JPS637790A - 酵素によるl−システインの製造方法 - Google Patents
酵素によるl−システインの製造方法Info
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、酵素法にてし一システィンを得る方法に関す
る。
る。
L−システインは医薬あるいは医薬原料1食品添加物、
化粧品添加物などとして有用な化合物であり、特に近年
はコールドパーマ液の原料として需要が伸びているS元
素含有のアミノ酸である。
化粧品添加物などとして有用な化合物であり、特に近年
はコールドパーマ液の原料として需要が伸びているS元
素含有のアミノ酸である。
〔従来の技術及び発明が解決しようとしている問題点〕
従来L−システインの製法としては、(1)天然物から
抽出する方法、(2)有機合成法、(3)発酵法、(4
)酵素法などが知られているが、天然物から抽出する方
法については、原料の供給が不安定であり、且つ不要な
他のアミノ酸が混入する。また、有機合成法においては
り、L−体の分割を要する。更に発酵法は酵素法より蓄
積全が低いなどの欠点があり工業的には酵素法が有利な
製法といわれている。
従来L−システインの製法としては、(1)天然物から
抽出する方法、(2)有機合成法、(3)発酵法、(4
)酵素法などが知られているが、天然物から抽出する方
法については、原料の供給が不安定であり、且つ不要な
他のアミノ酸が混入する。また、有機合成法においては
り、L−体の分割を要する。更に発酵法は酵素法より蓄
積全が低いなどの欠点があり工業的には酵素法が有利な
製法といわれている。
酵素を用いてL−システインを合成する酵素方法として
は、(1)システィン・シンターゼを用いてL−セリン
と硫化水素から合成する方法、(2)セリン・スルフヒ
ドラーゼを用いて、1L−セリンと硫化水素またはβ−
クロロアラニンと硫化水素から合成する方法、(3)シ
スティン・デスルフヒドラーゼを用いてβ−置換アラニ
ンと金属硫化物などから合成する方法、(4)2−アミ
ン−チアゾリン−4−カルボン酸(ATC)から、L−
ATC−ヒドラーゼ、ATC−ラマーゼ、S−カルバミ
ルーL−システイン・ヒドラーゼを用いて合成する方法
などが知られている。また本出願人は、先にL−セリン
と金属水硫化物などのスルフィドリル基を有する化合物
とをトリプトファン・シンターゼの存在下反応させて得
る方法を出願した(特願昭60〜84545号)。
は、(1)システィン・シンターゼを用いてL−セリン
と硫化水素から合成する方法、(2)セリン・スルフヒ
ドラーゼを用いて、1L−セリンと硫化水素またはβ−
クロロアラニンと硫化水素から合成する方法、(3)シ
スティン・デスルフヒドラーゼを用いてβ−置換アラニ
ンと金属硫化物などから合成する方法、(4)2−アミ
ン−チアゾリン−4−カルボン酸(ATC)から、L−
ATC−ヒドラーゼ、ATC−ラマーゼ、S−カルバミ
ルーL−システイン・ヒドラーゼを用いて合成する方法
などが知られている。また本出願人は、先にL−セリン
と金属水硫化物などのスルフィドリル基を有する化合物
とをトリプトファン・シンターゼの存在下反応させて得
る方法を出願した(特願昭60〜84545号)。
これらの酵素法を問わず、発酵法1合成法のいずれにお
いてもシスティン含有反応液よりシスティンの分離にお
いては、反応液の組成が複雑であることと、システィン
の水に対する溶解度が非常に大きいためシスティン含有
反応液より直接システィンとして単離・精製することは
極めて難しい。
いてもシスティン含有反応液よりシスティンの分離にお
いては、反応液の組成が複雑であることと、システィン
の水に対する溶解度が非常に大きいためシスティン含有
反応液より直接システィンとして単離・精製することは
極めて難しい。
また、システィンは酸化されやすく、容易にシスチンと
なるので、反応液中には生成したシスティンの一部がシ
スチンとして混入されることは避けられなかった。
なるので、反応液中には生成したシスティンの一部がシ
