CN101886087A - 一种利用毕赤酵母高效表达dna聚合酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法。表达步骤为：1)将DNA聚合酶基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体中，获得毕赤酵母重组表达质粒；2)将此重组表达质粒电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115，经MD平板和PCR鉴定筛选阳性克隆；3)挑取阳性克隆利用0.5％甲醇诱导表达。本发明能够用于表达DNA聚合酶基因。通过验证，与大肠杆菌表达系统相比，该方法能够明显提高DNA聚合酶的热稳定性等性能，且能够降低生产成本，缩短工艺流程，简化纯化步骤。
Description
技术领域
本发明涉及的是外源基因的诱导表达技术，特别是一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，是DNA聚合酶表达、生产的一种新思想、新途径、新方法。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是现代分子生物学最重要的基本研究手段之一。此项技术因其操作简单、快速、灵敏度高和特异性强等优点广泛应用于分子生物学、医学等相关学科的领域中。
DNA聚合酶作为聚合酶链式反应中的重要工具之一，在PCR过程中起着至关重要的作用。直到1988年，Rand 11 K Saiki等(Saiki R K，Gelfand D H，Stoffel S，ScharfS，et al.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science，1988，239：487-491)从Thermus aquatics中分离纯化获得了Taq DNA聚合酶，并成功地将其应用于PCR技术，大大简化了PCR流程，使PCR过程实现了自动连续循环，应用领域逐渐拓宽。因此，如何进一步提高DNA聚合酶的产量及各项酶学性能，并利用它实现方便、快捷、高效的PCR，以满足不同科学研究及实际应用的需要，已经成为目前广大分子生物学学者关注的焦点。
由于大部分用于PCR的DNA聚合酶来源于古细菌，因此，人们倾向于用原核表达系统，而不是真核表达系统来表达DNA聚合酶。因此，目前国内外众多研究将编码极端酶的基因在异源普通宿主菌(如大肠杆菌)中进行表达，通过该方法表达的蛋白质大多数都能维持原来的热稳定性，它们通常在低温下折叠，并不被宿主的蛋白酶水解，因此可以通过热变性的方法除去宿主蛋白而进行纯化，酶产量亦有所提高，是相对经济的方法，从一定程度上促进了PCR技术的广泛应用，并节约了PCR成本，但是在这个过程中仍然面临着纯化困难，成本较高等各种各样的问题(Francois Baneyx Recombinant protein expression in Escherichia coliCurrent Opinion in BiotechnologyVolume 10，Issue 5，1October 1999，Pages 411-421)。例如，如果培养温度过高，生长速度过快或生长过度，外源基因表达的目的蛋白大多数容易形成包涵体，这就需要将其转化为可溶性蛋白，这个步骤不但繁琐而且会降低酶活性。人们不断尝试对接种量、培养温度、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度等因素做进一步的优化，以期待提高目的蛋白的表达量和比活性，甚至是某些酶学性能。
发明内容
本发明的目的是提出一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，提供了除大肠杆菌表达DNA聚合酶以外的新方法。
具体做法如下：
1)设计一对5’端引入GTCA，3’端引入GGCCA碱基的引物，通过PCR的方法，将扩增下的产物，在dTTP的保护下经T4DNA聚合酶12℃处理20min后得到带有Cop I和NotI粘性末端的DNA聚合酶基因，与经过Cop I和Not I依次酶切的毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A连接，获得重组的毕赤酵母表达质粒；
2)将毕赤酵母重组表达质粒用Sal I酶切线性化后，电转化至Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，涂布组氨酸缺陷培养基MD(1.34％YNB，2％葡萄糖，1％(NH4)2SO4，4×10-5Biotin，1.5％Agar)平板，25℃-30℃培养2-4天，获得重组转化子；
