／発酵時間で表される。

発酵によるＬ−システイン製造に関して記載されている方法の一つの欠点は、培養ブロス中に様々な形態のアミノ酸が存在することである。沈殿物中に沈殿したＬ−シスチンに加えて、培養上澄み液中には、可溶なＬ−システイン、溶解した形態にあるＬ−シスチン、およびチアゾリジンが存在する（米国特許第６２１８１６８Ｂ１号、米国特許第５９７２６６３Ａ号、加国特許第２３８６５３９Ａ２号）。このチアゾリジン（２−メチルチアゾリジン−２，４−ジカルボン酸）は、Ｌ−システインおよびピルベートの縮合生成物であり、純粋な化学反応で形成される。なお、本発明において、用語「総システイン」は、Ｌ−システインおよびＬ−シスチンおよびそこから誘導されるチアゾリジン化合物を包含する意味であり、これらが発酵の際に形成され、培養基上澄み液および沈殿物中に蓄積する。

公知の方法では、総システインの組成が発酵の最後で異なっている、すなわち沈殿したＬ−シスチンの画分が４０〜６６％（米国特許第５９７２６６３Ａ号、加国特許第２３８６５３９Ａ２号）であり、残りの３４〜６０％は、培養基上澄み液中に、可溶生成物−主としてＬ−システインとチアゾリジンの形態で存在する。この生成物の不均質性が、培養基ブロスから標的とする生成物である天然Ｌ−システインの回収および精製を妨げている。

従って、製造された最終生成物が主として可溶なＬ−システインである方法が望ましい。さらに可能な限りチアゾリジンは形成されるべきではない。そのような方法では、沈殿物として存在するＬ−シスチンが、簡単な分離工程により細胞と共に分離され、可溶なＬ−システインは、イオン交換吸着により単離することができるので、目標生成物であるＬ−システインを培養基上澄み液から精製することは著しく容易になる。

本発明の目的は、製造発酵槽中で、微生物菌株を発酵培地中で培養し、天然Ｌ−システインを製造する方法であって、最終生成物が、培地中で主として可溶なＬ−システインの形態で存在する、方法を提供することである。

本発明の目的は、発酵槽培養基中で製造される化合物Ｌ−システイン、Ｌ−シスチンおよびチアゾリジンの画分が、培地中で最大８ｍｇ／ｌの鉄濃度により、標的とする仕方によって制御されることを特徴とする方法により達成される。

発酵培地中の鉄濃度は、好ましくは最大４ｍｇ／ｌ、特に好ましくは最大２ｍｇ／ｌの鉄である。これらの低い鉄濃度では、主として可溶なＬ−システインおよび沈殿したＬ−シスチンが生成物として形成され、チアゾリジンは形成されないので、著しく均質な生成物範囲が発酵槽培養基中に存在することが判明した。鉄濃度は０．２ｍｇ／ｌ未満に下げるべきではないが、これは発酵の最後に存在するＬ−システインの量および画分に悪影響を及ぼすためである。

これらの低い鉄濃度を含む培地中では、驚くべきことに総システインのＬ−システイン画分が増加し、発酵の最後で、少なくとも６５％になることが分かった。この知見は、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）で、アミノ酸、特にＬ−システインおよびその誘導体を製造すると記載される発酵培地が、少なくとも１４．９ｍｇ／ｌ鉄を含む（米国特許第６２１８１６８Ｂ１号）ので、特に驚くべきことである。

本発明のさらなる利点は、公知の方法（欧州特許第１３８９４２７号）と比較して、本発明の方法では、還元剤、例えばビタミンＣ、ビタミンＥまたはギ酸およびそれらの塩、を加えて、製造工程の最中にＬ-システインを安定化させる必要が無いことである。

本発明の発酵方法のシステイン形成段階は、Ｌ-システインが培養基ブロス中に最初に検出された時点で開始し、培養の最後まで続行される。典型的には、この段階は、製造発酵槽に接種してから２時間で開始される。