スチンとして混入されることは避けられなかった。
そのため通常システィンを一旦強制的に酸1ヒして、比
較的水に対する溶解度の小さいシスチンとしてしまい、
精製・単離を行なった後、必要により電解還元などによ
り精システィンとして回収する方法が知られているが、
−度生成しているシスティンを酸化によりシスチンとし
て、これを取り出し、さらに還元・精製してL−システ
インとして取り出すため、工程が複雑になり、収率、コ
スト面で大きなデメリットとなっていた。
較的水に対する溶解度の小さいシスチンとしてしまい、
精製・単離を行なった後、必要により電解還元などによ
り精システィンとして回収する方法が知られているが、
−度生成しているシスティンを酸化によりシスチンとし
て、これを取り出し、さらに還元・精製してL−システ
インとして取り出すため、工程が複雑になり、収率、コ
スト面で大きなデメリットとなっていた。
そのため本発明者らは、酵素反応により得られたL−シ
ステイン反応液より、直接L−システインを効率よくL
−システイン塩酸塩として単離する方法を検討し、先に
出願した。
ステイン反応液より、直接L−システインを効率よくL
−システイン塩酸塩として単離する方法を検討し、先に
出願した。
このような方法、即ちL−システイン反応液より直接L
−システインを単離するためには、従来法とは異なり、
副生シスチンは極力減すことが有利である。本発明はこ
の目的を達成するためのL−システインの製造方法であ
り、反応中に副生ずるL−シスチンを極力抑制し、しか
もL−システインの収率を向上させた酵素反応によるL
−セリンからL−システインを得る方法を提供するもの
である。
−システインを単離するためには、従来法とは異なり、
副生シスチンは極力減すことが有利である。本発明はこ
の目的を達成するためのL−システインの製造方法であ
り、反応中に副生ずるL−シスチンを極力抑制し、しか
もL−システインの収率を向上させた酵素反応によるL
−セリンからL−システインを得る方法を提供するもの
である。
本発明者らは、上記の課題を踏えて鋭意検討の結果、以
下の知見を得た。
下の知見を得た。
L−セリンにスルフィドリル基含有化合物を導入して酵
素反応を行うに際して使用するスルフィドリル基導入剤
としては、硫化水素ガスを使用することにより系内を還
元的ふん囲気とすることが可能であり、L−システイン
が有利な条件で得られる。この際、硫化水素は酸性であ
るため反応系を何らかの形でPHコントロールを行なわ
ないと、反応系のPHが下がり酵素反応における至適P
Hを逸脱して、反応の進行が止まる。
素反応を行うに際して使用するスルフィドリル基導入剤
としては、硫化水素ガスを使用することにより系内を還
元的ふん囲気とすることが可能であり、L−システイン
が有利な条件で得られる。この際、硫化水素は酸性であ
るため反応系を何らかの形でPHコントロールを行なわ
ないと、反応系のPHが下がり酵素反応における至適P
Hを逸脱して、反応の進行が止まる。
また、L−セリンと硫化水素との酵素反応においては、
至適PHが7.0〜9.5とアルカリ側にある酵素を用
いるのが収率も高く好ましい。
至適PHが7.0〜9.5とアルカリ側にある酵素を用
いるのが収率も高く好ましい。
したがって、反応中はアルカリ水溶液を適時添加してP
Hを調整しながら行う必要があるが、添加するアルカリ
の種類によっては、極めて酵素反応が阻害され収率が低
下することがわかった。
Hを調整しながら行う必要があるが、添加するアルカリ
の種類によっては、極めて酵素反応が阻害され収率が低
下することがわかった。
本発明は、これらの知見に基づき発明を完成したもので
ある。
ある。
即ち、本発明は、L−セリンとスルフィドリル基含有化
合物との酵素反応によりL−システイン基含有化合物と
して硫化水素ガスを用いて反応を行い、その際、PH調
整に添加するアルカリに、水酸化ナトリウムを用いるこ
とを特徴とする、L−システインの製造方法である。ま
た反応に際し、あらかじめ窒素、アルゴンなどの不活性
