CN107164255B - 一种构建重组酿酒酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种构建重组酿酒酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明首先敲除酿酒酵母BY4741的OPI基因，将来自酿酒酵母本身的肌醇‑1‑磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶，以及来自拟南芥的肌醇加氧酶和来自丁香假单胞菌的糖醛酸脱氢酶通过组成型质粒pY26‑GPD‑TEF导入酿酒酵母，实现酿酒酵母由葡萄糖从头合成葡萄糖二酸的途径构建。本发明构建的代谢途径避免了化学氧化法的非选择性、高能耗性和高成本性。通过工程菌的发酵培养，直接将廉价的葡萄糖转化为高附加值的D‑葡萄糖二酸，反应条件温和、转化率高、副产物少，可以极大地节约生产成本。

Description

一种构建重组酿酒酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法
技术领域
本发明涉及一种构建重组酿酒酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
D-葡糖二酸(D-glucaric acid)作为非常重要的有机酸已被广泛研究，其在医疗和工业中有着广泛的应用，比如降胆固醇、治疗糖尿病、肿瘤治疗等等，或可能用作聚合物前体，包括新型尼龙和高度分支聚酯。目前已经有利用产自葡萄糖的葡糖二酸制备羟基化尼龙的报道，羟基化尼龙是可生物降解的纤维。在美国太平洋西北国家实验室、国家再生能源实验室和美国能源部写的一份报告中，葡糖二酸被认为是”top value-added chemicalfrom biomass”。由于该有机酸的重要性，正越来越得到学术界和工业界的重视。
目前生产葡糖二酸的方法主要以化学法为主，即葡萄糖的化学氧化，采用硝酸作为溶剂和氧化剂，这是一个非选择性、高成本的过程。化学法的主要问题是低得率，只有不到40％；需要高温，会产生大量氧化反应副产物，不利于后续葡糖二酸的分离。虽然有研究发现催化剂五氧化二钒、4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基-1-二苯哌酯等可以提高葡糖二酸的得率，但是这些催化剂太昂贵。生物法合成葡糖二酸相较于传统的化学法，有着很多的优势，比如更加环境友好，更大的实现低成本生产的可能性。生物法产葡糖二酸有很多种途径。在合适的菌种中构建高效稳定的葡糖二酸合成途径，应用于工业生产，取代传统的化学途径，将是非常有前景的研究领域。
麻省理工学院Prather课题组研究了大肠杆菌代谢工程产有机酸，其在大肠杆菌中构建了合成葡糖二酸的代谢途径，同时表达了三个酶，包括来自酿酒酵母的肌醇-1-磷酸合成酶Ino1 (myo-inositol-1-phosphate)、单磷酸肌醇磷酸酶INM1(inositolmonophosphate 1-phosphatase) 来自老鼠的肌醇磷酸氧化酶MIOX(myo-inositoloxygenase)和来自丁香假单胞菌的糖醛酸脱氢酶Udh，利用大肠杆菌现有的PTS途径(phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system)，合成葡糖二酸，从葡萄糖到葡糖二酸的代谢途径。最后经优化，最终葡糖二酸的产量为1g/L，MIOX是影响最终产量的最重要因素，是整合代谢流的限速步骤。主要原因是 MIOX的不稳定性，在稳定期时，即使在没有葡糖二酸的情况下，MIOX的活力也会迅速下降。
该课题组利用蛋白融合技术提高了MIOX的稳定性，同时利用定向进化提高了MIOX的活力。将SUMO融合到MIOX的N-末端，使得葡糖二酸的产量提高了74％；虽然定向进化没有改进MIOX，但是他们筛选到了一个长941bp的DNA片段，它的表达可以提高肌醇的运输量，并且使得葡糖二酸的产量提高65％。最后，他们改造的重组大肠杆菌可以把10.8g/L 的肌醇转化成4.85g/L的葡糖二酸。该课题组还利用脚手架蛋白提高MIOX的比活力，从而提高了葡糖二酸的产量，相较于没有脚手架蛋白的对照，葡糖二酸产量提高了5倍。与之前报道的最高产量相比，提高了50％。该课题组在大肠杆菌代谢工程制备葡糖二酸的研究中取得了突破。
酿酒酵母相较于大肠杆菌，具有更高的工业应用价值，一方面前者的耐酸能力强于大肠杆菌，另一方面酵母本身可以作为单细胞蛋白用于饲料、食品等。酿酒酵母还具有其他优点，比如能够耐受低温、可低pH发酵、没有噬菌体感染、适合大规模发酵、易分离、高抗逆性等。因而酵母已经广泛用于产有机酸的研究，比如ρ-羟基苯甲酸、ρ-氨基苯甲酸、ρ-羟基苯丙烯酸、青蒿酸。而目前还没有酵母代谢工程制备葡糖二酸研究的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种产葡糖二酸的酿酒酵母工程菌株及构建方法。
本发明首先提供了一种重组酿酒酵母，首先敲除酿酒酵母BY4741的OPI基因，将来自酿酒酵母本身的肌醇-1-磷酸合成酶(INO1)和肌醇单磷酸酶(INM1)，以及来自拟南芥的肌醇加氧酶(MIOX)和来自丁香假单胞菌的糖醛酸脱氢酶(UDH)通过组成型质粒 pY26-GPD-TEF导入酿酒酵母，实现酿酒酵母由葡萄糖从头合成葡萄糖二酸的途径构建。
本发明还提供了构建所述重组酿酒酵母的方法，主要包括以下步骤：
(1)敲除酿酒酵母BY4741的OPI基因，得到酿酒酵母BY4741opi1Δ；
(2)将编码肌醇-1-磷酸合成酶、肌醇单磷酸酶的基因连接到质粒Pmri-21，得到重组质粒Pmri-GPD-TEF-INO1-INM1，线性化后，转化酿酒酵母BY4741opi1Δ，得到重组菌株BY4741opi1Δ-INO1-INM1；
