CN87103767A - 产生l-胱氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
L-丝氨酸与硫化氢或碱金属硫化物或氢硫化物在有酶参加下反应生成L-半胱氨酸，该L-半胱氨酸经氧化产生L-胱氨酸。该反应是在用作氧化剂的二甲亚砜参加下进行的，使由酶反应生成的L-半胱氨酸在反应系统中可成功地转化为L-胱氨酸。
Description
本发明涉及通过酶反应产生L-胱氨酸的方法。
胱氨酸能够很容易还原为半胱氨酸。L-胱氨酸和L-半胱氨酸都是含硫的氨基酸，并用作例如药物或其原料，或食品和化妆品的添加剂。特别值得注意的是近年来他们正被大量用于冷烫发液。
公众已知有许多方法能产生L-半胱氨酸，包括：（1）从天然物质中提取;（2）有机合成;（3）发酵;和（4）酶反应。从天然物质中提取L-半胱氨酸方法的缺点在于人们认为提供的原料不稳定，提取的产物可能含有其他不需要的氨基酸。L-半胱氨酸的有机合成则需要将其与D-半胱氨酸分离。发酵产生L-半胱氨酸的方法，效率很低。因此，这三种方法中没有一种方法适宜于工业生产。
人们已知有许多用酶产生L-半胱氨酸的方法，包括（1）通过使用半胱氨酸合酶或脱巯基酶，由L-丝氨酸和硫化氢合成L-半胱氨酸;（2）通过使用半胱氨酸脱巯基酶，例如从取代β-丙氨酸和金属硫化物合成L-半胱氨酸;和（3）通过L-ATC-水化酶、ATC-消旋酶或S-氨基甲酰-L-半胱氨酸水化酶，从2-氨基-噻唑啉-4-羧酸（ATC）合成L-半胱氨酸。由本发明的受让与人提交的日本专利申请84545/1985号公开了产生L-半胱氨酸的方法，即在色氨酸合酶存在的情况下，通过L-丝氨酸与具有巯基的化合物如金属氢硫化物的作用产生。
无论哪种方法都可采用，但是当反应产物混杂在组合物中以及半胱胺酸大量溶于水中时，将半胱氨酸直接从反应产物分离则是非常困难的。为此，通常是将半胱氨酸氧化为胱氨酸并将其从反应产物中分离出来，通过电解还原等方法回收精制的半胱氨酸。
将半胱氨酸氧化为胱氨酸的许多方法都是众所周知的。例如，日本专利公开物7634/1982号介绍的方法是用空气或过氧化物如H2O2将半胱氨酸氧化为含水的发酵产物，同时保持其pH值为5～10。
但是这个方法有许多不足之处。直到用酶反应产生半胱氨酸之后，才能开始例如由L-丝氨酸产生胱氨酸。用空气或H2O2氧化半胱氨酸时，要是不严格控制氧化条件，则除了胱氨酸外还将大量产生分解产物。
对L-丝氨酸的酶反应而言，将硫化氢（H2S）直接用作含硫氢基化合物，因其反应速度快和费用低，显然更好些。但是H2S气体难溶于水，通常不直接用它，而是用水溶性盐，例如以氢硫化钠作为H2S源。
在这种情况下，本发明的目的在于提供一个改进方法，即通过酶反应，从L-丝氨酸产生L-胱氨酸的方法。
根据本发明的特征，用二甲亚砜（DMSO）氧化由L-丝氨酸与硫化氢或与碱金属氢硫化物或碱金属硫化物进行酶反应得到的含水反应产物中的L-半胱氨酸。将二甲亚砜用于发生酶反应的系统中，使产生的半胱氨酸可以成功地转化为胱氨酸。使用二甲亚砜的优点还在于，当其促使硫化氢溶解在酶反应的水介质中时，使硫化氢获得令人满意的使用。
此外，二甲亚砜不仅不阻滞酶反应，而且还成功地将L-半胱氨酸氧化为L-胱氨酸，因此有利于急剧加速酶反应。对此，本发明能够避免L-半胱氨酸分解生成任何副产品，并且能以高产率从L-丝氨酸产生L-胱氨酸。
根据本发明，凡是能使L-丝氨酸与硫化氢或碱金属氢硫化物或碱金属硫化物进行酶反应的任何酶都能使用。任何已知的酶，例如半胱氨酸合酶或脱巯基酶都能使用。在上述提及的专利申请中所建议的色氨酸合酶也能使用。