ガスにより反応系内を置換した後、ジチオスレイトール
、ハイドロサルファイドなどの還元剤を添加しておけば
、さらにL−シスチンが抑制され収率が向上するもので
ある。
合物との酵素反応によりL−システイン基含有化合物と
して硫化水素ガスを用いて反応を行い、その際、PH調
整に添加するアルカリに、水酸化ナトリウムを用いるこ
とを特徴とする、L−システインの製造方法である。ま
た反応に際し、あらかじめ窒素、アルゴンなどの不活性
ガスにより反応系内を置換した後、ジチオスレイトール
、ハイドロサルファイドなどの還元剤を添加しておけば
、さらにL−シスチンが抑制され収率が向上するもので
ある。
本発明において使用する酵素は、至適PHが7.0〜9
.5であるL−セリンと硫化水素との酵素反応に用いら
れる酵素であれば何ら制限されず、例えば公知のシステ
ィン・シンターゼ、セリン・スルフヒドラーゼなどの酵
素を用いてもよく、また前記した出願人の提案のトリプ
トファン・シンターゼを用いて反応させることもできる
。
.5であるL−セリンと硫化水素との酵素反応に用いら
れる酵素であれば何ら制限されず、例えば公知のシステ
ィン・シンターゼ、セリン・スルフヒドラーゼなどの酵
素を用いてもよく、また前記した出願人の提案のトリプ
トファン・シンターゼを用いて反応させることもできる
。
特に本発明においては、トリプトファン・シンターゼを
用いて実施するのが収率も大きく好ましい方法である。
用いて実施するのが収率も大きく好ましい方法である。
トリプトファン・シンターゼの酵素生産菌としては前記
特■昭60〜84545号公報に開示されているように
エシェリヒア・コリMT−1(232(FERM B
P−19)、エシェリヒア・コリMT−10242(F
ERM BP−20)などの微生物やミノイロスボラ
・クラツサ(ATCC14692)などの微生物が使用
できるが、特にエシェリヒア・コリから得られたトリプ
トファン・シンターゼを用いるのが有利である。
特■昭60〜84545号公報に開示されているように
エシェリヒア・コリMT−1(232(FERM B
P−19)、エシェリヒア・コリMT−10242(F
ERM BP−20)などの微生物やミノイロスボラ
・クラツサ(ATCC14692)などの微生物が使用
できるが、特にエシェリヒア・コリから得られたトリプ
トファン・シンターゼを用いるのが有利である。
酵素は必ずしも抽出された純粋なものを使う必要はなく
、上記生産菌株の培養物、培養物から遠心分離などの方
法によって採取した生菌体、あるいはその凍結菌体二凍
結乾燥菌体、あるいは超音波処理などによって得られる
菌体処理物などが利用される。
、上記生産菌株の培養物、培養物から遠心分離などの方
法によって採取した生菌体、あるいはその凍結菌体二凍
結乾燥菌体、あるいは超音波処理などによって得られる
菌体処理物などが利用される。
本発明の態様を述べれば以下のとおりである。
通常、酵素法によるL−セリンよりL−システインを製
造する方法においては、スルフィドリル基の導入剤とし
て水硫化ナトリウムなどの金属水硫化物、硫化ナトリウ
ムなどの金属硫化物を用いる方法なども知られているが
、本発明方法においては、硫化水素ガスを用いる。これ
を反応系に導入することにより、反応器内の水溶液の部
分、あるいは気相部分は硫化水素で満たされ還元的ふん
囲気を保った状態に維持されるので、酸化によるL−シ
スチンは防止される。
造する方法においては、スルフィドリル基の導入剤とし
て水硫化ナトリウムなどの金属水硫化物、硫化ナトリウ
ムなどの金属硫化物を用いる方法なども知られているが
、本発明方法においては、硫化水素ガスを用いる。これ
を反応系に導入することにより、反応器内の水溶液の部
分、あるいは気相部分は硫化水素で満たされ還元的ふん
囲気を保った状態に維持されるので、酸化によるL−シ
スチンは防止される。
また反応に使用される酵素の至適PHは7.0〜へ5の
範囲であり、硫化水素を用いた場合、硫化水素は酸性ガ
スであるためPHが低下し、反応転換率が下がるので、
