CN106978434A - 一种在毕赤酵母内表达蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在毕赤酵母内表达蛋白的方法，包括如下步骤：(1)根据酵母细胞偏爱密码子优化原始T7 RNA聚合酶基因序列；优化后的T7 RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；按照优化的序列合成上、下游带酶切位点的T7聚合酶基因片段；(2)将T7 RNA聚合酶基因片段克隆到组成型毕赤酵母表达质粒pGAPZ A中，构建得到pGAPZ A‑RNAP质粒，并转化至毕赤酵母表达菌株，筛选获得稳定表达T7 RNA聚合酶的菌株；(3)将外源基因克隆至表达载体的多克隆位点上，转化至步骤(2)中的稳定表达T7 RNA聚合酶的菌株，以及表达蛋白。本发明在毕赤酵母内使用T7转录系统来表达蛋白，转录效率高，表达蛋白量大，所述方法无需筛选高表达的菌株，耗费时间短。

Description

一种在毕赤酵母内表达蛋白的方法

技术领域

本发明涉及重组蛋白表达领域，尤其涉及一种在毕赤酵母内表达蛋白的方法。

背景技术

目前毕赤酵母表达系统，通常采用AOX1启动子进行外源基因的表达，且目的基因整合到酵母染色体。AOX1启动子表达量相对原核系统T7启动子普遍低很多，不同菌落之间由于外源基因整合差异，导致表达量差异大，往往需要耗费数月的时间来筛选合适的表达菌株，且在传代过程中外源基因丢失的情况普遍。相对来讲，提高酵母表达系统的产量，简化表达菌株筛选过程具有重要意义。

发明内容

为了解决上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种在毕赤酵母内表达蛋白的方法，本发明在毕赤酵母内使用T7转录系统来表达蛋白，转录效率高，表达蛋白量大，所述方法无需筛选高表达的菌株，耗费时间短。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种在毕赤酵母内表达蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)根据酵母细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列；优化后的T7RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；按照优化的序列合成上、下游带酶切位点的T7聚合酶基因片段；

(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因片段克隆到组成型毕赤酵母表达质粒pGAPZ A中，构建得到pGAPZ A-RNAP质粒，并转化至毕赤酵母表达菌株，筛选获得稳定表达T7RNA聚合酶的菌株；

(3)将外源基因克隆至表达载体的多克隆位点上，转化至步骤(2)中所得的稳定表达T7RNA聚合酶的菌株，以及表达蛋白。

作为进一步的优选，所述步骤(1)中，所述T7RNA聚合酶为T7噬菌体RNA聚合酶。

作为进一步的优选，所述步骤(1)中，所述酶切位点包括：上游加入EcoRI酶切位点以及下游加入xho I酶切位点。

作为进一步的优选，所述步骤(1)中，所述合成为全基因合成。

作为进一步的优选，所述步骤(2)中，所述筛选为zeocin筛选。

作为进一步的优选，所述步骤(2)中，所述菌株选自毕赤酵母GS115、X33菌株。

作为进一步的优选，所述步骤(3)中，所述表达载体按照载体序列表顺序进行基因合成，并通过酶切连接形成环状质粒。

作为进一步的优选，所述步骤(3)中，表达载体序列如SEQ ID NO:2所示。

作为进一步的优选，所述步骤(3)中，所述表达载体具有酵母复制起始序列2μori、T7启动子、IRES、多克隆位点、抗性基因、大肠杆菌复制起始序列puc ori的元件。

作为进一步的优选，所述步骤(3)中，所述抗性基因原核为kana，真核阶段为neo。

本发明的有益效果是：本发明选用的T7启动子/RNA聚合酶的载体系统，可应用于外源基因在毕赤酵母细胞中的表达，基因在毕赤酵母细胞中受到T7噬菌体RNA聚合酶转录，转录效率高，表达蛋白量大；本发明使用非整合型表达，目的基因插入本发明所述表达载体，转入稳定表达T7RNA聚合酶的毕赤酵母宿主，加入适当抗性物质筛选，即可表达蛋白，聚合酶不需要高表达，因此无需对不同菌落进行筛选，只需要筛出一个能表达的菌株就可以，简化了步骤，耗费时间大大缩短。

