CN103343149A - L-酪氨酸或l-酪氨酸衍生物酶法转化制备方法 - Google Patents
L-酪氨酸或l-酪氨酸衍生物酶法转化制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)的酶法转化制备方法。该制备方法采用含丙酮酸的料液为底物，加入具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌体细胞或粗酶液、氨水、苯酚或邻苯二酚，25～55℃、pH7～11条件下进行酶促反应，利用等电点结晶法分离制备转化产物L-酪氨酸或L-多巴。该方法以廉价的丙酮酸料液为底物酶法合成了附加值较高的L-酪氨酸或L-多巴，具有原料来源广，酶促转化效率高，操作简便，生产成本低等优点。
Description
一、技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)的酶法转化制备方法。
二、背景技术
L-酪氨酸是一种芳香族氨基酸，是动物体内合成蛋白质所需要的重要氨基酸之一。在医药领域，L-酪氨酸是合成甲状腺素、肾上腺素、L-多巴、酪氨酸亚硫酸盐等的前体原料；临床上，酪氨酸亚硫酸盐用于治疗骨髓灰质炎和结核性脑膜炎的急性期、神经分裂症等中枢神经系统疾病，L-酪氨酸甲酯盐酸盐还可用于化妆品领域。
L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)又称L-多巴是生物体内一种重要的活性物质，是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素代谢过程中的重要中间产物。L-多巴在人体内可转变为多巴胺，是治疗常见老年病——帕金森症的主要药物，随着人口老龄化速度的加快，对L-多巴的需求将迅速增加。L-多巴还可用来治疗腿多动综合症、肝昏迷、CO中毒、心力衰竭、脱毛症等；此外，L-多巴还有抗衰老的功效。L-多巴是一种在医药卫生、保健美容等方面有显著功效的氨基酸衍生物。
根据文献报道，L-酪氨酸或L-多巴的制备方法主要有提取法、化学合成法和酶转化法。
1、提取法
提取法生产L-酪氨酸是利用天然蛋白资源如人发、猪毛、羽毛、猪血粉等为原料，经过水解、提取、精制等步骤分离制得L-酪氨酸。由于蛋白原料水解液中含有多种氨基酸，其中L-酪氨酸和L-胱氨酸的等电点和溶解度相近，分离得到高纯度L-酪氨酸非常困难，而且天然蛋白资源中L-酪氨酸含量较少，因此提取法生产L-酪氨酸效率较低。
植物中存在天然L-多巴。1913年生物化学家Guggenheim从蚕豆中提取得到L-多巴，之后发现在很多植物中存在L-多巴，如猫豆、藜豆等，其中猫豆中的L-多巴含量最高达6%～9%，是提取L-多巴的最主要原料。但从植物中提取L-多巴受到原料来源的限制，产量小，不能满足市场需求。
2、化学合成法
化学合成L-酪氨酸主要是通过L-苯丙氨酸羟基化或由对羟基苯甲醛与海因缩合、碱解、转氨等步骤得到，反应步骤多，得到的产物通常为外消旋体，需经拆分才能得到具有生理活性的L-酪氨酸。目前工业化生产L-多巴多以香草醛和乙内酰脲为原料，经八步反应制得，主要通过不对称法合成，合成过程中需要大量金属催化物，成本高、产物得率低且比旋光较低。尤其是D-多巴对人体有较大毒副作用，化学不对称合成的L-多巴一般达不到药剂使用要求。
3、酶转化法
酶法转化因具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、反应周期短、产物易于分离等优点而日益受到重视，是廉价生产L-酪氨酸或L-多巴的有效方法。目前已报道三种酶可以催化L-酪氨酸或L-多巴的合成：酪氨酸酚裂解酶，酪氨酸酶和转氨酶。
3.1酪氨酸酚裂解酶
酪氨酸酚裂解酶（EC4.1.99.2）可催化丙酮酸、氨水、苯酚或邻苯二酚生成L-酪氨酸或L-多巴，该反应为可逆反应，需要磷酸吡哆醛为辅酶，反应中丙酮酸和氨也可由L-丝氨酸替代。该酶广泛存在于假单胞菌属、真菌、链霉菌等微生物中，其中草生欧文氏菌（Erwinia herbicola）、弗氏柠檬酸菌（Citrobacterfreundii）中的酪氨酸酚裂解酶活性较高。
ENEI Hitoshi，等（Agr.Biol.Chem.,37(3):493-499,1973）以DL-丝氨酸和苯酚为底物，利用Erwinia herbicola ATCC21434中酪氨酸酚裂解酶酶法合成了L-酪氨酸，100ml反应体系中得到了5.35g L-酪氨酸。
N.G.Faleev，等（Enzyme Microb Tech,1980,2(4):305-308）利用部分纯化的丝氨酸羟甲基转移酶和酪氨酸酚裂解酶以甘氨酸、甲醛和苯酚为底物酶法合成了L-酪氨酸。
Kim Do Young，等（J Microbiol Biotechn,2007,17(1):116-122）在分批补料反应器中流加苯酚、丙酮酸和氨，利用Symbiobacterium toebii来源酪氨酸酚裂解酶催化反应，转化30h生成130g/L L-酪氨酸，L-酪氨酸对苯酚的最大转化率94%。
李华钟，等（工业微生物,2002,32(2):5-9）在10g/L丙酮酸、12g/L邻苯二酚、20g/L乙酸铵、1g/L EDTA、2g/L亚硫酸钠，pH8.0反应体系中，利用重组表达的酪氨酸酚裂解酶酶法合成L-多巴，15℃反应16h，产物L-多巴达到16.5g/L。
Matoishi Kaori，等（JP2006320238）对野生菌Erwinia herbicola和Citrobacterfreundii中酪氨酸酚裂解酶点突变，再以L-丝氨酸和苯酚为底物酶法合成了L-酪氨酸，酶活较野生型菌株提高了1.1-1.5倍。
3.2酪氨酸酶
酪氨酸酶直接以酪氨酸为底物催化合成L-多巴。该酶同时具有单酚氧化酶和二酚氧化酶氧化还原作用，其中单酚氧化酶催化单酚羟基化，二酚氧化酶可将二酚类化合物氧化为醌类化合物，为了防止L-多巴被氧化可引入化学还原剂，如抗坏血酸。