適時アルカリ水溶液を添加してコントロールする。
範囲であり、硫化水素を用いた場合、硫化水素は酸性ガ
スであるためPHが低下し、反応転換率が下がるので、
適時アルカリ水溶液を添加してコントロールする。
その場合添加するアルカリの種類によっては酵素反応を
阻害し、L−セリンからL−システインへの転換率が目
標に達しない場合もある。特に著しく阻害するアルカリ
は、アンモニアであり系内濃度が0.2%程度で転換率
は、水酸化ナトリウム使用の場合のV4以下となる。ま
た水酸化カリウム、ピロリン酸カリウムあるいは水酸化
カルシウムなどを用いた場合も水酸化ナトリウムを用い
た場合の転換率に及ばない。よって本発明においてはP
H調整用アルカリとしては水酸化ナトリウムを用いる必
要がある。
阻害し、L−セリンからL−システインへの転換率が目
標に達しない場合もある。特に著しく阻害するアルカリ
は、アンモニアであり系内濃度が0.2%程度で転換率
は、水酸化ナトリウム使用の場合のV4以下となる。ま
た水酸化カリウム、ピロリン酸カリウムあるいは水酸化
カルシウムなどを用いた場合も水酸化ナトリウムを用い
た場合の転換率に及ばない。よって本発明においてはP
H調整用アルカリとしては水酸化ナトリウムを用いる必
要がある。
また反応を実施するにあたり予じめN2.Arなどの不
活性、jf7・で−置換し¥、ハくと、初期の溶存酸素
によるシスティンからシスチンの酸化がさらに防止され
る。反応開始時の溶存酸素は1 ppm似下が望ましい
。さらには、反応系に還元剤であるハイドロサルファイ
ド、ジチオスレイトール、ジヒドロリポアミドなどの還
元剤を10〜500mhi程度添加することによりシス
チンの生成がより抑制される。添加する時期、方法は分
割添加でも良く、また反応後期に添加しても良い。
活性、jf7・で−置換し¥、ハくと、初期の溶存酸素
によるシスティンからシスチンの酸化がさらに防止され
る。反応開始時の溶存酸素は1 ppm似下が望ましい
。さらには、反応系に還元剤であるハイドロサルファイ
ド、ジチオスレイトール、ジヒドロリポアミドなどの還
元剤を10〜500mhi程度添加することによりシス
チンの生成がより抑制される。添加する時期、方法は分
割添加でも良く、また反応後期に添加しても良い。
本発明方法においては、L−セリンの基質濃度は特に制
限はないが、通常液中濃度1〜25重量%の範囲で使用
するのがよい。また反応液中における酵素の使用量は、
酵素の使用形態により異なシンターゼ使用の場合は、基
質の他に補酵素であるピリドキサールリン酸を微量、例
えば液中濃度として1〜50 ppmの範囲で添加する
のが望ましい。
限はないが、通常液中濃度1〜25重量%の範囲で使用
するのがよい。また反応液中における酵素の使用量は、
酵素の使用形態により異なシンターゼ使用の場合は、基
質の他に補酵素であるピリドキサールリン酸を微量、例
えば液中濃度として1〜50 ppmの範囲で添加する
のが望ましい。
また、硫化水素の使用量は、仕込みL−セリンのLO〜
L3倍モル程度が好ましく、多すぎると系内よりの逃げ
によるロス及びPH調整用の水酸化ナトリウムをむやみ
に使用する結果となり好ましくなく、少なすぎると反応
の激論に不足するう吹き込み速度は2〜12時間程度が
好ましい。
L3倍モル程度が好ましく、多すぎると系内よりの逃げ
によるロス及びPH調整用の水酸化ナトリウムをむやみ
に使用する結果となり好ましくなく、少なすぎると反応
の激論に不足するう吹き込み速度は2〜12時間程度が
好ましい。
以下実施例によって本発明の詳細な説明するが、実施例
中のシスチンの分析方法は公知のガイトンデ(Gait
onde )の方法によらシスティン換算で算出した。
中のシスチンの分析方法は公知のガイトンデ(Gait
onde )の方法によらシスティン換算で算出した。
すなわち、1000〜2000倍に希釈した被検液に5
μMの1,4−ジチオトレイトール(還元剤)約同量加
えてさらに2NのNaOHによりPH8,0〜8.5と
し、室温にて1時間放置して含有するシスチンをすべて
