JPH03266994A - Ｌ‐チロシンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、β−チロシナーゼ含有菌体又はその処理物の
存在下、フェノールとＬ−もしくはＤ　Ｌ−セリン、あ
るいはフェノールとピルビン酸もしくはその塩とアンモ
ニアもしくはその塩からＬ−チロシンを生成させる酵素
反応に際し、セリン又はピルビン酸からＬ−チロシン以
外の物質が生成するために分解されるのを抑制してＬ−
チロシンを効率よく製造する方法に関する。

（従来の技術） Ｌ−チロシンは、甲状腺機能亢進剤等の合成原料として
重要なアミノ酸であり、より安価な製造法の確立が期待
されている。

従来、Ｌ−チロシンは、大豆タンパク質の加水分解物か
らの抽出法や発酵法により製造されてきたが、積装コス
トが高いことや廃液の廃棄方法等に問題があり、近年、
β−チロシナーゼを使用したＬ−チロシンの製造法が注
目されてきた。

β−チロシナーゼ（チロシンフェノールリアゼ）は、フ
ェノールとＬ−セリンあるいはフェノールとピルビン酸
もしくはその塩とアンモニアもしくはアンモニウム塩か
らＬ−チロシンを生成する反応を触媒する既知の脱離酵
素である（酵素ハン１へブック、初版　６７８ページ、
朝倉書店刊参照）。

該反応においては、β−チロシナーゼ含有菌体もしくは
その処理物中にはβ−チロシナーゼ以外の伯の酵素も含
まれているため、セリン及びピルビン酸がＬ−チロシン
の生成に供せられる以外に、Ｌ−チロシン以外の化合物
の生成にも供せられることになり、目的とするＬ−チロ
シンの収率が低下するという問題があった。

従来し一セリンの分解活性を抑制する方法としては、ト
リプトファンシンターゼを含有するエシェリヒア・コリ
に属する菌体を４０〜６０°Ｃて加熱処理する方法（特
開昭５８−１２９９７２号公報）が知られ、またピルビ
ン酸の分解活性を抑制する方法としては、トリプトファ
ナーゼを含有する微生物又はその処理物をピリドキサー
ル−５′−リン酸の存在下加熱する方法（特開昭６３−
１３７６８９号公報）が知られているが、これらの方法
なβ−チロシナーゼ含有菌体に適用した場合には、いず
れも加熱処理を必要とするため手間がかかり、かっβ−
チロシナーゼを失活させる危険を有していた。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、β−チロシナーゼ活性を低下されることなく
、セリン又はピルビン酸の分解活性を抑制することによ
り、セリン又はピルビン酸から効率よくＬ−チロシンを
製造する方法を提供することを目的とする。

（課題を解決するだめの手段） 本発明の方法は、β−チロシナーゼ含有菌体又はその処
理物の存在下、フェノールとＬ−もしくはＤ　Ｌ−セリ
ン、あるいはフェノールとピルビン酸もしくはその塩と
アンモニアもしくはその塩からＬ−チロシンを生成させ
る酵素反応に際し、前記菌体を予め有機溶媒で前処理す
ることを特徴とするＬ−チロシンの製造方法である。

本発明に使用するβ−ヂロシナーゼ含有菌としては、エ
シェリヒア属に属するβ−ヂロシナーゼ含有菌、例えば
、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）　Ｔ　Ｄ−００１（ＦＥＲＭ−Ｐ１０８３８）が
好適に用いられる。

β−チロシナーゼ含有菌体の調製に使用される培地の炭
素源は、特に限定されるものではなく、例えばグルコー
ス、酢酸、グリセロール等が使用できる。また培地の窒
素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等の無機塩
を用いることができる。また、ペプトン、酵母エキス、
コンスティープリカー、カザミノ酸等の有機栄養源は、
炭素源及び窒素源として使用することができる。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。

培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０〜４０°Ｃ１好ましくは２８〜３２°Ｃで行う
。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは、７〜８付近
にて行い、培養中のｐｎの調整には、酸又はアルカリを
添加して行う。培養期間は１０時間〜４日間、最適期間
は１〜３日間である。このようにして得られた培養物か
ら菌体を集めて、β−チロシナーゼ含有菌体が得られる
。

このようにして調製した菌体は、アセトン、エタノール
、メタノール、インプロパツール等の有機溶媒と水溶液
の混合物中に懸濁し、０〜３０°Ｃ１好ましくは４〜２
０°Ｃの温度にて１０分間〜ｌＯ時間、好ましくは３０
分から２時間静止又はゆるやかに撹拌放置する。

水溶液は水又はリン酸緩衝液等が好適に用いられる。有
機溶媒の濃度は５〜５０％（Ｖ／Ｖｌ　、好ましくは、
１０〜３０％（Ｖ／Ｖｌが用いられる。水溶液のｐＨは
６〜１０、好ましくは７〜９である。菌体懸濁中の菌体
濃度は一般に０．０５〜４０％（Ｗ／Ｖｌ、好ましくは
Ｏｌ〜２０％ＦＷ／Ｖ）である。

上記のように前処理されたβ−チロシナーゼ含有菌体は
、菌体のまま用いることもできるが、該菌体を超音波処
理等で破砕した破砕物、又はその破砕物をさらに水等で
抽出した抽出物、又は該抽出物をさらに硫安等で処理し
て酵素成分を沈澱させた粗精製物の形で使用することも
できる。

さらに該菌体又はそれらの処理物は必要により固定化し
て用いることもできる。固定化法としては、公知の例え
ばり、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎＥｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１９．９３５　（１９７０１に記
載の方法が利用でき、具体的にはアクリルアミド等の重
合性モノマー、アルギン酸塩又はカラギーナン等の適当
な担体に菌体な固定化して不溶化させる方法等がある。