附图说明

图1为使用本发明实施例方法表达绿色荧光蛋白的细胞图。

图2为使用对比实施例方法表达绿色荧光蛋白的细胞图。

图3为本发明实施例表达载体的元件图谱。

具体实施方式

本发明实施例通过提供一种在毕赤酵母内表达蛋白的方法，解决了现有蛋白表达量低，步骤复杂，耗费时间长等缺陷。

为了解决上述缺陷，本发明实施例的主要思路是：

本发明实施例在毕赤酵母内表达蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)根据酵母细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列；优化后的T7RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；按照优化的序列合成两端带酶切位点的T7聚合酶基因片段；

(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因片段克隆到组成型毕赤酵母表达质粒pGAPZ A中，构建得到pGAPZ A-RNAP质粒，并转化至毕赤酵母表达菌株，筛选获得稳定表达T7RNA聚合酶的菌株；

(3)将外源基因克隆至表达载体的多克隆位点上，转化至步骤(2)中所得的稳定表达T7RNA聚合酶的菌株，以及表达蛋白；

表达载体序列见序列表如SEQ ID NO:2所示。其中的元件改造的思路如下：在Pyes2载体基础上，去掉pgal1以及t7启动子，插入t7-ev71IRES序列。将pyes2载体上Kana基因及启动子终止子，替换成ppic9k的kan以及启动子、终止子，以便于在原核和真核阶段分别用卡那霉素和g418抗性筛选，保持质粒的稳定性。改造后的结果为序列含有T7启动子，可以用于T7噬菌体聚合酶对下游片段的的转录起始，T7启动子下游含有EV71IRES序列，为转录后的Mrna提供核糖体进入位点，用于核糖体的翻译起始。下游为His标签，用于表达蛋白的标签纯化，下游为Poly A尾序列位点，不用加尾，直接生成含Poly A尾mRNA序列.有利于提高mRNA的寿命，延长翻译时间，提高表达量。T7终止子起到终止转录的作用。

所述步骤(1)中，使用T7RNA聚合酶基因序列(Geneabank登录号AM946981.1)在不改变野生型T7RNA聚合酶氨基酸序列的前提下，将每个氨基酸的密码子替换成毕赤酵母物细胞中使用频率最高或次高的，同时避免局部出现连续多个的GC、AT，并保证G+C含量在30％-70％之间。通过全基因合成该序列。所述表达载体能够在原核细菌和真核的酵母菌中进行复制，可以使用T7转录酶转录t7启动子后的基因。

为了让本发明之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举实施例，来说明本发明所述之在毕赤酵母内表达蛋白的方法。

实施例1

本发明实施例1在毕赤酵母内表达蛋白的方法，包括如下步骤：

1.密码子优化

使用T7RNA聚合酶基因序列(Geneabank登录号AM946981.1)在不改变野生型T7RNA聚合酶氨基酸序列的前提下，将每个氨基酸的密码子替换成酵母细胞中使用频率最高或次高的，同时避免局部出现连续多个的GC、AT，并保证G+C含量在30％-70％之间。最后在这段基因上游加入EcoRI酶切位点、下游加入xho I酶切位点。序列见序列表SEQ ID NO:1所示。密码子优化及全基因合成均在申请人公司完成。待优化序列生成后，通过Visual GeneDeveloper软件，进一步确认优化前后mRNA二级结构及自由能。

2.pGAPZ A-RNAP质粒构建

构建T7-RNAP的真核表达载体：通过EcoRI/xho I酶切位点双酶切pGAPZ A真核表达载体上，回收后线形化的pGAPZ A大片段，取5μg EcoRI/xho I酶切过的上述T7RNA聚合酶基因与约100ng pGAPZ A大片段、用T4DNA连接酶按常规方法进行连接反应，连接后转化大肠杆菌DH5α，利用卡那霉素抗性基因筛选阳性克隆，得到pGAPZ A-RNAP，并进行DNA测序。

