KR102246356B1 - spoⅡQ와 pcf 유전자 녹아웃을 통해 바실러스 리케니포르미스 발효 효소 생산을 향상시키는 방법 및 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 spoⅡQ와 pcf 유전자 녹아웃을 통해 바실러스 리케니포르미스(bacillus licheniformis) 발효 효소 생산을 향상시키는 방법 및 응용에 관한 것이며, 본 발명은 spoⅡQ와 pcf 유전자 녹아웃을 통해 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf를 획득하며, 아포 형성률이 0.16%까지 낮아지고, 진탕 플라스크 발효 배양 재조합균 α-아밀라아제의 효소 활성은 10.9% 향상되며, 5L 발효 배양 시 재조합균 α-아밀라아제의 효소 활성은 19.3% 향상되었다. 본 발명은 바실러스 리케니포르미스 표적 효소의 발효 활성을 어느 정도 향상시키며 균주 발효 생산 성능을 개선하므로, 산업 미생물의 유전공학 육종을 위한 사상과 방법에 참고할 수 있다.
Description
본 발명은 유전공학 기술 분야에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 spoⅡQ와 pcf 유전자 녹아웃을 통해 바실러스 리케니포르미스 발효 효소 생산을 향상시키는 방법 및 응용에 관한 것이다.
바실러스(Bacillus)는 효소 제제 산업에서 중요한 발효 생산 균주이며, 그중 바실러스 리케니포르미스(bacillus licheniformis)는 대사가 왕성하고 효소계가 풍부해 α-아밀라아제(α-amylase) 등을 대량 생산할 수 있어 방직, 식품, 사료, 의약품 등 산업에 광범위하게 사용된다.
바실러스 발효 효소 생산 과정에서, 특히 균체는 성장이 안정기에 도달한 후 영양 및 환경 조건의 변화로 인해 아포를 형성하기 시작한다. 아포의 생성은 고밀도 연속 발효에 유익하지 않으며 발효액 점도 증가, 포말 증가 등과 같은 발효 과정의 제어와 가스 교환에 영향을 미치고, 액체가 누출되기 쉬워 감염 가능성이 높고 발효 비용이 증가되는 단점이 있다. 또한 바실러스 성장 과정에서 종종 균체 자가 용해 현상이 동반되는데, 이는 미생물의 축적에 유익하지 않고 효과적인 발효주기를 단축시키며 발효 생산 효율을 저하시킨다.
중국 특허 문헌 CN108929883A(출원 번호 201810886538.5)는 아포 형성 관련 유전자 spoⅡE가 균주의 성장 및 효소 생성에 미치는 영향을 개시하였다. 상기 발명은 삽입 불활성화 방식을 통해 spoⅡE 일부 유전자 세그먼트를 Cmr 유전자와 융합하고, 융합 유전자 spoⅡE-Cmr는 바실러스 클라우시(Bacillus clausii) spoⅡE 유전자 서열에 삽입하며, spoⅡE 유전자가 정상적으로 발현하지 못하고 불활성화되도록 만든다. spoⅡE 유전자가 균주를 불활성화시키면 아포 생성률이 0.3%까지 현저하게 떨어지며, 공학적으로 변형된 균주 성장 속도를 기존 균주보다 현저하게 빠르게 만들어, 더욱 짧은 시간 내에 세포 수량을 축적시키고 더 높은 활성의 아밀라아제의 발효 생산이 가능하도록 구현한다.
중국 특허 문헌 CN108949785A(출원 번호 201810886539.X)는 효소 생산에서 아포 형성 관련 유전자 spo0A의 역할을 개시하였다. 삽입 불활성화 방식을 통해 spo0A 일부 유전자 세그먼트를 Cmr 유전자와 융합하고, 융합 유전자 spo0A-Cmr는 바실러스 클라우시 spo0A 유전자 서열에 삽입하며, spo0A 유전자가 정상적으로 발현하지 못하고 불활성화되도록 만든다. 이로 인해 세포 대사가 변하고 균주 아포 생성률이 저하되며 프로테아제의 발현이 약화되는 동시에, 아밀라아제 활성은 출발 균주에 비해 85.8% 증가하고, 펙티나아제 활성은 235%, 리파아제 활성은 70.0% 증가한다.