3)提取转化子基因组，通过PCR的方法鉴定已经正确插入DNA聚合酶基因的阳性克隆；
4)接种鉴定验证正确的重组转化子于50mL BMGY(2％Tryptone，1％Yeast extract，0.34％YNB，1％(NH4)2SO4，100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，1％甘油)培养基中，25℃-30℃150-250r/min培养40-50h，至OD600为6-10，于室温离心3000-6000r/min，5min，收集菌体；将菌体转移至25mLBMMY(2％Tryptone，1％Yeast extract，0.34％YNB，1％(NH4)2SO4，100mmol/L磷酸钾缓冲液pH 6.0)培养基中，25℃-30℃，150-250r/min培养，每隔24h补加一次甲醇(加量为培养基体积的0.5％)；表达时间24h-96h
5)取表达上清液分析表达水平，其中表达时间为72h时表达水平为最佳，所得上清液即为表达粗酶液。
本发明表达的DNA聚合酶基因，包括DNA依赖性DNA聚合酶基因和RNA依赖性DNA聚合酶基因。
本发明能够实现DNA聚合酶基因表达的载体是所有毕赤酵母表达载体，包括胞内表达载体和胞外表达载体。
本发明与现有的通过大肠杆菌表达聚合酶的方法相比具有的优势
一、本发明提出的DNA聚合酶表达方法，操作简单、成本低廉。相比大肠杆菌表达系统而言，毕赤酵母菌营养需求水平低、生长速度快、培养基价格低廉，进一步节约了成本。
二、本发明提出的DNA聚合酶表达方法，纯化步骤简单。毕赤酵母表达载体的启动子为醇氧化酶(AOX1)基因启动子，能够对外源蛋白的表达进行严格调控，本发明通过该系统表达的外源蛋白可以分泌到胞外，内源蛋白分泌量极少，避免了支原体污染，利于外源蛋白的分离与纯化，而大肠杆菌表达系统表达的蛋白，背景高，分离纯化耗费时间长，操作步骤繁琐。
三、本发明提出的DNA聚合酶表达方法，所表达的DNA聚合酶酶学性能表现更加优异。经过验证，与大肠杆菌表达系统比较，通过该方法表达的聚合酶PCR产量、热稳定性有明显的提高，聚合酶的保真性有了小幅度提高。
四、本发明提出的DNA聚合酶表达方法，便于进行规模化、工业化生产。经过多年的不断发展与完善，毕赤酵母表达系统的高密度发酵技术已经发展的比较成熟，利于DNA聚合酶规模化生产，极大程度上满足不断增长的研究及应用需求。
附图说明：
图1为本发明毕赤酵母重组表达载体构建过程。首先，通过引物设计使用高保真酶扩增目的基因片段后(①)，回收，然后在dTTP存在的条件下，用T4DNA聚合酶于12℃处理该片段20min(②)，生成粘性末端，同时将pHBM905A质粒经限制性内切酶Cop I和NotI依次酶切，产生两个带有固定碱基的单链粘性末端(③)，琼脂糖胶回收目的片段。最后，将双酶切后的载体和T4DNA聚合酶处理后片段经Solution I连接酶16℃连接2h后，转化大肠杆菌DH10β菌株，氨苄青霉素抗性LB平板筛选转化子，经质粒大小比对、PCR鉴定以及酶切鉴定获得完整的重组质粒。
图2为毕赤酵母表达RKOD酶SDS-PAGE检测。泳道M为蛋白质分子量标记，泳道1为GS-905A空载体诱导后样品，泳道2-5分别为酵母重组菌株GS-RKOD诱导24h、48h、72h、96h的样品。
图3大肠杆菌表达RKOD酶与酵母表达RKOD酶的SDS-PAGE检测对比。泳道M为蛋白质分子量标记，泳道1为酵母重组菌株GS-RKOD诱导72h样品，泳道2为30a-RKOD诱导破菌后上清样品，泳道3为30a-RKOD诱导后镍珠纯化后样品。
图4为酵母RKOD酶DNAse活性分析。泳道M1为λDNA-Eco T14marker，泳道M2为λDNA-Hind IIImarker；泳道3为pET30a质粒；泳道1、2、4分别为10U的粗酶液与λDNA-EcoT14、λDNA-Hind III、Supercoiled pET30a DNA 37℃孵育24小时后样品。
图5为大肠杆菌表达RKOD酶与酵母表达RKOD酶的PCR扩增效率分析。a)图中，泳道M为λEco T14DNA Marker，泳道1-4分别为大肠杆菌表达RKOD酶、酵母表达RKOD酶、Taq DNA聚合酶和primerstar DNA聚合酶的扩增样品(目的片段大小1.8kb)；b)图中，泳道M为λEco T14DNA Marker，泳道1-2为大肠杆菌表达RKOD酶的扩增样品，泳道3-5为酵母表达RKOD酶的扩增样品(目的片段大小2.5kb)。
