CN106591383A

CN106591383A - 一种以邻苯二酚为底物高效合成咖啡酸的方法

Info

Publication number: CN106591383A
Application number: CN201611166591.5A
Authority: CN
Inventors: 周景文; 陈坚; 吕永坤; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-12-16
Also published as: CN106591383B

Abstract

本发明公开了一种以邻苯二酚为底物高效合成咖啡酸的方法，属于生物化工领域。本发明构建的重组菌以邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵合成咖啡酸时，咖啡酸的产量可达到1.51g/L，由于邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵均为相对廉价的化合物，因此本发明方法是一种具有较大潜力的咖啡酸生物合成方法。与以往的以L‑酪氨酸为底物的生物转化方法相比，本发明方法在咖啡酸产量方面有了明显的提高。与化学合成方法相比，该方法的产物为单一的反‑咖啡酸，不需要对同分异构体进行进一步的分离。

Description

一种以邻苯二酚为底物高效合成咖啡酸的方法

技术领域

本发明涉及一种以邻苯二酚为底物高效合成咖啡酸的方法，属于生物化工领域。

背景技术

咖啡酸是一种高价值的芳香类化合物，结构上可划分为羟基肉桂酸，其同时具有酚羟基和丙烯酸2个官能团。体内和体外研究表明，咖啡酸具有一系列生理功能。例如，通过氧化机制，咖啡酸可以抑制癌细胞增殖；咖啡酸具有免疫调节和抗炎活性；咖啡酸亦可作为抗氧化剂，且优于其他天然化合物；另外，咖啡酸还具有抗病毒、抗抑郁、治疗糖尿病等活性。

作为木质素合成的关键中间代谢产物，咖啡酸存在于几乎所有植物中。该途径以L-酪氨酸或L-苯丙氨酸为前体，涉及到反-肉桂酸4-单加氧酶(CYP73A)、苯丙氨酸/酪氨酸氨基裂合酶、对香豆酸3-羟化酶等。然而，咖啡酸在植物中的含量普遍很低，因此提取困难。另一方面，化学方法合成的咖啡酸为顺势咖啡酸和反式咖啡酸的混合物；且由于结构的相似性，完全分离纯化出单一的任一化合物都较为困难。

通过合成生物学途径策略，将咖啡酸在植物中的合成途径平移至微生物底盘中，构建具有咖啡酸合成能力的工程菌是目前主要的研究思路。然而，由于酪氨酸等底物的溶解性较差，该类工程菌的咖啡酸产量和对底物的转化率均较低。通过以L-酪氨酸高产菌株作为咖啡酸异源合成途径的底盘，有助于解决该问题，然而效果并不理想，其表现为生产周期较长，且产量并未显著提高。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种咖啡酸的生物合成方法，为此，本发明首先提供了一种共表达酪氨酸苯裂合酶EhTPL和酪氨酸氨基裂合酶RgTAL的重组大肠杆菌，在较宽的底物浓度范围及反应条件下，均能有效合成咖啡酸。

所述的酪氨酸苯裂合酶EhTPL来源于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码酪氨酸苯裂合酶的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的酪氨酸氨基裂合酶RgTAL来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码酪氨酸氨基裂合酶的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所用的表达载体为pET28a(PB)，该载体用于单独表达EhTPL或RgTAL，或通过ePathBrick构建EhTPL和TcXAL的共表达结构。其DNA序列为SEQ IDNO.5。

在本发明的一种实施方式中，基因EhTPL和RgTAL通过ePathBrick策略构建不同的共表达结构。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌含有通过pET28a(PB)以假操纵子的结构顺序表达EhTPL和RgTAL基因的重组质粒pPsdOpr2。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌含有通过pET28a(PB)以单顺反子的结构顺序表达EhTPL和RgTAL基因的重组质粒pMnCisTr2。

本发明还提供应用所述重组大肠杆菌以邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵等低值化合物作为底物，通过全细胞转化合成咖啡酸的方法。

在本发明的一种实施方式中，重组大肠杆菌的培养使用TB培养基。

在本发明的一种实施方式中，全细胞转化体系中重组大肠杆菌的浓度是OD₆₀₀＝18±1；底物为10–100mM的邻苯二酚，NH₄Cl、丙酮酸钠和邻苯二酚的浓度的比例为13：1：1；反应温度为25–42℃。

在本发明的一种实施方式中，全细胞转化体系中重组大肠杆菌的浓度是OD₆₀₀＝18±1，转化体系中还含有0.65M NH₄Cl、50mM丙酮酸钠和50mM邻苯二酚作为底物，在37℃、220rpm条件下进行全细胞转化。

本发明中，酪氨酸苯裂合酶(tyrosine phenol-lyase,TPL)以邻苯二酚、丙酮酸和氨作为底物，合成3,4-二羟基L-苯丙氨酸(L-DOPA，左旋多巴)。来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸氨基裂合酶RgTAL将左旋多巴转化为反-咖啡酸和NH₃，如式(1)所示：

