CN114164238B - 一种l-酪氨酸的酶法合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L‑酪氨酸的酶法合成方法，属于医药领域。所述L‑酪氨酸的酶法合成方法包括以下步骤：S1：培养高酶活酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体；S2：采用固定化细胞技术制备凝胶球；S3：将制备好的凝胶球按（1‑2）：（5‑10）的比例加入到提前制备好的20 mL的反应体系，进行培养，培养结束后添加的氢氧化钠溶解L‑酪氨酸；S4：检测L‑酪氨酸的含量。本发明在L‑酪氨酸制备方法中添加海藻酸锰、明胶和吐温‑80时，能够实现固定化细胞，其中海藻酸锰、明胶复配对固定化细胞的机械强度和稳定性有一定的增强；吐温80可以增加海藻酸锰凝胶的通透性，有利于底物与目的产物的跨膜运输，提高L‑酪氨酸的产量。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种L-酪氨酸的酶法合成方法。
背景技术
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态及生化活性，生物体内的各种蛋白质由20种L型氨基酸构成，其中L-酪氨酸对人和动物的生长发育和新陈代谢起着重要作用。作为生化试剂，以及对经基肉桂酸、L-多巴、对轻基苯乙烯等医药化工产品的制备原料，L-酪氨酸被广泛应用在食品、饲料、医药和化工等行业。在农业科学研究中，L-酪氨酸也被作为饲料添加剂配制人工昆虫饲料;在食品领域，L-酪氨酸是一种重要的食品添加剂;在临床上，L-酪氨酸还被用于研究生殖避孕疗效；在化妆品领域，L-酪氨酸的盐类产品如L-酪氨酸甲酯盐酸盐，可有效的缓解酪氨酸酶对酪氨酸的氧化作用，进而减少黑色素的生成;在医药领域，L-酪氨酸是合成肾上腺素、甲状腺素、酪氨酸亚硫酸盐、左旋多巴等的前体原料，左旋多巴在体内转变为多巴胺，是目前治疗帕金森病的有效药物，酪氨酸亚硫酸盐用于治疗骨髓灰质炎、早老年性精神病、结核性脑膜炎的急性期等中枢神经系统疾病。
制备L-酪氨酸方法有蛋白质水解物提取法、化学合成法、直接发酵法、酶转化法，酶转化法是通过酪氨酸酚裂解酶，催化丙酮酸或L-丝氨酸、苯酚和氨酶法合成L-酪氨酸。酶转化法避免了为保证产物的区域选择性或对映选择性而使用的复杂步骤，优点是反应条件温和，副反应少，收率较高，光学纯度高。
中国专利文献“ L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物酶法转化制备方法（专利申请号为CN201310289373.0）”公开了一种L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物酶法转化制备方法，其步骤为：（1）将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生高酶活酪氨酸酚裂解酶；（2）将酪氨酸酚裂解酶细胞或酶粗提液与含丙酮酸发酵液或含丙酮酸粗提液或丙酮酸盐粗品水溶液混合，再加入氨水、苯酚或邻苯二酚、磷酸吡哆醛和表面活性剂，在25-55℃，pH7-11条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离制备转化产物L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)。该发明利用酪氨酸酚裂解酶催化丙酮酸、氨、苯酚或邻苯二酚合成L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)，酶法转化效率高，其中苯酚摩尔转化率达到95%以上，但是仍然存在有L-酪氨酸产量待提高的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种L-酪氨酸的酶法合成方法，以解决在中国专利文献“L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物酶法转化制备方法（专利申请号为CN201310289373.0）”公开的基础上，如何优化组分、用量、工艺等，从而提高L-酪氨酸的产量的问题。
为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种L-酪氨酸的酶法合成方法，包括以下步骤：