상기 기술적 해결책은 모두 포아 형성 관련 유전자 spo 패밀리가 녹아웃(knock-out)된 후 아밀라아제의 효소 활성을 향상시킬 수 있다는 것을 발견했다. 따라서 관련 기능을 가진 더 많은 유전자를 찾는 것이 아밀라아제의 후속 연구 및 제조에 큰 의미가 있다.
종래 기술의 단점을 고려하여, 본 발명은 spoⅡQ와 pcf 유전자 녹아웃(knock-out)을 통해 바실러스 리케니포르미스(bacillus licheniformis) 발효 효소 생산을 향상시키는 방법 및 응용을 제공하며, 수득한 유전자 공학균 바실러스 리케니포르미스 DL-1ΔspoⅡQΔpcf는 출발 균주 바실러스 리케니포르미스 DL-1보다 발효 생산 성능 측면에서 현저하게 향상되었다.
본 발명의 기술적 해결책은 하기와 같다.
α-아밀라아제 고생산성 재조합균은 α-아밀라아제 생산 미생물 중의 아포 형성 관련 유전자 spoⅡQ 및 용균 관련 유전자 pcf를 녹아웃함으로써 수득된다. 상기 아포 형성 관련 유전자 spoⅡQ 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.1과 같으며, 용균 관련 유전자 pcf의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.2와 같다.
바람직하게는, 상기 α-아밀라아제 생산 미생물은 바실러스 리케니포르미스이고, 더욱 바람직하게는 상기 바실러스 리케니포르미스는 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1이다.
상기 α-아밀라아제 고생산성 재조합균의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) α-아밀라아제 생산 미생물의 아포 형성 유전자 spoⅡQ를 녹아웃하여 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ를 획득한다.
(2) 단계 (1)에서 제조된 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ 중 균체 자가 용해 유전자 pcf를 녹아웃하여, 재조합균 바실러스 리케니포르미스 DL-1ΔspoⅡQΔpcf를 수득한다.
바람직하게는, 상기 단계 (1)에서, α-아밀라아제 생산 미생물의 아포 형성 유전자 spoⅡQ를 녹아웃시키는 구체적인 단계는 하기와 같다.
단계 1: 바실러스 리케니포르미스의 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하여 상류 및 하류 상동성 아암(arm) 프라이머 spoⅡQF1, spoⅡQR1 및 spoⅡQF2, spoⅡQR2를 설계하고 PCR 증폭을 수행하여, spoⅡQ 상류 및 하류 상동성 아암 세그먼트를 획득한 다음 PCR 중첩을 통해 상동성 아암을 연결하여 융합 세그먼트 spoⅡQF-spoⅡQR를 획득한다.
상기 상류 및 하류 상동성 아암 프라이머 spoⅡQF1, spoⅡQR1 및 spoⅡQF2, spoⅡQR2의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다.
spoⅡQF1：CATCGCCAGTCACTAGGATCCACGCCGAGGACGTAGCCT
spoⅡQR1: TTACCGTGCTTGGCATTATCCCTCGCTGAACATGTCCCGCTTT
spoⅡQF2: AAAGCGGGACATGTTCAGCGAGGGATAATGCCAAGCACGGTAA
spoⅡQR2: CAGTATTGACTGCAGGCGGCCGCAAGCTTGAACGGCTGCCTATT
단계 2: BamHⅠ과 NotⅠ을 이용하여 녹아웃된 pTOPO-Cmr에 대하여 이중 절단(double digestion), 정제, 심리스 클로닝(Seamless Cloning) 기술을 수행하여 단계 1에서 획득한 융합 세그먼트를 벡터와 연결하여 재조합 벡터 pTOPO-Cmr-spoⅡQ를 수득한다.
단계 3: 바실러스 리케니포르미스의 수용성 세포를 제조하며, 단계 2에서 획득한 재조합 벡터를 바실러스 리케니포르미스 균체에 전기천공법으로 도입하고, 클로람페니콜(chloramphenicol)을 함유하는 LB 고체 배지 상에 도포하여 1차 스크리닝을 진행하고, 1차 스크리닝 균주는 5% 자일로스(xylose)를 함유한 LB 액체 배지로 옮겨 2차 스크리닝을 진행하여, 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ를 제조한다.
바람직하게는, 상기 단계 (2)에서 재조합균 ΔspoⅡQ에서 균체 자가 용해 유전자 pcf를 녹아웃시키는 구체적인 단계는 하기와 같다.