3.RNAP/GS115稳定表达菌株构建

(1)制备线性化pGAPZ A-RNAP:①SacI-HF酶切pGAPZ A-RNAP，酶切反应体系:SacI1μL，DNA1μg，10×NE Buffer 5μL，ddH₂O补至50μL；反应温度37℃；反应时间10min；②琼脂糖凝胶电泳验证酶切后DNA；③乙醇沉淀法回收线性化DNA；(2)制备毕赤酵母感受态，氯化锂转化法转化pGAPZ A-RNAP至毕赤酵母X33中，参考毕赤酵母表达载体操作手册(invitrogen公司，catalogNo.v190-20)。将氯化锂转化后得到的菌液涂布于Zeocin(100μg/mL)抗性的YPD培养基筛选培养，挑单菌落小量摇菌扩增后取少量进行菌液PCR、电泳测序验证。

4.制备稳定表达T7噬菌体RNA聚合酶的酵母感受态细胞

方法参考毕赤酵母表达载体操作手册(invitrogen公司，catalog No.v190-20)。

5.表达载体全基因合成

基因合成一个含有酵母复制起始序列2μori、T7启动子、IRES、多克隆位点、KAN和Neo的抗性基因、大肠杆菌复制起始序列puc ori等元件的表达载体；序列如SEQ ID NO:2所示。合成的基因通过酶切连接成一个环形的质粒。

图3为本发明实施例表达载体的元件图谱。

6.pPYT7-eGFP蛋白克隆构建

设计引物peGFP-F:AAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAATGG

TGAGCAAGGGCGAG3’；peGFP-R:5’GCCGCCGCGGCTCGACTTTACT

TGTACAGCTCGTC 3’，从pcDNA3.1-eGFP中扩增eGFP基因，

反应条件:预变性95℃2min；扩增:变性95℃30s，退火温度65℃至53℃，步长0.5℃/循环30s，延伸72℃45s，30个循环；冷却12℃；切胶回收步骤5的pPYT7载体和Egfp基因产物；通过双酶切将标志蛋白eGFP蛋白基因插入pPYT7质粒，通过建立克隆反应体系:①按说明加入适量pPYT7线性化载体、目标插入片段eGFP、10×连接Buffer 1μL、连接酶1μL、ddH2O补至10μL；②25℃温育15min；在冰上保存直至转化或－20℃长期保存；转化大肠杆菌，用卡那霉素筛选阳性克隆，鉴定；

7.pPYT7-eGFP蛋白表达

转化:①向50μL rnap/gs115感受态细胞悬液中分别加入1μL pPYT7-eGFP，在冰浴中静置30min；②将离心管置于电转仪上，插入电极进行电转，然后快速将管转移到冰浴上，使细胞冷却2～3min；③加入900μL无菌的SOC培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min(150rpm/min)；④吸取100μL已转化的感受态细胞加到含低盐LB+g418(25μg/μL)固体培养基上，37℃培养；⑤培养12～16小时后，挑选单菌落，用peGFP-F、peGFP-R引物对菌落行PCR验证，对PCR验证成功的菌落提质粒，并测序验证。对于转化pPYT7-eGFP蛋白质粒成功的菌株，培养酵母，表达蛋白。将经过测序验证的X33-eGFP接种于MMH培养基中37℃培养2天后，取少量菌至PBS中，制成菌悬液，于全自动倒置荧光显微镜蓝光激发下观察。

图1为使用本发明实施例方法表达绿色荧光蛋白的细胞图。

对比实施例

1.毕赤酵母表达载体pPICZB-eGFP构建步骤如下:

(1)XhoⅠ酶切质粒pPICZ-B(3597bp)；

(2)用primestar酶、pPIC-eGFP-F、pPIC-eGFP-R引物通过Touchdown PCR从pcDNA3.1-eGFP中扩增eGFP基因，反应条件:预变性95℃2min；扩增:变性95℃30s，退火温度65℃至53℃，步长0.5℃/循环30s，延伸72℃45s，30个循环；冷却12℃；