使用色氨酸合酶特别有效和合乎需要，如在日本专利申请84545/1985号中公开的各种微生物都可用于产生酶，包括：大肠杆菌MT-10242（FERM BP-20）。使用从大肠杆菌得到的色氨酸合酶则特别有利。
酶不一定需要纯的提取产物。能使用任何这类微生物的培养产物、通过离心从中收集活的微生物、其冷冻冻干产物、通过超声处理得到的微生物等。
关于底物L-丝氨酸在反应液中的浓度并没有特殊限制，但通常所用溶液可取的浓度为1～25%（重量）。加入溶液的酶量视各种因素而定，如底物的浓度和酶的活性。一般不能给出详尽的规定，而应根据实际情况选用。如用色氨酸合酶时，加入很少量的5′-磷酸吡哆醛作为辅酶则更为理想。溶液可以含有例如0.1～50ppm的酸。
含有用于酶反应的硫氢基化合物可选自碱金属氢硫化物，如NaHS和KHS，或金属硫化物，如Na2S和K2S。另外，直接将硫化氢气体引入反应系统也是可能的。在这种情况下，较为可取的是每摩尔L-丝氨酸至少用1摩尔硫化氢。
关于二甲亚砜的用量，即适合的用量为每摩尔L-丝氨酸含0.2～5.0摩尔二甲亚砜，特别理想的用量为0.5～2.0摩尔。如每摩尔L-丝氨酸仅用约小于0.2摩尔二甲亚砜，则很难将所有的L-半胱氨酸产物全部转化为L-胱氨酸;如用硫化氢，则二甲亚砜并不能有助于其得到令人满意的溶解。如果所用二甲亚砜的量约大于5摩尔，则可能会严重抑制酶反应。
反应通常在温度20℃～60℃，pH5～10条件下进行2～50小时，如用硫化氢，则最佳反应时间为2～10小时。反应进行时，溶液渐呈白色，表示L-胱氨酸结晶沉淀析出。
完成了反应的溶液含有L-胱氨酸和未反应的L-丝氨酸。通过下面的实施例所述方法，从反应产物中分离出胱氨酸。在强盐酸和活性炭存在的条件下，对溶液进行加热和热过滤，以滤去溶液中的残留细胞。然后pH值降至5左右，使L-胱氨酸结晶。采用常规的固液分离，收集高纯度的L-胱氨酸。所收集的L-胱氨酸可通过电能还原，产生L-半胱氨酸。
现在参考几个本发明的实施例，更详细地介绍本发明。在各个实施例中，都是根据公知的Gaitonde方法，通过测定半胱氨酸的含量计算胱氨酸的含量。将各个实施例中所得反应产物稀释到浓度为1/1000～1/2000的溶液，以大约相同量的5微摩1，4-二硫苏糖醇（还原剂）加入该溶液，再加入2N的NaOH溶液，直至该溶液的pH值达至8.0～8.5。溶液在室温下静置1小时，使所含的全部胱氨酸都还原为半胱氨酸。将酸性水合茚三酮试剂加至该溶液，使半胱氨酸显色并在吸收仪的560nm波长处测量其吸收值，与预先配制的已知浓度的标准样品在560nm波长处吸收值的工作曲线进行比较，以测定各实施例产物中半胱氨酸的浓度。
实施例1
在带搅拌器、吹气管和排气管的200毫升分液瓶中，将10克L-胱氨酸、5.6克二甲亚砜和25毫克5′-磷酸吡哆醛进料，加入离子交换水，使其在分液瓶中组成100克溶液，再加10%的NaOH溶液，将溶液的pH值调至8.5。在分液瓶中再进料2.0克（干重）含有色氨酸合酶的大肠杆菌MT-10242（FERM BP-20），同时溶液保持在35℃。
将瓶中的硫化氢气体的每分钟约14毫升的速率吹入分液瓶，吹气反应持续进行4小时左右，同时加NaOH溶液使反应溶液的pH值保持在8.5。吹入溶液的硫化氢摩尔数约是L-丝氨酸摩尔数的1.5倍。吹入硫化氢气体后，溶液渐呈白色，表示L-胱氨酸沉淀析出。
尽可能均匀地从反应产物中采取试样，将各个样品溶于2N的盐酸溶液。通过离心分离从中离去大肠杆菌。由L-半胱氨酸分析计算L-胱氨酸的值为9.3%。这意味着大约81%的L-丝氨酸已经变为L-胱氨酸。
将大约25毫升的35%盐酸加入反应产物，pH值调至0.5。加入1.0克活性炭后，溶液在95℃下加热大约1小时。然后立即对溶液进行热过滤，滤去其中的大肠杆菌。溶液呈现透明黄色。