(3)选择组成型质粒pY26-GPD-TEF，在pY26-GPD-TEF的多克隆位点BglII/NotI插入 MIOX4片段，得到pY26-MIOX4质粒，利用Gibson Assembly组装构建pY26-MIOX4-UDH；
(4)将pY26-MIOX4-UDH转化酿酒酵母BY4741opi1Δ-INO1-INM1，得到重组菌组BY4741opi1Δ-INO1-INM/MIOX-UDH。
其中，步骤(2)将序列如SEQ ID NO:5所示的质粒Pmri-21和pY26-INO1-INM1分别用 BglII和SalI双酶切，凝胶电泳回收Pmri-21质粒和INO1-GPD-TEF-INM1片段，T4连接酶连接相应切口，得到重组质粒Pmri-GPD-TEF-INO1-INM1，用BlpI单酶切质粒使之线性化，转化酿酒酵母BY4741opi1Δ，得到得到重组菌株BY4741opi1Δ-INO1-INM1。
所述片段INO1来自酿酒酵母BY4741基因组，如SEQ ID NO:1所示。
所述片段INM1来自酿酒酵母BY4741基因组，如SEQ ID NO:2所示。
所述片段MIOX4来自拟南芥Arabidopsis thaliana，经过密码子优化，如SEQ IDNO:3所示，插入pUC57质粒酶切位点BglII/NotI，得到pUC57-MIOX4。
所述片段UDH来自丁香假单胞菌(Pseudomonas putida)，经过密码子优化后，如SEQ ID NO:4所示，插入pUC57-MIOX4的EcoRI和SacII，得到pUC57-MIOX4-UDH。
本发明还提供了一种利用该重组酵母发酵生产葡糖二酸的方法，利用葡萄糖、蔗糖或者肌醇生产葡糖二酸。所述方法具体将重组菌种子液以1％-2％接种量接种到发酵培养基中， 30℃、200rpm，培养72小时。所述发酵培养基，在本发明的一个实施案例中，其碳源为葡萄糖或肌醇。
所述方法，在本发明的一个实施案例中，具体是将种子液按照10％的接种量接种到含有 50ml液体培养基的250ml的锥形瓶中，30℃、摇床转速200rpm，培养72小时。
由于采用了上述的技术方案,本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：本发明公开了一种全新的从头合成D-葡萄糖二酸的酿酒酵母工程菌的构建方法。其优势主要体现在以下几个方面。
1、本发明构建的代谢途径避免了化学氧化法的非选择性、高能耗性和高成本性。通过工程菌的发酵培养，直接将廉价的葡萄糖转化为高附加值的D-葡萄糖二酸，产量为10g/L，反应条件温和、转化率高、副产物少，可以极大地节约生产成本。
2、酿酒酵母相较于大肠杆菌，具有更高的工业应用价值，一方面前者的耐酸能力强于大肠杆菌，另一方面酵母本身可以作为单细胞蛋白用于饲料、食品等。酿酒酵母还具有其他优点，比如能够耐受低温、可低pH发酵、没有噬菌体感染、适合大规模发酵、易分离、高抗逆性等。因而酵母已经广泛用于产有机酸的研究，比如ρ-羟基苯甲酸、ρ-氨基苯甲酸、ρ-羟基苯丙烯酸、青蒿酸。而目前还没有酵母代谢工程制备葡糖二酸研究的相关报道。
附图说明
图1质粒pY26-MIOX4-UDH的结构示意图。
图2质粒Pmri-GPD-TEF-INO1-INM1的结构示意图。
图3葡糖二酸质谱图，A：发酵样品，B：葡糖二酸标样。
具体实施方式
葡糖二酸的检测：液质联用(LC-MS)，仪器岛津离子阱飞行时间质谱仪。
实施例1 BY4741opi1Δ酿酒酵母菌株的获得。
以pUG6质粒为模板，引物PUG 6F和PUG 6R扩增敲除框(含loxp-kan-loxp组件)，敲除框带有OPI1基因上下游各50bp碱基作为同源臂。用醋酸锂化学转化法转化酿酒酵母BY4741感受态，涂布G418抗性平板，2-3天后长出单菌落。用引物OPI-1和OPI-4菌落PCR 验证得到正确条带，将正确菌株摇瓶培养至对数期，提取基因组验证。以此菌株做感受态，转化pSH65质粒，半乳糖诱导Cre切除Kan，验证切除正确后，在YPD液体培养基中连续传代以丢失质粒pSH65，获得敲除OPI1基因的菌株BY4741opi1Δ。
在酿酒酵母中，从葡萄糖开始合成肌醇的生物合成与代谢途径基本明晰。在肌醇的合成过程中，肌醇-1-磷酸合成酶是关键酶，该酶的编码基因为INO1，是酵母中受控制最严格的基因之一。我们发现，肌醇-1-磷酸合成酶的表达受到其产物肌醇的反馈抑制，抑制过程通过阻遏因子opi1来完成。野生菌株中肌醇-1-磷酸合成酶只在对数期或缺少肌醇的情况下表达，我们对INO1基因启动子的研究发现，其启动子的上游存在一些重复序列，称作UASINO元件，在转录过程中促进启动子的表达，为上游重复激活序列。UASINO是对肌醇敏感的序列，当细胞内肌醇缺乏时，opi阻遏蛋白与复合物结合在内质网；如果肌醇过量表达，opi1基因表达的阻遏蛋白与复合物解离，由内质网释放进入细胞核与UASINO结合，酵母细胞中的肌醇-1- 磷酸合成酶便受到阻遏，细胞中的肌醇合成停止。因此，要实现肌醇的过量积累，必须敲除 opi1这个转录负调控基因。
实施例2重组菌株BY4741opi1Δ-INO1-INM1构建
选择组成型质粒pY26-GPD-TEF质粒，用SmaI单酶切质粒，利用Gibson Assembly组装构建pY26-INO1质粒；然后再用EcoRI单酶切质粒pY26-INO1质粒，利用Gibson Assembly组装构建pY26-INO1-INM1质粒。阳性克隆使用验证引物pY26F和pY26R进行验证，结果通过电泳条带大小判断。