S1：将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生含高酶活酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体；
S2：以海藻酸锰与明胶作为复合载体，以CaCl2作为成型剂，取培养16h后的重组大肠E. coil BL21培养液离心收集菌体，然后添加9%的生理盐水制备成10%的菌液，菌液与海藻酸锰与明胶的混合液体按照（0.8-1）:1的体积比进行混匀，将混匀好的菌悬液通过电子蠕动泵滴入到CaCl2溶液中形成凝胶球，将凝胶球于2-4℃中静置，然后过滤，收集凝胶球以备用；
S3：将收集好的具体细胞经步骤S2固定化后，将制备好的凝胶球按（1-2）：（5-10）的比例加入到提前制备好的20 mL的反应体系，用氨水调节反应液pH为8.0-8.5，放置于温度为20-25℃，转速为200-250r/ min摇床中继续培养8-16h，然后培养结束后添加10 mol/L的氢氧化钠溶解L-酪氨酸；
S4：采用高效液相色谱检测L-酪氨酸的含量。
优选地，所述海藻酸锰与明胶的用量比为（0.8-1.2）:（0.5-1）。
优选地，所述海藻酸锰的浓度为0.3-0.5%，明胶的浓度为0.5-0.7%。
优选地，所述海藻酸锰中添加有浓度为0.6%的碳酸钙，海藻酸锰与碳酸钙的用量比为50:1。
优选地，所述步骤S2中菌液与海藻酸锰和明胶的混合液体按照0.9:1的体积比进行混匀。
优选地，所述步骤S2中凝胶球于3℃中静置4-5h。
优选地，所述步骤S3中反应体系包含0.6-0.65 mol/L的氯化按、0.07-0.1 mol/L苯酚、0.08-0.1 mol/L的丙酮酸钠、0.14-0.16μmol/L的磷酸吡哆醛。
优选地，所述步骤S3中反应体系包含0.63 mol/L的氯化铵、0.08mol/L苯酚、0.09mol/L的丙酮酸钠、0.15μmol/L的磷酸吡哆醛。
优选地，所述步骤S3中反应体系还包括表面活性剂。
优选地，所述表面活性剂为质量分数为0.1-0.15%的吐温-80。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明在L-酪氨酸的制备过程中添加海藻酸锰、明胶和吐温-80，进而实现采用固定化细胞技术，利用微生物中所含的复合酶系进行催化反应，固定化细胞保持了没的原始状态以及稳定性，使反应速度加快，协同提高了L-酪氨酸产量，这是因为：本发明利用海藻酸锰、明胶作为复合载体，氯化钙溶液的作用是使胶体聚沉，形成稳定的凝胶珠；海藻酸锰为海藻酸钙浸泡在硫酸锰液体中而得，海藻酸钙是天然凝胶，由海藻酸锰胶体溶液与氯化钙反应，即可得到海藻酸锰凝胶，海藻酸锰凝胶具有亲水性强，通透性能好，且锰离子能够提高固定化细胞的耐磷酸盐程度，即提高固定化细胞的稳定性。明胶是一种大分子的亲水胶体，是胶原部分水解后的一类蛋白质，明胶是一个具有一定分子量分布的多分散体系。海藻酸锰、明胶复配时，海藻酸根离子能够与明胶鏊合成海藻酸锰-明胶复合体，对固定化细胞的机械强度和稳定性有一定的增强，从而提高L-酪氨酸的产量。吐温80为表面活性剂，吐温80不仅可以增加海藻酸锰凝胶的通透性，有利于底物与目的产物的跨膜运输，提高L-酪氨酸的产量；还可以保护细胞免受苯酚的致毒性。
（2）背景技术所引用的专利文献“L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物酶法转化制备方法（专利申请号为CN201310289373.0）”，虽然该发明利用酪氨酸酚裂解酶催化丙酮酸、氨、苯酚或邻苯二酚合成L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)，酶法转化效率高，其中苯酚摩尔转化率达到95%以上，但是仍然存在有L-酪氨酸产量有待提高的问题，基于为了解决以上技术问题，本发明才对该发明的配方和工艺进行进一步的优化和改良，经过多次试验研究发现，当L-酪氨酸制备方法中添加海藻酸锰、明胶和吐温-80时，能够实现固定化细胞，其中海藻酸锰、明胶复配对固定化细胞的机械强度和稳定性有一定的增强；吐温80可以增加海藻酸锰凝胶的通透性，有利于底物与目的产物的跨膜运输，提高L-酪氨酸的产量；能够解决背景技术文件中出现的技术问题，产生了意想不到的效果。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，现采用以下实施例加以说明，以下实施例属于本发明的保护范围，但不限制本发明的保护范围。