先行技術（米国特許出願公開第２００３／００７７７６６Ａ１号、欧州特許出願公開第２１３３４２９Ａ１号、米国特許出願公開第２０１０／００９３０４５Ａ１号）に記載されている方法とは対照的に、本発明の発酵方法により、少なくとも２０ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも３０ｇ／ｌ、特に好ましくは少なくとも４０ｇ／ｌ乾燥バイオマスの細胞密度および１０ｇ／ｌシステインの体積生成物収率が達成される。

本発明の方法において使用できる微生物は、先行技術に記載されている全てのシステイン生産菌株である。そのような菌株は、例えば米国特許第６２１８１６８Ｂ１号、米国特許第５９７２６６３Ａ号、米国特許出願公開第２００４０３８３５２Ａ２号、加国特許第２３８６５３９Ａ２号、米国特許出願公開第２００９０５３７７８Ａ２号および欧州特許出願公開第２１３８５８５Ａ１号に記載されている。

微生物菌株としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の代表が好ましく、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａまたはＰａｎｔｏｅａ属の代表、特に好ましくはＥ．ｃｏｌｉまたはＰ．ａｎａｎａｔｉｓ種の菌株である。

これらの微生物菌株の中で、修正されたセリンＯ-アセチルトランスフェラーゼを有し、対応する野生型酵素と比較して、少なくとも２のファクターで、Ｌ-システインによるフィードバック阻害が低下しているか、または野生型細胞と比較して、エフラックス遺伝子の過発現により、少なくとも２のファクターで、細胞からのシステイン搬出が増加している菌株が好ましい。特に好ましい微生物菌株は、セリンＯ-アセチルトランスフェラーゼを有し、対応する野生型酵素と比較して少なくとも２のファクターで、Ｌ-システインによるフィードバック阻害が低下しており、野生型細胞と比較して、エフラックス遺伝子の過発現により、少なくとも２のファクターで、細胞からのシステイン搬出が増加している微生物菌株である。そのような菌株は、例えば米国特許第６２１８１６８Ｂ１号および米国特許第５９７２６６３Ａ号に記載のように公知である。特に好ましい菌株は、さらに修正された３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素を有する菌株であり、対応する野生型酵素と比較して少なくとも２のファクターで、Ｌ-セリンによるフィードバック阻害が低下しており（米国特許第７５８２４６０Ｂ２号）、野生型細胞と比較して、この酵素活性の最大でも５０％のみ細胞中に存在するように、少なくとも一種のＬ−システイン−分解酵素が弱体化している。

セリンＯ-アセチルトランスフェラーゼの好ましい変形は、対応する野生型細胞と比較して、少なくとも５のファクターで、特に好ましくは少なくとも１０のファクターで、特に好ましくは少なくとも５０のファクターで、Ｌ-システインによるフィードバック阻害が低下している。

エフラックス遺伝子は、好ましくはＥ．ｃｏｌｉのｙｄｅＤ（米国特許第５９７２６６３Ａ号）、ｙｆｉＫ（米国特許出願公開第２００４０３８３５２Ａ２号）、ｃｙｄＤＣ（国際公開第２００４１１３３７３号パンフレット）、ｂｃｒ（米国特許第２００５２２１４５３号）およびｅｍｒＡＢ（米国特許出願公開第２００５２２１４５３号）群、または異なった微生物からの対応する同族体遺伝子から生じる。同族体遺伝子は、この遺伝子の配列が、対応するＥ．ｃｏｌｉ遺伝子のＤＮＡ配列に少なくとも８０％の程度一致することを意味する。

野生型細胞と比較して、エフラックス遺伝子の過発現は、好ましくは少なくとも５のファクターで、特に好ましくは少なくとも１０のファクターで、特に好ましくは少なくとも２０のファクターで、細胞からのシステイン搬送増加につながる。

