CN108715827A - 酪氨酸酚裂解酶的胞外表达及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明阐述了一种酪氨酸酚裂解酶的胞外表达及其应用，属于生物技术领域。方法为克隆高活性的酪氨酸酚裂解酶基因，和信号肽基因共表达，转化大肠杆菌感受态细胞，构建信号肽介导的酪氨酸酚裂解酶胞外分泌工程菌，实现胞外表达，所得酪氨酸酚裂解酶发酵液用于转化合成酪氨酸及衍生物。本发明采用胞外表达方式构建酪氨酸酚解酶工程菌株，酶释放放量达到50％以上，减少蛋白在胞内过度堆积对细胞产生的毒性，总酶活较普通表达提高36％。发酵产生的酶部分释放到发酵液中，菌体细胞通透性良好，有利于底物同酶的接触，大幅度提高酶的催化效率。可以直接采用发酵液催化底物生产L‑酪氨酸及衍生物，无需破碎细胞提取纯酶进行反应，节约酶的使用成本。

Description

酪氨酸酚裂解酶的胞外表达及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种酪氨酸酚裂解酶的胞外表达及在酪氨酸及衍生物合成中的应用。
背景技术
酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase，TPL)，也称β-酪氨酸酶，在生物体内催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-酪氨酸。由于酪氨酸酚裂解酶并非严格的底物专一性，亦可催化苯酚的结构类似物如邻苯二酚、邻氟苯酚、愈创木酚分别生成酪胺酸的衍生物左旋多巴、3氟-L-酪氨酸、3-甲氧基L-酪氨酸。
酪氨酸及其衍生物具有重要的工业用途。如酪氨酸是重要的蛋白氨基酸，可用于氨基酸输液及氨基酸复合制剂的原料，作营养增补剂。治疗脊髓灰质炎和结核性脑炎、甲状腺机能亢进等症，亦用于制造二碘酪氨酸、二溴酪氨酸及左旋多巴的原料。左旋多巴作为一种重要的生物活性物质，是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物已成为治疗常见老年病帕金森氏病的主要药物。含氟活性更强、选择性更高的药物及农药已被广泛应用，3-氟-L-酪氨酸可用于合成含氟化合物的前体。可以作为标记的化合物模拟体内代谢过程，为研究生命现象提供重要手段。3-甲氧基-L-酪氨酸亦是重要的药物中间体，可用于阿魏酸等物质的合成。
L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，收率低，环境污染严重，应用酶法取代酸水解法具有重要应用价值。Para等采用固定化C.intermiedius细胞法，以丙酮酸钠、硫酸铵、苯酚为底物合成L-酪氨酸，反应5h可积累5g/L的L-酪氨酸。Lee以Klebsiella aerogenes和E.herbicola ATCC21434为酶源，以甘氨酸、甲醛、苯酚为原料，反应16h可生产L-酪氨酸26.3g/L。
Foor等将Erwinia herbicola的TPL结构基因tutA与tac启动子融合，经乳糖诱导后在大肠杆菌中进行表达，反应30h后，L-DOPA产量为105mM。李静等以弗氏柠檬酸细菌Citrobacter freundiiATCC8090为出发菌株，通过诱变获得TPL高产突变株C37-30，并对C37-30进行产酶条件和多巴合成条件的优化，最终L-DOPA产量为12.6g/L。以上关于利用酪氨酸酚裂解酶合成L-酪氨酸和左旋多巴的合成效率较低，不能应用于工业化生产，且尚未见利用酪氨酸酚裂解酶生产3-氟-L-酪氨酸和3-甲氧基-L-酪氨酸的报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服目前菌株酶活力较低，催化合成酪氨酸及衍生物效率不高的缺点，提供一种酪氨酸酚裂解酶的胞外表达的方法，增加酶的表达量，简化酶使用前的透膜处理工序，增加酶同底物的接触效率，提高酶法生产酪氨酸及衍生物的效率。
本发明所采用的技术方案是：
一种酪氨酸酚裂解酶的胞外表达及在酪氨酸及衍生物合成中的应用，属于生物技术领域，其特征为：克隆高活性的酪氨酸酚裂解酶基因，和信号肽基因共表达，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，构建胞外表达的酪氨酸酚裂解酶工程菌，并配合发酵调控措施增加酪氨酸酚裂解酶的胞外分泌量，所得酪氨酸酚裂解酶发酵液用于合成L-酪氨酸及其衍生物。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种酪氨酸酚裂解酶的胞外表达工程菌的构建方法，具体步骤如下：
1)TPL工程菌构建
根据Erwinia herbicola中TPL的基因序列(Genebank号：D13714.1)和克隆载体pET28a的序列信息设计含有接头和限制性内切酶位点的上下游引物，以Erwiniaherbicola ATCC21434基因组DNA为模板，克隆Erwinia herbicola酪氨酸酚裂解酶编码基因TPLSEQ.NO.1，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒把PCR片段与经过NdeI和Xho I酶切载体pET28a进行连接，得到酪氨酸酚裂解酶表达质粒pET28a-TPL；
2)TPL和torA共表达工程菌构建
