CN87103766A - 由半胱氨酸生产胱氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

由酶催化法或发酵法得到的含半胱氨酸水溶液，在二甲亚砜的存在下，通过氧化半胱氨酸以高产率来生产胱氨酸。

Description

由半胱氨酸生产胱氨酸的方法

本发明涉及通过氧化由酶催化法或发酵法得到的半胱氨酸以生产胱氨酸的方法。

L-半胱氨酸和L-胱氨酸是含硫的基本氨基酸，业已发现它们可用作医药，医药原料，食品添加剂以及化妆品的添加剂。尤其近年来，对这些化合物用作冷烫发液的原料之需求正稳步增长。

在由发酵法、酶催化法、合成法或其它任何方法得到的含半胱氨酸反应液的半胱氨酸分离过程中（下文称的“反应液”一词应指在酶催化法、发酵法或合成法的反应完全后，所存在的溶液），由于反应液的组合物复杂，并且半胱氨酸在水中的溶解度十分高，所以目前盛行这样一些方法，先将最初得到的半胱氨酸进行分离和提纯，然后与强酸如盐酸或对甲苯磺酸反应，而生成相应的盐。

这些方法一般流程都复杂，得到的半胱氨酸的产率很低。所以要从发酵法得到复杂组合物的反应液中，分离出高纯度的半胱氨酸是困难的。特别是，由于反应液中含有由微生物引起的杂质，则由发酵法或酶催化法得到的反应液进行分离和提纯半胱氨酸，必然伴有严重的损失。

由于半胱氨酸相当容易氧化，所以已提出一种方法，其包括强制反应液中的半胱氨酸氧化成胱氨酸，再分离出纯的胱氨酸，然后电解还原已分离的胱氨酸，从而得到纯的半胱氨酸。

在半胱氨酸发酵肉汤培养中进行半胱氨酸二氧化，这样一些方法目前已经被公开。在日本特开昭57（1982）-7，643号说明书中所公开的方法，就采用了这样的氧化过程，即用空气或像H₂O₂的过氧化物并使反应的混合物保持pH值为5到10。

根据该发明人的示踪实验，可以假定在采用H₂O₂或空气氧化的方法中，该反应具有游离基氧化的形式，则必然伴有反应条件控制难以及有相当大比例的产物发生分解等缺点。

当反应液是发酵肉汤培养液时，而该发酵液在半胱氨酸的反应系统中含有像Fe⁺⁺或Mn⁺⁺的金属离子用作催化正如上文所述方法的游离基反应，则以相当高的产率得到胱氨酸。但是，该反应液中实际上不含金属离子，所以产率低。如果将所加的金属离子如Fe⁺⁺和Mn⁺⁺与已分离的胱氨酸混合，很可能会对胱氨酸电解还原产生反作用。

为了从发酵法或酶催化法得到的半胱氨酸反应液中去除所用的微生物细胞或所用的酶，通过添加HCl或H₂SO₄反应液的pH值调至不大于4，再加活性炭，热处理由所用的酶或所用的微生物细胞得到的生成液，使之絮凝和吸附在活性炭上，再将生成的复合物经固一液分离，业已发现这样一种方法是十分有效的。在这种情况下，用空气或H₂O₂的氧化方法要求反应液的pH值保持不小于5，正如在上文提及的说明书中特别指出的那样，因此，在处理反应液后，该方法并不适合在酸性条件下氧化半胱氨酸。

尤其根据该发明人的示踪实验，则肯定了在pH值为1左右的强酸条件下，用空气氧化实际上并不产生胱氨酸。

迄今为止，归纳已有技术所知的氧化半胱氨酸的方法，有借助于用黄原酸甲酯（methyl    xanthide）〔美国专利4，039，586〕氧化的方法以及借助γ射线照射的方法〔化学通讯，第826-827页，1968〕。但是这些方法不应当称之为工业可行的方法。

本发明人致力于解决上述问题作出了刻苦的研究。

具体地说，本发明涉及胱氨酸的生产方法，其特征在于以下步骤，在有二甲亚砜（在此用作氧化剂）的存在下，氧化由酶催化法或酵法得到含半胱酸水溶液中的半胱氨酸，然后将半胱氨酸转化成胱氨酸，以及分离生成的胱氨酸。