(3)切胶回收步骤(1)和(2)产物；

(4)建立In-Fusion克隆反应体系:①按说明加入适量pPICZ B线性化载体、目标插入片段eGFP、10×Clonase Buffer 1μL、In-Fusion^TM Clonase1μL、ddH₂O补至10μL；②25℃温育15min；在冰上保存直至转化或－20℃长期保存；

(5)转化:①向50μL感受态细胞悬液中分别加入1μL PPICZ B-eGFP，在冰浴中静置30min；②将离心管置于42℃水浴中放置60～90s，然后快速将管转移到冰浴上，使细胞冷却2～3min；③加入900μL无菌的SOC培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min(150rpm/min)；④吸取100μL已转化的感受态细胞加到含低盐LB+Zeocin(25μg/μL)固体培养基上，37℃培养；⑤培养12～16小时后，挑选单菌落，用5-AOX、3-AOX引物对菌落行PCR验证，对PCR验证成功的菌落提质粒，并测序验证。

2.毕赤酵母X33-eGFP的构建步骤如下:

(1)制备线性化pPICZ-eGFP:①SacI-HF酶切pPICZ-eGFP，酶切反应体系:SacI 1μL，DNA1μg，10×NE Buffer 5μL，ddH2O补至50μL；反应温度37℃；反应时间10min；②琼脂糖凝胶电泳验证酶切后DNA；③乙醇沉淀法回收线性化DNA；

(2)制备毕赤酵母感受态，氯化锂转化法转化PPICZ B-eGFP至毕赤酵母X33中，参考毕赤酵母表达载体操作手册(invitrogen公司，catalogno.v190-20)。将氯化锂转化后得到的菌液涂布于Zeocin(100μg/mL)抗性的YPD培养基筛选培养，挑单菌落小量摇菌扩增后取少量进行菌液PCR、电泳测序验证。

3.诱导AOX1启动子的启动及观察eGFP蛋白的表达将经过测序验证的X33-eGFP接种于MMH培养基中37℃培养2天后，取少量菌至PBS中，制成菌悬液，于全自动倒置荧光显微镜蓝光激发下观察。

图2为使用对比实施例方法表达绿色荧光蛋白的细胞图。

上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：

本发明选用的T7启动子/RNA聚合酶的载体系统，可应用于外源基因在毕赤酵母细胞中的表达，基因在毕赤酵母细胞中受到T7噬菌体RNA聚合酶转录，转录效率高，表达蛋白量大；本发明使用非整合型表达，目的基因插入本发明所述表达载体，转入稳定表达T7RNA聚合酶的毕赤酵母宿主，加入适当抗性物质筛选，即可表达蛋白，聚合酶不需要高表达，因此无需对不同菌落进行筛选，只需要筛出一个能表达的菌株就可以，简化了步骤，耗费时间大大缩短。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

<110> 武汉金开瑞生物工程有限公司

<120> 一种在毕赤酵母内表达蛋白的方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4848

<212> DNA

<213> Pichia pastoris

<400> 1

atgaacacta tcaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaattggc tgctatccca 60

