JPH02207794A - フマラーゼ活性の除去方法 - Google Patents
フマラーゼ活性の除去方法Info
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- JPH02207794A JPH02207794A JP2704489A JP2704489A JPH02207794A JP H02207794 A JPH02207794 A JP H02207794A JP 2704489 A JP2704489 A JP 2704489A JP 2704489 A JP2704489 A JP 2704489A JP H02207794 A JPH02207794 A JP H02207794A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
簾栗上ｑ科尻公国
本発明は、微生物菌体又はその処理物内のフマラーゼ活
性を効果的に除去する方法に関するものである。
性を効果的に除去する方法に関するものである。
理法ｏ１釘ト［Ｗ彫
り一アラニンの工業的製法としては、主にＬ−アスパラ
ギン酸の酵素的脱炭酸により製造する方法（特公昭５３
−２７７９２号公報参照）、あるいはフマル酸とアンモ
ニアからアスパルターゼ及びアスパラギン酸脱炭酸酵素
を作用させて製造する方法（特開昭５６−３５９９１号
公報参照）等が提案されている。しかしながら、前者の
方法では、原料となるＬ−アスパラギン酸が比較的高価
なためアラニンの製造費が高くつき、経済的な製造方法
とは言えない。後者の方法では、該両酵素が働く反応液
のｐＨが大きく異なるため、反応槽を分離することが必
要となる。また、反応液のｐｎが中性域では該両酵素を
同時に作用させることができるが、その場合、微生物菌
体又はその処理物を該両酵素源として用いるに当たって
は、共存するし一アラニンをラセミ化する酵素をあらか
じめ失効させる処理が必要である（特開昭５７−１３２
８８２号公報、特開昭６２−８７０８８号公報参照）。
ギン酸の酵素的脱炭酸により製造する方法（特公昭５３
−２７７９２号公報参照）、あるいはフマル酸とアンモ
ニアからアスパルターゼ及びアスパラギン酸脱炭酸酵素
を作用させて製造する方法（特開昭５６−３５９９１号
公報参照）等が提案されている。しかしながら、前者の
方法では、原料となるＬ−アスパラギン酸が比較的高価
なためアラニンの製造費が高くつき、経済的な製造方法
とは言えない。後者の方法では、該両酵素が働く反応液
のｐＨが大きく異なるため、反応槽を分離することが必
要となる。また、反応液のｐｎが中性域では該両酵素を
同時に作用させることができるが、その場合、微生物菌
体又はその処理物を該両酵素源として用いるに当たって
は、共存するし一アラニンをラセミ化する酵素をあらか
じめ失効させる処理が必要である（特開昭５７−１３２
８８２号公報、特開昭６２−８７０８８号公報参照）。
このように、Ｌ−アラニンの工業的製法に関しては諸種
の問題が残されていた。
の問題が残されていた。
本発明者らは先に、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ）属に属する微生物又はその処理物
とシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）属に属
する微生物又はその処理物との存在下に、フマル酸又は
その塩とアンモニア又はアンモニウム塩とを酵素反応さ
せて、反応液中にＬ−アラニンを効率良く製造する方法
を提案した（特願昭６３−２３２５７０号明細書参照）
。
ａｃｔｅｒｉｕｍ ）属に属する微生物又はその処理物
とシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）属に属
する微生物又はその処理物との存在下に、フマル酸又は
その塩とアンモニア又はアンモニウム塩とを酵素反応さ
せて、反応液中にＬ−アラニンを効率良く製造する方法
を提案した（特願昭６３−２３２５７０号明細書参照）
。
本発明者らは、さらに効率良くＬ−アラニンを製造する
ことを目的として反応条件等を検討したところ、シュー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）属細菌内に共存
するフマラーゼの作用によって、原料であるフマル酸の
一部がＬ−リンゴ酸に変換され、結果的にＬ−アラニン
の収率が低下することが明らかになった。それ由、本発
明者らはかかる問題点を解決すべく鋭意検討したところ
、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）属微生
物の菌体又はその処理物、すなわち菌体の破壊物又はこ
れらの固定化物、をピリドキサールリン酸を含有する中
性水性溶媒中で加熱処理することにより、Ｌ−アスパラ
ギン酸からＬ−アラニンへの反応を触媒するアスパラギ