将质粒Pmri-21和pY26-INO1-INM1分别用BglII和SalI双酶切，凝胶电泳回收Pmri21 质粒和INO1-GPD-TEF-INM1片段，T4连接酶连接相应切口，得到重组质粒 Pmri-GPD-TEF-INO1-INM1，用BlpI单酶切质粒使之线性化，转化酿酒酵母BY4741opi1Δ，涂布G418抗性平板，2-3天后长出单菌落。用引物INOF和INO-A菌落PCR验证得到正确条带，将正确菌株摇瓶培养至对数期，提取基因组验证。以此菌株做感受态，转化pSH65质粒，半乳糖诱导Cre切除Kan验证切除正确后，在YPD液体培养基中连续传代丢失质粒 pSH65，得到重组菌株BY4741opi1Δ-INO1-INM1。
实施例3重组菌组BY4741opi1Δ-INO1-INM/MIOX-UDH的构建
片段MIOX4来自拟南芥Arabidopsis thaliana，经过密码子优化，如SEQ ID NO:3所示，插入pUC57质粒酶切位点BglII/NotI，得到pUC57-MIOX4。片段UDH来自丁香假单胞菌(Pseudomonas putida)，经过密码子优化后，如SEQ ID NO:4所示，插入pUC57-MIOX4的EcoRI和SacII，得到pUC57-MIOX4-UDH。以pUC57-MIOX4-UDH为模板，分别以 pY26-MIOX4F/pY26-MIOX4R和pY26-UDHF/pY26-UDHR为引物扩增得到MIOX4和UDH 基因，经过PCR产物纯化试剂盒纯化，用SmaI单酶切pY26-GPD-TEF质粒，经过凝胶试剂盒回收片段，利用GibsonAssembly组装构建pY26-UDH质粒；然后再用EcoRI单酶切质粒 PY26-UDH质粒，利用GibsonAssembly组装构建pY26-UDH–MIOX4质粒，验证引物为PY26F 和pY26R。将构建质粒醋酸锂转化酿酒酵母BY4741opi1Δ-INO1-INM，涂布URA3缺陷平板， 2-3天长出转化子。菌落PCR验证正确，得到重组菌组BY4741opi1Δ-INO1-INM/MIOX-UDH。
表1为实施例1、2、3用到的引物
Figure BDA0001279334600000051
实施例4重组酿酒酵母发酵生产葡糖二酸
将重组酵母菌BY4741opi1Δ-INO1-INM/MIOX-UDH发酵培养，单克隆接种于25mlYPD培养基(酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)，30℃、200rpm培养24小时。按2％接种量接种于50mlYPD(摇瓶容量250ml)，发酵培养基分为YPD和YPD-MI (YPD培养基添加60mM肌醇)。在发酵24小时、48小时时添加0.5％的葡萄糖，每隔12小时取样1ml。培养结束后，将1ml发酵液在8000rpm离心5min，取上清过0.22um滤膜，通过LC-MS检测，产量为10g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种构建重组酿酒酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法
<160> 21
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1624
<212> DNA
<213> 酿酒酵母BY4741
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aggacatatt tggctgtgag gggaacaatt aataacgaaa gtgacgaaca aacaaaatat 840
atcacagact tttggaactg tgttgatggc catttgaaat atgactga 888
<210> 3
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgactatca gtgtagaaaa gcctatattt gaggaagagg tgagtgcctt cgagaaatca 60
ggcgacaata ttggagagct taagctggac ggagggtttt caatgcccaa gatggacaca 120
aatgatgatg aggctttttt ggctcccgag atgaacgcct ttggtagaca gttcagagac 180
tatgacgtcg aaagcgaaag gcaaaaagga gtagaggagt tttataggtt acagcacatt 240
aaccagacgg ttgactttgt taaaaaaatg cgtgcagaat acgggaaact tgacaagatg 300
gtaatgagca tatgggagtg ctgcgagctt ctgaatgagg ttgttgacga atcagaccct 360
gacttagatg agcctcaaat acaacatttg cttcaaagtg cggaggccat caggaaggac 420
tatcccaatg aggattggct gcatcttacg gctttaatac atgatttggg gaaggtgatc 480
acactgcctc agttcggcgg acttccccaa tgggccgtcg taggggatac gttccctgtg 540
ggatgtgctt ttgatgaaag caatgtacat cacaagtact ttgtagagaa tcccgacttc 600
cataatgaga catacaatac gaagaacggt atttattccg aaggatgcgg cttaaacaac 660
gtgatgatgt cttggggaca tgatgactat atgtatttgg tagccaaaga gaacggaagt 720