本发明构建的重组菌以邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵合成咖啡酸时，咖啡酸的产量可达到1.51g/L，由于邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵均为相对廉价的化合物，因此本发明方法是一种具有较大潜力的咖啡酸生物合成方法。与以往的以L-酪氨酸为底物的生物转化方法相比，本发明方法在咖啡酸产量方面有了明显的提高。与化学合成方法相比，该方法的产物为单一的反-咖啡酸，不需要对同分异构体进行进一步的分离。

附图说明

图1、将邻苯二酚、丙酮酸和氨转化为咖啡酸的技术路线。

图2、pET28a(PB)的结构。

图3、EhTPL和RgTAL的不同共表达结构。

图4、左旋多巴的色谱图和质谱图。其中，A为色谱图，B为一级质谱图，C为二级质谱图。

图5、strEhTPL转化左旋多巴合成的产量曲线。

图6、咖啡酸的色谱图。其中，1为咖啡酸对应的色谱峰。

图7、咖啡酸的质谱图。其中，A为负离子模式下m/z＝179.0350对应的提取粒子流，B为一级质谱图，C为二级质谱图。

图8、strRgTAL转化咖啡酸合成的时间曲线。

图9、strRgTAL转化咖啡酸的底物浓度与产量的关系。

具体实施方式

邻苯二酚、左旋多巴(L-DOPA)和咖啡酸标准品购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)，分析纯邻苯二酚、左旋多巴(L-DOPA)、氯化铵和丙酮酸钠购自生工生物工程(上海)有限公司。来源于草生欧文氏菌Erwinia herbicola的酪氨酸苯裂合酶基因EhTPL和来源于粘红酵母Rhodotorula glutinis的酪氨酸氨基裂合酶基因RgTAL由金斯瑞生物科技有限公司优化并合成。其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，DNA序列分别为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4。

TB培养基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油4ml/L，磷酸二氢钾17mM，磷酸氢二钾72mM。为防止沉淀，将磷酸二氢钾/磷酸氢二钾配制成10倍浓度的母液，过滤除菌，使用前加入。其他成分121℃高压蒸汽灭菌15min。

50mM磷酸盐缓冲液PBS：分别配置50mM的NaH₂PO₄和50mM的Na₂HPO₄，以NaH₂PO₄滴定Na₂HPO₄至不同的pH。

重组大肠杆菌的培养方法：将平板划线分离的单菌落转接至含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm过夜培养。以1％(v/v)的接种量转接至装有25mL TB培养基的250mL三角瓶中，同时添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素。37℃、220rpm培养4h后，添加终浓度为500μM的IPTG诱导EhTPL、RgTAL或融合蛋白的表达，将三角瓶转移至25℃、220rpm，继续培养10h。将菌液收集到离心管中，4000rpm、4℃离心5min收集菌体。

咖啡酸的全细胞转化方法：以25mL PBS洗涤收集的菌体，离心后重悬于等体积的PBS中。同时添加0.65M NH₄Cl、50mM丙酮酸钠和50mM邻苯二酚作为底物进行反应，该反应在恒温摇床上进行。在不同的时间点取样进行分析。

全细胞转化的样品分析：将样品12000rpm离心2min，取上清，以甲醇稀释10倍后，使用0.22μm滤膜过滤。样品分析使用Shimadzu LC-MS/MS-IT-TOF，进样体积10μL，使用自动进样器进样。使用C18反向色谱柱(Thermo scientific,ODS-2HYPERSIL,Dim.(mm)250×4.6,particle size 5μm)对样品进行分离。流动相A为水，流动相B为甲醇。使用梯度洗脱，0min 5％B，8min 25％B，9min 5％B，维持该浓度至12min。流速为1mL/min。柱温：40℃。使用紫外检测器，λ＝323nm测定咖啡酸，λ＝280nm测定左旋多巴。质谱分析使用负离子模式，以提取离子流(extracted ion chromatograms,EIC)m/z＝179.0350检测咖啡酸，以提取离子流m/z＝196.0615检测左旋多巴。二级质谱MS/MS分析的前体分别为：咖啡酸179.0350m/z，左旋多巴196.0615m/z；宽度设置为1Da。通过与标准品的保留时间、一级质谱、二级质谱图进行比对，确定目标物质。使用液相色谱图的峰面积对咖啡酸和左旋多巴进行定量分析。