ttcaacactt tggctgacca ctacggtgaa agattggcta gagaacaatt ggctttggaa 120

cacgaatctt acgaaatggg tgaagctaga ttcagaaaga tgttcgaaag acaattgaag 180

gctggtgaag ttgctgacaa cgctgctgct aagccattga tcactacttt gttgccaaag 240

atgatcgcta gaatcaacga ctggttcgaa gaagttaagg ctaagagagg taagagacca 300

actgctttcc aattcttgca agaaatcaag ccagaagctg ttgcttacat cactatcaag 360

actactttgg cttgtttgac ttctgctgac aacactactg ttcaagctgt tgcttctgct 420

atcggtagag ctatcgaaga cgaagctaga ttcggtagaa tcagagactt ggaagctaag 480

cacttcaaga agaacgttga agaacaattg aacaagagag ttggtcacgt ttacaagaag 540

gctttcatgc aagttgttga agctgacatg ttgtctaagg gtttgttggg tggtgaagct 600

tggtcttctt ggcacaagga agactctatc cacgttggtg ttagatgtat cgaaatgttg 660

atcgaatcta ctggtatggt ttctttgcac agacaaaacg ctggtgttgt tggtcaagac 720

tctgaaacta tcgaattggc tccagaatac gctgaagcta tcgctactag agctggtgct 780

ttggctggta tctctccaat gttccaacca tgtgttgttc caccaaagcc atggactggt 840

atcactggtg gtggttactg ggctaacggt agaagaccac tcgcgttggt tagaactcat 900

tctaagaagg ctttgatgag atacgaagac gtttacatgc cagaagttta caaggctatc 960

aacatcgctc aaaacactgc ttggaagatc aacaagaagg ttttggctgt tgctaacgtt 1020

atcactaagt ggaagcactg tccagttgaa gacatcccag ctatcgaaag agaagaattg 1080

ccaatgaagc cagaagacat cgacatgaac ccagaagctt tgactgcttg gaagagagct 1140

gctgctgctg tgtacagaaa ggacagagct agaaagtcta gaagaatctc tttggaattt 1200

atgttggaac aagctaacaa gttcgctaac cacaaggcta tctggttccc atacaacatg 1260

gactggagag gtagagttta cgctgtttct atgttcaacc cacaaggtaa cgacatgact 1320

aagggtttgt tgactttggc taagggtaag ccaatcggta aggaaggtta ctactggttg 1380

aagatccacg gtgctaactg tgctggtgtt gacaaggttc cattcccaga aagaatcaag 1440

ttcatcgaag aaaaccacga aaacatcatg gcttgtgcta agtctccatt ggaaaacact 1500

tggtgggctg aacaagactc tccattctgt ttcttggctt tctgtttcga atacgctggt 1560

gttcagcatc acggcttgtc ttacaactgc tctttgccat tggctttcga cggttcttgt 1620

tctggtatcc aacacttctc tgctatgttg agagacgaag ttggtggtag agctgttaac 1680

ttgttgccat ctgaaactgt tcaagacatc tacggtatcg ttgctaagaa ggttaacgaa 1740

atcttgcaag ctgacgctat caacggtact gacaacgaag ttgttactgt tactgacgaa 1800

aacactggtg aaatctctga aaaggttaag ttgggtacta aggctttggc tggtcaatgg 1860

ttggctcacg gtgttactag atctgttact aagagatctg ttatgacttt ggcttacggt 1920

tctaaggaat ttggtttcag acaacaagtt ttggaagaca ctatccaacc agctatcgac 1980

tctggtaagg gtccaatgtt cactcaacca aaccaagctg ctggttacat ggctaagttg 2040

atctgggaat ctgtttctgt tactgttgtt gctgctgttg aagctatgaa ctggttgaag 2100

tctgctgcta agttgttggc tgctgaagtt aaggacaaga agactggtga aatcttgaga 2160

aagagatgtg ctgttcattg ggttactcca gacggcttcc cagtttggca ggaatacaag 2220

aagccaatcc aaactagatt gaacttgatg ttcttgggtc aattcagatt gcaaccaact 2280

atcaacacta acaaggactc tgaaatcgac gctcacaagc aagaatctgg tatcgctcca 2340

aacttcgttc actctcaaga cggttctcac ttgagaaaga ctgttgtttg ggctcacgaa 2400

aagtacggta tagaatcgtt cgctctcatc cacgactcgt tcggtactat cccagctgac 2460

gctgctaact tgttcaaggc tgttagagaa actatggttg acacttacga atcttgtgac 2520

gttttggctg acttctacga ccaattcgct gaccaattgc acgaatctca attggacaag 2580

atgccagctt tgccagctaa gggtaacttg aacttgagag acatcttgga atctgacttc 2640

gctttcgctt aa 2652

<210> 2

<211> 2652

<212> DNA

<213> Pichia pastoris

<400> 2

taatacgact cactatatta aaacagctgt gggttgcacc cacccaccgg gccactgggc 60

cgctagcact ctggtactga ggtacctttg tgcgcctgtt tttactcccc ttccccccga 120