以下实施例中所述的一种L-酪氨酸的酶法合成方法，包括以下步骤：
S1：将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生含高酶活酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体；
S2：以海藻酸锰与明胶作为复合载体，海藻酸锰与明胶的用量比为（0.8-1.2）:（0.5-1），海藻酸锰的浓度为0.3-0.5%，明胶的浓度为0.5-0.7%，海藻酸锰中添加有浓度为0.6%的碳酸钙，海藻酸锰与碳酸钙的用量比为50:1；以CaCl2作为成型剂，取培养16h后的酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体，然后添加9%的生理盐水制备成10%的菌液，菌液与海藻酸锰与明胶的混合液体按照（0.8-1）:1的体积比进行混匀，将混匀好的菌悬液通过电子蠕动泵滴入到CaCl2溶液中形成凝胶球，将凝胶球于2-4℃中静置4-5h，然后过滤，收集凝胶球以备用；
S3：将收集好的具体细胞经步骤S2固定化后，将制备好的凝胶球按（1-2）：（5-10）的比例加入到提前制备好的20 mL的反应体系，反应体系包含0.6-0.65 mol/L的氯化按、0.07-0.1 mol/L苯酚、0.08-0.1 mol/L的丙酮酸钠、0.14-0.16μmol/L的磷酸吡哆醛，以及质量分数为0.1-0.15%的吐温-80；用氨水调节反应液pH为8.0-8.5，放置于温度为20-25℃，转速为200-250r/ min摇床中继续培养8-16h，然后培养结束后添加10 mol/L的氢氧化钠溶解L-酪氨酸；
S4：采用高效液相色谱检测L-酪氨酸的含量。
下面通过更具体实施例加以说明。
实施例1
一种L-酪氨酸的酶法合成方法，包括以下步骤：
S1：将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生含高酶活酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体；
S2：以海藻酸锰与明胶作为复合载体，海藻酸锰与明胶的用量比为1:0.8，海藻酸锰的浓度为0.4%，明胶的浓度为0.6%，海藻酸锰中添加有浓度为0.6%的碳酸钙，海藻酸锰与碳酸钙的用量比为50:1；以CaCl2作为成型剂，取培养16h后的酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体，然后添加9%的生理盐水制备成10%的菌液，菌液与海藻酸锰与明胶的混合液体按照1:1的体积比进行混匀，将混匀好的菌悬液通过电子蠕动泵滴入到CaCl2溶液中形成凝胶球，将凝胶球于4℃中静置5h，然后过滤，收集凝胶球以备用；
S3：将收集好的具体细胞经步骤S2固定化后，将制备好的凝胶球按1.5：8的比例加入到提前制备好的20 mL的反应体系，反应体系包含0.63 mol/L的氯化铵、0.08mol/L苯酚、0.09 mol/L的丙酮酸钠、0.15μmol/L的磷酸吡哆醛，以及质量分数为0.12%的吐温-80；用氨水调节反应液pH为8.3，放置于温度为22℃，转速为220r/ min摇床中继续培养12h，然后培养结束后添加10 mol/L的氢氧化钠溶解L-酪氨酸；
S4：采用高效液相色谱检测L-酪氨酸的含量。
实施例2
一种L-酪氨酸的酶法合成方法，包括以下步骤：
S1：将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生含高酶活酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体；
S2：以海藻酸锰与明胶作为复合载体，海藻酸锰与明胶的用量比为1:0.5，海藻酸锰的浓度为0.5%，明胶的浓度为0.6%，海藻酸锰中添加有浓度为0.6%的碳酸钙，海藻酸锰与碳酸钙的用量比为50:1；以CaCl2作为成型剂，取培养16h后的酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体，然后添加9%的生理盐水制备成10%的菌液，菌液与海藻酸锰与明胶的混合液体按照0.9:1的体积比进行混匀，将混匀好的菌悬液通过电子蠕动泵滴入到CaCl2溶液中形成凝胶球，将凝胶球于4℃中静置4h，然后过滤，收集凝胶球以备用；