acactgccca gtgctgggca atttataata cgttaccact ctttctatcc actacacaca 780
gcaggcgaat atacgcactt gatgaatgaa gaagacaagg aaaatctgaa atggctgcac 840
gttttcaaca aatacgatct ttacagtaag tctaaagtgc atgttgacgt ggaaaaggtc 900
aagccttatt atatgagctt aataaaaaag tacttccctg aaaatctgcg ttggtga 957
<210> 4
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggcctccg ctcatactac gcaaactcca tttaatagat tattgcttac aggcgcagca 60
ggtgggttag gtaaggtttt aagagaaact ttgcgtccat attcccacat tcttcgtttg 120
tctgatatag ctgagatggc acctgccgtg ggtgatcatg aagaagttca agtttgtgac 180
cttgcagaca aggacgcagt gcacaggtta gtagagggcg tcgatgctat cttacacttt 240
ggtggagttt cagtcgaaag accatttgaa gaaattttgg gtgctaatat atgtggtgtc 300
tttcacatat acgaagctgc tagaagacat ggcgttaaaa gagtcatttt tgccagcagt 360
aaccatgtaa taggctttta taagcaaaac gaaactatcg atgcgcattc tccacgtaga 420
ccagattcat attacggtct atcaaaatcc tatggagagg atatggcgtc cttttacttt 480
gacaggtatg gtattgaaac tgttagtata aggatagggt catcatttcc tgaacctcaa 540
aataggagaa tgatgtcaac atggttatca tttgatgatc ttacccgttt gcttgagaga 600
gcattgtata cgccggacgt gggtcatacc gtcgtttacg gtgtctccga taataaaact 660
gtttggtggg acaatagatt cgcatctaag ttggattatg ctcctaagga tagttccgag 720
gtatttaggg cgaaagttga tgcacaacct atgcctgctg atgacgaccc tgccatggtc 780
taccaagggg gtgccttcgt ggcgagtggt ccgtttggtg ataaatga 828
<210> 5
<211> 3784
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggatcttcga gaacccttaa tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttattaggt 60
gatatcagat ccacggatca ctaaagggaa caaaagctgg agctggcctt gtaggcctct 120
tcgctattac gccagctgaa ttggagcgac ctcatgctat acctgagaaa gcaacctgac 180
ctacaggaaa gagttactca agaataagaa ttttcgtttt aaaacctaag agtcacttta 240
aaatttgtat acacttattt tttttataac ttatttaata ataaaaatca taaatcataa 300
gaaattcgct tatttagaag tgtcaacaac gtatctacca acgatttgac ccttttccat 360
cttttcgtaa atttctggca aggtagacaa gccgacaacc ttgattggag acttgaccaa 420
acctctggcg aagaattgtt aattaagagc tcagatctta tcgtcgtcat ccttgtaatc 480
catcgatact agtgcggccg ccctttagtg agggttgaat tcgaattttc aaaaattctt 540
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tatacatatc catatacata tccatatcta atcttactta tatgttgtgg aaatgtaaag 660
agccccatta tcttagccta aaaaaacctt ctctttggaa ctttcagtaa tacgcttaac 720
tgctcattgc tatattgaag tacggattag aagccgccga gcgggtgaca gccctccgaa 780
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cctcgcgccg cactgctccg aacaataaag attctacaat actagctttt atggttatga 900
agaggaaaaa ttggcagtaa cctggcccca caaaccttca aatgaacgaa tcaaattaac 960