３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素の好ましい変形は、対応する野生型酵素と比較して少なくとも５のファクターで、特に好ましくは少なくとも１０のファクターで、特に好ましくは少なくとも５０のファクターで、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が低下している。

Ｌ−システイン分解酵素は、好ましくはトリプトファナーゼ（ＴｎａＡ）およびシスタチオニン−β−リアーゼ（ＭａｌＹ、ＭｅｔＣ）の群に由来する。

野生型菌株と比較して、酵素活性の最大でも１０％のみが細胞中になお存在するように、これらの酵素の少なくとも一種が弱体化しているような菌株が特に好ましい。特に好ましいのは、これら酵素の少なくとも一種が完全に不活性化されている菌株である。

本発明において、製造発酵槽は、好ましくは、公称容積≧１ｍ^３の発酵槽を意味する。特に好ましいのは、公称容積≧５ｍ^３、特に好ましくは公称容積≧５０ｍ^３の発酵槽を使用する。

Ｌ−システイン製造の際の細胞の培養は、好気性成長条件下、すなわち酸素の存在下で行う。Ｌ−システイン発酵の製造段階における酸素含有量は、３０〜１％Ｏ_２飽和、好ましくは１０〜１％、特に好ましくは５〜１％である。

炭素供給源は、好ましくは糖、糖アルコール、有機酸または糖含有植物加水分解物である。本発明の方法では、グルコース、フルクトース、ラクトース、グリセロールまたはこれらの化合物の２種類以上を含んでなる混合物を炭素供給源として使用する。

好ましくは、炭素供給源は、システイン製造段階の際の発酵槽中の炭素供給源が１０ｇ／ｌを超えないように培養基に計量供給する。２ｇ／ｌの最大濃度が好ましく、特に好ましくは０．５ｇ／ｌ、特に好ましくは０．１ｇ／ｌである。

本発明の方法で使用するＮ供給源は、好ましくはアンモニア、アンモニウム塩またはタンパク質加水分解物である。ｐＨを安定化させるための補正手段としてアンモニアを使用する場合、このＮ供給源は、発酵の際に定期的に補充する。

さらなる培地添加剤として、元素リン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄および、痕跡量の（すなわちμＭ濃度で）、元素モリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛およびニッケル、の塩を加えることができる。本発明により、Ｌ−システイン発酵には、培地の鉄濃度が、８ｍｇ／ｌ未満であることが重要であり、好ましくは４ｍｇ／ｌ未満、特に好ましくは２ｍｇ／ｌ未満である。鉄濃度は、０．２ｍｇ／ｌ未満に低下すべきではない。

さらに、有機酸(例えば酢酸塩、クエン酸塩)、アミノ酸(例えばイソロイシン)およびビタミン(例えばＢ１、Ｂ６)を培地に加えることができる。

使用できる複雑な栄養供給源は、例えば酵母抽出物、コーンスティープ水、大豆粉または麦芽エキスである。

中温性微生物、例えばＥ．ｃｏｌｉまたはＰ．ａｎａｎａｔｉｓ用の培養温度は、好ましくは１５〜４５℃、特に好ましくは３０〜３７℃である。

発酵の際における発酵培地のｐＨは、好ましくはｐＨ５．０〜８．５、特に好ましくはｐＨ７．０である。

Ｌ−システインおよびＬ−システイン誘導体の製造には、発酵中に硫黄供給源を供給する必要がある。これに関して、硫酸塩またはチオ硫酸塩の使用が好ましい。Ｌ−システインの発酵には、培地のチオ硫酸塩濃度は、５ｇ／ｌ未満、好ましくは３ｇ／ｌ未満、特に好ましくは１ｇ／ｌ未満、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ未満にすべきであるが、０．１ｍｇ／ｌ未満に低下すべきではない。