实施例1重组大肠杆菌的构建方法

(I)EhTPL和RgTAL共表达载体的构建

基因EhTPL和RgTAL由金斯瑞生物科技有限公司优化合成，并克隆至pUC57-Simple，重组质粒分别命名为pUC57-EhTPL和pUC57-RgTAL。pET28a(PB)是以pET-28a(+)为基础构建的ePathBrick表达载体，该载体包含同尾酶Avr II、Xba I、Spe I和Nhe I即下游的Sal I，可以通过ePathBrick策略构建不同的共表达结构。pET28a(PB)的结构如图2，DNA序列为SEQ ID NO.5。分别使用限制性内切酶Bam HI/Hind III消化重组载体pUC57-EhTPL、pUC57-RgTAL和表达载体pET28a(PB)，使用琼脂糖凝胶电泳分离没切产物，并分别回收目的基因EhTPL(1371bp)、RgTAL(2082bp)和表达载体pET28a(PB)(5371bp)。按照摩尔比4:1，将两种目的基因分别与表达载体pET28a(PB)混合，使用T4连接酶在16℃条件下连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB平板。通过菌落PCR验证阳性转化子，所用引物序列为SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.7。将阳性转化子转接至含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm过夜培养后提取质粒。经Bam HI/HindIII双酶切验证正确的重组质粒分别标记为pET-EhTPL和pET-RgTAL。根据4种同尾酶AvrII、Xba I、Spe I、Nhe I及Sal I的组合，分别通过酶切、连接构建不同结构的共表达载体。所使用的酶切位点、回收片段的大小及构建的共表达质粒如表1所示。不同的表达结构如图3A所示。

表1本实施例构建的RgTAL和EhTPL共表达载体

(II)EhTPL和RgTAL融合表达载体的构建

分别使用引物对SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11扩增基因RgTAL和EhTPL，使用引物SEQ ID NO.16/SEQ ID NO.17扩增质粒pUC18，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收后，使用Gibson Assembly试剂盒组装为重组质粒pUC18-RgTAL-EhTPL；分别使用引物SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14/SEQ ID NO.15扩增基因EhTPL和RgTAL，使用引物SEQ ID NO.16/SEQ ID NO.17扩增质粒pUC18，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收后，使用Gibson Assembly试剂盒组装为重组质粒pUC18-EhTPL-RgTAL。两条基因均由编码连接肽GGGS的核酸序列“GGT GGT GGT TCT”连接。分别使用限制性内切酶Bam HI/Hind III消化pUC18-RgTAL-EhTPL、pUC18-EhTPL-RgTAL和pET-28a(PB)，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，回收大小为3468bp的融合基因RgTAL-EhTPL和EhTPL-RgTAL，以及大小为5346bp的pET-28a(PB)。经胶回收纯化后，使用T4连接酶将融合基因与载体连接成环，分别得到重组表达载体pFus1和pFus2。重组载体结构如图2B所示。

所构建的共表达载体经Sanger测序验证正确后，分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建得到一系列工程菌株，如表2所示。

表2本实施例所构建的菌株、基因性状及质粒的结构

实施例2重组大肠杆菌strEhTPL催化左旋多巴合成能力分析

为了重组大肠杆菌strEhTPL催化邻苯二酚合成左旋多巴的能力，以含有空质粒pET28a(PB)的大肠杆菌strCtr作为空白对照，根据上述转化方法，以PBS(50mM,pH 7.0)作为反应介质，在37℃、220rpm条件下反应，特定时间点取样，测定左旋多巴的合成情况。

结果表明，以strEhTPL催化的反应体系中有左旋多巴的合成，而空白对照中则未检测到左旋多巴。该结果验证了EhTPL催化邻苯二酚合成左旋多巴的能力，且在没有酪氨酸苯裂合酶存在的情况下该合成过程不能自发进行。左旋多巴的色谱图和质谱图如图4，其中，A为左旋多巴的色谱图，B为一级质谱图，C为二级质谱图。通过左旋多巴的产量对取样时间点作图，可以确定在转化0.5小时左旋多巴即达到最大产量1.64g/L，如图5所示。

实施例3重组大肠杆菌strRgTAL催化咖啡酸合成能力分析及底物浓度优化

培养重组大肠杆菌strRgTAL，以0.5mM IPTG诱导RgTAL的表达。以25mL PBS洗涤收集的菌体，离心后重悬于等体积的PBS(50mM,pH 7.0)中，菌体浓度为OD₆₀₀＝18±1。同时添加终浓度为1g/L的左旋多巴作为底物进行反应，该反应在37℃、220rpm恒温摇床上进行。以含有空质粒pET-28a(PB)的大肠杆菌strCtr作为空白对照。特定时间点取样，测定咖啡酸的合成情况。

结果表明，以strRgTAL催化的反应体系中有咖啡酸的合成，而空白对照中则未检测到咖啡酸。该结果验证了RgTAL催化左旋多巴合成咖啡酸的能力，且该转化过程不能自发进行。咖啡酸的色谱图如图6，其中，1为咖啡酸对应的峰；咖啡酸的质谱图如图7所示，其中A为提取粒子流，B为一级质谱图，C为二级质谱图。通过咖啡酸的产量对取样时间点作图，可以确定在转化8小时咖啡酸达到最大产量626.10mg/L，转化率为68.53％，如图8所示。

对咖啡酸转化过程中的底物浓度进行优化，以重组大肠杆菌strRgTAL作为催化剂，左旋多巴添加浓度分别为2g/L、5g/L和10g/L。转化条件为在上述最优条件，即37℃、220rpm、pH 7.5。在第6小时取样，测定咖啡酸的产量和转化率。