Krishnaveni，等（Current Microbiology,2009,58(2):122-128）利用真菌Acremonium rutilum酪氨酸酶转化酪氨酸合成L-多巴，经条件优化后连续培养120h，最大产量为0.89g/L。
3.3转氨酶
转氨酶可将L-天冬氨酸或L-谷氨酸中的氨基转移到对羟基苯丙酮酸或3,4-二羟基苯丙酮酸上，进而生成L-酪氨酸或L-多巴。
吴敏，等（化学世界,2002,43(9):476-478）以对羟基苯甲醛、海因、氢氧化钠为原料化学合成了对羟基苯丙酮酸，再利用大肠杆菌天冬氨酸转氨酶将天冬氨酸的氨基转移至对羟基苯丙酮酸上制得L-酪氨酸，转化率75%。
Tomoshisa N.，等（Agr.Biol.Chem.,1973,37(12):2841-2847）采用粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）为生产菌株，利用L-天冬氨酸或L-谷氨酸的氨基转移到3,4-二羟基苯丙酮酸上生成L-多巴，转化率达80%，产率达4g/L。
以上酶法转化合成L-酪氨酸或L-多巴的路线中以酪氨酸酚裂解酶活性最高，最接近工业化应用，但反应底物之一丙酮酸或L-丝氨酸成本较高，目前以高纯度丙酮酸或L-丝氨酸酶法制备L-酪氨酸或L-多巴原辅料成本高，难以进行工业化生产，因此寻找来源丰富廉价的丙酮酸或L-丝氨酸工业原料是实现酪氨酸酚裂解酶酶法制备L-酪氨酸或L-多巴产业化的关键。
三、发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种高效、低成本制备L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)的方法。本发明利用含丙酮酸的料液为底物，加入具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌体细胞或粗酶液、氨水、苯酚或邻苯二酚，催化合成L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)。
本发明可以通过以下技术方案来达到：
L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)的酶法转化制备方法，其步骤为：
（1）将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生高酶活酪氨酸酚裂解酶；
（2）将酪氨酸酚裂解酶细胞或酶粗提液与含丙酮酸发酵液或含丙酮酸粗提液或丙酮酸盐粗品水溶液混合，再加入氨水、苯酚或邻苯二酚、磷酸吡哆醛和表面活性剂，在25～55℃，pH7～11条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离制备转化产物L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)。
上述步骤（1）所述的酪氨酸酚裂解酶菌株为Citrobacter freundii ATCC8090或Citrobacter koseri ATCC BAA-895或Erwinia herbicola ATCC21434。培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L。
上述步骤（2）所述的含丙酮酸发酵液中丙酮酸含量为10～150g/L，丙酮酸粗提液或丙酮酸盐粗品水溶液中丙酮酸含量为50～900g/L；酶促反应中丙酮酸与苯酚或邻苯二酚的摩尔比为1:1；磷酸吡哆醛浓度为0.05～0.5g/L；所述的表面活性剂为吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵或TritonX-100，其浓度为0.01～1.0g/L。
目前，我国L-酪氨酸和L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)生产主要来源于提取法，该方法工艺成熟，但天然资源中L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)含量较少，生产过程环保压力大，不适于大规模工业化生产，满足不了市场需求；而采用酪氨酸酚裂解酶生产L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)工艺受制于价格昂贵的丙酮酸或L-丝氨酸原料，到目前为止还难以实现工业化生产。
我国丙酮酸的生产方法主要有化学合成法和发酵法，生产过程中丙酮酸的分离精制增加了成品丙酮酸的成本，而酶法转化对底物丙酮酸的纯度要求不高，因此利用发酵法生产丙酮酸的发酵液或粗提液以及化学法合成丙酮酸盐的粗品水溶液为原料，酶法合成L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)可大大降低生产成本。本发明以含丙酮酸的料液、氨水、苯酚或邻苯二酚为底物，利用酪氨酸酚裂解酶催化合成L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)，解决了酪氨酸酚裂解酶酶法合成L-酪氨酸或L-多巴工艺的原料问题，使生产成本大幅度降低，具有重大突出效果和工业化价值。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
（1）本发明利用酪氨酸酚裂解酶催化丙酮酸、氨、苯酚或邻苯二酚合成L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)，酶法转化效率高，其中苯酚摩尔转化率达到95%以上。