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aagcgatgat ttttgatcta ttaacagata tataaatgca aaaactgcat aaccacttta 1080
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catggaggcc cagaataccc tccttgacag tcttgacgtg cgcagctcag gggcatgatg 1680
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gggaaacgct cccctcacag acgcgttgaa ttgtccccac gccgcgcccc tgtagagaaa 1860
tataaaaggt taggatttgc cactgaggtt cttctttcat atacttcctt ttaaaatctt 1920
gctaggatac agttctcaca tcacatccga acataaacaa ccatgggtaa ggaaaagact 1980
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cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccggcaaaac agcattccag 2280
gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg 2340
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caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat 2760
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atccagtgtc gaaaacgaac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 3060
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cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 3180
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accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 3300
catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 3360
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actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 3600
gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 3660
aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 3720
gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 3780
aaaa 3784
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggattctag aactagtgga tcccccgggc tgcaggatga cagaagataa tattgctcc 59
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgaggtcgac ggtatcgata agcttgatat cgaattttac aacaatctct cttcgaatc 59
<210> 8
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cctctggcga agaattgtta attaaagatc tccgctcagt catatttcaa atggccatca 60
ac 62
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gaactagcgc ggccgctgat cagttaactc cggaccatga ccattgatct agcttctatc 60
<210> 10
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aaacctctgg cgaagaattg ttaattaaag atctccgccg acgccctcta ctaacctgtg 60
c 61
<210> 11
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tagaactagc gcggccgctg atcagttaac tccggaccaa gcgtattact gaaagttcca 60
a 61
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gacggattct agaactagtg gatcccccgg gctgcaggat ggcctccgct catactacgc 60