合成trimethylamine-N-oxide reductase的信号肽torA编码基因SEQ.NO.2(Genebank号：BAA36139.1)，利用NdeI和NcoI分别将torA编码基因和质粒pET28a-TPL双酶切，然后二者进行连接构建得到带有torA信号肽的酪氨酸酚裂解酶表达质粒pET28a-torA-TPL，检测正确后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到酪氨酸酚裂解酶胞外表达工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-torA-TPL。
本发发明还提供利用上述工程菌进行酪氨酸酚裂解酶的胞外表达方法，具体步骤如下：
(1)将构建的酪氨酸酚裂解酶胞外表达工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-torA-TPL接入含100mg/L卡那霉素的LB斜面培养基37℃培养10～20h；
进一步，步骤(1)所述的LB斜面培养基的成分及其终浓度为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(2)接步骤(1)斜面培养基培养的菌种于含有100mg/L的卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200r/min培养4～8h得到种子液；
进一步，步骤(2)所述液体LB培养基的成分及其终浓度为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(3)取步骤(2)的种子液以3～15％种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在10～50％之间，用氨水调节pH值稳定在7.0，流加补料培养基控制葡萄糖浓度为2～5g/L，37℃培养6～10h降温至26～30℃加入1～5g/L的乳糖进行诱导表达，继续培养8～25h结束发酵测定酶活，得到含有酪氨酸酚裂解酶的发酵液。
进一步，步骤(3)所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨15g/L，豆粕水解液20g/L，KH2PO4 16g/L，MgSO4 2g/L，(NH4)2SO4 5g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。补料培养基为：葡萄糖500g/L，豆粕水解液20g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。
本发明还提供一种利用上述酪氨酸酚裂解酶发酵液转化得到L-酪氨酸的应用，具体方法如下：1L反应体系中加入依次5～30g的丙酮酸钠、5～10g苯酚、10～50g氯化铵、25～100mg磷酸吡哆醛，1～5g Na2SO3加入水溶解并用氨水调节pH为7.5～8.5，补入含有酪氨酸酚裂解酶的发酵液50～150mL，并定容至1L，过程中流加丙酮酸钠和苯酚溶液，温度35～50℃，200r/min转条件下反应，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应；反应结束后盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液用氢氧化钠溶液调pH至5.0～7.0，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体烘干称重，得到L-酪氨酸。
本发明还提供一种利用上述酪氨酸酚裂解酶发酵液转化得到左旋多巴的应用，具体方法如下：1L反应体系中加入依次5～30g的丙酮酸钠、5～10g邻苯二酚、10～50g氯化铵、25～100mg磷酸吡哆醛，1～5g Na2SO3加入水溶解并用氨水调节pH为7.5～8.5，补入含有酪氨酸酚裂解酶的发酵液50～150mL，并定容至1L，过程中流加丙酮酸钠和邻苯二酚溶液，温度35～50℃，200r/min转条件下反应，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应；反应结束后盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液用氢氧化钠溶液调pH至5.0～7.0，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体烘干称重，得到左旋多巴。
本发明还提供一种利用上述酪氨酸酚裂解酶发酵液转化得到3-氟-L-酪氨酸的应用，具体方法如下：1L反应体系中加入依次5～30g的丙酮酸钠、5～10g邻氟苯酚、10～50g氯化铵、25～100mg磷酸吡哆醛，1～5g Na2SO3加入水溶解并用氨水调节pH为7.5～8.5，补入含有酪氨酸酚裂解酶的发酵液50～150mL，并定容至1L，温度35～50℃，200r/min转条件下反应，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应；反应结束后盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液用氢氧化钠溶液调pH至5.0～7.0，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体烘干称重，得到3-氟-L-酪氨酸。
