JPS60991B2 - Ｄ−ｎ−カルバモイルフエニルグリシンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＤ−Ｎ−カルバモィルフェニルグリシンの製造
法に関する。

更に詳しくは、５−フェニルヒダントインを立体特異的
に開裂加水分解する能力を有する微生物を利用してＤ−
Ｎーカルバモィルフェニルグリシンを製造するに際し、
反応系中に２価の鉄トコバルトまたはマンガンを存在さ
せることにより、５一フェニルヒダントインの加水分解
速度を増加させる方法に関するものである。Ｄ−Ｎ−カ
ルバモィルフェニルグリシンは例えば鉢酸の存在下に亜
硝酸と反応させるとＤ−フェニルグリシンに変換される
が、０−フェニルグリシンは半合成ペニシリンおよび半
合成セフアロスポリンの合成原料として極めて重要な化
合物である。

本発明者の一人は、５−フェニルヒダントィンにヒダン
トィン環を立体特異的に開裂加水分解する能力を有する
微生物の培養物、菌体もしくは菌体処理物を作用させて
、Ｄ−Ｎ−カルバモイルフェニルグリシンを生成させる
方法を見出し、先に特願昭５１−１１５７５および持顔
昭５２一４８７１７として出願した。

この方法は微生物菌体内の酵素を利用してＤ体の５−フ
ェニルヒダントィンを立体特異的に開裂加水分解し、Ｄ
体のＮ−カルバモィルフェニルグリシンを生成させるも
のであるが、適当な温度とｐＨに保持された水性煤質中
で反応させればヒダントィン環のラセミ化が有効に行わ
れ、原料としてＤＬ−５一フヱニルヒダントインを用い
てもそのほ）、全量がＤ−Ｎーカルバモィルフヱニルグ
リシンに変換されると云う優れた方法である。しかしな
がら工業的に実施する場合には酵素源である菌体等の使
用量をできるだけ減少させるとか、反応速度を増大させ
て反応時間を短縮することにより、経済性を高めること
が望ましい。本発明者等はこれらの点を改良するために
鋭意研究を行った結果、２価の鉄、コバルトまたはマン
ガンが反応速度の増大に有効であることを見出し、本発
明を完成するに到った。即ち本発明は、５−フェニルヒ
ダントィンを立体特異的に開裂加水分解してＤ−Ｎ−カ
ルバモィルフェニルグリシンを生成する能力を有する微
生物の倍養物、菌体もしくは菌体処理物をｐＨ７〜１０
の水性煤質中で５−フェニルヒダントィンに作用させて
Ｄ−Ｎ−カルバモイルフエニルグリシンに変換させる反
応に際し、反応系中に２価の鉄、コバルトまたはマンガ
ンを存在させることを特徴とするＤ−Ｎ−カルバモィル
フェニルグリシンの製造法である。

本発明の方法で用いられる微生物は、５一フェニルヒダ
ントィンを立体特異的に開裂加水分解する能力、即ち５
−フェニルヒダントインのＤ体のみを開裂加水分解して
Ｄ−Ｎーカルバモイルフェニルグリシンを生成する能力
を有するもので、既に特願昭５１−１１５７５および特
願昭５２−４８７１７に記載されているように、分類学
的にみても広範囲の種属に見出されている。

