JPS637790A

JPS637790A - 酵素によるｌ−システインの製造方法

Info

Publication number: JPS637790A
Application number: JP15174586A
Authority: JP
Inventors: Shoichiro Miyahara; 宮原　匠一郎; Toshiaki Kamiguchi; 上口　俊昭; Masatsugu Hashimukai; 橋向　匡嗣; Kazunari Nitta; 新田　一成
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1986-06-30
Filing date: 1986-06-30
Publication date: 1988-01-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、酵素法にてし一システィンを得る方法に関す
る。

Ｌ−システインは医薬あるいは医薬原料１食品添加物、
化粧品添加物などとして有用な化合物であり、特に近年
はコールドパーマ液の原料として需要が伸びているＳ元
素含有のアミノ酸である。

〔従来の技術及び発明が解決しようとしている問題点〕
従来Ｌ−システインの製法としては、（１）天然物から
抽出する方法、（２）有機合成法、（３）発酵法、（４
）酵素法などが知られているが、天然物から抽出する方
法については、原料の供給が不安定であり、且つ不要な
他のアミノ酸が混入する。また、有機合成法においては
り、Ｌ−体の分割を要する。更に発酵法は酵素法より蓄
積全が低いなどの欠点があり工業的には酵素法が有利な
製法といわれている。

酵素を用いてＬ−システインを合成する酵素方法として
は、（１）システィン・シンターゼを用いてＬ−セリン
と硫化水素から合成する方法、（２）セリン・スルフヒ
ドラーゼを用いて、１Ｌ−セリンと硫化水素またはβ−
クロロアラニンと硫化水素から合成する方法、（３）シ
スティン・デスルフヒドラーゼを用いてβ−置換アラニ
ンと金属硫化物などから合成する方法、（４）２−アミ
ン−チアゾリン−４−カルボン酸（ＡＴＣ）から、Ｌ−
ＡＴＣ−ヒドラーゼ、ＡＴＣ−ラマーゼ、Ｓ−カルバミ
ルーＬ−システイン・ヒドラーゼを用いて合成する方法
などが知られている。また本出願人は、先にＬ−セリン
と金属水硫化物などのスルフィドリル基を有する化合物
とをトリプトファン・シンターゼの存在下反応させて得
る方法を出願した（特願昭６０〜８４５４５号）。

これらの酵素法を問わず、発酵法１合成法のいずれにお
いてもシスティン含有反応液よりシスティンの分離にお
いては、反応液の組成が複雑であることと、システィン
の水に対する溶解度が非常に大きいためシスティン含有
反応液より直接システィンとして単離・精製することは
極めて難しい。

また、システィンは酸化されやすく、容易にシスチンと
なるので、反応液中には生成したシスティンの一部がシ
スチンとして混入されることは避けられなかった。

そのため通常システィンを一旦強制的に酸１ヒして、比
較的水に対する溶解度の小さいシスチンとしてしまい、
精製・単離を行なった後、必要により電解還元などによ
り精システィンとして回収する方法が知られているが、
−度生成しているシスティンを酸化によりシスチンとし
て、これを取り出し、さらに還元・精製してＬ−システ
インとして取り出すため、工程が複雑になり、収率、コ
スト面で大きなデメリットとなっていた。

そのため本発明者らは、酵素反応により得られたＬ−シ
ステイン反応液より、直接Ｌ−システインを効率よくＬ
−システイン塩酸塩として単離する方法を検討し、先に
出願した。

このような方法、即ちＬ−システイン反応液より直接Ｌ
−システインを単離するためには、従来法とは異なり、
副生シスチンは極力減すことが有利である。本発明はこ
の目的を達成するためのＬ−システインの製造方法であ
り、反応中に副生ずるＬ−シスチンを極力抑制し、しか
もＬ−システインの収率を向上させた酵素反応によるＬ
−セリンからＬ−システインを得る方法を提供するもの
である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の課題を踏えて鋭意検討の結果、以
下の知見を得た。

Ｌ−セリンにスルフィドリル基含有化合物を導入して酵
素反応を行うに際して使用するスルフィドリル基導入剤
としては、硫化水素ガスを使用することにより系内を還
元的ふん囲気とすることが可能であり、Ｌ−システイン
が有利な条件で得られる。この際、硫化水素は酸性であ
るため反応系を何らかの形でＰＨコントロールを行なわ
ないと、反応系のＰＨが下がり酵素反応における至適Ｐ
Ｈを逸脱して、反応の進行が止まる。

また、Ｌ−セリンと硫化水素との酵素反応においては、
至適ＰＨが７．０〜９．５とアルカリ側にある酵素を用
いるのが収率も高く好ましい。

したがって、反応中はアルカリ水溶液を適時添加してＰ
Ｈを調整しながら行う必要があるが、添加するアルカリ
の種類によっては、極めて酵素反応が阻害され収率が低
下することがわかった。