图6为大肠杆菌表达RKOD酶与酵母表达RKOD酶的热稳定性对比研究。泳道M为λEcoT14DNAMarker，泳道1-3为大肠杆菌表达RKOD酶100℃热处理1h后三个片段的PCR产物，泳道4-6为毕赤酵母表达RKOD酶100℃热处理1h后三个片段的PCR产物，泳道7-9为毕赤酵母表达RKOD酶1处理100℃热处理2h后三个片段的PCR产物，泳道10-12为大肠杆菌表达RKOD酶100℃热处理2h后三个片段的PCR产物，泳道13-15为毕赤酵母表达RKOD酶处理100℃热处理3h后三个片段的PCR产物，泳道16-18为大肠杆菌表达RKOD酶100℃热处理3h后三个片段的PCR产物。
具体实施方式
下面以实例对本发明进一步说明：
实施例1：
利用本发明方法在酵母中表达本实验室合成的来源于Thermococcus kodakarensis菌种的DNA聚合酶基因，以后统称为RKOD。首先，将pHBM905A质粒经限制性内切酶Cop I和Not I依次酶切，产生带有两个固定碱基单链粘性末端的载体，琼脂糖胶回收该载体。其次，根据已知基因序列，采用GeneTool 软件设计RKOD-905a F ：5′GTCAATGATCCTCGACACTGACTACATAACCG 3′和RKOD-905a R ：5′GGCCATATTTTTTCTGTTTTTCCAGCATCTGC 3′两条引物，使用primerstar DNA聚合酶进行PCR扩增，得到RKOD(2.5kb)基因片段，将该片段琼脂糖胶回收后，在dTTP存在的条件下，用T4DNA聚合酶12℃处理20min，生成与pHBM905A载体相配对的粘性末端，回收片段。然后将载体和片段经Solution I酶16℃连接2个小时后，转化至大肠杆菌DH10β感受态细胞，氨苄青霉素LB平板筛选转化子，经质粒大小比对、PCR鉴定及酶切鉴定获得重组质粒(见图1)。随机挑选重组质粒送上海英俊生物技术有限公司测序，将测序结果正确的重组质粒分别命名为905A-RKOD。接着，将重组质粒905A-RKOD用Sal I酶切线性化，将回收后的酶切产物电击转化至Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，然后涂布组氨酸缺陷培养基MD平板，28℃培养3天，获得重组转化子。随机提取转化子基因组，以其为模板，RKOD-905AF/RKOD-905A R为引物进行PCR鉴定，故扩增得到2.5kb产物的转化子即为阳性克隆，将验证正确的重组克隆命名为GS-RKOD。最后，将鉴定验证正确的重组转化子GS-RKOD接种于50mL BMGY培养基中，28℃、200r/min培养48h，至OD600为6-9，于室温离心5000r/min，5min，收集菌体，随后，将菌体转移至25mL BMMY培养基中，28℃、200r/min培养，每隔24h补加一次甲醇(加量为培养基体积的0.5％)，GS-RKOD阳性转化子经诱导表达后，分别取24h，48h，72h，96h表达上清液进行SDS-PAGE电泳，分析不同时段的蛋白质表达水平，(见图2)。
实施例2：
通过大肠杆菌表达体系表达本实验室合成的来源于Thermococcus kodakarensis菌种的DNA聚合酶基因(RKOD基因)，作为实施例1的对比，以验证通过酵母表达DNA聚合酶这种方法的优越性。首先，根据已知基因序列，通过GENETOOL软件，设计引物(正向引物：5′ATGATCCTCGACACTGACTACATAACCG 3’；反向引物：5’TTATTTTTTCTGTTTTTCCAGCATCTGC 3’)扩增RKOD基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测有清晰条带后，琼脂糖胶回收该片段。然后将pET-30a质粒经过限制性内切酶EcoRV37℃酶切2小时，形成线性平末端载体。然后将载体和片段经Solution I酶16℃连接2个小时后，转化至大肠杆菌DH10β感受态细胞，卡那霉素LB平板筛选转化子，经质粒大小比对、PCR鉴定及酶切鉴定获得重组质粒。随机挑选重组质粒送上海英俊生物技术有限公司测序，将测序结果正确的重组质粒分别命名为30a-RKOD。然后将测序正确的重组质粒30a-RKOD转化BL21(DE3)菌株，挑单菌落接种于卡那霉素LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12小时，1％转接入100mL卡那霉素LB液体培养基，37℃、200rpm培养至OD600为0.5-0.6时，加入1M IPTG 50μL，16℃、200rpm诱导12小时。然后于4℃、6000rpm离心收集菌体5min，加入5mLPBS，混匀，超声波破菌，4℃、12000rpm离心2min取上清，镍珠纯化，进行SDS-PAGE电泳，分析表达水平(见图3)。
