JPH03266993A - Ｌ‐チロシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、β−チロシナーゼ含有菌体の存在下、フェノ
ールとＬ−もしくはＤＬ−セリン、あるいはフェノ−′
ルとピルビン酸もしくはその塩とアンモニアもしくはそ
の塩からＬ−チロシンを生成させる酵素反応に際し、β
−チロシナーゼの安定性を向上させ、Ｌ−チロシンを製
造する方法に関する。

（従来の技術） Ｌ−チロシンは、甲状腺機能亢進剤等の合成原料として
重要なアミノ酸であり、より安価な製造法の確立が期待
されている。

従来、Ｌ−チロシンは、大豆タンパク質の加水分解物か
らの抽出法や発酵法により製造されてきたが、精製コス
トが高いことや廃液の廃棄方法等に問題があり、近年、
β−チロシナーゼを使用したＬ−チロシンの製造法が注
目されてきた。

β−チロシナーゼ（チロシンフェノールリアゼ）は、フ
ェノールとＬ−セリン、あるいはフェノールとピルビン
酸もしくはその塩とアンモニアもしくはアンモニウム塩
からＬ−チロシンを生成する反応を触媒する既知の脱離
酵素である（酵素ハンドブック、初版、６７８ページ、
朝倉書店刊参照）。

（発明が解決しようとする課題） β−チロシナーゼは比較的安定性が低く、工業的（こは
十分とはいえなかった。そこで、β−チロシナーゼを用
いてＬ−チロシンを工業的に生産するには、β−チロシ
ナーゼの安定性を向上さぜることが重要である。

（課題を解決するための手段） 本発明の方法は、β−チロシナーゼ含有菌体又はその処
理物の存在下、フェノールとＬ−もしくはＤ　Ｌ−セリ
ン、あるいはフェノールとピルビン酸もしくはその塩と
アンモニアもしくはその塩からＬ−チロシンを生成させ
る酵素反応に際し、前記菌体をピリドキザルリン酸を含
有する水溶液で前処理することを特徴とするＬ−チロシ
ンの製造方法である。

本発明の方法によれば、β−チロシナーゼの安定性が向
上し、固定化法によりＬ−チロシンを生産する場合に、
より一層長期間酵素活性が保持され、Ｌ−チロシンを有
利に製造することができる。

本発明に使用するβ−チロシナーゼ含有菌としては、エ
シェリヒア属に属するβ−チロシナゼ含有菌、例えばエ
シェリヒア・コリＴＤ００１、（ＦＥＲＭ−Ｐ１０８３
８）が好適に用いられる。

β−チロシナーゼ含有菌体の調製に使用される培地の炭
素源は、特に限定されるものではなく、例えばグルコー
ス、酢酸、グリセロール等が使用できる。また、培地の
窒素源どしては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等の無機
塩を用いることができる。また、ペプトン、酵母エキス
、コンスティープリカー、カザミノ酸等の有機栄養源は
、炭素源及び窒素源として使用することができる。無機
塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリ
ウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。

培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０〜４０°Ｃ１好ましくは２８〜３２°Ｃて行う
。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近に
て行い、培養中のｐＨの調整には、酸又はアルカリを添
加して行う。培養期間は１０時間〜４日間、最適期間は
１〜３日間である。このようにして得られた培養物から
菌体な集め、これを水又はリン酸緩衝液等の適当な緩衝
液で洗浄し、β−チロシナーゼ含有菌体が得られる。

このようにして得た菌体は、ピリドキサルリン酸を含有
する水溶液中に懸濁し、０〜４０℃、好ましくは４〜３
０°Ｃの温度にて１０分間〜１０時間、好ましくは３０
分から２時間静止保存する。水滴液は、水又はりん酸緩
衝液等が好適に用いられる。ピリドキサルリン酸の濃度
は０．０００１％〜１０％、好ましくは０．０００５％
〜０１％である。水溶液のｐＨはｐＨ６〜１０、好まし
くはｐＨ７〜９である。菌体懸濁液中の菌体濃度は一般
に００５〜４０％ｈ／Ｖ）　、好ましくは０１〜２０％
（Ｗ／Ｖｌである。