将反应液通过本发明建议的氧化过程，只是必须满足这个要求，即该反应液应该是发酵法或酶催化法得到的含半胱氨酸的反应液。例如，能够采用通过用2-氨基-噻唑啉-4-（ATC）培养产生L-半胱氨酸的微生物如假单胞菌属所得到的反应液，正如前文提及的日本特开昭57（1982）7，634所描述的那样。本发明最好采用在生产半胱氨酸过程中能产生无机盐含量相高的反应液。

本发明人以前曾研究并申请了一个专利，即通过用L-丝氨酸作为原料并用含硫化合物如Na₂S，NaHS，或H₂S作为巯基引发剂进行酶催化反应，在色氨酸合酶的存在下得到L-半胱氨酸的方法。由这种酶催化反应得到的反应液含有像NaCl和（NH₄）₂SO₄的无机盐类。

当应用本发明的方法于酶催化或发酵的反应液时，在二甲亚砜（下文简称“DMSO”）存在下，通过存在于氧化反应统中的盐的催化作用，估计有助于氧化过程反应度的提高，因为该氧化过程依赖于离子反应。

本发明涉及在由酶催化法（下文称酶催化法包括发酵法）得到的反应液中，将半胱氨酸氧化成胱氨酸的方法。由于反应是在温和的反应条件下进行的，所以并不受反应液组合物的影响。

因此，该反应液可以含有在半胱氨酸生产过程中生成的大量的胱氨酸，甚至可含有在培养过程中产生的所用的酶或所用的微生物细胞。例如，将在最初由酶催化反应生成的以及仍含有所用的酶或所用的微生物细胞的反应液中所含的半胱氨酸氧化成胱氨酸，即通过在该溶液中添加DMSO，并从该溶液中移去所用的酶或所用的微生物细胞，从而分离出已生产的胱氨酸。

但是，正如上文已经描述的，从本发明的反应液中移去所用的微生物细胞，最有效的方法包括在PH值不大于4的酸性条件下，最好pH为1左右，并在吸附剂的存在下热处理反应液，从而絮凝所用的微生物细胞，产生的絮凝物吸附在活性炭上，再洗脱该吸附物。对于含有半胱氨酸的酸性水溶液是由从上述反应液中移出所用的微生物细胞所致，将DMSO作为氧化剂添加到该溶液中，从而将半胱氨酸转化成胱氨酸。在反应中，因为按本发明将半胱氨酸氧化成胱氨酸，反应速度提高是与溶液pH降低成比例的，胱氨酸的产率增加与溶液度增加成正比。

所用的DMSO之量应足以达到，对于反应液中每含1摩尔的半胱氨酸，要添加大约0.2到2.0摩尔，最好为0.5到1.0摩尔。

尽管对于本发明的反应所要求的温度不需严格规定，但最好还是控制在5℃100℃的范围里。

本发明不要求压力供氧到本反应系统里。本反应能在任何常规密封式反应容器中进行，甚至也可以在N₂的气氛下进行。

于是通过使用DMSO起氧化作用，本发明具有以下优点：（1）在用空气的氧化过程或用H₂O₂的氧化过程中，只有添加Fe⁺⁺，Mn⁺⁺或Cu⁺⁺这样的金属离子作为催化剂到该反应系统中，才能得到适当的反应速度。而本发明的方法绝对没有使用催化剂。

由于用空气的氧化过程或用H₂O₂的氧化过程是一种游离基反应，它不会因胱氨酸的产生而终止反应，但进而产生像磺基丙氨酸这样的分解产物。结果，对于回收胱氨酸就不可避免地伴有严重的损失，氧化反应就不容易控制。按照本发明，在有DMSO存在下进行的氧化过程中，由于氧化反应是离子反应，所以反应温和并且大量从半胱氨酸产生胱氨酸、当反应在有电解无机盐的存在下进行时，氧化的反应速度提高。当将本发明的方法用于L-半胱氨酸反应液时，其中所述的反应液是通过用L-丝氨酸作为底物并且在色氨酸含酶的存在下将含硫化合物进行酶反应而得到的，则这种电解无机盐存在的效果是特别突出的。（2）将半胱氨酸水溶液进行本发明的氧化反应，则要求其pH值尽可能地低。当由移去所用的微生物细胞所产生的半胱氨酸水溶液进行氧化反应时，其中移出所用微生物细胞的过程是用活性炭并在酸性条件下（pH4或更小）进行的，该水溶液能直接用于氧化反应中，无需调节pH值。