단계 I: 바실러스 리케니포르미스 게놈 DNA 및 pHT01 플라스미드를 템플릿으로 사용하여 상하류 프라이머 pcfF, pcfR 및 Cm rF, Cm rR을 설계하고, PCR 증폭으로 pcf 유전자 세그먼트 및 클로람페니콜 내성 Cm r 유전자 세그먼트를 획득하며, PCR 중첩을 통해 pcf 및 Cm r 유전자 세그먼트를 연결하여 융합 세그먼트 pcf-Cm r을 획득한다.
상기 프라이머 pcfF, pcfR 및 Cm rF, Cm rR 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다.
pcfF CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATG
pcfR TTACCGTGCTTGGCATTATCCCTCGCTGAACATGTCCCGCTTT
CmrF CTACTGTTCAAACCAATGTGAAACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCAC
CmrR CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGG
단계 II: 단계 I에서 수득된 pcf-Cm r에 대하여 BamHI를 이용해 단일 절단, 정제를 진행한 후 전기천공법으로 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ 균체에 도입한다.
단계 III: 단계 II에서 수득된 형질 전환된 균을 클로람페니콜이 함유된 LB 고체 배지 상에 도포하고, 클로람페니콜 내성이 있는 양성 유전자 결실 재조합균을 스크리닝하여 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf를 획득한다.
상기 α-아밀라아제 고생산성 재조합균을 이용하여 α-아밀라아제를 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다.
(i) α-아밀라아제 고생산성 재조합균을 활성화시켜 활성화 균체를 제조한다.
(ii) 단계 (i)에서 제조된 활성화 균체를 확대 배양하여 발효 균체를 제조한다.
(iii) 단계 (ii)에서 제조된 발효 균체를 발효 배지에 접종하고, 37℃, 300rpm 조건에서 84시간 동안 발효하며, 고액 분리를 거쳐 액체를 취하고 정제하여 α-아밀라아제를 제조한다.
상기 발효 배지의 성분은 하기와 같다.
트립톤(tryptone) 10g/L, 효모 추출물 분말 5g/L, 가용성 전분 20g/L, 염화나트륨 10g/L, 포도당 1g/L, 글리세린 2.5%(부피분율), pH 7.0.
바람직하게는, 상기 단계 (i)에서, 글리세린관에서 균액을 취하여 LB 플레이트에 획선으로 도말하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하며, 단일 콜로니를 선택하여 50mL의 액체 LB 배지로 옮기고 37℃, 200rpm 조건에서 20시간 동안 2회 계대 배양하여 활성화 균체를 제조한다.
바람직하게는, 상기 단계 (ii)에 있어서, 단계 (i)에서 수득된 활성화 균체를 2% 접종량으로 100mL LBPG 배지에 옮겨 37℃, 200rpm 조건으로 확대 배양한다.
상기 LBPG 배지의 성분은 하기와 같다.
트립톤 10g/L, 효모 추출물 분말 5g/L, 염화나트륨 10g/L, 포도당 1g/L, 글리세린 2.5%(부피분율), pH 7.0.
바람직하게는, 상기 단계 (iii)에서, 고속 냉동 원심분리기를 이용하여 발효액을 4℃, 12000rpm 조건에서 10분 동안 원심 분리를 진행하여 조효소액을 수득하며, 이는 후속 효소 활성 측정에 사용된다.
본 발명의 유익한 효과는 하기와 같다.
1. 본 발명자는 연구를 통해 포아 형성 관련 유전자 spoⅡQ가 종래 기술에 공지된 spo 패밀리 유전자의 특성과 달리, spoⅡQ 녹아웃 후 α-아밀라아제의 생산량을 직접적으로 향상시킬 수 없으나, 이는 균체 자가 용해 유전자 pcf와 동시에 녹아웃되면, α-아밀라아제의 생산량을 현저하게 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
2. 본 발명은 유전자 녹아웃 방식을 통해 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf를 획득하며, LB 배지에서 배양될 때, 재조합균 아포 생성률이 출발 균주의 0.16%까지 낮아지고, 균체 성장이 더욱 안정적이며, 진탕 플라스크 발효는 재조합균이 출발균보다 α-아밀라아제 효소 활성이 10.9% 향상된다는 것을 보여준다. 5L 발효기 발효는 재조합균이 출발균보다 α-아밀라아제 효소 활성이 19.3% 향상되고, 진탕 플라스크 발효 시보다 α-아밀라아제 효소 활성이 3.4배 향상된다는 것을 보여준다. 중간 및 후기 발효에서, 재조합균은 출발균보다 발효액 중의 용존 산소가 높고 포말 생성량이 적었으며 발효 성능이 출발균보다 어느 정도 향상되었다.