本発明は、これらの知見に基づき発明を完成したもので
ある。

即ち、本発明は、Ｌ−セリンとスルフィドリル基含有化
合物との酵素反応によりＬ−システイン基含有化合物と
して硫化水素ガスを用いて反応を行い、その際、ＰＨ調
整に添加するアルカリに、水酸化ナトリウムを用いるこ
とを特徴とする、Ｌ−システインの製造方法である。ま
た反応に際し、あらかじめ窒素、アルゴンなどの不活性
ガスにより反応系内を置換した後、ジチオスレイトール
、ハイドロサルファイドなどの還元剤を添加しておけば
、さらにＬ−シスチンが抑制され収率が向上するもので
ある。

本発明において使用する酵素は、至適ＰＨが７．０〜９
．５であるＬ−セリンと硫化水素との酵素反応に用いら
れる酵素であれば何ら制限されず、例えば公知のシステ
ィン・シンターゼ、セリン・スルフヒドラーゼなどの酵
素を用いてもよく、また前記した出願人の提案のトリプ
トファン・シンターゼを用いて反応させることもできる
。

特に本発明においては、トリプトファン・シンターゼを
用いて実施するのが収率も大きく好ましい方法である。

トリプトファン・シンターゼの酵素生産菌としては前記
特■昭６０〜８４５４５号公報に開示されているように
エシェリヒア・コリＭＴ−１（２３２（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−１９）、エシェリヒア・コリＭＴ−１０２４２（Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−２０）などの微生物やミノイロスボラ
・クラツサ（ＡＴＣＣ１４６９２）などの微生物が使用
できるが、特にエシェリヒア・コリから得られたトリプ
トファン・シンターゼを用いるのが有利である。

酵素は必ずしも抽出された純粋なものを使う必要はなく
、上記生産菌株の培養物、培養物から遠心分離などの方
法によって採取した生菌体、あるいはその凍結菌体二凍
結乾燥菌体、あるいは超音波処理などによって得られる
菌体処理物などが利用される。

本発明の態様を述べれば以下のとおりである。

通常、酵素法によるＬ−セリンよりＬ−システインを製
造する方法においては、スルフィドリル基の導入剤とし
て水硫化ナトリウムなどの金属水硫化物、硫化ナトリウ
ムなどの金属硫化物を用いる方法なども知られているが
、本発明方法においては、硫化水素ガスを用いる。これ
を反応系に導入することにより、反応器内の水溶液の部
分、あるいは気相部分は硫化水素で満たされ還元的ふん
囲気を保った状態に維持されるので、酸化によるＬ−シ
スチンは防止される。

また反応に使用される酵素の至適ＰＨは７．０〜へ５の
範囲であり、硫化水素を用いた場合、硫化水素は酸性ガ
スであるためＰＨが低下し、反応転換率が下がるので、
適時アルカリ水溶液を添加してコントロールする。

その場合添加するアルカリの種類によっては酵素反応を
阻害し、Ｌ−セリンからＬ−システインへの転換率が目
標に達しない場合もある。特に著しく阻害するアルカリ
は、アンモニアであり系内濃度が０．２％程度で転換率
は、水酸化ナトリウム使用の場合のＶ４以下となる。ま
た水酸化カリウム、ピロリン酸カリウムあるいは水酸化
カルシウムなどを用いた場合も水酸化ナトリウムを用い
た場合の転換率に及ばない。よって本発明においてはＰ
Ｈ調整用アルカリとしては水酸化ナトリウムを用いる必
要がある。

また反応を実施するにあたり予じめＮ２．Ａｒなどの不
活性、ｊｆ７・で−置換し￥、ハくと、初期の溶存酸素
によるシスティンからシスチンの酸化がさらに防止され
る。反応開始時の溶存酸素は１　ｐｐｍ似下が望ましい
。さらには、反応系に還元剤であるハイドロサルファイ
ド、ジチオスレイトール、ジヒドロリポアミドなどの還
元剤を１０〜５００ｍｈｉ程度添加することによりシス
チンの生成がより抑制される。添加する時期、方法は分
割添加でも良く、また反応後期に添加しても良い。

本発明方法においては、Ｌ−セリンの基質濃度は特に制
限はないが、通常液中濃度１〜２５重量％の範囲で使用
するのがよい。また反応液中における酵素の使用量は、
酵素の使用形態により異なシンターゼ使用の場合は、基
質の他に補酵素であるピリドキサールリン酸を微量、例
えば液中濃度として１〜５０　ｐｐｍの範囲で添加する
のが望ましい。

また、硫化水素の使用量は、仕込みＬ−セリンのＬＯ〜
Ｌ３倍モル程度が好ましく、多すぎると系内よりの逃げ
によるロス及びＰＨ調整用の水酸化ナトリウムをむやみ
に使用する結果となり好ましくなく、少なすぎると反応
の激論に不足するう吹き込み速度は２〜１２時間程度が
好ましい。