（2）本发明采用含丙酮酸的料液为底物，充分利用了工业生产过程物料，省去了丙酮酸的分离纯化工序，降低了生产成本，减小了环保压力，实施效果突出，具有良好的经济效益和社会效益。
（3）酶促反应生成的L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)在水中溶解度较小，用等电点结晶法即可实现分离。
（4）酶法合成L-酪氨酸或L-多巴具有反应条件温和，酶立体选择性强，成本低，工艺流程简单等优点，适合工业化生产。
四、具体实施方式
实施例一
1．将Citrobacter freundii ATCC8090在如下1000ml培养基（g/ml）中培养：玉米浆0.5%，NaCl0.5%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O0.02%，牛肉膏2%，葡萄糖1%，麦芽糖0.5%，pH7.2。37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿细胞12g。
2．将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含10g/L丙酮酸的丙酮酸发酵液，添加10g氯化铵、21ml500g/L苯酚水溶液，氨水调pH8.5，再加入0.2g/L磷酸吡哆醛和0.01g/L吐温80，45℃酶促反应3h，反应结束后总体积1050ml。取样碱溶HPLC检测转化液中L-酪氨酸浓度为18.3g/L，对苯酚摩尔转化率为95%。
3．将转化液4000r/min离心15min，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物38.4g，用400ml纯水溶解固体混合物，滴加6mol/L盐酸调pH0.5，搅拌升温至85℃，将固体L-酪氨酸溶解完全，加活性炭脱色除去菌体细胞，滤液保温80℃左右用氨水调pH4.0～5.0，搅拌结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸16.7g，收率87%，比旋光（c=5，1mol/L盐酸）。
实施例二
1．将Citrobacter freundii ATCC8090在如下1000ml培养基（g/ml）中培养：玉米浆0.5%，蛋白质水解物0.5%，牛肉膏2%，麦芽糖1.0%，乳糖0.5%，NaCl0.5%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O0.03%，pH7.2。37℃振荡培养16h，4000r/min离心15min得湿细胞14g。
2．将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含30g/L丙酮酸的丙酮酸发酵液，添加10g氯化铵、20ml500g/L苯酚水溶液，氨水调pH9.0，再加入0.5g/L磷酸吡哆醛和0.1g/L吐温80，45℃酶促反应，流加44ml500g/L苯酚水溶液，反应12h结束，转化液总体积1100ml。取样碱溶后HPLC检测转化液中L-酪氨酸浓度为53.8g/L，对苯酚摩尔转化率为96%。
3．将转化液4000r/min离心15min，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物132g，用1200ml纯水溶解固体混合物，滴加6mol/L盐酸调pH0.5，搅拌升温至85℃，将固体L-酪氨酸溶解完全，加活性炭脱色除去菌体细胞，滤液保温80℃，用氨水调pH5.0，搅拌结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸49.7g，收率84%，比旋光
（c=5，1mol/L盐酸）。
实施例三
1．将Citrobacter koseri ATCC BAA-895在如下1000ml培养基（g/ml）中培养：蛋白胨1.0%，牛肉膏0.5%，蔗糖0.5%，果糖1.0%，NaCl0.5%，KH2PO40.3%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，pH7.2。37℃振荡培养16h，4000r/min离心15min得湿细胞15g。
2．将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含150g/L丙酮酸的丙酮酸发酵液，添加10g氯化铵、20ml500g/L苯酚水溶液，氨水调pH11.0，再加入0.05g/L磷酸吡哆醛和1.0g/L TritonX-100，45℃酶促反应，流加300ml500g/L苯酚水溶液，反应22h结束，转化液总体积1350ml。取样碱溶HPLC检测转化液中L-酪氨酸浓度为214.5g/L，对苯酚摩尔转化率为94%。
3．L-酪氨酸分离纯化方法同实施例二，得到L-酪氨酸干重240.4g，收率83%，比旋光（c=5，1mol/L盐酸）。
实施例四
1．将Erwinia herbicola ATCC21434在如下1000ml培养基（g/ml）中培养：蛋白胨1.0%，酵母膏0.3%，牛肉膏0.2%，乳糖0.5%，葡萄糖1.0%，NaCl0.5%，KH2PO40.2%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O0.04%，pH7.2。37℃振荡培养15h，4000r/min离心15min得湿细胞14g。
2．将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含50g/L丙酮酸的丙酮酸粗提液，添加10g氯化铵、20ml500g/L苯酚水溶液，氨水调pH10.0，再加入0.3g/L磷酸吡哆醛和0.2g/L CTAB，55℃酶促反应，流加87ml500g/L苯酚水溶液，反应15h后结束，转化液体积1130ml。取样碱溶HPLC检测转化液中L-酪氨酸浓度为87.5g/L，对苯酚摩尔转化率为96%。