도 1은 본 발명 실시예 1에서 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis) 결과 사진이다.
여기에서 (a)는 spoⅡQ 상류 상동성 아암 세그먼트 전기영동 결과 사진이고, 도면에서 레인 1, 2는 600bp의 상류 상동성 아암 세그먼트이고, 레인 M은 마커(Maker)이고;
(b)는 spoⅡQ 하류 상동성 아암 세그먼트 전기영동 결과 사진이고, 도면에서 레인 1, 2는 600bp의 하류 상동성 아암 세그먼트이고, 레인 M은 마커이고;
(c)는 융합 세그먼트 spoⅡQF-spoⅡQR의 전기영동 결과 사진이고, 도면에서 레인 1, 2는 1200bp의 표적 세그먼트이고, 레인 M은 마커이다.
도 2는 본 발명 실시예 2에서의 아가로스 겔 전기영동 결과 사진이다.
여기에서 (a)는 pcf 유전자 세그먼트 전기영동 결과 사진이고, 도면에서 레인 1, 2 및 3은 418bp의 pcf 부분 유전자 세그먼트이고, 레인 M은 마커이고;
(b)는 Cm r 유전자 세그먼트 전기영동 결과의 사진이고, 도면에서 레인 1, 2 및 3은 1245bp의 Cm r 유전자 세그먼트이고, 레인 M은 마커이고;
(c)는 융합 세그먼트 pcf-Cm r의 전기영동 결과 사진이고, 도면에서 레인 1, 2 및 3은 1663bp의 표적 세그먼트이고, 레인 M은 마커이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에서 진탕 플라스크에서 배양한 출발균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1과 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ의 아포자 형성률을 측정한 결과의 히스토그램이다.
도 4는 본 발명 실시예 4 중 진탕 플라스크 발효에서 출발균과 및 재조합균의 균체 성장 주기 측정 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 5에서 출발균과 재조합균의 α-아밀라아제 활성 플레이트의 초기 시험 결과의 사진이다.
여기에서 (a)는 출발균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1 결과 사진이고, (b)는 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1spoⅡQ 결과 사진이고, (c)는 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1Δpcf 결과 사진이고, (d)는 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1spoⅡQΔpcf 결과 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예 5에서 출발균과 재조합균의 진탕 플라스크 발효에서 α-아밀라아제 효소 활성의 측정 결과의 히스토그램이다.
도 7은 본 발명의 실시예 6에서 5L 발효기 발효에서 출발균과 재조합균의 성장 측정 결과를 보여주는 그래프이며, 여기에서 (a)는 성장 그래프이고 (b)는 용존 산소 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예 6에서 5L 발효기 발효에서 출발균과 재조합균 α-아밀라아제 효소 활성 측정 결과의 히스토그램이다.
여기에서 (a)는 spoⅡQ 상류 상동성 아암 세그먼트 전기영동 결과 사진이고, 도면에서 레인 1, 2는 600bp의 상류 상동성 아암 세그먼트이고, 레인 M은 마커(Maker)이고;
(b)는 spoⅡQ 하류 상동성 아암 세그먼트 전기영동 결과 사진이고, 도면에서 레인 1, 2는 600bp의 하류 상동성 아암 세그먼트이고, 레인 M은 마커이고;
(c)는 융합 세그먼트 spoⅡQF-spoⅡQR의 전기영동 결과 사진이고, 도면에서 레인 1, 2는 1200bp의 표적 세그먼트이고, 레인 M은 마커이다.
도 2는 본 발명 실시예 2에서의 아가로스 겔 전기영동 결과 사진이다.
