JPS60120983A - ブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法 - Google Patents
ブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法Info
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- JPS60120983A JPS60120983A JP22807283A JP22807283A JPS60120983A JP S60120983 A JPS60120983 A JP S60120983A JP 22807283 A JP22807283 A JP 22807283A JP 22807283 A JP22807283 A JP 22807283A JP S60120983 A JPS60120983 A JP S60120983A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ブレビバクテリウム属に属する菌体の培養方
法に関するものである。
法に関するものである。
本発明の方法によれば、ブレビバクテリウム属に属する
菌体内に産生されるアスパルターゼ含はを増加させるこ
とができ、アスパルターゼ相対比活性が著しく大きくな
る。
菌体内に産生されるアスパルターゼ含はを増加させるこ
とができ、アスパルターゼ相対比活性が著しく大きくな
る。
アスパルターゼが、フマール酸とアンモニアからＬ−ア
スパラギン酸を生成する反応の酵素触媒であることはよ
く知られている。また、このＬ −アスパラギン酸は、
重要なアミノ酸の一つとじて広く知られており、医薬品
や食品添加物等として用いられている。
スパラギン酸を生成する反応の酵素触媒であることはよ
く知られている。また、このＬ −アスパラギン酸は、
重要なアミノ酸の一つとじて広く知られており、医薬品
や食品添加物等として用いられている。
従来、種々の菌体を用いた醗酵法或いは、これら菌体の
産生するアスパルターゼを利用する酵素法により、フマ
ール酸及びアンモニア等からＬ−アスパラギン酸を製造
する試みが数多く提案されている。
産生するアスパルターゼを利用する酵素法により、フマ
ール酸及びアンモニア等からＬ−アスパラギン酸を製造
する試みが数多く提案されている。
この場合、高いアスパルターゼ活性を有する菌体を新た
に自然界から採取することは重要なことである。しかし
ながらこの様な菌体を入手することは極めて困難である
ので、これに代って例えば、本発明者らの提案（特開昭
５６−２６１９６号公報）した、ブレビバクテリウム属
に属する菌体にα−アミノ−ｎ−酪酸耐性を付与し、フ
マール酸及びアンモニアからＬ−アスパラギン酸を合成
する能力を高める方法、また１、 Ｃｈｉｂａｔａ ｅ
ｔ、 ａｌ、、Ａｐｐａ、 Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｔ、、
υ、８７８（１９７４） の提案しているアスパルター
ゼ生産菌としてエシェリヒア・コリを用い、該菌体の培
養終了後、該菌内をフマール酸を含む水溶液に３７℃に
て数１０時間浸漬することにより約１０倍、アスパルタ
ーゼ活性を増加させ得ることが知られている。この方法
に７ おける活性の増加は、菌体の細胞膜が自己消化に
より破壊され、基質および生成物の透過効率が向上した
ため、見かけ一ヒ活性が上昇したことが明らかにされて
いる。更に、特開昭５７−１３８３８３号公報では、ア
スパルターゼ活性を有する微生物等を酸処理してフマラ
ーゼ活性のみを選択的に失活させてＬ−アスパラギン酸
の収率を高める方法を提案している。
に自然界から採取することは重要なことである。しかし
ながらこの様な菌体を入手することは極めて困難である
ので、これに代って例えば、本発明者らの提案（特開昭
５６−２６１９６号公報）した、ブレビバクテリウム属
に属する菌体にα−アミノ−ｎ−酪酸耐性を付与し、フ
マール酸及びアンモニアからＬ−アスパラギン酸を合成
する能力を高める方法、また１、 Ｃｈｉｂａｔａ ｅ
ｔ、 ａｌ、、Ａｐｐａ、 Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｔ、、
υ、８７８（１９７４） の提案しているアスパルター
ゼ生産菌としてエシェリヒア・コリを用い、該菌体の培
養終了後、該菌内をフマール酸を含む水溶液に３７℃に
て数１０時間浸漬することにより約１０倍、アスパルタ
ーゼ活性を増加させ得ることが知られている。この方法
に７ おける活性の増加は、菌体の細胞膜が自己消化に
より破壊され、基質および生成物の透過効率が向上した
ため、見かけ一ヒ活性が上昇したことが明らかにされて
いる。更に、特開昭５７−１３８３８３号公報では、ア