ン酸β−脱炭酸酵素活性を低下させることなく、フマラ
ーゼ活性をほぼ完全に除去することを見い出し本発明を
完成するに到った。
ことを目的として反応条件等を検討したところ、シュー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）属細菌内に共存
するフマラーゼの作用によって、原料であるフマル酸の
一部がＬ−リンゴ酸に変換され、結果的にＬ−アラニン
の収率が低下することが明らかになった。それ由、本発
明者らはかかる問題点を解決すべく鋭意検討したところ
、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）属微生
物の菌体又はその処理物、すなわち菌体の破壊物又はこ
れらの固定化物、をピリドキサールリン酸を含有する中
性水性溶媒中で加熱処理することにより、Ｌ−アスパラ
ギン酸からＬ−アラニンへの反応を触媒するアスパラギ
ン酸β−脱炭酸酵素活性を低下させることなく、フマラ
ーゼ活性をほぼ完全に除去することを見い出し本発明を
完成するに到った。
■の簿 及び効果
本発明は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）属に属するＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を
有する微生物又はその処理物を、ピリドキサールリン酸
を含有する中性領域の水性溶媒中で、４０℃を越え６０
℃以内の温度で加熱処理することを特徴とするフマラー
ゼ活性の除去方法を提供するものである。
）属に属するＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を
有する微生物又はその処理物を、ピリドキサールリン酸
を含有する中性領域の水性溶媒中で、４０℃を越え６０
℃以内の温度で加熱処理することを特徴とするフマラー
ゼ活性の除去方法を提供するものである。
本発明の方法は、フマル酸を原料基質として、微生物又
はその処理物による酵素反応によってＬ−アラニンを製
造する方法に応用可能である。これにより、共存するフ
マラーゼの作用によって原料であるフマル酸の一部がＬ
−リンゴ酸に変換されることなく、すなわち原料の損失
をきたすことなく、効率良くＬ−アラニンを製造するこ
とが可能となる。
はその処理物による酵素反応によってＬ−アラニンを製
造する方法に応用可能である。これにより、共存するフ
マラーゼの作用によって原料であるフマル酸の一部がＬ
−リンゴ酸に変換されることなく、すなわち原料の損失
をきたすことなく、効率良くＬ−アラニンを製造するこ
とが可能となる。
Ｈの貝 なＵ
本発明に使用する微生物としては、Ｌ−アスパラギン酸
β−脱炭酸酵素を含有する微生物であれば特に限定され
るものではないが、例えばシュードモナス・ダクネー（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ ）ＩＡＭ
１１５２ （１，Ｃｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ、Ａｐ
ｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。
β−脱炭酸酵素を含有する微生物であれば特に限定され
るものではないが、例えばシュードモナス・ダクネー（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ ）ＩＡＭ
１１５２ （１，Ｃｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ、Ａｐ
ｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。
１３、９３５ （１９６５））等が挙げられる。
本発明に用いられる上記微生物菌体は、菌体のまま用い
ることも出来るし、その処理物すなわち菌体の破壊物あ
るいは固定化物としても使用することが出来る。固定化
手法としては、公知の例えばり、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏｇｙ＋ １
９＋ ９３５ （１９７０） に記載の方法が利用で
き、具体的には菌体をアクリルアミド等の重合性モノマ
ーを用いたり、アルギン酸塩あるいはカラギーナン等の
適当な担体に不溶化させる等がある。
ることも出来るし、その処理物すなわち菌体の破壊物あ
るいは固定化物としても使用することが出来る。固定化
手法としては、公知の例えばり、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏｇｙ＋ １
９＋ ９３５ （１９７０） に記載の方法が利用で
き、具体的には菌体をアクリルアミド等の重合性モノマ
ーを用いたり、アルギン酸塩あるいはカラギーナン等の
適当な担体に不溶化させる等がある。