本发明还提供一种利用上述酪氨酸酚裂解酶发酵液转化得到3-甲氧基-L-酪氨酸的应用，具体方法如下：1L反应体系中加入依次5～30g的丙酮酸钠、5～10g愈创木酚、10～50g氯化铵、25～100mg磷酸吡哆醛，1～5g Na2SO3加入水溶解并用氨水调节pH为7.5～8.5，补入含有酪氨酸酚裂解酶的发酵液50～150mL，并定容至1L，过程中流加丙酮酸钠和愈创木酚溶液，温度35～50℃，200r/min转条件下反应，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应；反应结束后盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液用氢氧化钠溶液调pH至5.0～7.0，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体烘干称重，得到3-甲氧基-L-酪氨酸。
本发明与现有技术相比的有益效果具体体现在：
1、本发明采用胞外表达方式构建酪氨酸酚解酶工程菌株，酶释放量达到50％以上，减少蛋白在胞内过度堆积对细胞产生的毒性，总酶活较普通表达提高40％。
2、本发明发酵产生的酶部分释放到发酵液中，且菌体细胞通透性良好，有利于底物同酶的接触，大幅度提高酶的催化效率。可以直接采用发酵液催化底物生产L-酪氨酸及衍生物，无需破碎细胞提取纯酶进行反应，节约酶的使用成本。
附图说明
图1：L-酪氨酸液相谱图；
图2：左旋多巴液相谱图；
图3：3-氟-L-酪氨酸液相谱图；
图4：3-甲氧基-L-酪氨酸液相谱图。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1胞外分泌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌的构建工程菌的构建采用一步法克隆定向无缝克隆试剂盒进行。
根据Erwinia herbicola中TPL的基因序列(D13714.1)信息和克隆载体pET28a设计含有接头(斜体表示)和限制性内切酶位点(粗体表示)的上下游引物，上游引物为TPL-F：5′-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGATGAACTATCCTGCCGAGCC-3′；下游引物为TPL-R：5′
-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAATAAAGTCAAAACGCG-3′。通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取得到Erwinia herbicola ATCC21434基因组DNA，并以该基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒把PCR片段与经过NdeI和Xho I酶切载体pET28a进行连接，得到酪氨酸酚裂解酶表达质粒pET28a-TPL，检测正确后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到酪氨酸酚裂解酶工程菌株E.coli BL21(DE3)/pT28a-TPL。
合成trimethylamine-N-oxide reductase的信号肽torA编码基因SEQ.NO.2(Genebank号：BAA36139.1)，合成序列两端加入NcoI和NdeI的限制性酶切位点，利用NdeI和NcoI分别将torA编码基因和质粒pET28a-TPL双酶切，然后二者进行连接构建得到信号肽介导的酪氨酸酚裂解酶表达质粒pET28a-torA-TPL，检测正确后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到信号肽介导的酪氨酸酚裂解酶工程菌株E.coli BL21(DE3)/pT28a-torA-TPL。
将构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-TPL、E.coli BL21(DE3)/pET28a-torA-TPL分别接入含100mg/L抗生素的LB斜面培养基37℃培养16h，其中LB斜面培养基的成分及终浓度为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的卡那霉素，接1环斜面培养基培养的菌种于LB液体培养基，37℃、200r/min培养6h得到种子液。
将所述种子液以3～15％种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在10～50％之间，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，流加补料培养基控制葡萄糖浓度为2～5g/L，37℃培养6～10h降温至26～30℃加入1～5g/L的乳糖进行诱导表达，继续培养8～14h结束发酵测定酶活，得到含有酪氨酸酚裂解酶的发酵液。发酵结束分别测定胞内胞外酶活，结果如表1所示，E.coli BL21(DE3)/pET28a-TorA-TPL可以实现胞外分泌。