<210> 13
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgacggtatc gataagcttg atatcgaatt ttatttatca ccaaacggac cactcg 56
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctggcaaggt agacaagccg acaa 24
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggagggcgtg aatgtaagcg tga 23
<210> 16
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ttaatgcctg tgaatgagta tagtgtttgc aacgacgata gaagtccttg cagctgaagc 60
ttcgtacgc 69
<210> 17
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tatcatttca gtattgatgg gaacgaatgt aagccctgaa gctgactctg ggataggcca 60
ctagtggatc tg 72
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gacgcttacg cagacatctc ata 23
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
agggtccgat aataatggta gttc 24
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gtcgatcaca agtaggcaca aac 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cttgaacagt gggcgttaca tcg 23

Claims (4)

1.一种重组酿酒酵母，其特征在于，首先敲除酿酒酵母BY4741的OPI基因，将来自酿酒酵母本身的编码肌醇-1-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶的基因连接到质粒Pmri-21，得到重组质粒Pmri-GPD-TEF-INO1-INM1，线性化后，转化敲除了OPI基因的酿酒酵母BY4741opi1Δ，得到重组菌株BY4741opi1Δ-INO1-INM1；再通过组成型质粒pY26-GPD-TEF，利用GibsonAssembly组装构建携带来自拟南芥的编码肌醇加氧酶和来自丁香假单胞菌的糖醛酸脱氢酶的基因的质粒pY26-MIOX4-UDH，转化酿酒酵母BY4741opi1Δ-INO1-INM1，得到重组酿酒酵母，实现酿酒酵母由葡萄糖从头合成葡萄糖二酸的途径构建；
编码所述肌醇-1-磷酸合成酶的基因INO1来自酿酒酵母BY4741基因组，如SEQ ID NO:1所示，编码所述肌醇单磷酸酶的基因INM1来自酿酒酵母BY4741基因组，如SEQ ID NO:2所示，编码所述肌醇加氧酶的基因MIOX4的序列如SEQ ID NO:3所示，编码所述糖醛酸脱氢酶的基因UDH的序列如SEQ ID NO:4所示。
2.一种构建权利要求1所述重组酿酒酵母的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)敲除酿酒酵母BY4741的OPI基因，得到酿酒酵母BY4741opi1Δ；
(2)将编码肌醇-1-磷酸合成酶、肌醇单磷酸酶的基因连接到质粒Pmri-21，得到重组质粒Pmri-GPD-TEF-INO1-INM1，线性化后，转化酿酒酵母BY4741opi1Δ，得到重组菌株BY4741opi1Δ-INO1-INM1；
(3)选择组成型质粒pY26-GPD-TEF，在pY26-GPD-TEF的多克隆位点BglII/NotI插入编码肌醇加氧酶的基因片段MIOX4，得到pY26-MIOX4质粒，利用Gibson Assembly进一步组装构建pY26-MIOX4-UDH；
(4)将pY26-MIOX4-UDH转化酿酒酵母BY4741opi1Δ-INO1-INM1，得到重组菌组BY4741opi1Δ-INO1-INM/MIOX-UDH。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)将序列如SEQ ID NO:5所示的质粒Pmri-21和pY26-INO1-INM1分别用BglII和SalI双酶切，凝胶电泳回收Pmri-21质粒和INO1-GPD-TEF-INM1片段，T4连接酶连接相应切口，得到重组质粒Pmri-GPD-TEF-INO1-INM1，用BlpI单酶切质粒使之线性化，转化酿酒酵母BY4741opi1Δ，得到得到重组菌株BY4741opi1Δ-INO1-INM1。
4.一种利用权利要求1所述重组酿酒酵母生产葡糖二酸的方法，其特征在于，利用葡萄糖、蔗糖或者肌醇生产葡糖二酸，将重组菌种子液接种到发酵培养基中，30℃、200rpm，培养72小时。
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Saccharomyces cerevisiae S288c inositol...e 1-phosphatase IN;GenBank;《GenBank：NM_001179176.1》;20170217;核苷酸和氨基酸及相关信息 *

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