該菌体又はその処理物の存在下での酵素反応は、通常の
酵素反応と同様に、例えば０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６，０〜１００）あるいは水（ｐＨ６，０〜１００）等
の溶媒中で、約２０〜５０°Ｃ１好ましくは約３０〜４
０°Ｃの温度て通常約２〜７２時間で行われる。反応は
、撹拌効果を与えつつ行うのが好ましい。

反応液中のフェノール濃度は、特に厳密に限定されるも
のではないが、反応液中の濃度が１０％ＦＷ／Ｖ）以下
に保たれるように連続的又は断続的に培地に添加して反
応させるのが特に好ましい。

またその全添加量も特に限定されるものではないが、０
１〜１０％、好ましくは０５〜５％である。

基質のし−もしくはＤＬ−セリン又はピルビン酸もしく
はその塩とアンモニアもしくはその塩は、−ｅには各々
０１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲で使用するのが適当
である。

（発明の効果） 本発明によれば、β−チロシナーゼ含有菌又はその処理
物中のセリン又はピルビン酸の分解活性が選択的に抑制
されるので、セリン又はピルビン酸からのＬ−チロシン
の生成が効率的に進行し、Ｌ−チロシンを高収率で製造
することができる。

（実施例） 参考例１ 第１表に示した培地１００ｍ１を５００−容三角フラス
コに分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理したものに
、β−チロシナーゼ生産菌であるエシェリヒア・コリＴ
　Ｄ　−００１（ＦＥＲＭＰ−１０８３８）を植菌し、
３７°Ｃで１日振盪培養した。

第１表 ペプトン 酵母エキス Ｎ　ａ、　Ｃ４２ Ｌ−チロシン １０ｇ ５ｇ ５ｇ ５ｇ 該培養液の２０−を同様にして調製した培地１０００−
に接種し、通気撹拌培養槽を用い、３７℃にて回転数１
１００Ｏｒｐ、通気量１　ｖｖｍ、ｐＨ７，２（２８％
アンモニア水て調整）にて２０時間培養した。培養終了
液の２００−づつから遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５
分間、４℃）により集菌し、１５０ｍＭリン酸緩衡液（
ｐＨ８，０）の２０ｍｆｆにより菌体を洗浄した。

実施例１ 参考例１により得た菌体な２０°Ｃて第４表に示す有機
溶媒に懸濁し、各々１時間静置して前処理した後、遠心
分離（８０００ｒｐｍ、４°Ｃ１１５分）により菌体を
集め、５０ｍＭリン酸緩衡液（ｐＨ７，８）で１回洗浄
した。この前処理菌体のβチロシナーゼ活性及びセリン
分解活性を測定した。

β−チロシナーゼ活性は、上記前処理菌体の全量に第２
表の反応液５０−を加え、３０°Ｃて２時間反応さぜた
後のＬ−チロシンの生成量を液体クロマトグラフィー（
腸性ＬＣ−５Ａ）で測定して求めた。

セリン分解活性は、前処理菌体の全量に第３表の組成の
反応液５０−を加え、３０°Ｃて、２時間反応させた後
、残存するセリンを液体クロマトグラフィー（腸性ＬＣ
−５Ａ）で測定して求めた。

結果を第４表に示す。

第２表 第４表 フェノール Ｌ−セリン ピリドキサール ＮＨ，Ｃρ ５′−リン酸 無処理 ００ ００ アセトン Ｎａ　　２　５Ｏ３ （ｐＨ８，０） ０４　　％ 第３表 Ｌ−セリン ピリドキサール−５′−リン酸 トリス緩衝液（ｐＨ８，０） １００　　ｍＭ ０．０４ｍＭ １００　　ｍＭ ２Ｏ１５９９ エタノール　３０　　　　８　　　　９８５０　　　　
　　　１　　　　　　　９２２０　　　　　２０　　　
　　　　９８メタノール　３０　　　１３　　　　９６
５０　　　　３　　　　８７ 実施例２ 参考例１により得た菌体を、第６表に示す有機溶媒に懸
濁し、各１時間静置して前処理した菌体について、β−
チロシナーゼ活性及びピルビン酸分解活性を測定した。

β−チロシナーゼ活性は、実施例１と同様の方法で測定
して求めた。

ピルビン酸分解活性は、前処理菌体の全量に第１ ２ ５表の組成の反応液５０ｍ１’を加え、３０°Ｃで２時
間反応させた後、残存するピルビン酸を液体クロマトグ
ラフィー（島原ＬＣ−５Ａ）で測定して求めた。結果を
第６表に示す。

第５表 ピルビン酸ナトリウム　　　　　　１００　　ｍＭピリ
ドキザールー５′−リン酸　　　（１，０４ｍＭトリス
−緩衝液（ｐＨ８，０）　　　　　１００　　ｍＭＮＨ
４Ｃｊ２　　　　　　　　　　　１００　　ｍＭ上上記
試験結果から明らかなように、有機溶媒で前処理された
菌体ては、セリン又はピルビン酸分解活性が選択的に抑
制されているが、β−チロシナーゼ活性は減少していな
いことが分かる。

第６表 無処理 ００ ００ アセトン ０ ０ ８ ７ ８ ０ エタノール　３０ ０ メタノ ル　　３０ ０

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. β−チロシナーゼ含有菌体又はその処理物の存在下、フ
   ェノールとＬ−もしくはＤＬ−セリン、あるいはフェノ
   ールとピルビン酸もしくはその塩とアンモニアもしくは
   その塩からＬ−チロシンを生成させる酵素反応に際し、
   前記菌体を有機溶媒で前処理することを特徴とするＬ−
   チロシンの製造方法。