其中液体LB液体培养基配方为；酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃灭菌30min。
所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨15g/L，豆粕水解液20g/L，KH2PO4 16g/L，MgSO4 2g/L，(NH4)2SO4 5g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。补料培养基为：葡萄糖500g/L，豆粕水解液20g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。
酪氨酸酚裂解酶酶活测定方法为：
10mL酪氨酸酚裂解酶发酵液10000r/min离心10min，上清液用于测胞外酶活；离心收集的细胞重悬于50mM的磷酸缓冲液中(pH 7.0)，超声破碎后12000r/min离心10min去除细胞碎片，上清液用于测定胞内酶活。
反应体系：0.1mL适当稀释的酶液加入到1.9mL含650mM NH4Cl、50mM苯酚、50mM丙酮酸钠、0.1mM磷酸吡哆醛、1g/L Na2SO3(50mM，pH 7.0)的反应体系中，pH8.0、37度反应30min，加入等体积的5mol/L的盐酸终止反应，采用高效液相色谱仪测定L-酪氨酸的含量。酶活定义为在pH 8.0、温度37℃的条件下，每l min转化生成1μmol L-酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位U。
表1.两种菌株发酵液中酶活测定
实施例2通过分泌表达获得酪氨酸酚裂解酶发酵液转化L-酪氨酸
(1)将构建的酪氨酸酚裂解酶工程菌株E.coli BL21(DE3)/pT28a-torA-TPL接入含100mg/L卡那霉素的LB斜面培养基上，于37℃培养10～20h；其中LB培养基配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(2)500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的卡那霉素，接1环斜面培养基培养的菌种于LB液体培养基，37℃、200r/min培养4～8h，其中液体LB培养基配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(3)5L发酵罐中装入3.0L发酵培养基，种子液以5％种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在20～30％之间，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，流加补料培养基控制葡萄糖浓度为2g/L，37℃培养6h降温至26℃加入1g/L的乳糖进行诱导表达，继续培养14h结束发酵测定酶活(酶活测定方法同实施例1)，胞外酶活达到13.5U/mL，占总酶活的51.6％。其中发酵培养基为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨15g/L，豆粕水解液20g/L，KH2PO4 16g/L，MgSO4 2g/L，(NH4)2SO4 5g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。补料培养基为：葡萄糖500g/L，豆粕水解液20g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。
(4)将步骤(3)得到的发酵液作为催化剂投入转化液中进行酪氨酸及衍生物生产，其转化条件为：1L反应体系中加入依次30g的丙酮酸钠、26g苯酚、30g氯化铵、25mg磷酸吡哆醛，1g Na2SO3加入适量水溶解并用氨水调节pH为8.5，补入步骤(3)的发酵液50mL，并定容至1L，温度40℃，200r/min转条件下反应，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应。反应结束后用盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液用氢氧化钠溶液调pH至5.6，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体并水洗，烘干称重L-酪氨酸质量为44.4g，提取收率为90％，液相检测纯度为98.5％。
酪氨酸及衍生物含量测定方法如下：取转化液10000rpm离心10min，收集上清液，分别以L-酪氨酸及其衍生物作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定L-酪氨酸及其衍生物的纯度。
实施例3
通过分泌表达获得酪氨酸酚裂解酶发酵液转化L-酪氨酸