本発明の方法に使用される上記の微生物菌体の調製に使
用する培地は、特に限定されるものではなく一般の微生
物に使用されるものでよい。
用する培地は、特に限定されるものではなく一般の微生
物に使用されるものでよい。
Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物菌
体の調製に使用する培地の炭素源は、特に限定されるも
のではなく、例えばフマル酸、コハク酸、アスパラギン
酸等が使用できるが、その中でもフマル酸が好適に使用
される。培地の窒素源としては、アンモニア、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素
等の無機塩を用いることが出来るし、また、ペプトン、
酵母エキス、コンスティープリカー、カザミノ酸等の有
機栄養源も使用することが出来る。無機塩としては、リ
ン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグ
ネシウム等が用いられる。
体の調製に使用する培地の炭素源は、特に限定されるも
のではなく、例えばフマル酸、コハク酸、アスパラギン
酸等が使用できるが、その中でもフマル酸が好適に使用
される。培地の窒素源としては、アンモニア、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素
等の無機塩を用いることが出来るし、また、ペプトン、
酵母エキス、コンスティープリカー、カザミノ酸等の有
機栄養源も使用することが出来る。無機塩としては、リ
ン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグ
ネシウム等が用いられる。
培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３２℃で行う
。培養途中のｐｉｔは５〜１０、好ましくは７〜８付近
にて行い、培養中のｐＨの調整には、酸又はアルカリを
添加して行う。培養開始時の培地中の炭素源の濃度は０
．０５〜１０重量％が用いられ、具体例としてフマル酸
を使用する場合、フマル酸濃度は、好ましくは０．１〜
５重量％、更に好ましくは０．５〜２重量％が適する。
度は２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３２℃で行う
。培養途中のｐｉｔは５〜１０、好ましくは７〜８付近
にて行い、培養中のｐＨの調整には、酸又はアルカリを
添加して行う。培養開始時の培地中の炭素源の濃度は０
．０５〜１０重量％が用いられ、具体例としてフマル酸
を使用する場合、フマル酸濃度は、好ましくは０．１〜
５重量％、更に好ましくは０．５〜２重量％が適する。
培養期間は１０時間〜４日間、最適期間は１〜３日間で
ある。
ある。
このようにして得られた培養物から各々菌体を集めて、
水又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明のフマラーゼ活性
の除去方法を実施する。
水又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明のフマラーゼ活性
の除去方法を実施する。
本発明の方法においては、上記で調整された微生物菌体
又はその処理物を、ピリドキサールリン酸を含有する水
又はリン酸緩衝液等の中性溶媒中に懸濁後、加熱処理を
実施することによりフマラーゼ活性を除去することがで
きる。
又はその処理物を、ピリドキサールリン酸を含有する水
又はリン酸緩衝液等の中性溶媒中に懸濁後、加熱処理を
実施することによりフマラーゼ活性を除去することがで
きる。
該水性溶媒中にはピリドキサールリン酸を含有するが、
その濃度は０．０００１〜０．５重量％、好ましくは０
．０００５〜０．１重量％さらに好ましくは０．００１
〜０．０５重量％である。水性溶媒のｐＦＩは６．５〜
７．５の中性領域が好適に用いられる。加熱処理温度は
４０℃を越え６０℃以内、とりわけ４５〜５０℃で実施
するのが好ましい、加熱処理時間は、処理温度により異
るが、微生物が遊離菌体の場合通常１０分間〜２４時間
、好ましくは３０分間〜１０時間、菌体の破壊物の場合
は５分間〜１２時間、好ましくは２０分間〜５時間、ま
た固定化菌体の場合は３０分間〜４８時間、好ましくは
６０分間〜２４時間が適する。水性溶媒中の菌体又はそ
の処理物の濃度は特に制限されるものではないが通常０
．１〜５０重量％が用いられる。
その濃度は０．０００１〜０．５重量％、好ましくは０
．０００５〜０．１重量％さらに好ましくは０．００１
〜０．０５重量％である。水性溶媒のｐＦＩは６．５〜
７．５の中性領域が好適に用いられる。加熱処理温度は
４０℃を越え６０℃以内、とりわけ４５〜５０℃で実施
するのが好ましい、加熱処理時間は、処理温度により異
るが、微生物が遊離菌体の場合通常１０分間〜２４時間
、好ましくは３０分間〜１０時間、菌体の破壊物の場合