スパルターゼ活性を有する微生物等を酸処理してフマラ
ーゼ活性のみを選択的に失活させてＬ−アスパラギン酸
の収率を高める方法を提案している。
しかしながら、Ｌ〜アスパラギン酸を工業的に製造する
ことを目的とする場合、上述した、培養後のアスパルタ
ーゼを含む菌体の処理によりアスパルターゼ活性を高め
る等によりＬ−アスパラギン酸の収率を向上することと
は異なり、菌体の産生ずるアスパルターゼの量を増大さ
せることも重要なことである。
ことを目的とする場合、上述した、培養後のアスパルタ
ーゼを含む菌体の処理によりアスパルターゼ活性を高め
る等によりＬ−アスパラギン酸の収率を向上することと
は異なり、菌体の産生ずるアスパルターゼの量を増大さ
せることも重要なことである。
本発明者らは、上記観点から短い培養時間でかつ高収敬
でアスパルターゼを得る方法につき、ブレビバクテリウ
ム属に属する菌体の培養法を鋭意検討したところ、該菌
体をフマール酸の特定量を含有する培地で好気的に培養
すると菌体内に産生されるアスパルターゼ含量が短い培
養時間で著しく増加することを見い出し本発明を完成し
た。
でアスパルターゼを得る方法につき、ブレビバクテリウ
ム属に属する菌体の培養法を鋭意検討したところ、該菌
体をフマール酸の特定量を含有する培地で好気的に培養
すると菌体内に産生されるアスパルターゼ含量が短い培
養時間で著しく増加することを見い出し本発明を完成し
た。
即ち、本発明は、ブレビバクテリウム属にｉする菌体を
培養する方法において、該菌体をフマール酸を０．５〜
２．８％含有する培地で好気的に培養することを特徴と
するブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法を提供
するものである。
培養する方法において、該菌体をフマール酸を０．５〜
２．８％含有する培地で好気的に培養することを特徴と
するブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法を提供
するものである。
本発明において用いられるアスパルターゼを産生ずる菌
体は、ブレビバクテリウム属に属する菌体である。例え
ば、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３（ＦＥ
ＲＭ３０６８）、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ
２３３からα−アミノ−ｎ−酪酸耐性株として誘導した
菌株：ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−Ａ
Ｂ−４１本発明において使用する培地の炭素源、窒素源
及び無機塩等の培地組成は特に限定されるものでけない
。炭素源としては、例えばエタノール、ｎ−パラフィン
、糖蜜等を使用することができ、窒素源としては硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等
のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の
硝酸塩もしくはアンモニア、尿素などが適当である。無
機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カ
リウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に菌
の生育に必要であれば、ペプトン、肉エキス、ン 酵母エキス、コーグステイープリカー、カザミノ酸、各
種ビタミン等の栄養素を培地に添加して用いることもで
きる。
体は、ブレビバクテリウム属に属する菌体である。例え
ば、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３（ＦＥ
ＲＭ３０６８）、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ
２３３からα−アミノ−ｎ−酪酸耐性株として誘導した
菌株：ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−Ａ
Ｂ−４１本発明において使用する培地の炭素源、窒素源
及び無機塩等の培地組成は特に限定されるものでけない
。炭素源としては、例えばエタノール、ｎ−パラフィン
、糖蜜等を使用することができ、窒素源としては硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等
のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の
硝酸塩もしくはアンモニア、尿素などが適当である。無
機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カ
リウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に菌
の生育に必要であれば、ペプトン、肉エキス、ン 酵母エキス、コーグステイープリカー、カザミノ酸、各
種ビタミン等の栄養素を培地に添加して用いることもで
きる。
培養は通気攪拌、振とう等を行いながら好気的条件下で
行なう。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３
５℃で行なう。培養途中の）ＩＨは５〜１０、好ましく
は約７〜約８にて行なう。また、培養液のｐＩ（の調整
には、酸或いはアルカリを添加する公知の方法が用いら
れる。
行なう。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３
５℃で行なう。培養途中の）ＩＨは５〜１０、好ましく
は約７〜約８にて行なう。また、培養液のｐＩ（の調整
には、酸或いはアルカリを添加する公知の方法が用いら
れる。
本発明の方法は、上記ブレビバクテリウム属に属する菌
体を上記の培地中で培養するが、その際にフマール酸を
０．５〜２．８重量％、好ましくは１〜２．６重量％の
範囲で添加して行う必要がある。
体を上記の培地中で培養するが、その際にフマール酸を
０．５〜２．８重量％、好ましくは１〜２．６重量％の
範囲で添加して行う必要がある。
上記フマール酸の添加量がこの範囲から外れると培養物
のアスパルターゼ相対比活性の改良が小さいか殆どない
。培養開始時のエタノール濃度Ｖｉ１〜５容量％、好ま
しくは２〜３容量％が適する。
のアスパルターゼ相対比活性の改良が小さいか殆どない
。培養開始時のエタノール濃度Ｖｉ１〜５容量％、好ま
しくは２〜３容量％が適する。
培養期間は通常１５〜２４時間行われる。
本発明の方法で培養した菌体は、活性の高いアスパルタ
ーゼを高濃度に含有しているので、この菌体を含む培養
液、培養液から分離した菌体、菌体の破壊物又は磨砕物
、菌体の自己消化液及び菌体を固定化したものなどを用
いる公知手法により、フマール酸または、そのナトリウ
ム塩もしくはカルシウム塩等のフマール酸塩およびアン
モニアまたは、塩化アンモニウムもしくは炭酸アンモニ
ウム等のアンモニウム塩から効率的にＬ−アスパラギン
酸を生合成することができる。
ーゼを高濃度に含有しているので、この菌体を含む培養
液、培養液から分離した菌体、菌体の破壊物又は磨砕物
、菌体の自己消化液及び菌体を固定化したものなどを用
いる公知手法により、フマール酸または、そのナトリウ
ム塩もしくはカルシウム塩等のフマール酸塩およびアン
モニアまたは、塩化アンモニウムもしくは炭酸アンモニ
ウム等のアンモニウム塩から効率的にＬ−アスパラギン
酸を生合成することができる。
Ｌ−アスパラギン酸の製造法としては、例えばＬ−アス
パラギン酸の製造に供する酵素源として、本発明の方法
で培養した菌体、又はその固定化物しくはその固定化物
をあらかじめＬ−アスパラギン酸及びアンモニウムイオ
ンの存在下で且つｐＨのアルカリ域に於いて４０℃以上
６０℃以下に加熱処理した処理物を用いることもできる
。
パラギン酸の製造に供する酵素源として、本発明の方法
で培養した菌体、又はその固定化物しくはその固定化物
をあらかじめＬ−アスパラギン酸及びアンモニウムイオ
ンの存在下で且つｐＨのアルカリ域に於いて４０℃以上
６０℃以下に加熱処理した処理物を用いることもできる
。
フマール酸又はその塩とアンモニア又は無機アンモニウ
ム塩を用いる場合には、これら２成分のモル比は１：１
〜５０間にあるのが適当である。
ム塩を用いる場合には、これら２成分のモル比は１：１
〜５０間にあるのが適当である。
酵素反応は、０〜６０℃の温度範囲で実施することがで
きるが、アスパルターゼの安定性を考慮して２０〜５０
℃で実施するのが好ましい。
きるが、アスパルターゼの安定性を考慮して２０〜５０
℃で実施するのが好ましい。
実施例−１
第１表に示した培地５０１を５００ゴ容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、エタ
ノール２容量％を添加後、アスパルターゼ生産菌である
ブレビバクテリウム・７ラバム ＭＪ２３３−ＡＢ−４
１（ＦＥＲＭ３８１２）を植菌し、３０℃にて２４時間
培養を行なった。
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、エタ
ノール２容量％を添加後、アスパルターゼ生産菌である
ブレビバクテリウム・７ラバム ＭＪ２３３−ＡＢ−４
１（ＦＥＲＭ３８１２）を植菌し、３０℃にて２４時間
培養を行なった。
この培養液２０ｍ／を、２ｔのジャーファーメンクー中
の第２表に示す組成の培地１ｔに接種し、３３℃、ｐＨ
７，６（２８％アンモニア水で調整）にて、通気量１ｗ