(1)将构建的酪氨酸酚裂解酶工程菌株E.coli BL21(DE3)/pT28a-torA-TPL接入含100mg/L卡那霉素的LB斜面培养基37℃培养10～20h，其中LB斜面培养基配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(2)500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的卡那霉素，接1环斜面培养基培养的菌种于LB液体培养基37℃、200r/min培养4～8h，其中液体LB培养基配方为；酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(3)5L发酵罐中装入3.0L发酵培养基，种子液以5％种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在20～30％之间，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，流加补料培养基控制葡萄糖浓度为2g/L，37℃培养6h降温至26℃加入1g/L的乳糖进行诱导表达，继续培养14h结束发酵测定酶活，胞外酶活达到14.1U/mL，占总酶活的50.1％。发酵培养基、补料培养基同实施例2。
(4)将步骤(3)得到的发酵液作为催化剂投入转化液中进行酪氨酸及衍生物生产，其转化条件为：1L反应体系中加入依次10g的丙酮酸钠、10g苯酚、30g氯化铵、25mg磷酸吡哆醛，1g Na2SO3加入适量水溶解并用氨水调节pH为8.5，补入发酵液90mL，并定容至1L，温度40℃，200r/min转条件下反应，过程中等摩尔流加丙酮酸钠和苯酚溶液并控制丙酮酸钠和苯酚浓度不超过10g/L，丙酮酸钠流加总量为80g，苯酚流加总量为68.4g，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应。反应结束后盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液用氢氧化钠溶液调pH至5.6，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体并水洗，烘干称重L-酪氨酸质量为136g，提取收率为91.9％，液相检测纯度为99.1％，如图1所示。L-酪氨酸含量测定方法同实施例2。
实施例4
通过分泌表达获得酪氨酸酚裂解酶发酵液转化左旋多巴
(1)将构建的酪氨酸酚裂解酶工程菌株E.coli BL21(DE3)/pT28a-torA-TPL接入含100mg/L卡那霉素的LB斜面培养基37℃培养10～20h，其中LB培养基配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(2)500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的卡那霉素，接1环斜面菌种于LB液体培养基37℃、200r/min培养4～8h，其中液体LB培养基配方为；酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(3)5L发酵罐中装入3.0L发酵培养基，种子液以8％种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在25～40％之间，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，流加补料培养基控制葡萄糖浓度为2g/L，37℃培养6h降温至30℃加入2g/L的乳糖进行诱导表达，继续培养14h结束发酵测定胞外酶活达到14.5U/mL，占总酶活的53.2％。发酵培养基、补料培养基同实施例2。
(4)将步骤(3)得到的发酵液作为催化剂投入转化液中进行酪氨酸及衍生物生产，其转化条件为：1L反应体系中加入依次7g的丙酮酸钠、7g邻苯二酚、40g氯化铵、25mg磷酸吡哆醛，2g Na2SO3加入适量水溶解并用氨水调节pH为8.0，补入发酵液120mL，并定容至1L，温度25℃，200r/min转条件下反应，过程中等摩尔流加丙酮酸钠和邻苯二酚溶液并控制丙酮酸钠和苯酚浓度不超过7g/L，丙酮酸钠流加总量为50g，邻苯二酚流加总量为50g，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应。反应结束后盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液用氢氧化钠溶液调pH至5.5，于4℃条件下结晶20h，离心收集晶体并水洗，烘干称重左旋多巴质量为85g，提取收率为83.3％，液相检测纯度为98.9％，如图2所示。左旋多巴含量测定方法同实施例2。
实施例5
通过分泌表达获得酪氨酸酚裂解酶发酵液转化3-氟-L-酪氨酸
(1)将构建的酪氨酸酚裂解酶工程菌株E.coli BL21(DE3)/pT28a-torA-TPL接入含100mg/L卡那霉素的LB斜面培养基37℃培养10～20h，其中LB斜面培养基配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(2)500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的卡那霉素，接1环斜面菌种于LB液体种子培养基37℃、200r/min培养4～8h，其中液体LB培养基配方为；酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(3)5L发酵罐中装入3.0L发酵培养基，种子液以5％种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在20～30％之间，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，流加补料培养基控制葡萄糖浓度为2g/L，37℃培养6h降温至26℃加入2g/L的乳糖进行诱导表达，继续培养16h结束发酵测定酶活，胞外酶活达到12.7U/mL，占总酶活的53.6％。发酵培养基、补料培养基同实施例2。