如图9所示，结果表明，随着底物浓度的增加，咖啡酸的产量不断提高，10g/L时的咖啡酸产量最高，达到4.33g/L。但是，随着底物浓度的提高，底物的转化率不断降低。原因可能在于，底物在6h时尚未完全转化。因此，延长转化时间可能有利于进一步提高底物的转化率。

实施例3重组大肠杆菌催化邻苯二酚合成咖啡酸能力验证

为了验证表2所列重组大肠杆菌转化邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵合成咖啡酸的能力，以25mL PBS洗涤收集的菌体，离心后重悬于等体积的PBS(50mM,pH 7.0)中，菌体浓度为OD₆₀₀＝18±1。同时添加0.65M NH₄Cl、50mM丙酮酸钠和50mM邻苯二酚作为底物进行反应，该反应在37℃、220rpm恒温摇床上进行。以含有空质粒pET28a(PB)的大肠杆菌strCtr作为空白对照。特定时间点取样，测定咖啡酸的合成情况。以0-10小时内咖啡酸的最大产量作为该菌株对应的最大产量。

结果表明，重组大肠杆菌均能够催化邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵合成咖啡酸；且空白对照的转化体系中不能检测到咖啡酸的合成。样品分析的色谱图如图6所示，其中咖啡酸对应的色谱峰为(1)；样品分析的质谱图如图7所示，其中A为负离子模式下m/z＝179.0350对应的提取粒子流，B为一级质谱图，C为二级质谱图。strPsdOpr2对应的咖啡酸产量最高，达到1.51g/L。说明该重组大肠杆菌对应的EhTPL和RgTAL共表达结构能够平衡底物到咖啡酸的代谢流。另一方面，表达融合基因的重组大肠杆菌的咖啡酸产量普遍低于共表达EhTPL和RgTAL的菌株，这可能与蛋白质融合导致的空间位阻效应有关。

表2不同重组大肠杆菌所携带的外源基因结构及咖啡酸产量

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种以邻苯二酚为底物高效合成咖啡酸的方法

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 456

<212> PRT

<213> Erwinia herbicola

<400> 1

Met Asn Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val Glu Thr Val

1 5 10 15

Ser Met Ile Ser Arg Asp Glu Arg Val Lys Lys Met Gln Glu Ala Gly

20 25 30

Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ile Asp Leu Leu

35 40 45

Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp Ala Gly Met

50 55 60

Met Ile Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Glu Asn Phe Tyr His Leu

65 70 75 80

Glu Lys Thr Val Lys Glu Leu Phe Gly Phe Lys His Ile Val Pro Thr

85 90 95

His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gln Leu Ala Ile Lys

100 105 110

Pro Gly Gln Tyr Val Ala Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Phe

115 120 125

His Gln Glu Lys Asn Gly Ala Thr Phe Val Asp Ile Val Arg Asp Glu

130 135 140

Ala His Asp Ala Ser Leu Asn Leu Pro Phe Lys Gly Asn Ile Asp Leu

145 150 155 160

Asn Lys Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala

165 170 175

Tyr Ile Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Val

180 185 190

Ser Met Ala Asn Met Arg Ala Val His Glu Met Ala Ser Thr Tyr Gly

195 200 205

Ile Lys Ile Tyr Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn Ala Tyr Phe

210 215 220

Ile Lys Glu Gln Glu Ala Gly Tyr Glu Asn Val Ser Ile Lys Asp Ile

225 230 235 240

Val His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met Ser Gly Lys

245 250 255

Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met Asn Asp Glu

260 265 270

Glu Met Phe Ser Ala Ala Lys Glu Leu Val Val Val Tyr Glu Gly Met

275 280 285

Pro Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Met Ala Ile

290 295 300

Gly Leu Arg Glu Ala Met Gln Tyr Glu Tyr Ile Glu His Arg Val Lys

305 310 315 320

Gln Val Arg Tyr Leu Gly Asp Lys Leu Arg Glu Ala Gly Val Pro Ile

325 330 335

Val Glu Pro Thr Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Arg Phe

340 345 350

Cys Pro His Leu Thr Gln Asp Gln Phe Pro Ala Gln Ser Leu Ala Ala

355 360 365

Ser Ile Tyr Met Glu Thr Gly Val Arg Ser Met Glu Arg Gly Ile Val

370 375 380

Ser Ala Gly Arg Ser Lys Glu Thr Gly Glu Asn His Ser Pro Lys Leu

385 390 395 400

Glu Thr Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Tyr Ala His

405 410 415

Met Asp Val Ile Ala Asp Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Gln His Lys Glu