ここに記載する方法により発酵させる微生物は、初期成長段階に続くバッチまたは流加培養プロセスで、２〜３０時間の間、高い効率で、培養培地中にＬ−システインおよびそこから誘導される化合物を分泌する。

目標生成物をさらに精製するには、下記の工程を行うことができる。
−沈殿物として存在する細胞およびＬ−シスチンを除去する分離工程
−イオン交換吸着によるＬ−システインの単離
−沈殿結晶化
この種のプロセスは、先行技術から公知である。

下記の例は本発明をさらに説明する。

例１：システイン生産菌株の製造
野生型菌株Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）およびＰ．ａｎａｎａｔｉｓ（ＡＴＣＣ１１５３０）を、それぞれの場合、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６（米国特許第５９７２６６３Ａ号の例２に記載）で、米国特許第５９７２６６３Ａ号に記載されている電気穿孔法により形質転換した。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６は、複製開始点およびテトラサイクリン耐性遺伝子に加えて、ｃｙｓＥＸ対立遺伝子も含み、これは、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下しているセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、およびエフラックス遺伝子ｙｄｅＤ（ＯＲＦ３０６）をコードし、その発現は、構成するＧＡＰＤＨプロモーターにより制御される。プラスミドを有する細胞の選択は、テトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天プレート上で行った。ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎプラスミドキット（ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ）を使用するさらなるプラスミド単離および制限分析の後、所望の形質転換体、すなわちプラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６を取り入れた細胞、を単離し、例２に記載する発酵に使用した。

例２：硫酸鉄七水和物の様々な供給によるシステイン生産菌種の培養
システイン生産を立証するために、例１に記載する微生物を、発酵槽中で、流加培養モードで、グルコースおよびチオサルフェートを連続的に供給しながら培養した。使用した製造発酵槽は、公称容積が５ｍ^３のバイオリアクターであった。製造発酵槽用の接種材料は、２段階予備培養手順で調製した。

予備培養基１（振とうフラスコ）
テトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地４００ｍｌに、三角フラスコ（２０００ｍｌ）１０個中で、特別な菌株（Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０ｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６またはＰ．ａｎａｎａｔｉｓｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６）を接種し、振とう装置（１５０ｒｐｍ、３０℃）で７時間培養した。

予備培養基２（予備発酵槽）
次いで、１０個の三角フラスコから取った予備培養基１を一つに合わせた。４ｌの予備培養基１を無菌の接種フラスコに移し、その全量を、公称容積５００ｌの予備発酵槽にポンプ輸送した。発酵培地（２００ｌ）は、グルコース２０ｇ／ｌ、トリプトン（Ｄｉｆｃｏ）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）５ｇ／ｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４５ｇ／ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４１．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ０．３ｇ／ｌ、ＣａＣｌ_２ｘ２Ｈ_２Ｏ０．０１５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ０．００２ｇ／ｌ、Ｎａ_３クエン酸塩ｘ２Ｈ_２Ｏ１ｇ／ｌ、ビタミンＢ１０．００５ｍｇ／ｌ、痕跡量元素溶液（Ｎａ_２ＭｏＯ_４ｘ２Ｈ_２Ｏ０．１５ｇ／ｌ、Ｈ_３ＢＯ_３２．５ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ_２ｘ６Ｈ_２Ｏ０．７ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ_４ｘ５Ｈ_２Ｏ０．２５ｇ／ｌ、ＭｎＣｌ_２ｘ４Ｈ_２Ｏ１．６ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ０．３ｇ／ｌからなる）１ｍｌ／ｌおよびテトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを含んでいた。