agtaacttag aagctgtaaa tcagatcaat agcaggtgtg gcacaccagt catacctcga 180

tcaagcactt ctgtttcccc ggactgagta tcaataggct gctcgcgcgg ctgaaggaga 240

aaacgttcgt tacccgacca actacttcga gaagcttagt accaccatga acgaggcagg 300

gtgtttcgct cagcacaacc ccagtgtaga tcaggctgat gagtcactgc aacccccatg 360

ggcgaccatg gcagtggctg cgttggcggc ctgcccatgg agaaatccat gggacgctct 420

aattctgaca tggtgtgaag agcctattga gctagctggt agtcctccgg cccctgaatg 480

cggctaatcc caactgcgga gcacatgctc acaaaccagt gggtggtgtg tcgtaacggg 540

caactctgca gcggaaccga ctactttggg tgtccgtgtt tccttttatt cttatattgg 600

ctgcttatgg tgacaatcaa agagttgtta ccatatagct attggattgg ccatccggtg 660

tgcaacaggg caattgttta cctatttatt ggttttgtac cattatcact gaagtctgtg 720

atcactctca aattcatttt gaccctcaac ataatcagac atgggctcac aggtgtccac 780

acaacgctcc ggttcgcatg gcccaccacc accaccacca cctggccacc acccatatgg 840

gatccgaatt cgatatctta attaagctgc aggagctcgt cgacgcggcc gcactcgagt 900

gagatctgac tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagtttaaac actagtccgc 960

tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct 1020

gaaaggagga actatatccg ggcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 1080

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 1140

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 1200

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 1260

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 1320

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 1380

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 1440

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 1500

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 1560

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 1620

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 1680

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 1740

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 1800

tctcaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 1860

cacatgttgg tctccagctt gcaaattaaa gccttcgagc gtcccaaaac cttctcaagc 1920

aaggttttca gtataatgtt acatgcgtac acgcgtctgt acagaaaaaa aagaaaaatt 1980

tgaaatataa ataacgttct taatactaac ataactataa aaaaataaat agggacctag 2040

acttcaggtt gtctaactcc ttccttttcg gttagagcgg atgtgggggg agggcgtgaa 2100

tgtaagcgtg acataactaa ttacatgata tcgacaaagg aaaaggggga cggatctccg 2160

aggcctggga cccgtgggcc gccgtcggac gtgttagaaa aactcatcga gcatcaaatg 2220

aaactgcaat ttattcatat caggattatc aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg 2280

taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc 2340

tgcgattccg actcgtccaa catcaataca acctattaat ttcccctcgt caaaaataag 2400

gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctt 2460

atgcatttct ttccagactt gttcaacagg ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact 2520

cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc 2580

gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag 2640

cgcatcaaca atattttcac ctgaatcagg atattcttct aatacctgga atgctgtttt 2700

cccggggatc gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga gtacggataa aatgcttgat 2760

ggtcggaaga ggcataaatt ccgtcagcca gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc 2820

attggcaacg ctacctttgc catgtttcag aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata 2880