ｍ、攪拌回転数８００ ｒｐｍにて２０時間培養を行っ
た。この際、添加するフマール酸の濃度を第４表に示し
た通り０〜２．５重量％と変化させた。すべての実験に
おいて培地中のエタノール濃度は１〜１．５容量％に保
たれるようにエタノールを断続的に添加した。
の第２表に示す組成の培地１ｔに接種し、３３℃、ｐＨ
７，６（２８％アンモニア水で調整）にて、通気量１ｗ
ｍ、攪拌回転数８００ ｒｐｍにて２０時間培養を行っ
た。この際、添加するフマール酸の濃度を第４表に示し
た通り０〜２．５重量％と変化させた。すべての実験に
おいて培地中のエタノール濃度は１〜１．５容量％に保
たれるようにエタノールを断続的に添加した。
培養終了後、培養液を遠止分離（４０００ｒｐｍ、１５
分間）したのち集菌体を蒸留水に懸濁し、ＯＤ、（光学
密度、波長５１０．での吸光度）値５０の菌体懸濁液を
調整し、該菌体ｌ！！濁液を供試液とした。
分間）したのち集菌体を蒸留水に懸濁し、ＯＤ、（光学
密度、波長５１０．での吸光度）値５０の菌体懸濁液を
調整し、該菌体ｌ！！濁液を供試液とした。
アスパルターゼ活性の測定は、第３表に示した反応液の
１．Ｏｄを４６℃にて１時間反応を行った後、該反応終
了液を遠心分離（４００Ｏｒｐｍ、１５分間）後、その
上澄夜中のアスパラギン酸生成量をロイコノストックメ
センテロイデス ＡＴＣＣ８０４２による微生物定敬法
によりめることにより行ない、アスパルターゼ活性は、
フマール酸無添加で培養した菌体の酵素活性を１００と
する相対比活性をもって表示した。
１．Ｏｄを４６℃にて１時間反応を行った後、該反応終
了液を遠心分離（４００Ｏｒｐｍ、１５分間）後、その
上澄夜中のアスパラギン酸生成量をロイコノストックメ
センテロイデス ＡＴＣＣ８０４２による微生物定敬法
によりめることにより行ない、アスパルターゼ活性は、
フマール酸無添加で培養した菌体の酵素活性を１００と
する相対比活性をもって表示した。
得られた結果を第４表に示した。
第１表
尿素 ４７
（ＮＩ（４）２ＳＯ４１４ｒ
Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｙ
ＫＨ２ＰＯ４０，５＃
Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ２００，５１
酵母エキス １ ′
カザミノ酸 ＩＩ
ビオチン ２００ μｆ
塩酸チアミン １００ ｌ
ＦｅＳＯ４４Ｈｚ０ ６ Ｗ
ＭｎＳ０４４〜６Ｈ２０６＃
蒸留水 １０００ ｍ
第２表
（ＮＨ４ｈｓｏ４２３ ｆ
ＫＨ２ＰＯ４０，５＃
に２ＨＰＯ４０，５９
ＭｇＳ０４４ＨｚＯＯ，ｓ ｙ
酵母エキス ３ 〃
カザミノ酸 ３ 〃
ビオチン ２００ μ２
塩酸チアミン １００ ＃
］１ｉ’ｅＳＯ４Ｈ７Ｈ２０２０”９
ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２０２０ｚ
蒸留水 １０００ ａｔ
窮３表
フマール酸 ５００ μｒｎｏｔｅ
ＭｇＳＯ４−７ＨｚＯ工ｏ ｓ
Ｔｗｅｅｎ ２０＊１ ｐｌ
供試液 ０．１ ｍｌ
全 量 １ｄ（２８％アンモニＬ水
にてｐＨ９，４に調整）
〔＊印：和光純薬■製非イオン系界面活性剤、商品名〕
第４表
参考例−１
第２表の培地組成にさらにフマール酸を２０ｆ／を添加
した培地を用い実施例−１と同様の培養を行なった。こ
の培養液の６００１を遠止分離（６０００ｒｐｍ、１５
分間）によシ集菌した後、該集菌体を２ｔのジャーファ
ーメンタ−中の第５表に示す組成の溶液１ｔに添加し、
４６℃にて５時間攪拌しながらフマラーゼの失活処理を
行った。
した培地を用い実施例−１と同様の培養を行なった。こ
の培養液の６００１を遠止分離（６０００ｒｐｍ、１５
分間）によシ集菌した後、該集菌体を２ｔのジャーファ
ーメンタ−中の第５表に示す組成の溶液１ｔに添加し、
４６℃にて５時間攪拌しながらフマラーゼの失活処理を
行った。
（以下処理菌体と記す）
この後、遠心分離（６０００ｒｐｒｒ＋、１５分間）に
て集菌し、該集菌体を第６表に示した反応液にて二度洗
浄後、２１のジャーファーメンタ−中の第５表に示した
反応液１ｔに添加し、４６℃にて１０時間攪拌しながら
反応を行った。
て集菌し、該集菌体を第６表に示した反応液にて二度洗
浄後、２１のジャーファーメンタ−中の第５表に示した
反応液１ｔに添加し、４６℃にて１０時間攪拌しながら
反応を行った。
反′応終了後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１５分間）
により菌体を除いた反応残液中のリンゴ酸濃度及びアス
パラギン酸濃度を測定した。リンゴ酸量は液体クロマト
グラフィーにより測定し、アスパラギン酸量はロイコノ
ストック・メセンテロイデスＰ−６θ ＡＴＣＣ８０４
２による微生物定量法によ請求めた。