420 425 430

Asp Ile Arg Gly Leu Thr Phe Val Tyr Glu Pro Lys Gln Leu Arg Phe

435 440 445

Phe Thr Ala Arg Phe Asp Phe Ile

450 455

<210> 2

<211> 693

<212> PRT

<213> Rhodotorula glutinis

<400> 2

Met Ala Pro Arg Pro Thr Ser Gln Ser Gln Ala Arg Thr Cys Pro Thr

1 5 10 15

Thr Gln Val Thr Gln Val Asp Ile Val Glu Lys Met Leu Ala Ala Pro

20 25 30

Thr Asp Ser Thr Leu Glu Leu Asp Gly Tyr Ser Leu Asn Leu Gly Asp

35 40 45

Val Val Ser Ala Ala Arg Lys Gly Arg Pro Val Arg Val Lys Asp Ser

50 55 60

Asp Glu Ile Arg Ser Lys Ile Asp Lys Ser Val Glu Phe Leu Arg Ser

65 70 75 80

Gln Leu Ser Met Ser Val Tyr Gly Val Thr Thr Gly Phe Gly Gly Ser

85 90 95

Ala Asp Thr Arg Thr Glu Asp Ala Ile Ser Leu Gln Lys Ala Leu Leu

100 105 110

Glu His Gln Leu Cys Gly Val Leu Pro Ser Ser Phe Asp Ser Phe Arg

115 120 125

Leu Gly Arg Gly Leu Glu Asn Ser Leu Pro Leu Glu Val Val Arg Gly

130 135 140

Ala Met Thr Ile Arg Val Asn Ser Leu Thr Arg Gly His Ser Ala Val

145 150 155 160

Arg Leu Val Val Leu Glu Ala Leu Thr Asn Phe Leu Asn His Gly Ile

165 170 175

Thr Pro Ile Val Pro Leu Arg Gly Thr Ile Ser Ala Ser Gly Asp Leu

180 185 190

Ser Pro Leu Ser Tyr Ile Ala Ala Ala Ile Ser Gly His Pro Asp Ser

195 200 205

Lys Val His Val Val His Glu Gly Lys Glu Lys Ile Leu Tyr Ala Arg

210 215 220

Glu Ala Met Ala Leu Phe Asn Leu Glu Pro Val Val Leu Gly Pro Lys

225 230 235 240

Glu Gly Leu Gly Leu Val Asn Gly Thr Ala Val Ser Ala Ser Met Ala

245 250 255

Thr Leu Ala Leu His Asp Ala His Met Leu Ser Leu Leu Ser Gln Ser

260 265 270

Leu Thr Ala Met Thr Val Glu Ala Met Val Gly His Ala Gly Ser Phe

275 280 285

His Pro Phe Leu His Asp Val Thr Arg Pro His Pro Thr Gln Ile Glu

290 295 300

Val Ala Gly Asn Ile Arg Lys Leu Leu Glu Gly Ser Arg Phe Ala Val

305 310 315 320

His His Glu Glu Glu Val Lys Val Lys Asp Asp Glu Gly Ile Leu Arg

325 330 335

Gln Asp Arg Tyr Pro Leu Arg Thr Ser Pro Gln Trp Leu Gly Pro Leu

340 345 350

Val Ser Asp Leu Ile His Ala His Ala Val Leu Thr Ile Glu Ala Gly

355 360 365

Gln Ser Thr Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val Glu Asn Lys Thr Ser

370 375 380

His His Gly Gly Asn Phe Gln Ala Ala Ala Val Ala Asn Thr Met Glu

385 390 395 400

Lys Thr Arg Leu Gly Leu Ala Gln Ile Gly Lys Leu Asn Phe Thr Gln

405 410 415

Leu Thr Glu Met Leu Asn Ala Gly Met Asn Arg Gly Leu Pro Ser Cys

420 425 430

Leu Ala Ala Glu Asp Pro Ser Leu Ser Tyr His Cys Lys Gly Leu Asp

435 440 445

Ile Ala Ala Ala Ala Tyr Thr Ser Glu Leu Gly His Leu Ala Asn Pro

450 455 460

Val Thr Thr His Val Gln Pro Ala Glu Met Ala Asn Gln Ala Val Asn

465 470 475 480

Ser Leu Ala Leu Ile Ser Ala Arg Arg Thr Thr Glu Ser Asn Asp Val

485 490 495

Leu Ser Leu Leu Leu Ala Thr His Leu Tyr Cys Val Leu Gln Ala Ile

500 505 510

Asp Leu Arg Ala Ile Glu Phe Glu Phe Lys Lys Gln Phe Gly Pro Ala

515 520 525

Ile Val Ser Leu Ile Asp Gln His Phe Gly Ser Ala Met Thr Gly Ser

530 535 540

Asn Leu Arg Asp Glu Leu Val Glu Lys Val Asn Lys Thr Leu Ala Lys

545 550 555 560

Arg Leu Glu Gln Thr Asn Ser Tyr Asp Leu Val Pro Arg Trp His Asp

565 570 575

Ala Phe Ser Phe Ala Ala Gly Thr Val Val Glu Val Leu Ser Ser Thr

580 585 590

Ser Leu Ser Leu Ala Ala Val Asn Ala Trp Lys Val Ala Ala Ala Glu

595 600 605

Ser Ala Ile Ser Leu Thr Arg Gln Val Arg Glu Thr Phe Trp Ser Ala

610 615 620

Ala Ser Thr Ser Ser Pro Ala Leu Ser Tyr Leu Ser Pro Arg Thr Gln

625 630 635 640

Ile Leu Tyr Ala Phe Val Arg Glu Glu Leu Gly Val Lys Ala Arg Arg

645 650 655

Gly Asp Val Phe Leu Gly Lys Gln Glu Val Thr Ile Gly Ser Asn Val

660 665 670

Ser Lys Ile Tyr Glu Ala Ile Lys Ser Gly Arg Ile Asn Asn Val Leu

675 680 685

Leu Lys Met Leu Ala

690

<210> 3

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaactatc cggcagaacc gtttcgcatc aaaagcgtcg aaaccgtcag catgatcagc 60