例えば、細菌に属するものとしてはアクロモバクター属
（Ａｃｈｒｏｍｏ戊ｃｔｅｒ）、ア ェ ロ バクタ
ー属（Ａｅｒｏ戊ｃｔｅｒ）、アェロモナス属（Ａｅｍ
ｍｏｎａｓ）Ｌァグロバクテリゥム属（ＡｇＯ舷ｃｔｅ
ｒｉｍｍ）、アルカリゲネス属（ＡＩｃａｌｉ銭ｎｅｓ
）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃにｒ）、
バチルス属（母ｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属
（Ｂｒｅｖｍａｃｔｅｒｉｍｍ）、コリネバクテリウム
属（Ｃｏひ肥ｂａｃｔｅｒｉｍｍ）、ェンテロバクター
属（Ｅｎにｒｏ畑ｃｔｅｒ）、ェルウィニア属（ＥＭＭ
ａ）、ェシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ク
レブシーラ属（Ｋ１８ｂｓら１１ａ）、ミクロバクテリ
ウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｍｍ）、ミクロ コ
ツカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ入 プロ タミノバ
クター属（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏ畑ｃｔｅｒ入 プロテウ
ス属（Ｐｒｏｔｅ船）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏＭｓ）、サルチナ属（ＳａｒｃｉＭ）、セラチア
属（ＳｅｎａｔＥ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏ
ｍｏｎａｓ）など、放線菌に属するものとしてはアクチ
ノミセス属（Ａｃｔｍｏｍｙｃｅｓ）、ミコバクテリウ
ム属（Ｍｙｃｏ舷ｃｔｅｒ瓜ｍ ）、 ノ カ ル
デイ ア 属（ Ｎｏｃａｒｄｉａ入 ス ト レ プ
ト ミ セ ス 属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）な
ど、かびに属するものとしてはアスベルギルス属（Ａｓ
ｐｅｒｇｌｌ船）、パヱシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏ
ｍｙｃｅｓ）、ベニシリウム属（ＰｅｎｉｃｉｌＩＮｍ
）など、酵母に属するものとしてはキャンディダ属（Ｃ
ａｎｄ幻ａ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ロードトル
ラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｍｌａ）、トルロプシス属（Ｔｏ
ｍｌｏｐｓＳ）などの中に見出される。

しかし上述の各種微生物の中でも、５一フェニルヒダン
トィンを立体特異的に加水分解する能力が本来優れてい
る菌株を使用する場合に、本発明の効果が顕著に現れる
傾向がある。

例えばアェロバクタ−・クロアカエ（Ａｅｒｏｂａｃに
ｒｃｌｏａｃａｅ）ｌＡＭ１２２１、コリネバクテリウ
ム・セベドニカム（Ｃｏｒ肌ｅ舷ｃｔｅｒｍｍｓｅｐｅ
ｄｏｎｉｃｍｍ）ＩＦ０３３０６、ミクロバクテリウム
・フラバム（Ｍｉｃｒｏｂａｃにｒｉｍｍｆｌａｖｍｍ
）ＡＴＣＣＩ０３４０、ミコバクテリウム・スメグマテ
イス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ肌ｍ Ｓｍｅｇｍａｔｉｓ
）ＡＴＣＣ６０７、シユードモナス・クロロラフイス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｉｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｉ
Ｆ０３９０４、シユードモナス・ストリアタ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏＭｓｓｔｒｉａｔａ）ＩＦＯ１２９９６などは
、反応系に２価の鉄、コバルトまたはマンガンを特に添
加しなくても本来の活性が優れた菌株であるが、本発明
の方法を適用することによって活性を一層高めることが
でき、また本来の活性が高い菌株程大きな効果を示す煩
向がある。本発明の方法で使用される微生物は、通常の
方法で培養することができる。

培養は通常液体塔地を用いて行われ、渚地には資化し得
る炭素源、窒素源および各微生物の生育に必要な無機塩
、栄養素を含有させるが、更に所望の酵素の含量を向上
させるために適当な酵素誘導基質を存在させることが望
ましい。酵素誘導基質としては、ウラシル、シトシンの
ようなピリミジン系核酸塩基やそれらの誘導体、あるい
はヒダントィン、ＤＬ−５−メチルヒダントインのよう
なヒダントイン化合物が適している。培養条件としては
、使用する微生物の至適生育条件に応じて温度２０〜８
５こ○、ｐＨ４〜１１の範囲が用いられるが、一般的に
は温度２０〜４０午０、ｐＨ５〜９において１０〜７５
時間培養を行う。

培養中には通気、澄拝を行って微生物の生育を促進させ
ることもできる。５一フェニルヒダントィンの加水分解
反応には、上記のようにして培養した微生物を、培養物
、菌体もしくは菌体処理物の形態で使用することができ
る。