予備発酵槽中のｐＨは、接種の前に２５％ＮＨ_４ＯＨ溶液により７．０に調節した。発酵の際、ｐＨは、２５％ＮＨ_４ＯＨを使用して自動補正により７．０に維持した。培養基は、２００ｒｐｍで撹拌し、開始時に無菌フィルターを経由する無菌の圧縮空気０．５ｖｖｍで通気した。酸素プローブは、接種の前に、これらの出発条件下で１００％飽和に校正しておいた。発酵中のＯ_２飽和に対する望ましい値は、３０±１％に調節した。Ｏ_２飽和が望ましい値未満に低下した場合、調整カスケードを開始し、Ｏ_２飽和を望ましい値に回復させた。ここで、ガス導入を連続的に最大２ｖｖｍに増加した。

培養は、温度３０℃、圧力５０ｋＰａで１５ｈ行った。この培養の後、６００ｎｍ光学密度（ＯＤ_６００）は１８〜２０であった。

主培養基（製造発酵槽）
発酵は、公称容積が５ｍ^３の発酵槽中で行った。発酵培地（２３００ｌ）は、グルコース１５ｇ／ｌ、トリプトン（Ｄｉｆｃｏ）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）５ｇ／ｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４５ｇ／ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４１．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ０．３ｇ／ｌ、ＣａＣｌ_２ｘ２Ｈ_２Ｏ０．０１５ｇ／ｌ、Ｎａ_３クエン酸塩ｘ２Ｈ_２Ｏ１ｇ／ｌおよび痕跡量元素溶液（上記参照）、ビタミンＢ１０．００５ｍｇ／ｌおよびテトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを含有する。実験混合物に応じて、培地に７５ｍｇ／ｌ、４０ｍｇ／ｌ、２０ｍｇ／ｌ、１０ｍｇ／ｌ、３ｍｇ／ｌまたは０．５ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏを捕捉した。製造発酵槽中のｐＨは、接種の前に、２５％ＮＨ_４ＯＨ溶液をポンプで加え、７．０に調節した。発酵の際、ｐＨは、２５％ＮＨ_４ＯＨを使用して自動補正により７．０に維持した。接種のために、２００ｌの予備培養基２を発酵容器にポンプで供給した。従って、出発容積は、約２５００ｌであった。培養基は、開始時に１２０ｒｐｍで撹拌し、無菌フィルターを経由して無菌の圧縮空気を１．５ｖｖｍで通気した。酸素プローブは、接種の前に、これらの出発条件下で１００％飽和に校正しておいた。発酵中のＯ_２飽和に対する望ましい値は、３０±１％に調節した。Ｏ_２飽和が望ましい値未満に低下した後、調整カスケードを開始し、Ｏ_２飽和を望ましい値に回復させた。ここで、ガス導入を連続的に増加し（最大２ｖｖｍまで）、次いで撹拌速度を連続的に増加させた（最大３００ｒｐｍまで）。

発酵は、温度３０℃、圧力５０〜６０ｋＰａで行った。２時間の発酵時間の後、硫黄供給源の連続供給を、無菌６０％チオ硫酸ナトリウムｘ５Ｈ_２Ｏ原液の形態で行った。供給速度は、培地中のチオサルフェート濃度が、５ｇ／ｌを決して超えないように調整した。発酵槽中のグルコース含有量が初期の１５ｇ／ｌから約２ｇ／ｌに低下したときに、直ちに５６％グルコース溶液を連続的に加えた。供給速度は、発酵槽中のグルコース濃度がその点から１０ｇ／ｌを超えないように調整した。グルコース測定は、ＹＳＩ（ＹｅｌｌｏｗＳｐｒｉｎｇｓ、オハイオ州、米国）から入手したグルコース分析装置で行った。発酵時間は２４時間であった。次いで、全ての発酵槽中で、４０〜４５ｇ／ｌ乾燥バイオマスの細胞密度を測定した。