上記のように前処理されたβ−チロシナーゼ含有菌体は
、菌体のまま用いることもてきるし、その処理物すなわ
ち菌体の破砕物、さらに該菌体又はそれらの処理物は固
定化して用いることもてきる。固定化法としては公知の
例えばＬＧｏｌｄｓｔｅｊ、ｎ、　　Ｍｅｔｈｏｄ　　
ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１９　９３５（１９
７０）に記載の方法が利用でき、具体的にはアクノルア
ミド等の重合性モノマー、アルギン酸塩又はカラギーナ
ン等の適当な担体に菌体を固定化して不溶化させる方法
等がある。

該菌体又はその処理物の存在下での上記酵素反応は、通
常の酵素反応と同様に、例えば０．１．Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６，０〜１００）あるいは水（ｐＨ６，０〜１０
０）等の溶媒中で、約２０〜５０″Ｃ１好ましくは約３
０〜４０℃の温度で通常約２〜７２時間で行われる。反
応は、撹拌効果を与えつつ行うのが好ましい。

反応液中のフェノール濃度は特に厳密に限定されるもの
ではないが、反応液中の濃度が１０％（Ｗ／Ｖｌ以下に
保たれるように連続的又は断続的に培地に添加して反応
させるのが特に好ましい。またその全添加量も特に限定
されるものではないが、通常０１〜１０％、好ましくは
０５〜５％ｈｖ／ｖ）である。

基質のし−もしくはＤＬ−セリン又はビルビン酸もしく
はその塩とアンモニアもしくはその塩は、一般には各々
０１〜２０％ｆｗ／ｖ）の濃度範囲で使用するのが適当
である。

（発明の効果） 本発明によれば、ピリドキサルリン酸で前処理されたβ
−チロシナーゼ含有菌体は、β−チロシナーゼの安定性
が向」ニし、Ｌ−チロシンを著量生産させることができ
る。

（実施例） 参考例 第１表に示した培地１００−を５００ｉ容三角フラスコ
に分注し、１２０°Ｃて１５分間滅菌処理したものに、
β−チロシナーゼ生産菌であるエシェリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｔ　Ｄ　−００１
（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０８３８）を植菌し、３７°Ｃて
１日振盪培養した。

第１表 ペプトン 酵母エキス Ｎａ（１２ Ｌ−チロシン 蒸留水（ｐＨ７，２） １０ｇ ５ｇ ５ｇ ５ｇ ０００ｄ 該培養液の２０ｍ１を同様にして調製した培地１０００
ｍ＆に接種し、通気撹拌培養槽を用い、３７°Ｃにて回
転数１１００Ｏｒｐ、通気量ｌ　ｖｖｍ、ｐＨ７，２（
２８％アンモニア水で調整）にて２０時間培養した。培
養終了液の２００−づつから遠心分離（８０００ｒｐｍ
、１５分間、４°Ｃ）により集菌し、５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８，０）の２０−により菌体を洗浄した。

実施例 参考例により得た菌体全量を、各試験区のとおりピリド
キサルリン酸を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，８）　１０ｍ＃に懸濁し、４℃で４時間静置した。

この処理菌体を第２表の反応液１００−に加え、３０°
Ｃで４８時間酵素反応させた。なお、フェノール及びＬ
−セリンを、１８時間後及び３６時間後に各々０．５％
（ｗ／ｖ）　、　１％ＦＷ／Ｖ）反応液に添加した。生
成したＬ−チロシン量は、高速液体クロマトグラフィー
（島原ＬＣ５Ａ）で測定して求めた。結果を第３表に示
す。

第２表 フェノール Ｌ−セリン ピリドキサルリン酸 ＮＨ４（１２ エヂレンシアミン ４酢酸２ナトリウム Ｎａ　２　５Ｏ３ １％（ｗ／ｖ） ２％ ０．０１　％ １％ ０、２％ ４％ 第３表 無処理　　　　１００ ０．０００１．　　　　　　　１４５ ０．００１　　　　１６２ ０、０１　　　　　１６５ ０．１　　　　　　］７０ ＊ピリドキザルリン酸 上記の結果から明らかなように、ビリドキザルノン酸で
前処理された菌体からはＬ−チロシンが著量生産された
。これは酵素反応に関与したβ−チロシナーゼが安定化
されたためである。

蒸留水（ｐＨ８，０）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. β−チロシナーゼ含有菌体又はその処理物の存在下、フ
   ェノールとＬ−もしくはＤＬ−セリン、あるいはフェノ
   ールとピルビン酸もしくはその塩とアンモニアもしくは
   その塩からＬ−チロシンを生成させる酵素反応に際し、
   前記菌体をピリドキサルリン酸を含有する水溶液で前処
   理することを特徴とするＬ−チロシンの製造法。