システィンに還元し、酸性ニンヒドリン試薬を用いて発
色させ、吸光度計にて550nmの吸光度を測定する。
μMの1,4−ジチオトレイトール(還元剤)約同量加
えてさらに2NのNaOHによりPH8,0〜8.5と
し、室温にて1時間放置して含有するシスチンをすべて
システィンに還元し、酸性ニンヒドリン試薬を用いて発
色させ、吸光度計にて550nmの吸光度を測定する。
−方、既知の濃度の漂準サンプルを作成し、560nm
の吸光度の検量線を作成しておき、本検量線をもとに被
検液中のシスティン+シスチン濃度を算出した。また、
1.4−ジチオスレイトールによる還元操作を省略して
システィン濃度の算出を行い、上記システィン+シネチ
ン濃度よりシスティン濃度を差し引くことによりシスチ
ン濃度は算出した。
の吸光度の検量線を作成しておき、本検量線をもとに被
検液中のシスティン+シスチン濃度を算出した。また、
1.4−ジチオスレイトールによる還元操作を省略して
システィン濃度の算出を行い、上記システィン+シネチ
ン濃度よりシスティン濃度を差し引くことによりシスチ
ン濃度は算出した。
実施例1
かくはん機及び吹き込み管、排気管つきの200ゴ容セ
パラブルフラスコにL−セリン10g、ピリドキサ−ル
ミノン酸2.51n9を加え、イオン交換水にて全容を
100pとする。32%NaOH液にて反応液のPHを
8゜Oとして反応液を45°C−定に保ちN2ガスを5
0m7!/分の速度で30分吹き込み系内の溶存酸素を
Q、8ppmとして、トリプトファン・シンターゼ含有
菌体(エシェリヒア・コリMT−10242FERM
BP−20)を乾燥菌体換算で2.0g装入する。さ
らに1,4−ジチオスレイトール1.5 g(約100
mM ) を添加した。
パラブルフラスコにL−セリン10g、ピリドキサ−ル
ミノン酸2.51n9を加え、イオン交換水にて全容を
100pとする。32%NaOH液にて反応液のPHを
8゜Oとして反応液を45°C−定に保ちN2ガスを5
0m7!/分の速度で30分吹き込み系内の溶存酸素を
Q、8ppmとして、トリプトファン・シンターゼ含有
菌体(エシェリヒア・コリMT−10242FERM
BP−20)を乾燥菌体換算で2.0g装入する。さ
らに1,4−ジチオスレイトール1.5 g(約100
mM ) を添加した。
硫化水素ガスをボンベより約10mA!/分の速度で吹
き込み始め、約4時間で吹き込みを終了する。
き込み始め、約4時間で吹き込みを終了する。
(硫化水素の使用量は対し一セリン約1.1倍モルであ
る。)吹き込み終了後さらに2時間かくはんを行ない反
応を完結させる。反応中は32%NaOH液を反応系内
のPHが&0となるようにコシトロールしながら添加し
、最終的に初期のPH副調整含めて約15gの32%N
aOH液を消費した。
る。)吹き込み終了後さらに2時間かくはんを行ない反
応を完結させる。反応中は32%NaOH液を反応系内
のPHが&0となるようにコシトロールしながら添加し
、最終的に初期のPH副調整含めて約15gの32%N
aOH液を消費した。
反応終了後の反応液tts、lをなるべく均一にサンプ
リングし、2N塩酸に溶解後、遠心分離により除菌し、
L−システイン及びL−シスチンの分析を行うと、それ
ぞれL−システイン9.00%(L−セリンからの転換
率9066% )、L−シスチン0.12%(L−セリ
ンからの転換率1.2%)とL−シスチン含量の翫めて
少ない反応液を得ることができzo 及びメルカプトエタノールの添加を省略して実施した。
リングし、2N塩酸に溶解後、遠心分離により除菌し、
L−システイン及びL−シスチンの分析を行うと、それ
ぞれL−システイン9.00%(L−セリンからの転換
率9066% )、L−シスチン0.12%(L−セリ
ンからの転換率1.2%)とL−シスチン含量の翫めて
少ない反応液を得ることができzo 及びメルカプトエタノールの添加を省略して実施した。
反応系のPH副調整使用した32%NaOH液は分析を
行なった結果、L−システイン8.56%(L−セリン
からの転換率84.0%)、L−シスチン0.50%(