与用空气或用H₂O₂进行氧化过程的传统方法相比较，本发明的方法依赖于用DMSO的氧化过程，则产生了许多引入注目的效果，例如尤其在强酸条件下，降低了半胱氨酸分解成磺基丙氨酸的速率。支持这一事实的数据将列于下表。

在试验氧化过程中，将10%L-半胱氨酸水溶液用作试样溶液。DMSO和H₂O₂各自在每摩尔的L-半胱氨酸溶液中加0.75摩尔。在用空气的氧化过程中，让空气以每分钟三倍于溶液体积数之速率通过该溶液。在所有试验中，将氧化过程在室温下进行八小时。表中上面部分的数据表示半胱氨酸的转化率（氧化率），而下面部分的数据表示胱氨酸的生成率（胱氨酸的选择性）。

DMSO 空气 H₂O₂

PH1    98/96    5/4    99/68

PH7    87/85    85/79    99/76

注意：在用空气和H₂O₂的试验中，以分钟数计加FeCl₂，使反应系统中存在Fe⁺⁺离子。

现在通过参考下文更详细说明的工作实施例来描述本发明。在这些工作实施例中，分析半胱氨酸和胱氨酸如下。用已知的Gaitonde法来分折半胱氨酸。

将精确称取的0.5克左右已知溶液作为一个试样，并用2N的HCl稀释到原来体积的10至20倍。进一步用蒸馏水稀释上述的稀释溶液到大约100倍。将最后稀释成原体积的1000到2000倍的溶液用茚三酮试剂着色，再用溶气计在560nm下测定吸收度。另外应预先制备已知浓度的标准试样，以得到在560nm下吸收度的校正曲线。于是从该校正曲线计标出已知溶液的半胱氨酸浓度。

关于胱氨酸的浓度，将上述稀释到原来溶液体积的1000到2000倍的已知溶液，与大致等积5μM的1.4-二硫苏糖醇（还原剂）混合，并添加2N的NaOH以调节ph值到8.0至8.5，在室温下静置一小时，使胱氨酸完全还原成半胱氨酸，并通过上述方法计算半胱氨酸的浓度。通过从如此计算的浓度中减去还原前的半胱氨酸的浓度，就是胱氨酸的浓度。

实施例1

在一个内容积为300毫升并装有搅拌器的分液瓶中，将含有22.0%（重量）L-丝氨酸（以L-丝氨酸计0.19摩尔）的91克L-丝氨酸水溶液，28.1克氢硫化钠二水合物（NaSH.2H₂O）〔0.38摩尔）以及10克由大肠杆菌E.Coli MT-10242（FERM BP-20）产生的并仍含有所用细胞（干含量2.2克）的色氨酸合酶培养液化合，通过添加5%的氢氧化钠水溶液来调节pH值到7.5，并用水稀释到总体积为200毫升。将生成的混合物置于35℃的恒温浴中，使其反应24小时。

在反应完成后，用盐酸调节反应混合物的pH值到1.0，然后与5克活性炭（由武田药品工业株式会社制造的、注册商标投放市场的“Tokusei    Shirasagi”）结合，再在80℃下加热30分钟。在这种热处理后，保持反应混合物80℃，通过瓷漏斗进行热过滤，以滤去所用的微生物细胞，得到188克已处理形式的反应过滤物。通过分析计算该反应过滤物，含有20.1克（0.166摩尔）L-半胱氨酸，两者均当作L-半胱氨酸来还原。通过计算得出95.8%L-丝氨酸转化成L-胱半胱氨酸和L-胱氨酸。

将通过热处理如此得到的反应液送进内容积为300毫升并装有搅拌器的分液瓶中，再添加9.7克DMSO在室温下搅拌八小时，得到196.2克含有L-胱氨酸结晶沉淀的溶液（溶液的pH值仍然为1）。在该溶液中，保留了0.2克L-半胱氨酸。