は５分間〜１２時間、好ましくは２０分間〜５時間、ま
た固定化菌体の場合は３０分間〜４８時間、好ましくは
６０分間〜２４時間が適する。水性溶媒中の菌体又はそ
の処理物の濃度は特に制限されるものではないが通常０
．１〜５０重量％が用いられる。
以下に実施例を挙げてさらに具体的に説明する。
大施開
（１） 微生物の調整
培地（フマル酸ナトリウム０．５％、フマル酸アンモニ
ウム１．０％、酵母エキス０．５％、リン酸１カリウム
０．０５％、Ｍｇ５Ｏ，・ＩＨｔｏ ０．０５％含有
、ｐＨ７，０） １００ ｍｆを５００ｓ＋ｊ！容三
角フラスコに分注、滅菌した後シュードモナス、ダクネ
ー（Ｐｓｅｕｄ６ｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ ）
ＩＡＭ １１５２を植菌し、３０℃にて１日間振盪培養
を行った（前培養）。
ウム１．０％、酵母エキス０．５％、リン酸１カリウム
０．０５％、Ｍｇ５Ｏ，・ＩＨｔｏ ０．０５％含有
、ｐＨ７，０） １００ ｍｆを５００ｓ＋ｊ！容三
角フラスコに分注、滅菌した後シュードモナス、ダクネ
ー（Ｐｓｅｕｄ６ｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ ）
ＩＡＭ １１５２を植菌し、３０℃にて１日間振盪培養
を行った（前培養）。
次に、上記培地と同様の培地１１を２ｔ容通気撹拌槽に
仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、前培養物の２
０ｍβを添加して、回転数１００゜ｒｐｍ ％通気量１
ｖｖｌｌｌ、温度３０℃、ｐＨ７，３にて１日間培養を
行った。
仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、前培養物の２
０ｍβを添加して、回転数１００゜ｒｐｍ ％通気量１
ｖｖｌｌｌ、温度３０℃、ｐＨ７，３にて１日間培養を
行った。
培養終了後、培養物１００ａ＋１！から遠心分離して集
菌後、該菌体をフマラーゼ活性の除去処理に用いた。
菌後、該菌体をフマラーゼ活性の除去処理に用いた。
（２）実験方法
上記で得られた菌体を、ピリドキサールリン酸１０■／
ｌを含有するｐＨ７，５の１０ｍＭリン酸緩衝液１０ｎ
＋１！に加え、各種の条件で加熱処理を行った。加熱処
理菌体を遠心分離により集菌し、該菌体のフマラーゼ活
性及びＬ−アスパラギン酸β脱炭酸酵素活性を下記の方
法で測定した。
ｌを含有するｐＨ７，５の１０ｍＭリン酸緩衝液１０ｎ
＋１！に加え、各種の条件で加熱処理を行った。加熱処
理菌体を遠心分離により集菌し、該菌体のフマラーゼ活
性及びＬ−アスパラギン酸β脱炭酸酵素活性を下記の方
法で測定した。
フマラーゼ活性は、前記の加熱処理菌体を反応液（フマ
ル酸８３０ｍＭ 、 ＣａＣ１ｔ ・２Ｈｚ０ ７
．５１、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
０．１容量％及びアンモニア２Ｍ含有、ｐＨ７，５）２
０ｍｊ！に懸濁し、３０℃にて２時間振盪した後の生成
リンゴ酸量を高速液体クロマトグラフィーにて測定する
ことによって求めた。
ル酸８３０ｍＭ 、 ＣａＣ１ｔ ・２Ｈｚ０ ７
．５１、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
０．１容量％及びアンモニア２Ｍ含有、ｐＨ７，５）２
０ｍｊ！に懸濁し、３０℃にて２時間振盪した後の生成
リンゴ酸量を高速液体クロマトグラフィーにて測定する
ことによって求めた。
Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性は、同様に前記
の加熱処理菌体を反応液（アスパラギン酸１５００ｍＭ
、ピリドキサールリン酸０．０４ｍＭ、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレートＯ０■容量％及びアンモ
ニア０．４Ｍ含有、ｐＨ４，７）２０１１１１に懸濁し
、３０℃にて１時間振盪した後の生成アラニン量を、ペ
ーパークロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフ
ィーにて測定することによって求めた。
の加熱処理菌体を反応液（アスパラギン酸１５００ｍＭ
、ピリドキサールリン酸０．０４ｍＭ、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレートＯ０■容量％及びアンモ
ニア０．４Ｍ含有、ｐＨ４，７）２０１１１１に懸濁し
、３０℃にて１時間振盪した後の生成アラニン量を、ペ
ーパークロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフ
ィーにて測定することによって求めた。
なお、各酵素活性値は、加熱処理しない菌体の活性を１
００とする相対活性をもって表示した。