将大约5毫升的40%NaOH溶液加入该溶液，调整pH值至5。冷却溶液，析出L-胱氨酸结晶。用真空吸滤过滤器收集结晶，在20毫升离子交换水中洗涤，干燥后得8.2克白色L-胱氨酸结晶。这个量相当于所用L-丝氨酸的72摩尔%。晶体的[α]20 D值为-218.7°，纯度99.1%，灰分含量0.2%。
实施例2
在带搅拌器的200毫升分液瓶中，将10克L-丝氨酸，5.6克二甲亚砜，25毫克5′-磷酸吡哆醛和9.5克氢硫化纳（试剂纯度70%）进料。加入离子交换水，使其在分液瓶中组成200克溶液。加10%NaOH溶液，将溶液的pH值调至8.0，然后在分液瓶中装入2.0克（干重）与实施例1所用相同的菌。再加入浓度为每升4摩尔的磷酸溶液，溶液的pH值保持在8.0，温度为35℃。反应持续进行16小时左右。反应开始后约2小时，溶液呈白色，表示胱氨酸沉淀析出。
尽可能均匀地从反应产物中采取试样，各个样品溶于2N的盐酸溶液，通过离心分离，离去其中的大肠杆菌。从L-半胱氨酸分析计算L-胱氨酸的值为9.1%。这表示大约79%的L-丝氨酸已经转化为L-胱氨酸。
由此以下的各个步骤都重复实施例1的方法，得到L-胱氨酸晶体7.6克。这个量相当于所用L-丝氨酸的66.7摩尔%。晶体的[α]20 D值为-220°，纯度99.3%，灰分含量0.1%。
实施例3
在带搅拌器的200毫升分液瓶中，将10克L-丝氨酸，5.6克二甲亚砜，25毫克5′-磷酸吡哆醛和9.3克硫化钠（试剂纯度96%或更高纯度）进料。加入离子交换水，组成200克溶液，再加10%HCl溶液，将溶液的pH值调至8.0。在分液瓶中再装入2.0克（干重）与实施例1所用相同的菌，同时溶液保持在35℃，加10%HCl溶液，使pH值保持在8.0。反应持续约16小时。反应开始后约2小时，溶液开始时呈白色，表示胱氨酸沉淀析出。
尽可能均匀地从反应产物中采取试样，每个样品都溶于2N的盐酸溶液中，通过离心分离，离去其中的大肠杆菌。从L-半胱氨酸中分析计算L-胱氨酸的值为8.7%，即74%左右的L-丝氨酸已转化为L-胱氨酸。
由此以下的各个步骤都重复实施例1的方法，得到L-胱氨酸结晶7.4克。这个量相当于所用L-丝氨酸的64.9摩尔%。晶体的[α]20 D值为-221°，纯度98%，灰分含量03%。
实施例4
在带搅拌器的200毫升分液瓶中，将10克L-丝氨酸和5.6克二甲亚砜进料。加入离子交换水，组成50克溶液。然后将分液瓶装上含有半胱氨酸脱巯基酶的酶溶液，这种酶是通过培养枯草杆菌ATCC 6051并在缓冲液中经超声破碎所收集的大肠杆菌制备得到的。加入NaOH溶液，组成100克溶液，pH值为8.5。
将瓶中的硫化氢气体以每分钟大约14毫升的速率吹入分液瓶，吹气反应持续约4小时，用NaOH溶液将反应溶液的pH值保持在8.5。吹入溶液的硫化氢摩尔数约是L-丝氨酸摩尔数的1.5倍。吹入气体后，溶液渐呈白色，说明存在L-胱氨酸。
尽可能均匀地从反应产物中采取试样，各个样品溶于2N的盐酸溶液，通过离心分离，离去其中的枯草杆菌。由L-半胱氨酸分析计算L-胱氨酸的值为5.8%。这表示大约53%的L-丝氨酸已经转化为L-胱氨酸。反应产物显示的半胱氨酸浓度不超过0.1%。
Claims (2)
1、一种在有酶存在的条件下将L-丝氨酸反应生成L-半胱氨酸并且再氧化该L-半胱氨酸产生L-胱氨酸的方法，其改进在于将所述的L-丝氨酸与选自一组包括硫化氢、碱金属硫化物和碱金属氢硫化的物质进行反应，而该L-丝氨酸与上述物质的反应是在有二甲亚砜用作所述L-半胱氨酸的氧化剂参加下进行的。
2、根据权利要求1的方法，其中所述酶是色氨酸合酶。
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