S3：将收集好的具体细胞经步骤S2固定化后，将制备好的凝胶球按1：5的比例加入到提前制备好的20 mL的反应体系，反应体系包含0.65 mol/L的氯化按、0.09mol/L苯酚、0.09mol/L的丙酮酸钠、0.16μmol/L的磷酸吡哆醛，以及质量分数为质量分数为0.1%的吐温-80中的一种；用氨水调节反应液pH为8.0，放置于温度为20℃，转速为220r/ min摇床中继续培养16h，然后培养结束后添加10 mol/L的氢氧化钠溶解L-酪氨酸；
S4：采用高效液相色谱检测L-酪氨酸的含量。
实施例3
一种L-酪氨酸的酶法合成方法，包括以下步骤：
S1：将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生含高酶活酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体；
S2：以海藻酸锰与明胶作为复合载体，海藻酸锰与明胶的用量比为1.2:0.9，海藻酸锰的浓度为0.3%，明胶的浓度为0.7%，海藻酸锰中添加有浓度为0.6%的碳酸钙，海藻酸锰与碳酸钙的用量比为50:1；以CaCl2作为成型剂，取培养16h后的酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体，然后添加9%的生理盐水制备成10%的菌液，菌液与海藻酸锰与明胶的混合液体按照1:1的体积比进行混匀，将混匀好的菌悬液通过电子蠕动泵滴入到CaCl2溶液中形成凝胶球，将凝胶球于2℃中静置4h，然后过滤，收集凝胶球以备用；
S3：将收集好的具体细胞经步骤S2固定化后，将制备好的凝胶球按1.5：9的比例加入到提前制备好的20 mL的反应体系，反应体系包含0.6mol/L的氯化按、0.1 mol/L苯酚、0.1 mol/L的丙酮酸钠、0.14μmol/L的磷酸吡哆醛，以及质量分数为0.12%的吐温-80；用氨水调节反应液pH为8.0，放置于温度为22℃，转速为250r/ min摇床中继续培养8h，然后培养结束后添加10 mol/L的氢氧化钠溶解L-酪氨酸；
S4：采用高效液相色谱检测L-酪氨酸的含量。
实施例4
一种L-酪氨酸的酶法合成方法，包括以下步骤：
S1：将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生含高酶活酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体；
S2：以海藻酸锰与明胶作为复合载体，海藻酸锰与明胶的用量比为0.8:1，海藻酸锰的浓度为0.4%，明胶的浓度为0.5%，海藻酸锰中添加有浓度为0.6%的碳酸钙，海藻酸锰与碳酸钙的用量比为50:1；以CaCl2作为成型剂，取培养16h后的酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体，然后添加9%的生理盐水制备成10%的菌液，菌液与海藻酸锰与明胶的混合液体按照0.8:1的体积比进行混匀，将混匀好的菌悬液通过电子蠕动泵滴入到CaCl2溶液中形成凝胶球，将凝胶球于3℃中静置5h，然后过滤，收集凝胶球以备用；
S3：将收集好的具体细胞经步骤S2固定化后，将制备好的凝胶球按2：9的比例加入到提前制备好的20 mL的反应体系，反应体系包含0.63mol/L的氯化按、0.07 mol/L苯酚、0.08mol/L的丙酮酸钠、0.15μmol/L的磷酸吡哆醛，以及质量分数为质量分数为0.12%的吐温-80；用氨水调节反应液pH为8.5，放置于温度为25℃，转速为200r/ min摇床中继续培养14h，然后培养结束后添加10 mol/L的氢氧化钠溶解L-酪氨酸；
S4：采用高效液相色谱检测L-酪氨酸的含量。
对比例1
与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于制备L-酪氨酸的酶法合成方法中不添加海藻酸锰、明胶和吐温-80。
对比例2