菌体としては生菌体の他に、凍結乾燥菌体やアセトン乾
燥菌体のような乾燥菌体を用いることも可能であり、菌
体処理物としては菌体磨砕物や菌体抽出物などを用いる
ことができる。反応基質である５一フェニルヒダントィ
ンはＤＬ体、Ｄ体もしくはＬ体のいずれでもよいが、通
常は化学合成で造られるＤＬ体を使用するのが便利であ
る。５−フェニルヒダントィンに微生物の培養物、菌体
もしくは菌体処理物を作用させるには、通常ｐＨ７〜１
０の水性煤質中で両者を混合すればよい。

５一フェニルヒダントィンの水に対する溶解度が小さい
ために、基質を懸濁した状態で反応させることがあるが
、反応の進行に伴って基質は水性媒費中に逐次溶解して
いくので、支障なく反応を完結させることができる。

本発明の方法では、上記のような５−フェニルヒダント
ィンに微生物の培養物、菌体もしくは菌体処理物を作用
させてＤ−Ｎ−カルバモイルフェニルグリシンを生成さ
せる反応に際して、反応系に２価の鉄、コバルトまたは
マンガンを存在させる。

通常は、それらの金属の塩酸塩、硫酸塩のような無機塩
あるいは酢酸塩のような有機酸塩など、溶解して２価の
鉄、コバルトまたはマンガンのイオンを発生しうる化合
物を反応液に添加する方法が用いられる。反応液に添加
される化合物の濃度は０．０２〜５ｍＭ程度であるが、
０．０５ｍＭ以上が特に適当である。なお、反応系に前
記の金属塩を存在させる他の方法として、微生物の培養
培地に予め金属塩を添加しておき、その培養物を反応液
成分として使用することも行われる。反応はｐＨ７〜１
０の水性媒質中で行われる。

ｐＨ７未満では反応速度が極めて小さく、ｐＨＩＯを超
えると好ましくない副反応を生じる。ｐＨ７〜１０の範
囲が好ましい理由としては、本発明で用いられる微生物
酵素の至薄ｐＨが８〜９附近にあること、ｐＨが増すに
つれて５一フェニルヒダントインの溶解度とＬ体のラセ
ミ化速度が増加することなどにある。反応の進行に伴っ
て水性煤質のｐＨが低下してくるので、反応中に適時中
和剤を添加して至適ｐＨを保持することが望ましい。こ
の場合にｐＨスタツトを使用して、連続的に中和を行う
のが最も望ましい方法である。中和剤としては、アンモ
ニア、苛性ソーダ、苛性カリなどが適当である。反応温
度は使用する微生物の酵素に通した温度として２０〜８
５ｑＣの範囲が用いられるが、一般的には３０〜４０ｏ
ｏが使用される。

加水分解反応によって生成したＤ−Ｎ−カルバモィルフ
ェニルグリシンを反応混合物から単離するには、ｐＨ調
整やイオン交換樹脂処理など公知の方法が用いられる。

しかしそれを単離することなく、反応混合物から不溶物
を除去したのちそのま）次の工程の反応に供してもよい
。例えば前記反応混合物を炉過または遠心分離して不溶
物を除き、その炉液又は上蒲液に雛酸を加えて亜硝酸を
反応させると、Ｄ−Ｎ−カルバモィルフェニルグリシン
はＤ−フヱニルグリシンに変換される。このようにして
得られたＤ−フェニルグリシンは、反応液から公知の方
法によって単離すればよい。次に実施例を示して本発明
を具体的に説明するが本発明はこれらの例のみに限定さ
れるものではない。なお実施例中に記載する％は、特に
示さない限り重量％である。実施例 １ 下記の組成からなるｐＨ６．５の液体培地２００の‘を
調製し、２夕の振顔フラスコに入れて１２０００で１５
分間蒸気殺菌を行った。