实施例1与实施例2的结果分析：
经过对初酶液蛋白浓度测定试剂盒测定，通过酵母分泌表达的RKOD酶最佳诱导时间为48h-72h，表达量在诱导至72h时可达到181mg/L，活性浓度为15U/mL，比活力为63.5U/mg；DNase活性分析表明，酵母初酶液DNase活性较低(见图4)。通过对两种分别在大肠杆菌和酵母里面表达的聚合酶的扩增性能分析发现，酵母表达的聚合酶PCR产量与商品化的高保真聚合酶PCR的产量相当(见图5a)，但是明显高于大肠杆菌表达聚合酶的PCR产量(见图5b)，；SDS-PAGE检测表明，与大肠杆菌表达的聚合酶相比，杂蛋白少，纯度高(见图3)；与大肠杆菌表达系统表达的聚合酶酶相比，酵母表达的聚合酶的热稳定性明显提高(见图6)；通过DNA聚合酶保真性分析表明，与大肠杆菌表达的聚合酶相比，酵母表达的聚合酶扩增忠实性略微提高(大肠杆菌表达的聚合酶错配率约为1.38×10-6，酵母表达的聚合酶错赔率约为1.1×10-6，Taq DNA聚合酶错配率约为1×10-5，primerstar DNA聚合酶错配率约为1×10-6)。
本发明中用于转化大肠杆菌感受态细胞DH10β购置于Invitrogen公司，Pichia pastorisGS115感受态细胞和pHBM905A质粒均由本实验室保存，限制性内切酶(Cop I、EcoRV、Not I、Sal I等)购自Promega公司，primerstar DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、Solution I酶、镍珠均购于TaKaRa公司，所有引物均由上海捷瑞生物公司合成。
Claims (3)
1.一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，其特征在于：
1)设计一对5’端引入GTCA，3’端引入GGCCA碱基的引物，通过PCR的方法，将扩增下的产物，在dTTP的保护下经T4DNA聚合酶12℃处理20min后得到带有Cop I和NotI粘性末端的DNA聚合酶基因，与经过Cop I和Not I依次酶切的毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A连接，获得重组的毕赤酵母表达质粒；
2)将毕赤酵母重组表达质粒用Sal I酶切线性化后，电转化至Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，涂布组氨酸缺陷培养基MD平板，25℃-30℃培养2-4天，获得重组转化子；培养基MD组成为1.34％YNB，2％葡萄糖，1％(NH4)2SO4，4×10-5％Biotin，1.5％Agar；
3)提取转化子基因组，通过PCR的方法鉴定获得已经正确插入DNA聚合酶基因的阳性克隆；
4)接种鉴定验证正确的重组转化子于50mL BMGY培养基中，25℃-30℃150-250r/min培养40-50h，至OD600为6-10，于室温离心3000-6000r/min，5min，收集菌体；将菌体转移至25mL BMMY培养基中，25℃-30℃，150-250r/min培养，，每隔24h补加一次为培养基体积0.5％的甲醇，表达时间24h-96h；
BMGY培养基为2％Tryptone，1％Yeast extract，0.34％YNB，1％(NH4)2SO4，100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，1％甘油；
BMMY培养基为2％Tryptone，1％Yeast extract，0.34％YNB，1％(NH4)2SO4，100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0；
5)取表达上清液分析表达水平，其中表达时间为72h时表达水平为最佳。
2.根据权利1要求所述的一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，其特征是表达DNA聚合酶基因，包括DNA依赖性DNA聚合酶基因和RNA依赖性DNA聚合酶基因。
3.根据权利1要求所述的一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，其特征在于用于实现DNA聚合酶基因表达的载体是所有毕赤酵母表达载体，包括胞内表达载体和胞外表达载体。
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