L−セリンからの転換率5.0%)であった。
行なった結果、L−システイン8.56%(L−セリン
からの転換率84.0%)、L−シスチン0.50%(
L−セリンからの転換率5.0%)であった。
して25%NH,水を使用した。
果、L−システイン1.83%(L−セリンからの転換
率17.5%)、L−シスチン0.65%(L−セリン
からの転換率6.3%)と極めて低い転換率であった。
率17.5%)、L−シスチン0.65%(L−セリン
からの転換率6.3%)と極めて低い転換率であった。
Claims (3)
- (1)L−セリンとスルフィドリル基含有化合物との酵
素反応によりL−システインを製造する方法において、
反応時の至適PHが7.0〜9.5を有する酵素を用い
、スルフィドリル基含有化合物として硫化水素ガスを用
いて反応を行い、その際PH調整に添加するアルカリに
、水酸化ナトリウムを用いることを特徴とする、L−シ
ステインの製造方法。 - (2)L−セリンとスルフィドリル基含有化合物との酵
素反応によりL−システインを製造する方法において、
あらかじめ、不活性ガスにより反応系内を置換した後、
還元剤を添加して還元的ふん囲気下に、反応時の至適P
Hが7.0〜9.5を有する酵素を用い、スルフィドリ
ル基含有化合物として硫化水素ガスを用いて反応を行い
、その際PH調整に添加するアルカリに、水酸化ナトリ
ウムを用いることを特徴とする、L−システインの製造
方法。 - (3)酵素に、トリプトファン・シンターゼを用いる特
許請求の範囲第1項または第2項記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15174586A JPS637790A (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | 酵素によるl−システインの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15174586A JPS637790A (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | 酵素によるl−システインの製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS637790A true JPS637790A (ja) | 1988-01-13 |
Family
ID=15525351
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP15174586A Pending JPS637790A (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | 酵素によるl−システインの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS637790A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014518078A (ja) * | 2011-06-30 | 2014-07-28 | ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト | 発酵による天然l−システインの製造方法 |
-
1986
- 1986-06-30 JP JP15174586A patent/JPS637790A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014518078A (ja) * | 2011-06-30 | 2014-07-28 | ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト | 発酵による天然l−システインの製造方法 |
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