caatcgatag attgtcgcac ctgattgccc gacattatcg cgagcccatt tatacccata 2940

taaatcagca tccatgttgg aatttaatcg cggcctcgag caagacgttt cccgttgaat 3000

atggctcatg gtttagttcc tcaccttgtc gtattatact atgccgatat actatgccga 3060

tgattaattg tcaacaccgc cccttagatt agattgctat gctttctttc taatgaacaa 3120

gaagtaaaaa aagttgtaat agaacaagaa aaatgaaact gaaacttgag aaattgaaga 3180

ccgtttatta acttaaatat caatggaggt cactgaaaga gaaaaaaact aaaaaaaaaa 3240

atttcaagaa aaagaaacgt gataaaaatt tttattgcct ttttcgacga agaaaaagaa 3300

acgaggcggt ctcttttttc ttttccaaac ctttagtacg ggtaattaac gacaccctag 3360

aggaagaaag agggaaaatt tagtatgctg tgcttgggtg ttttgaagtg gtacggcgat 3420

gcgcggagtc cgagaaaatc tggaagagta aaaaaggagt agaaacattc acatttcccc 3480

gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 3540

ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac 3600

acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag 3660

cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat 3720

cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 3780

aaggagaaaa taccgcatca ggaacgaagc atctgtgctt cattttgtag aacaaaaatg 3840

caacgcgaga gcgctaattt ttcaaacaaa gaatctgagc tgcattttta cagaacagaa 3900

atgcaacgcg aaagcgctat tttaccaacg aagaatctgt gcttcatttt tgtaaaacaa 3960

aaatgcaacg cgacgagagc gctaattttt caaacaaaga atctgagctg catttttaca 4020

gaacagaaat gcaacgcgag agcgctattt taccaacaaa gaatctatac ttcttttttg 4080

ttctacaaaa atgcatcccg agagcgctat ttttctaaca aagcatctta gattactttt 4140

tttctccttt gtgcgctcta taatgcagtc tcttgataac tttttgcact gtaggtccgt 4200

taaggttaag aaggctactt tggtgtctat tttctcttcc ataaaaaaag cctgactcca 4260

cttcccgcgt ttactgatta ctagcgaagc tgcgggtgca ttttttcaag ataaaggcat 4320

ccccgattat attctatacc gatgtggatt gcgcatactt tgtgaacaga aagtgatagc 4380

gttgatgatt cttcattggt cagaaaatta tgaacggttt cttctatttt gtctctatat 4440

actacgtata ggaaatgttt acattttcgt attgttttcg attcactcta tgaatagttc 4500

ttactacaat ttttttgtct aaagagtaat actagagata aacataaaaa atgtagaggt 4560

cgagtttaga tgcaagttca aggagcgaaa ggtggatggg taggttatat agggatatag 4620

cacagagata tatagcaaag agatactttt gagcaatgtt tgtggaagcg gtattcgcaa 4680

tcgcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 4740

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 4800

ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattg 4848

Claims (10)

1.一种在毕赤酵母内表达蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括：

(1)根据酵母细胞偏爱密码子优化原始T7 RNA聚合酶基因序列；优化后的T7 RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；按照优化的序列合成上、下游带酶切位点的T7聚合酶基因片段；

(2)将所述合成的T7 RNA聚合酶基因片段克隆到组成型毕赤酵母表达质粒pGAPZ A中，构建得到pGAPZ A-RNAP质粒，并转化至毕赤酵母表达菌株，筛选获得稳定表达T7 RNA聚合酶的菌株；

(3)将外源基因克隆至表达载体的多克隆位点上，转化至步骤(2)中所得的稳定表达T7RNA聚合酶的菌株，以及表达蛋白。

2.根据权利要求1所述的在毕赤酵母内表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述T7 RNA聚合酶为T7噬菌体RNA聚合酶。

3.根据权利要求1所述的在毕赤酵母内表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述酶切位点包括：上游加入EcoRI酶切位点以及下游加入xho I酶切位点。

4.根据权利要求1所述的在毕赤酵母内表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述合成为全基因合成。

5.根据权利要求1所述的在毕赤酵母内表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述筛选为zeocin筛选。

6.根据权利要求1所述的在毕赤酵母内表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述菌株选自毕赤酵母GS115、X33菌株。

7.根据权利要求1所述的在毕赤酵母内表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述表达载体按照载体序列表顺序进行基因合成，并通过酶切连接形成环状质粒。

8.根据权利要求1所述的在毕赤酵母内表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，表达载体序列如SEQ ID NO:2所示。

9.根据权利要求1所述的在毕赤酵母内表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述表达载体具有酵母复制起始序列2μori、T7启动子、IRES、多克隆位点、抗性基因、大肠杆菌复制起始序列puc ori的元件。

10.根据权利要求9所述的在毕赤酵母内表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述抗性基因原核为Kana，真核阶段为neo。