により菌体を除いた反応残液中のリンゴ酸濃度及びアス
パラギン酸濃度を測定した。リンゴ酸量は液体クロマト
グラフィーにより測定し、アスパラギン酸量はロイコノ
ストック・メセンテロイデスＰ−６θ ＡＴＣＣ８０４
２による微生物定量法によ請求めた。
結果は第７表に、フマラーゼの失活処理を行なわない（
未処理菌体と記す）菌体での反応結果と共に示した。
未処理菌体と記す）菌体での反応結果と共に示した。
（以下余白）
第５表
アスパラギン酸 ７５０ ｍＭ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１０ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１ 容量％
ＮＨ３２Ｍ
第６表
フマール酸 ８ａｏ ｍＭ
ＭｇＳＯ４゛７Ｈｚ０ １０ ｍＭ
’ｌ’ｗｅｅｎ ２０ ０．１容量％
Ｎ）ｈ ４ Ｍ
第７表
Claims (1)
- （１） ブレビバクテリウム属に属する菌体を培養する
方法において、該菌体をフマール酸を０．５〜２．８％
含有する培地で好気的に培養することを特徴とするブレ
ビバクテリウム属に属する菌体の培養法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22807283A JPS60120983A (ja) | 1983-12-02 | 1983-12-02 | ブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22807283A JPS60120983A (ja) | 1983-12-02 | 1983-12-02 | ブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60120983A true JPS60120983A (ja) | 1985-06-28 |
| JPH0468906B2 JPH0468906B2 (ja) | 1992-11-04 |
Family
ID=16870751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22807283A Granted JPS60120983A (ja) | 1983-12-02 | 1983-12-02 | ブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60120983A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01165984U (ja) * | 1988-05-11 | 1989-11-21 | ||
| EP0683231A1 (en) | 1994-05-20 | 1995-11-22 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Process for production of L-aspartic acid |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5626196A (en) * | 1979-08-10 | 1981-03-13 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | Preparation of l-aspartic acid |
-
1983
- 1983-12-02 JP JP22807283A patent/JPS60120983A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5626196A (en) * | 1979-08-10 | 1981-03-13 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | Preparation of l-aspartic acid |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01165984U (ja) * | 1988-05-11 | 1989-11-21 | ||
| EP0683231A1 (en) | 1994-05-20 | 1995-11-22 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Process for production of L-aspartic acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0468906B2 (ja) | 1992-11-04 |
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