(4)将步骤(3)得到的发酵液作为催化剂投入转化液中进行酪氨酸及衍生物生产，其转化条件为：1L反应体系中加入依次10g的丙酮酸钠、10.5g邻氟苯酚、30g氯化铵、25mg磷酸吡哆醛，1g Na2SO3加入适量水溶解并用氨水调节pH为8.5，补入发酵液50mL，并定容至1L，温度40℃，200r/min转条件下反应，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应。反应结束后盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液真空浓缩至100mL体积，用氢氧化钠溶液调pH至5.6，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体并水洗，烘干称重3-氟-L-酪氨酸质量为14.4g，提取收率为80％，液相检测纯度为98.5％，如图3所示。3-氟-L-酪氨酸及衍生物含量测定方法同实施例2。
实施例6
通过分泌表达获得酪氨酸酚裂解酶发酵液转化3-甲氧基-L-酪氨酸
(1)将构建的酪氨酸酚裂解酶工程菌株E.coli BL21(DE3)/pT28a-torA-TPL接入含100mg/L卡那霉素的LB斜面培养基37℃培养10～20h，其中LB培养基配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(2)500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的卡那霉素，接1环斜面菌种于LB液体种子培养基37℃、200r/min培养4～8h，其中液体LB培养基配方为；酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(3)5L发酵罐中装入3.0L发酵培养基，种子液以5％种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在20～30％之间，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，流加补料培养基控制葡萄糖浓度为2g/L，37℃培养6h降温至26℃加入2g/L的乳糖进行诱导表达，继续培养16h结束发酵测定酶活，胞外酶活达到13.9U/mL，占总酶活的54.8％。发酵培养基、补料培养基同实施例2。
(4)将步骤(3)得到的发酵液作为催化剂投入转化液中进行酪氨酸及衍生物生产，其转化条件为：1L反应体系中加入依次10g的丙酮酸钠、3g愈创木酚、30g氯化铵、25mg磷酸吡哆醛，1g Na2SO3加入适量水溶解并用氨水调节pH为8.5，补入发酵液50mL，并定容至1L，温度40℃，200r/min转条件下反应，过程中流加愈创木酚并维持浓度不高于3g/L，流加总量为8.3g，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应。反应结束后盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液真空浓缩至300mL体积，用氢氧化钠溶液调pH至5.6，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体并水洗，烘干称重3-甲氧基-L-酪氨酸质量为13.5g，提取收率为70.3％，液相检测纯度为99.3％，如图4所示。3-甲氧基-L-酪氨酸含量测定方法同实施例2。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 酪氨酸酚裂解酶的胞外表达及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1371
<212> DNA
<213> Erwinia herbicola(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atgaactatc ctgccgagcc tttccgcatt aaaagtgttg aaaccgtatc aatgatctca 60
cgcgatgagc gtgttaaaaa aatgcaagaa gcgggctata acacgttttt actgaattca 120
aaggatatct acatcgatct gctgacagac agcggtacaa atgccatgag tgacaagcag 180
tgggcaggga tgatgattgg tgatgaagcc tacgcaggca gtgaaaactt ctaccatctc 240
gaaaaaacgg tgaaagagtt gtttggtttc aaacacatcg ttccaaccca ccagggacgc 300
ggggcggaaa acctgctctc gcagctggcc attaagcccg gtcaatatgt cgcaggaaat 360
atgtacttta caacaacccg cttccatcag gaaaaaaatg gcgcaacctt tgtggatatt 420