培地組成： 肉エキス ３．０％グリ
セロール １．０％ウラシル
０．１％これとは別
に、肉エキス０．５％、イーストエキス０．５％、ベプ
トン０．５％、ｐＨ６．５の液体塔地１０泌にシユード
モナス・ストリアタ（Ｐｓｅｕｄｍｏ順ｓｓｔｒ松ｔａ
）ＩＦＯ１２９９６を接種して、３３００で２独特間振
鰹培養した。

この培養物１０Ｍを前記２００の‘の液体培地に加えて
、３３ｏｏで１７時間振糧培養を行った。こうして得た
培養物の２００の‘を遠心分離して集菌し、生理的食塩
水２００叫で洗総した後、１００机の生理的食塩水に菌
体を懸濁させて、下記の反応液成分として使用した。反
応液成分： ‘１｝ ＤＬ−５一フヱニルヒダントィンを０．１Ｍの
酸酸アンモニウム−水酸化アンモニウム緩衝液に溶解し
て調製した、濃度５０のＭの基質溶液（ｐＨ９．１）
４．０叫【２） ＦｅＳ０４・７日２０、ＣｏＣ１２
１８日２０またはＭｎＣ１２・４日２０を溶解した濃度
１〜１０００蛇ｐｍの２価金属水溶液 ０．５の【｛３
｝ 前記菌体懸濁液 ０．５の‘ 上記｛１）、｛２）および（３｝を混合した計５．０Ｍ
の反応液を夫々共栓付試験管に入れ、振浸しながら３７
３０で１時間反応させた。

反応開始時における基質濃度は４．０机Ｍ、２価金属濃
度は０〜１００倣ｐｍ（０〜約５のＭ）であった。１時
間反応させたのち反応液を直ちに氷冷し、その１．０の
‘を探って、脱イオン水１．０の‘と２．５％トリクロ
ル酢酸水溶液２．０の‘を加えた。

次いで２．５％Ｐ−ジメチルァミノベンズァルデヒドの
鮒塩酸溶液２．０羽を加えて発色させ、この混合液を遠
心分離して不溶物を除いたのち、４４仇帆の吸光度を測
定した。吸光度の測定結果から、反応液１．０の上中に
生成していた○一Ｎ−力ルバモイルフエニルグリシンの
量が求められた。

それらの結果を表１〜３に示す。表１ 表２ 表３ 実施例 ２ 下記の組成からなるｐＨ７．０の液体培地を調製し、５
００の‘の振顔フラスコに９０叫入れて１２０ｑＣで１
５分間蒸気殺菌を行った。

培地組成： 肉エキス ２．０％グリセ
ロール １．０％ヒダントイ
ン ０．１％それとは別に
上記組成の培地１０のとを用いてシュードモナス・スト
リア夕（ＰｓｅｕｄｏｍｏＭｓｓｔｒａｔａ〉ＩＦＯ１
２９９６を試験管中で３３℃で２４時間振糧培養し、得
た培養物を前記の５００の‘振顔フラスコ中の渚地に加
えて、３チ○で２凪時間振濠培養を行った。

この培養物１００の‘を遠心分離して菌体を集め、１０
０の上の生理的食塩水で洗淡したのち、菌体を生理的食
塩水２０汎‘に懸濁させた。一方、ＤＬ−５−フェニル
ヒダントイン５．０夕を１３０のＺの水に懸濁したのち
、が−ＮａＯＨを用いて液のｐＨを８．７に調整し、液
温を３７００にした。

次いで、そこに前記の菌体懸濁液２０の‘を添加し、更
にＦｅＳ０４・７日２０をｌｍＭの濃度になるように加
えた。鰯梓下に３７０で反応を行ったが、生成Ｄ−Ｎー
カルバモイルフェニルグリシンを中和するためにｐＨス
タットを用いて州−ＮａＯＨ水溶液を滴下し、反応後の
ｐＨを８．７に保持した。反応が始つてから時々反応混
合物を１．０舷とり出し、実施例１と同様にＰージメチ
ルアミノベンズアルデヒドで発色させて４４０柳の波長
で比色定量する方法により、Ｄ−Ｎ−カルバモイルフェ
ニルグリシンの生成量を測定した。次に上記の実験の中
でＦｅＳ０４・７鴇○を用いたところを、ＣｏＣ１２・
母日２０またはＭｎＳ０４０』日２０に代えた他は全く
同様にして、夫々２価のコバルトまたはマンガンの効果
を調べた。