cgcgacgaac gcgtcaaaaa gatgcaggaa gcgggctata acacctttct gctgaacagc 120

aaagacatct acatcgacct gctgaccgat tctggcacca acgcaatgtc cgataaacag 180

tgggccggta tgatgattgg cgacgaagca tacgcgggta gcgaaaactt ttaccacctg 240

gagaaaaccg tcaaagagct gttcggcttc aaacacattg ttccgaccca tcaaggtcgc 300

ggtgcagaaa atctgctgag tcagctggca attaaaccgg gtcagtacgt tgccggtaac 360

atgtacttca ccaccacccg tttccatcag gagaaaaacg gcgcgacctt cgtcgatatc 420

gttcgtgacg aagcacacga cgcaagtctg aatctgccgt tcaaaggcaa catcgacctg 480

aacaaactgg cgaccctgat caaagagaaa ggcgcagaaa acattgcgta tatctgcctg 540

gcagttaccg ttaatctggc aggcggtcaa ccggtttcta tggcgaatat gcgcgctgtt 600

cacgaaatgg caagcaccta cggcatcaaa atctactacg acgctacccg ttgcgttgaa 660

aacgcgtact tcatcaaaga gcaggaagcg ggctacgaaa acgtcagcat caaagacatc 720

gtccacgaaa tgtttagcta cgctgacggt tgcaccatgt ctggcaaaaa agactgcctg 780

gtcaacattg gcggctttct gtgcatgaac gacgaagaaa tgttcagcgc cgcgaaagaa 840

ctggttgttg tctacgaagg tatgccgtct tacggtggtc tggctggtcg cgatatggaa 900

gcaatggcaa ttggtctgcg cgaagcaatg cagtacgaat acatcgagca ccgcgtcaaa 960

caggttcgtt atctgggcga taaactgcgc gaagcaggcg ttccgattgt agaaccgacc 1020

ggcggtcacg cagtttttct ggacgcacgt cgtttttgtc cgcatctgac ccaggatcaa 1080

tttccggcac aaagcctggc agcatctatt tacatggaaa ccggcgtccg ttctatggaa 1140

cgtggtattg ttagcgcagg tcgtagcaaa gaaaccggcg aaaaccatag cccgaaactg 1200

gaaaccgttc gtctgaccat tccgcgtcgc gtttatacct acgcgcacat ggacgtcatc 1260

gcggacggta ttatcaaact gtaccagcac aaagaggaca ttcgcggcct gacctttgtt 1320

tacgaaccga aacagctgcg cttctttacc gcgcgtttcg acttcatcta a 1371

<210> 4

<211> 2082

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggcgccgc gcccgacttc tcaaagccag gcccgcactt gcccgaccac ccaggttacc 60