gtccgcgatg aagcacatga cgccagcctg aatctcccct ttaaaggtga tattgacctg 480
aataaattag cgacgctcat taaagaaaaa ggcgccgaga acatcgccta tatctgcctt 540
gcggtcaccg tgaatctggc gggtgggcag cctgtttcaa tggcgaatat gcgtgccgta 600
catgaaatgg ccagcacgta tggcattaag atcttttacg atgccacccg ttgcgttgaa 660
aatgcctatt ttatcaaaga gcatgaagcg ggctacgaga acgtcagtat caaagatatc 720
gtgcatgaaa tgttcagcta tgccgatggg tgcaccatga gcggtaaaaa agattgtctg 780
gtgaatatcg gcggcttctt gtgtatgaac gatgaggaga tgttctcagc ggcaaaagag 840
ttggttgtcg tttatgaggg tatgccgtca tacggcgggc tggccggtcg ggatatggaa 900
gcgatggcta ttgggctacg tgaagccatg cagtatgaat atattgaaca tcgggtcaaa 960
caggtgcgct atctgggcga taaactccgt gaagccggcg tacccattgt tgaaccgacg 1020
ggcggacatg cggtatttct tgatgctcgt cgtttctgtc cacacctgac gcaggatcag 1080
ttccctgcgc agagcctggc agccagcatc tatatggaaa ccggcgtgcg aagtatggaa 1140
cgtggaattg tttctgccgg tcgtagcaag gaaacggggg agaaccatcg ccccaaactg 1200
gagacggtac gtctcactat tccacgccgt gtttacactt acgcgcacat ggatgttgtt 1260
gccgatggca tcattaaact gtaccagcat aaagaagata ttcgtggtct gacgtttgtt 1320
tatgaaccta aacaacttcg cttctttact gcgcgttttg actttattta a 1371
<210> 2
<211> 136
<212> DNA
<213> 合成序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
ccatggaaca ataacgatct ctttcaggca tcacgtcggc gttttctggc acaactcggc 60
ggcttaaccg tcgccgggat gctggggccg tcattgttaa cgccgcgacg tgcgactgcg 120
gcgcaagcgg catatg 136

Claims (9)

1.一种酪氨酸酚裂解酶的胞外表达工程菌的构建方法，其特征在于它的具体步骤如下：
1)TPL工程菌构建
根据Erwinia herbicola中TPL的基因序列和克隆载体pET28a的序列信息设计含有接头和限制性内切酶位点的上下游引物，以Erwinia herbicola ATCC21434基因组DNA为模板，克隆Erwinia herbicola酪氨酸酚裂解酶编码基因TPLSEQ.NO.1，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒把PCR片段与经过NdeI和Xho I酶切载体pET28a进行连接，得到酪氨酸酚裂解酶表达质粒pET28a-TPL；
2)TPL和torA共表达工程菌构建
合成trimethylamine-N-oxide reductase的信号肽torA编码基因SEQ.NO.2，利用NdeI和NcoI分别将torA编码基因和质粒pET28a-TPL双酶切，然后二者进行连接构建得到带有torA信号肽的酪氨酸酚裂解酶表达质粒pET28a-torA-TPL，检测正确后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到酪氨酸酚裂解酶胞外表达工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-torA-TPL。
2.利用权利要求1所述工程菌进行酪氨酸酚裂解酶胞外表达的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)将构建的酪氨酸酚裂解酶胞外表达工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-torA-TPL接入含100mg/L卡那霉素的LB斜面培养基37℃培养10～20h；
(2)接步骤(1)斜面培养基培养的菌接种于含有100mg/L的卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200r/min培养4～8h得到种子液；