以下実施例によって本発明の詳細な説明するが、実施例
中のシスチンの分析方法は公知のガイトンデ（Ｇａｉｔ
ｏｎｄｅ　）の方法によらシスティン換算で算出した。

すなわち、１０００〜２０００倍に希釈した被検液に５
μＭの１，４−ジチオトレイトール（還元剤）約同量加
えてさらに２ＮのＮａＯＨによりＰＨ８，０〜８．５と
し、室温にて１時間放置して含有するシスチンをすべて
システィンに還元し、酸性ニンヒドリン試薬を用いて発
色させ、吸光度計にて５５０ｎｍの吸光度を測定する。

−方、既知の濃度の漂準サンプルを作成し、５６０ｎｍ
の吸光度の検量線を作成しておき、本検量線をもとに被
検液中のシスティン＋シスチン濃度を算出した。また、
１．４−ジチオスレイトールによる還元操作を省略して
システィン濃度の算出を行い、上記システィン＋シネチ
ン濃度よりシスティン濃度を差し引くことによりシスチ
ン濃度は算出した。

実施例１かくはん機及び吹き込み管、排気管つきの２００ゴ容セ
パラブルフラスコにＬ−セリン１０ｇ、ピリドキサ−ル
ミノン酸２．５１ｎ９を加え、イオン交換水にて全容を
１００ｐとする。３２％ＮａＯＨ液にて反応液のＰＨを
８゜Ｏとして反応液を４５°Ｃ−定に保ちＮ２ガスを５
０ｍ７！／分の速度で３０分吹き込み系内の溶存酸素を
Ｑ、８ｐｐｍとして、トリプトファン・シンターゼ含有
菌体（エシェリヒア・コリＭＴ−１０２４２ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−２０）を乾燥菌体換算で２．０ｇ装入する。さ
らに１，４−ジチオスレイトール１．５　ｇ（約１００
　ｍＭ　）　を添加した。

硫化水素ガスをボンベより約１０ｍＡ！／分の速度で吹
き込み始め、約４時間で吹き込みを終了する。

（硫化水素の使用量は対し一セリン約１．１倍モルであ
る。）吹き込み終了後さらに２時間かくはんを行ない反
応を完結させる。反応中は３２％ＮａＯＨ液を反応系内
のＰＨが＆０となるようにコシトロールしながら添加し
、最終的に初期のＰＨ副調整含めて約１５ｇの３２％Ｎ
ａＯＨ液を消費した。

反応終了後の反応液ｔｔｓ、ｌをなるべく均一にサンプ
リングし、２Ｎ塩酸に溶解後、遠心分離により除菌し、
Ｌ−システイン及びＬ−シスチンの分析を行うと、それ
ぞれＬ−システイン９．００％（Ｌ−セリンからの転換
率９０６６％　）、Ｌ−シスチン０．１２％（Ｌ−セリ
ンからの転換率１．２％）とＬ−シスチン含量の翫めて
少ない反応液を得ることができｚｏ及びメルカプトエタノールの添加を省略して実施した。

反応系のＰＨ副調整使用した３２％ＮａＯＨ液は分析を
行なった結果、Ｌ−システイン８．５６％（Ｌ−セリン
からの転換率８４．０％）、Ｌ−シスチン０．５０％（
Ｌ−セリンからの転換率５．０％）であった。

して２５％ＮＨ，水を使用した。

果、Ｌ−システイン１．８３％（Ｌ−セリンからの転換
率１７．５％）、Ｌ−シスチン０．６５％（Ｌ−セリン
からの転換率６．３％）と極めて低い転換率であった。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）Ｌ−セリンとスルフィドリル基含有化合物との酵
素反応によりＬ−システインを製造する方法において、
反応時の至適ＰＨが７．０〜９．５を有する酵素を用い
、スルフィドリル基含有化合物として硫化水素ガスを用
いて反応を行い、その際ＰＨ調整に添加するアルカリに
、水酸化ナトリウムを用いることを特徴とする、Ｌ−シ
ステインの製造方法。
（２）Ｌ−セリンとスルフィドリル基含有化合物との酵
素反応によりＬ−システインを製造する方法において、
あらかじめ、不活性ガスにより反応系内を置換した後、
還元剤を添加して還元的ふん囲気下に、反応時の至適Ｐ
Ｈが７．０〜９．５を有する酵素を用い、スルフィドリ
ル基含有化合物として硫化水素ガスを用いて反応を行い
、その際ＰＨ調整に添加するアルカリに、水酸化ナトリ
ウムを用いることを特徴とする、Ｌ−システインの製造
方法。
（３）酵素に、トリプトファン・シンターゼを用いる特
許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。