caagttgata tcgttgagaa aatgctggcg gctccgactg atagcaccct ggagctggac 120

ggttatagcc tgaacctggg tgatgttgtg agcgctgcgc gtaagggtcg tccggttcgt 180

gttaaagata gcgatgaaat ccgcagcaaa atcgacaaga gcgttgaatt tctgcgcagc 240

caactgagca tgtctgttta cggtgtgacc accggctttg gcggctccgc ggacacccgc 300

accgaggacg caattagcct gcaaaaggcg ctgctggaac accagctgtg tggtgtgctg 360

ccgagcagct tcgacagctt tcgcctgggt cgtggtctgg agaacagcct gccgctggaa 420

gttgttcgcg gtgcaatgac cattcgtgtg aactctctga cccgtggcca tagcgctgtt 480

cgtctggttg ttctggaagc actgaccaac tttctgaacc acggtattac cccgattgtt 540

ccgctgcgcg gtaccatctc cgcgagcggc gatctgtctc cactgtctta cattgcagcg 600

gcgattagcg gtcacccgga tagcaaagtt cacgtggttc atgaaggcaa agagaagatc 660

ctgtacgcgc gcgaagcgat ggcgctgttt aacctggagc cggtggttct gggtccgaag 720

gagggcctgg gtctggtgaa cggtaccgca gtttccgcga gcatggcaac cctggcactg 780

cacgacgcgc acatgctgag cctgctgagc caatctctga ccgcgatgac cgtggaggcg 840

atggttggtc acgcgggcag cttccatcca ttcctgcacg atgttacccg tccgcacccg 900

acccaaatcg aggttgcggg taacattcgc aaactgctgg agggctctcg cttcgcggtt 960

caccacgagg aagaggttaa ggttaaggat gatgaaggca ttctgcgtca ggatcgttat 1020

ccgctgcgca ccagcccgca atggctgggt ccgctggtgt ccgacctgat tcacgctcat 1080

gccgttctga ccatcgaagc gggtcaaagc accaccgata acccactgat cgatgttgag 1140

aacaagacca gccatcacgg tggcaacttt caagcggcag cggttgccaa cactatggaa 1200

aagacccgtc tgggcctggc ccaaatcggt aaactgaact tcacccagct gaccgagatg 1260

ctgaacgcgg gcatgaaccg tggcctgccg agctgcctgg cggctgaaga cccatccctg 1320

agctatcatt gcaaaggtct ggacattgcg gcggctgcat ataccagcga actgggccac 1380

ctggctaacc cggttaccac ccacgttcaa ccggctgaaa tggcaaacca ggcggtgaac 1440

agcctggcgc tgattagcgc acgtcgtacc accgaatcta acgacgttct gtccctgctg 1500

ctggcaaccc acctgtactg cgtgctgcag gcgatcgacc tgcgtgcgat tgagttcgag 1560

ttcaagaaac agtttggtcc ggccattgtt agcctgatcg accaacactt tggtagcgcg 1620

atgaccggta gcaacctgcg tgatgagctg gttgaaaagg ttaacaagac tctggccaag 1680

cgtctggagc aaaccaacag ctacgatctg gttccgcgct ggcacgacgc ttttagcttc 1740

gctgcaggca ctgttgttga ggttctgtcc agcaccagcc tgagcctggc ggccgtgaac 1800

gcatggaagg ttgcggcagc cgagagcgcg atctccctga cccgccaggt tcgtgaaacc 1860

ttttggtccg ctgcaagcac ctccagcccg gcgctgtctt acctgagccc gcgcacccag 1920

atcctgtacg catttgtgcg tgaggaactg ggtgttaaag cccgccgtgg tgacgttttc 1980

ctgggtaaac aagaagttac catcggcagc aacgttagca agatttacga agccatcaag 2040

agcggccgta tcaacaacgt tctgctgaag atgctggcat aa 2082

<210> 5

<211> 5371

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gccatattca acgggaaacg tcttgctcta ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg 60

atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc 120

gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg 180

ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc 240

cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc 300

ccgggaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg 360

atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta 420

acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg 480

atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa 540

tgcataaact tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg 600

ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa 660

tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt 720

cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc 780

agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aagaattaat tcatgagcgg atacatattt 840

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 900

cctgaaattg taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc 960

tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc 1020

gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 1080

tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca 1140

ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg 1200

agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag 1260

aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc 1320

accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt cccattcgcc aatccggagt 1380

cgactcctcc tttcgctagc aaaaaacccc tcaagacccg tttagaggcc ccaaggggtt 1440

atgctagtta ttgctcagcg gtggcagcag ccaactcagc ttcctttact agtttgttag 1500

cagccggatc tcagtggtgg tggtggtggt gctcgagtgc ggccgcaagc ttgtagacgg 1560

agctcgaatt cggatccgcg acccatttgc tgtccaccag tcatgcttgc catatggctg 1620

ccgcgcggca ccaggccgct gctgtgatga tgatgatgat ggctgctgcc catggtatat 1680

ctccttctta aagttaaaca aaattatttc tagaggggaa ttgttatccg ctcacaattc 1740

ccctatagtg agtcgtatta atttcgcggg atcgagatct cgatcctcta cgccggacgc 1800

atcgtggccg gcatcaccgg cgcctaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca 1860

ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta 1920

tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc 1980

ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt 2040

cgcataaggg agagcgtcga gatcccggac accatcgaat ggcgcaaaac ctttcgcggt 2100

atggcatgat agcgcccgga agagagtcaa ttcagggtgg tgaatgtgaa accagtaacg 2160

ttatacgatg tcgcagagta tgccggtgtc tcttatcaga ccgtttcccg cgtggtgaac 2220

caggccagcc acgtttctgc gaaaacgcgg gaaaaagtgg aagcggcgat ggcggagctg 2280

aattacattc ccaaccgcgt ggcacaacaa ctggcgggca aacagtcgtt gctgattggc 2340

gttgccacct ccagtctggc cctgcacgcg ccgtcgcaaa ttgtcgcggc gattaaatct 2400

cgcgccgatc aactgggtgc cagcgtggtg gtgtcgatgg tagaacgaag cggcgtcgaa 2460

gcctgtaaag cggcggtgca caatcttctc gcgcaacgcg tcagtgggct gatcattaac 2520

tatccgctgg atgaccagga tgccattgct gtggaagctg cctgcactaa tgttccggcg 2580

ttatttcttg atgtctctga ccagacaccc atcaacagta ttattttctc ccatgaagac 2640

ggtacgcgac tgggcgtgga gcatctggtc gcattgggtc accagcaaat cgcgctgtta 2700

gcgggcccat taagttctgt ctcggcgcgt ctgcgtctgg ctggctggca taaatatctc 2760

actcgcaatc aaattcagcc gatagcggaa cgggaaggcg actggagtgc catgtccggt 2820

tttcaacaaa ccatgcaaat gctgaatgag ggcatcgttc ccactgcgat gctggttgcc 2880

aacgatcaga tggcgctggg cgcaatgcgc gccattaccg agtccgggct gcgcgttggt 2940

gcggatatct cggtagtggg atacgacgat accgaagaca gctcatgtta tatcccgccg 3000

ttaaccacca tcaaacagga ttttcgcctg ctggggcaaa ccagcgtgga ccgcttgctg 3060

caactctctc agggccaggc ggtgaagggc aatcagctgt tgcccgtctc actggtgaaa 3120

agaaaaacca ccctggcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca 3180

ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat 3240

taatgtaagt tagctcactc attaggcacc gggatctcga ccgatgccct tgagagcctt 3300

caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac 3360

tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg 3420

cgaggaccgc tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat 3480

cttgcacgcc ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa 3540

gcaggccatt atcgccggca tggcggcccc acgggtgcgc atgatcgtgc tcctgtcgtt 3600

gaggacccgg ctaggctggc ggggttgcct tactggttag cagaatgaat caccgatacg 3660

cgagcgaacg tgaagcgact gctgctgcaa aacgtctgcg acctgagcaa caacatgaat 3720

ggtcttcggt ttccgtgttt cgtaaagtct ggaaacgcgg aagtcagcgc cctgcaccat 3780

tatgttccgg atctgcatcg caggatgctg ctggctaccc tgtggaacac ctacatctgt 3840

attaacgaag cgctggcatt gaccctgagt gatttttctc tggtcccgcc gcatccatac 3900

cgccagttgt ttaccctcac aacgttccag taaccgggca tgttcatcat cagtaacccg 3960

tatcgtgagc atcctctctc gtttcatcgg tatcattacc cccatgaaca gaaatccccc 4020

ttacacggag gcatcagtga ccaaacagga aaaaaccgcc cttaacatgg cccgctttat 4080

cagaagccag acattaacgc ttctggagaa actcaacgag ctggacgcgg atgaacaggc 4140

agacatctgt gaatcgcttc acgaccacgc tgatgagctt taccgcagct gcctcgcgcg 4200

tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 4260

tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 4320

gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac 4380

tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tatgcggtgt gaaataccgc 4440

acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 4500

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 4560

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 4620

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 4680

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 4740

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 4800

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 4860

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 4920

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 4980

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 5040

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 5100

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 5160

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 5220

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 5280

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gaacaataaa actgtctgct 5340

tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg a 5371

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagaaagcga aaggagcggg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccatacccac gccgaaacaa 20

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctcggtaccc ggggatccat ggcgccgcgc ccgacttctc aaa 43

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gttcatagaa ccaccacctg ccagcatctt cagcagaa 38

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctggcaggtg gtggttctat gaactatccg gcagaacc 38

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acggccagtg ccaagctttt agatgaagtc gaaacgcgcg gta 43

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctcggtaccc ggggatccat gaactatccg gcagaaccgt ttc 43

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcgccataga accaccaccg atgaagtcga aacgcgcgg 39

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttcatcggtg gtggttctat ggcgccgcgc ccgacttct 39

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acggccagtg ccaagctttt atgccagcat cttcagcaga acg 43

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggcactggcc gtcgttttac aacgt 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccgggtaccg agctcgaatt cgtaa 25

Claims

1.一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，以一种共表达酪氨酸苯裂合酶EhTPL和酪氨酸氨基裂合酶RgTAL的重组大肠杆菌，催化底物邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵，合成咖啡酸。

2.根据权利要求1所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，所述的酪氨酸苯裂合酶EhTPL来源于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，所述的酪氨酸氨基裂合酶RgTAL来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1～3任一所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

5.根据权利要求1～3任一所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，所用的表达载体为pET28a(PB)。

6.根据权利要求1～5任一所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有通过pET28a(PB)以假操纵子的结构顺序表达EhTPL和RgTAL基因的重组质粒pPsdOpr2。

7.根据权利要求1～5任一所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有通过pET28a(PB)以单顺反子的结构顺序表达EhTPL和RgTAL基因的重组质粒pMnCisTr2。

8.根据权利要求6或7所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，全细胞转化体系中重组大肠杆菌的浓度是OD₆₀₀＝18±1；底物为10–100mM的邻苯二酚，NH₄Cl、丙酮酸钠和邻苯二酚的浓度的比例为13：1：1；反应温度为25–42℃。

9.根据权利要求8所述的一种咖啡酸的生物合成方法，其特征在于，全细胞转化体系中重组大肠杆菌的浓度是OD₆₀₀＝18±1，转化体系中还含有0.65M NH₄Cl、50mM丙酮酸钠和50mM邻苯二酚作为底物，在37℃、220rpm条件下进行全细胞转化。

10.一种重组大肠杆菌，其特征在于，共表达酪氨酸苯裂合酶EhTPL和酪氨酸氨基裂合酶RgTAL，通过pET28a(PB)以假操纵子或单顺反子的结构顺序表达EhTPL和RgTAL基因。