００とする相対活性をもって表示した。
（３）結果
結果は下表に示す通りであり、本発明の方法により、Ｌ
−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を失効することな
くフマラーゼ活性を除去できることが認められた。
−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を失効することな
くフマラーゼ活性を除去できることが認められた。
表
Claims (1)
- シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属するＬ
−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生物又
はその処理物を、ピリドキサールリン酸を含有するｐＨ
６．５〜７．５の水性溶媒中で、４０℃を越え６０℃以
内の温度で加熱処理することを特徴とするフマラーゼ活
性の除去方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2704489A JPH02207794A (ja) | 1989-02-06 | 1989-02-06 | フマラーゼ活性の除去方法 |
| DE69010526T DE69010526T2 (de) | 1989-02-06 | 1990-02-06 | Verfahren zur Herstellung von L-Alanin. |
| EP90102312A EP0386476B1 (en) | 1989-02-06 | 1990-02-06 | Process for producing L-alanine |
| US07/790,063 US5116743A (en) | 1989-02-06 | 1991-11-12 | L-alanine production with two microorganisms having fumarase inactivity in a single reaction tank |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2704489A JPH02207794A (ja) | 1989-02-06 | 1989-02-06 | フマラーゼ活性の除去方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02207794A true JPH02207794A (ja) | 1990-08-17 |
Family
ID=12210073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2704489A Pending JPH02207794A (ja) | 1989-02-06 | 1989-02-06 | フマラーゼ活性の除去方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02207794A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5149651A (en) * | 1990-04-27 | 1992-09-22 | Mitsubishi Petrochemical. Co., Ltd. | Process for culturing microorganisms of the genus pseudomonas and process for producing l-alanine using said microorganisms |
| CN103411967A (zh) * | 2013-08-20 | 2013-11-27 | 安徽华恒生物工程有限公司 | L-天冬氨酸-β-脱羧酶活性的检测板及其制作方法 |
-
1989
- 1989-02-06 JP JP2704489A patent/JPH02207794A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5149651A (en) * | 1990-04-27 | 1992-09-22 | Mitsubishi Petrochemical. Co., Ltd. | Process for culturing microorganisms of the genus pseudomonas and process for producing l-alanine using said microorganisms |
| CN103411967A (zh) * | 2013-08-20 | 2013-11-27 | 安徽华恒生物工程有限公司 | L-天冬氨酸-β-脱羧酶活性的检测板及其制作方法 |
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