将氧化过程生成的溶液与5%的氢氧化钠水溶液中和到pH值为5左右，使结晶沉淀。通过过滤分离结晶，干燥后得到19.8克（0.165摩尔，以100%计）白色粉状结晶。得到这些结晶的折射率为〔α〕²⁰ _D＝-218°（C＝2，2N.HCl），Fe含量不大于10ppm，纯度不小于98.5%。关于回收率，在反应液中存在的所有L-胱氨酸和L-半胱氨酸，其95.0%被回收。分解率不高于2%。

对比实验：

按照实施例1的方法得到相同的反应液，将之进行热处理，然后用5%的氢氧化钠水溶液中和，使pH值达到5。

将热处理后产生的反应液输送到与实施例1所用相同的内容积为300毫升的分液瓶里，在其中再与0.2克FeCl₂混合，并在室温下用空气以大约200毫升/分的流速吹入该瓶，制得200.8克有L-胱氨酸沉淀结晶物的溶液，在该溶液中，还存在4.2克L-半胱氨酸。

通过过滤从反应液中分离出结晶物，并干燥分离后的结晶物，得到14.8克白色粉末的结晶，其折射率为〔α〕²⁰ _D＝-215°（C＝2，2N HCl），Fe含量为30ppm，纯度不小于98.5%。关于回收率，在反应液中所有L-半胱氨酸和L-胱氨酸，其70.3%被回收。分解率为9.9%。

实施例2

在内容积为300毫升并将有搅拌机的分液瓶里，将含有22.0%（重量）的L-丝氨酸（0.19摩尔L-丝氨酸）的91克L-丝氨酸水溶液、28.1克0.38摩尔）硫氢化钠二水合物（NaSH·2H₂O）以及由大肠杆菌E.Coli.MT-10242（FERM BP-20）产生的并且仍含有所用细胞（干重含量2.2克）的10克色氨酸合酶的培养液化合，再添加5%氢氧化钠调节pH值到7.5，然后用水稀释使总体积为200毫升。将该稀释溶液置入35℃的恒温浴中，反应24小时。

反应完全后得到的反应液，经分析计算含有18.5克（0.153摩尔）L-半胱氨酸和3.2克（0.013摩尔）L-胱氨酸，两者当作L-半胱氨酸被还原。计算L-丝氨酸转化为L-半胱氨酸和L-胱氨酸的转化率为94.2%。

由此得到的反应液用30毫升左右的浓盐酸使pH达0.5，再与0.97克DMSO化合，在35℃下搅拌氧化八小时。在此阶段，氧化液含有0.7克（0.006摩尔）L-半胱氨酸和20.7克（0.086摩尔）L-胱氨酸。计算L-丝氨酸转化成L-胱氨酸的转化率为90.6%。

将氧化液和添和添加的5克活性炭（武田药品工业株式会社的产品）在80℃下加热30分钟。保持生成的反应混合物在80℃，用瓷漏斗进行热过滤，滤去所用的微生物细胞并得到已处理过的均一过滤物2.30克（pH仍为0.5）。经分析计算该过滤物含有0.3克（0.002摩尔）L-半胱氨酸和20.8克（0.087摩尔）L-胱氨酸。L-丝氨酸转化成L-胱氨酸的转化率为91.3%。

将分离所用微生物细胞后产生的溶液，用大约5毫升30%的NaOH溶液滴加中和，使L-胱氨酸结晶物沉淀。用瓷漏斗真空过滤分离结晶物，再用50毫升水彻洗涤，干燥得到20.2克（0.084摩尔，以100%计）白色粉末结晶。其折射率为〔α〕²⁰ _D＝-218.6（C＝2，2N HCl），Fe含量不大于10ppm，其纯度不小于98.5%。关于回收率，对于反应液中的所有L-半氨酸和L-胱氨酸，几乎100%被回收。

Claims (3)

1、生产胱氨酸的方法，包括通过酶催化法或发酵法得到含半胱氨酸水溶液而产生半胱氨酸，在氧化剂二甲亚砜的存在下经氧化，由此将所述的半胱氨酸转化成胱氨酸，再分离出胱氨酸。

2、按权利要求1的方法，其中所述的含半胱氨酸水溶液是在色氨酸合酶的存在下由L-丝氨酸与含巯基化合物反应得到的L-半胱氨酸水溶液。

3、按权利要求1的方法，其中所述的含半胱氨酸水溶液的PH值不大于4。