(3)取步骤(2)的种子液以体积比3～15％种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在10～50％之间，用氨水调节pH值稳定在7.0，流加补料培养基控制葡萄糖浓度为2～5g/L，37℃培养6～10h，然后降温至26～30℃加入1～5g/L的乳糖进行诱导表达，继续培养8～25h结束发酵测定酶活，得到含有酪氨酸酚裂解酶的发酵液。
3.根据权利要求2所述的一种酪氨酸酚裂解酶的胞外表达方法，其特征在于步骤(2)所述的LB斜面培养基的成分及其终浓度为：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L、琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min。
4.根据权利要求2所述的一种酪氨酸酚裂解酶的胞外表达方法，其特征在于步骤(3)所述液体LB培养基的成分及其终浓度为：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L，pH7.0，121℃灭菌30min。
5.根据权利要求2所述的一种酪氨酸酚裂解酶的胞外表达方法，其特征在于步骤(4)所述发酵培养基成分及其终浓度为：葡萄糖20g/L、酵母浸粉5g/L、蛋白胨15g/L、豆粕水解液20g/L、KH2PO4 16g/L、MgSO4 2g/L、(NH4)2SO4 5g/L，pH7.0，121℃灭菌20min；补料培养基成分及其终浓度为：葡萄糖500g/L、豆粕水解液20g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。
6.一种利用权利要求2-5任何一项所述酪氨酸酚裂解酶发酵液转化得到L-酪氨酸的应用，具体方法如下：1L反应体系中加入依次5～30g的丙酮酸钠、5～10g苯酚、10～50g氯化铵、25～100mg磷酸吡哆醛，1～5g Na2SO3加入水溶解并用氨水调节pH为7.5～8.5，补入含有权利要求1-4任何一项所述酪氨酸酚裂解酶的发酵液50～150mL，并定容至1L，转化过程中流加丙酮酸钠和苯酚溶液，温度35～50℃，200r/min转条件下反应，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应；反应结束后盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液用氢氧化钠溶液调pH至5.0～7.0，于4℃条件下结晶16h，得到L-酪氨酸晶体。
7.一种利用权利要求2-5任何一项所述酪氨酸酚裂解酶发酵液转化得到左旋多巴的应用，具体方法如下：1L反应体系中加入依次5～30g的丙酮酸钠、5～10g邻苯二酚、10～50g氯化铵、25～100mg磷酸吡哆醛，1～5g Na2SO3加入水溶解并用氨水调节pH为7.5～8.5，补入含有权利要求1-4任何一项所述酪氨酸酚裂解酶的发酵液50～150mL，并定容至1L，转化过程中流加丙酮酸钠和邻苯二酚溶液，温度35～50℃，200r/min转条件下反应，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应；反应结束后盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液用氢氧化钠溶液调pH至5.0～7.0，于4℃条件下结晶16h，得到左旋多巴晶体。
8.一种利用权利要求2-5任何一项所述酪氨酸酚裂解酶发酵液转化得到3-氟-L-酪氨酸的应用，具体方法如下：1L反应体系中加入依次5～30g的丙酮酸钠、5～10g邻氟苯酚、10～50g氯化铵、25～100mg磷酸吡哆醛，1～5g Na2SO3加入水溶解并用氨水调节pH为7.5～8.5，补入含有权利要求1-4任何一项所述酪氨酸酚裂解酶的发酵液50～150mL，并定容至1L，温度35～50℃，200r/min转条件下反应，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应；反应结束后盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液用氢氧化钠溶液调pH至5.0～7.0，于4℃条件下结晶16h，得到3-氟-L-酪氨酸晶体。
9.一种利用权利要求2-5任何一项所述酪氨酸酚裂解酶发酵液转化得到3-甲氧基-L-酪氨酸的应用，具体方法如下：1L反应体系中加入依次5～30g的丙酮酸钠、5～10g愈创木酚、10～50g氯化铵、25～100mg磷酸吡哆醛，1～5g Na2SO3加入水溶解并用氨水调节pH为7.5～8.5，补入含有权利要求1-4任何一项所述酪氨酸酚裂解酶的发酵液50～150mL，并定容至1L，转化过程中流加丙酮酸钠和愈创木酚溶液，温度35～50℃，200r/min转条件下反应，液相检测丙酮酸钠完全转化时停止反应；反应结束后盐酸调pH至1.0，过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，滤过液用氢氧化钠溶液调pH至5.0～7.0，于4℃条件下结晶16h，得到3-甲氧基-L-酪氨酸晶体。
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