また、それらの対照実験として金属イオンを特に添加し
ない実験も行った。以上の実験における反応時間と反応
系中のＤ−Ｎ−カルバモィルフェニルグリシン生成量と
の関係を図１に示す。

図１に示されるように、金属塩を添加しないときに比べ
て、２価の鉄、コバルトまたはマンガンを添加した場合
にはし反応速度が顕著に増加した。

実施例 ３ 下記の組成からなるｐＨ７．０の液体塔地を調製し、５
００の‘の振濠フラスコに５０泌づつ分注して、１２０
ｑｏで１５分間蒸気殺菌を行った。

培地組成： 肉エキス １．０％べプト
ン １．０％酵母エキス
０．５％グリセロール
１．０％ウラシル
０．１％ＮａＣＩ
Ｏ．３％表４に示す６種の微
生物を前記の培地に夫々接種して、３＄○で２鮒時間振
盤培養を行った。

これらの培養物を夫々遠心分離して集菌し、５０の‘の
生理的食塩水で洗総して再び遠心分離により菌体を分離
した。表４に示すシュードモナス・クロロラフイス、シ
ユードモナス・ストリアタおよびコリネバクテリウム・
セベドニカムの場合には各２５の‘、その他の菌株の場
合には各５の‘の生理的食塩水にこれらの分離菌体を懸
濁させて、下記の反応液成分として使用した。反応液成
分： 【１’ＤＬ−５一フェニルヒダントィンを０．１Ｍの酢
酸アンモニウム−水酸化アンモニウム緩衝液に溶解して
調製した、濃度５０ｗＭの基質溶液（ｐＨ９．１） ４
．０の上‘２１ ＦｅＳ０４・７日２０、ＣｏＣ１２
・母日２０またはＭｎＣ１２・４日２０を溶解した濃度
１０ｍＭの２属塩水溶液 ０．５の‘【３’前記菌体懸
濁液 ０．５の‘ 上記‘１｝、■および糊を混合した反応液５．０の‘を
夫々共桧付設験管に入れ、振浸しながら３７０で１時間
反応させた。

反応開始時における基質濃度は４０肌Ｍ、２価金属塩濃
度はｌｍＭであった。１時間反応させたのち、実施例１
と同様にして反応液１．０地中に生成していたＤ−Ｎー
カルバモィルフヱニルグリシンの量を測定した。

それらの結果を表４に示すが、いくつかの微生物につい
て２価の鉄、コバルトもしくはマンガンの効果が確認さ
れた。表 ４

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の方法による目的化合物の生成量（夕）又
はその変換率（モル％）と反応時間との関係を示すグラ
フである。 曲線■はＦｅＳ０４・７日２０１ｍＭ添加、■はＣｏＣ
１２・細２０１机Ｍ添加、■はＭｎＣ１２・４＆０１ｍ
Ｍ添加、■は無添加の場合である。 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ５−フエニルヒダントインを立体特異的に開裂加水
   分解してＤ−Ｎ−カルバモイルフエニルグリシンを生成
   する能力を有する微生物の培養物、菌体もしくは菌体処
   理物を、ｐＨ７〜１０の水性媒質中で５−フエニルヒダ
   ントインに作用させてＤ−Ｎ−カルバモイルフエニルグ
   リシンに変換する反応に際し、反応系中に２価の鉄、コ
   バルトまたはマンガンを存在させることを特徴とするＤ
   −Ｎ−カルバモイルフエニルグリシンの製造法。 ２ ２価の鉄、コバルトまたはマンガンを濃度０．０５
   ｍＭ以上存在させる特許請求の範囲第１項記載の製造法
   。