3．L-酪氨酸分离纯化方法同实施例二，得到L-酪氨酸干重83g，收率83.9%，比旋光
（c=5，1mol/L盐酸）。
实施例五
1．将Citrobacter freundii ATCC8090在如下1000ml培养基（g/ml）中培养：豆饼水解液3%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.2%，乳糖1.0%，蔗糖0.5%，麦芽糖0.5%，NaCl0.5%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.03%，pH7.2。37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿细胞17g。
2．将湿菌体加入到200ml转化液中，转化液含10g氯化铵、0.1g磷酸吡哆醛和0.5g TritonX-100，流加含200g/L丙酮酸的丙酮酸粗提液600ml和500g/L的苯酚水溶液256ml，40℃酶促反应，氨水控制pH8.0，反应28h后结束，转化液总体积1120ml。碱溶检测转化液中L-酪氨酸浓度为207g/L，对苯酚摩尔转化率为94%。
3．L-酪氨酸分离纯化方法同实施例二，得到L-酪氨酸干重199.5g，收率86%，比旋光
（c=5，1mol/L盐酸）。
实施例六
1．将Citrobacter koseri ATCC BAA-895在如下1000ml培养基（g/ml）中培养：蛋白胨1.0%，酵母膏0.3%，玉米浆1%，果糖0.5%，蔗糖0.5%，NaCl0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.05%，pH7.2。37℃振荡培养15h，4000r/min离心15min得湿细胞14g。
2．将湿菌体加入到400ml转化液中，转化液含10g氯化铵、0.4g磷酸吡哆醛和0.6g TritonX-100，流加含600g/L丙酮酸的丙酮酸盐粗品水溶液300ml和500g/L的苯酚水溶液385ml，45℃酶促反应，氨水控制pH9.0，反应38h后结束，转化液总体积1240ml。取样碱溶检测转化液中L-酪氨酸浓度为281g/L，对苯酚摩尔转化率为94%。
3．L-酪氨酸分离纯化方法同实施例二，得到L-酪氨酸干重293g，收率84%，比旋光
（c=5，1mol/L盐酸）。
实施例七
1．将Citrobacter freundii ATCC8090在如下1000ml培养基（g/ml）中培养：蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，玉米浆2%，果糖0.5%，麦芽糖1.0%，NaCl0.5%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，pH7.0。37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿细胞20g。
2．将湿菌体加入到600ml转化液中，转化液含10g氯化铵、0.5g磷酸吡哆醛和1.0g TritonX-100，流加含900g/L丙酮酸的丙酮酸盐粗品水溶液100ml和500g/L的苯酚水溶液192ml，45℃酶促反应，氨水控制pH10.0，反应22h后结束，转化液总体积960ml。取样碱溶检测转化液中L-酪氨酸浓度为185g/L，对苯酚摩尔转化率为96%。
3．L-酪氨酸分离纯化方法同实施例二，得到L-酪氨酸干重151.2g，收率85.2%，比旋光
（c=5，1mol/L盐酸）。
实施例八
1．将Citrobacter koseri ATCC BAA-895在如下1000ml培养基（g/ml）中培养：玉米浆2%，NaCl0.5%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O0.05%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，乳糖0.5%，pH7.0。37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿细胞16g。
2．将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含10g/L丙酮酸的丙酮酸发酵液，添加10g氯化铵、10g亚硫酸钠，25ml500g/L邻苯二酚水溶液，氨水调pH7.0，再加入0.08g/L磷酸吡哆醛和0.1g/L吐温80，25℃酶促反应6h，反应结束后体积1060ml。取样酸溶HPLC检测转化液中L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)浓度为19g/L，对邻苯二酚摩尔转化率为90%。
3．将转化液4000r/min离心15min，收集湿细胞和固体L-多巴混合物36.3g，用400ml纯水溶解固体混合物，滴加6mol/L盐酸调pH0.5，搅拌升温将固体L-多巴溶解完全，加活性炭脱色除去菌体细胞，滤液中加入1%维生素C，再用氨水调pH4.0，搅拌结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)15.6g，收率78.3%，比旋光（c=5.3，1mol/L盐酸）。
实施例九
1．将Citrobacter freundii ATCC8090在如下1000ml培养基（g/ml）中培养：豆饼水解液3%，酵母膏1%，果糖1%，乳糖0.5%，NaCl0.5%，KH2PO40.04%，MgSO4·7H2O0.03%，pH7.0。37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿细胞17g。