与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于制备L-酪氨酸的酶法合成方法中不添加海藻酸锰。
对比例3
与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于制备L-酪氨酸的酶法合成方法中不添加明胶。
对比例4
与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于制备L-酪氨酸的酶法合成方法中不添加吐温-80。
对比例5
采用中国专利文献“L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物酶法转化制备方法（专利申请号为CN201310289373.0）”中实施例1中所述方法制备L-酪氨酸。
按照实施例1-4和对比例1-5的制备L-酪氨酸，计算所得L-酪氨酸的产量，其结果见下表。
| 组别 | L-酪氨酸产量（g/L） |
| 实施例1 | 31.6 |
| 实施例2 | 30.5 |
| 实施例3 | 29.9 |
| 实施例4 | 29.4 |
| 对比例1 | 18.5 |
| 对比例2 | 27.7 |
| 对比例3 | 27.3 |
| 对比例4 | 28.2 |
| 对比例5 | 18.3 |
由上表可知：（1）由实施例1-4和对比例5的数据可见，实施例1-4制得的L-酪氨酸的产量显著高于对比例5制得的L-酪氨酸的产量，至少高60.7%。
（2）由实施例1和对比例1-4的数据可见，在L-酪氨酸的制备过程中添加海藻酸锰、明胶和吐温-80，进而实现采用固定化细胞技术，利用微生物中所含的复合酶系进行催化反应，固定化细胞保持了没的原始状态以及稳定性，使反应速度加快，协同提高了L-酪氨酸产量，这是因为：本发明利用海藻酸锰、明胶作为复合载体，氯化钙溶液的作用是使胶体聚沉，形成稳定的凝胶珠；海藻酸锰为海藻酸钙浸泡在硫酸锰液体中而得，海藻酸钙是天然凝胶，由海藻酸锰胶体溶液与氯化钙反应，即可得到海藻酸锰凝胶，海藻酸锰凝胶具有亲水性强，通透性能好，且锰离子能够提高固定化细胞的耐磷酸盐程度，即提高固定化细胞的稳定性。明胶是一种大分子的亲水胶体，是胶原部分水解后的一类蛋白质，明胶是一个具有一定分子量分布的多分散体系。海藻酸锰、明胶复配时，海藻酸根离子能够与明胶鏊合成海藻酸锰-明胶复合体，对固定化细胞的机械强度和稳定性有一定的增强，从而提高L-酪氨酸的产量。吐温80为表面活性剂，吐温80不仅可以增加海藻酸锰凝胶的通透性，有利于底物与目的产物的跨膜运输，提高L-酪氨酸的产量；还可以保护细胞免受苯酚的致毒性。
以上内容不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
Claims (1)
1.一种L-酪氨酸的酶法合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生含高酶活酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体；
S2：以海藻酸锰与明胶作为复合载体，以CaCl2作为成型剂，取培养16h后的步骤S1中培养液离心收集菌体，然后添加9%的生理盐水制备成10%的菌液，菌液与海藻酸锰与明胶的混合液体按照1:1的体积比进行混匀，将混匀好的菌悬液通过电子蠕动泵滴入到CaCl2溶液中形成凝胶球，将凝胶球于4℃中静置5h，然后过滤，收集凝胶球以备用；
S3：将收集好的具体细胞经步骤S2固定化后，将制备好的凝胶球按1.5：8的比例加入到提前制备好的20 mL的反应体系，用氨水调节反应液pH为8.3，放置于温度为22℃，转速为220r/ min摇床中继续培养12h，然后培养结束后添加10 mol/L的氢氧化钠溶解L-酪氨酸；
S4：采用高效液相色谱检测L-酪氨酸的含量；
所述海藻酸锰与明胶的用量比为1:0.8;
所述海藻酸锰的浓度为0.4%，明胶的浓度为0.6%;
所述海藻酸锰中添加有浓度为0.6%的碳酸钙，海藻酸锰与碳酸钙的用量比为50:1;
所述步骤S3中反应体系包含0.63 mol/L的氯化铵、0.08mol/L苯酚、0.09 mol/L的丙酮酸钠、0.15μmol/L的磷酸吡哆醛;
所述步骤S3中反应体系还包括质量分数为0.12%的吐温-80。
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