発酵の最後に、試料を採取し、培養基上澄み液中のＬ−システインおよびそこから誘導された誘導体（特にＬ−シスチンおよびチアゾリジン）、および沈殿物（Ｌ−シスチン）の含有量をそれぞれ個別に測定した（表１および２参照）。この目的には、Ｇａｉｔｏｎｄｅの熱量計ニンヒドリン試験を原則的に使用した（Ｇａｉｔｏｎｄｅ，Ｍ．Ｋ．（１９６７），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０４，６２７−６３３）。ここで、試験の強い酸性反応条件下で、遊離のＬ−システインだけではなくチアゾリジンに結合したＬ−システインも含まれ、定量されることに注意する。培養基上澄み液中に溶解したＬ−シスチンは、Ｇａｉｔｏｎｄｅのニンヒドリン試験では、希釈溶液中で、ｐＨ８．０でジチオトレイトール（ＤＴＴ）による還元に続いて、Ｌ−システインとして検出される。沈殿物中にあるＬ−シスチンは、先ず８％塩酸中に溶解させてから、同様に定量される。

培養基上澄み液中に溶解した成分Ｌ−システイン、Ｌ−シスチンおよびチアゾリジンを特異的に定量するために、２種類のさらなる試験方法を追加的に使用した、すなわち遊離Ｌ−システインの定量は、Ｓａｎｇ−ＨａｎＬｅｅらの文献（１９９５、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ２１３，８３７ｆｆ）に記載されている、５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を使用した試験により行い、遊離ＳＨ基を特異的に検出できる。Ｌ−シスチンおよび誘導体Ｌ−シスチンおよびチアゾリジンの区別は、Ｄａβｌｅｒらの文献（２０００、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３６，１１０１ｆｆ）に記載されているＨＰＬＣ法により行った。

Claims

製造発酵槽中で微生物菌株を発酵培地において培養し、天然Ｌ−システインを製造する方法であって、前記発酵培地中で製造される化合物Ｌ−システイン、Ｌ−シスチンおよびチアゾリジンの画分が、前記発酵培地中において最大８ｍｇ／ｌの鉄濃度により、標的とする様式で制御される、方法。
前記発酵培地中の鉄濃度が、最大４ｍｇ／ｌ、好ましくは最大２ｍｇ／ｌの鉄である、請求項１に記載の方法。
前記発酵培地中の鉄濃度が０．２ｍｇ／ｌ未満に低下しない、請求項１または２に記載の方法。
還元剤、例えばビタミンＣ、ビタミンＥまたはギ酸およびそれらの塩が添加されない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
使用する前記微生物菌株が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の代表、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａまたはＰａｎｔｏｅａ属の代表、特に好ましくはＥ．ｃｏｌｉまたはＰ．ａｎａｎａｔｉｓ種の菌株である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物菌株が、修正されたセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼを有し、対応する野生型酵素と比較して、少なくとも２のファクターで、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下しているか、または、野生型細胞と比較して、エフラックス遺伝子の過発現により、少なくとも２のファクターで、細胞からのシステイン搬出が増加している、請求項５に記載の方法。
前記微生物菌株が、修正されたセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼを有し、対応する野生型酵素と比較して、少なくとも２のファクターで、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下しており、野生型細胞と比較して、エフラックス遺伝子の過発現により、少なくとも２のファクターで、細胞からのシステイン搬出が増加している、請求項６に記載の方法。
前記微生物菌株が、修正された３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素を有し、対応する野生酵素と比較して、少なくとも２のファクターで、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が低下しており、野生型細胞と比較して、この酵素活性の最大５０％だけが細胞中になお存在するように、少なくとも一種のＬ−システイン−分解酵素が弱体化している、請求項７に記載の方法。
前記細胞の培養が、公称容積≧１ｍ^３の発酵槽、好ましくは公称容積≧５ｍ^３、特に好ましくは公称容積≧５０ｍ^３の発酵槽で行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
前記発酵培地中、チオサルフェート濃度が、５ｇ／ｌ未満、好ましくは３ｇ／ｌ未満、特に好ましくは１ｇ／ｌ未満、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ未満であるが、０．１ｍｇ／ｌ未満には低下しない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。