2．将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含30g/L丙酮酸的丙酮酸粗提液，添加10g氯化铵、20g亚硫酸钠，20ml500g/L邻苯二酚水溶液，氨水调pH9.0，再加入0.12g/L磷酸吡哆醛和0.15g/L TritonX-100，30℃酶促反应，流加55ml500g/L邻苯二酚水溶液，反应15h后结束，转化液体积1130ml。取样酸溶检测转化液中L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)的浓度为54.1g/L，对邻苯二酚摩尔转化率为91%。
3．L-多巴分离制备方法同实施例八，得到L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)干重48.2g，收率79%，比旋光（c=5.3，1mol/L盐酸）。
实施例十
1．将Erwinia herbicola ATCC21434在如下1000ml培养基（g/ml）中培养：蛋白胨1%，酵母膏1%，葡萄糖1%，蔗糖0.5%，NaCl0.5%，KH2PO40.04%，MgSO4·7H2O0.03%，pH7.0。37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿细胞15g。
2．将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含50g/L丙酮酸的丙酮酸粗品水溶液，添加10g氯化铵、20g亚硫酸钠，20ml500g/L邻苯二酚水溶液，氨水调pH9.0，再加入0.15g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L TritonX-100，25℃酶促反应，流加105ml500g/L邻苯二酚水溶液，反应35h后结束，转化液体积1210ml。取样酸溶检测转化液中L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)的浓度为82.3g/L，对邻苯二酚摩尔转化率为89%。
3．L-多巴分离制备方法同实施例把，得到L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)干重77.7g，收率78%，比旋光
（c=5.3，1mol/L盐酸）。
Claims (6)
1.一种L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物即L-3-羟基酪氨酸的酶法转化制备方法，其特征是由以下步骤构成：
（1）将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生高酶活酪氨酸酚裂解酶；
（2）将酪氨酸酚裂解酶细胞或酶粗提液与含丙酮酸发酵液或含丙酮酸粗提液或丙酮酸盐粗品水溶液混合，氨水调pH7～11，再加入苯酚或邻苯二酚、磷酸吡哆醛和表面活性剂，在25～55℃条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离制备转化产物L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物(L-3-羟基酪氨酸)。
2.根据权利要求1所述一种L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物即L-3-羟基酪氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于步骤（1）所述的酪氨酸酚裂解酶菌株为Citrobacter freundii ATCC8090或Citrobacter koseri ATCC BAA-895或Erwiniaherbicola ATCC21434。
3.根据权利要求1所述一种L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物即L-3-羟基酪氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于步骤（1）中的培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L。
4.根据权利要求1所述一种L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物即L-3-羟基酪氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于步骤（2）所述的含丙酮酸的发酵液中丙酮酸含量为10～150g/L，丙酮酸粗提液或丙酮酸盐粗品水溶液中丙酮酸含量为50～900g/L。
5.根据权利要求1所述一种L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物即L-3-羟基酪氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于步骤（2）所述的酶促反应中磷酸吡哆醛浓度为0.05～0.5g/L。
6.根据权利要求1所述一种L-酪氨酸或L-酪氨酸衍生物即L-3-羟基酪氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于步骤（2）所述的表面活性剂为吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵或TritonX-100，其浓度为0.01～1.0g/L。
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