여기에서 (a)는 pcf 유전자 세그먼트 전기영동 결과 사진이고, 도면에서 레인 1, 2 및 3은 418bp의 pcf 부분 유전자 세그먼트이고, 레인 M은 마커이고;
(b)는 Cm r 유전자 세그먼트 전기영동 결과의 사진이고, 도면에서 레인 1, 2 및 3은 1245bp의 Cm r 유전자 세그먼트이고, 레인 M은 마커이고;
(c)는 융합 세그먼트 pcf-Cm r의 전기영동 결과 사진이고, 도면에서 레인 1, 2 및 3은 1663bp의 표적 세그먼트이고, 레인 M은 마커이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에서 진탕 플라스크에서 배양한 출발균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1과 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ의 아포자 형성률을 측정한 결과의 히스토그램이다.
도 4는 본 발명 실시예 4 중 진탕 플라스크 발효에서 출발균과 및 재조합균의 균체 성장 주기 측정 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 5에서 출발균과 재조합균의 α-아밀라아제 활성 플레이트의 초기 시험 결과의 사진이다.
여기에서 (a)는 출발균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1 결과 사진이고, (b)는 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1spoⅡQ 결과 사진이고, (c)는 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1Δpcf 결과 사진이고, (d)는 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1spoⅡQΔpcf 결과 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예 5에서 출발균과 재조합균의 진탕 플라스크 발효에서 α-아밀라아제 효소 활성의 측정 결과의 히스토그램이다.
도 7은 본 발명의 실시예 6에서 5L 발효기 발효에서 출발균과 재조합균의 성장 측정 결과를 보여주는 그래프이며, 여기에서 (a)는 성장 그래프이고 (b)는 용존 산소 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예 6에서 5L 발효기 발효에서 출발균과 재조합균 α-아밀라아제 효소 활성 측정 결과의 히스토그램이다.
이하에서는 실시예를 참조하여 본 발명의 기술적 해결책을 보다 상세하게 설명하나 이는 본 발명의 보호 범위를 제한하지 않는다.
생물학적 물질의 출처:
실시예에서 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1은 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였으며, 균주 일련번호는 ATCC NO. 27811이다.
실시예 1 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ의 구축
바실러스 리케니포르미스 게놈을 템플릿으로 사용하여 spoⅡQ 유전자 상류 및 하류 상동성 아암 spoⅡQF, spoⅡQR 및 융합 세그먼트 spoⅡQF-spoⅡQR에 대하여 PCR 증폭을 진행하며, 프라이머 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다.
spoⅡQF1：CATCGCCAGTCACTAGGATCCACGCCGAGGACGTAGCCT
spoⅡQR1: TTACCGTGCTTGGCATTATCCCTCGCTGAACATGTCCCGCTTT
spoⅡQF2: AAAGCGGGACATGTTCAGCGAGGGATAATGCCAAGCACGGTAA
spoⅡQR2: CAGTATTGACTGCAGGCGGCCGCAAGCTTGAACGGCTGCCTATT
증폭 산물은 1% 아가로스 겔 전기영동으로 검출하였으며, 600bp 및 1200bp가량에서 특이성 띠가 나타났고, 그 결과는 도 1 (a), (b), (c)와 같다.
BamHI와 NotI를 이용하여 녹아웃한 pTOPO-Cmr에 대하여 이중 절단을 진행하고, 정제 키트에 제공된 단계에 따라 정제를 진행하며, 심리스 클로닝을 이용하여 융합 세그먼트를 벡터와 연결하며, 연결체계는 하기 표와 같다.
전기천공법을 이용하여 재조합 벡터를 바실러스 리케니포르미스 균체에 형질 전환하고, 37℃, 180rpm 조건에서 1시간 동안 소생시키며, 클로람페니콜 내성 플레이트에 도포하여 1차 상동성 단일 교차(single crossover)가 발생한 균주를 스크리닝하고, 1차 상동성 교차에 성공한 균주를 5% 자일로스가 함유된 LB 액체 배지로 옮겨 37℃, 200rpm 조건에서 3회 계대 배양하고, 각각의 계대 배양마다 24시간 동안 2차 상동성 단일 교차가 발생한 균주를 스크리닝하며, 마지막으로 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ를 성공적으로 구축한다.
실시예 2 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf, 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1Δpcf의 구축
재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1Δpcf와 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf의 구축 과정과 방법은 동일하므로 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf만 예시로 들어 설명하도록 한다.
바실러스 리케니포르미스 게놈 DNA 및 pHT01 플라스미드를 템플릿으로 사용하여 pcf, Cm r 및 재조합 세그먼트 pcf-Cm r에 대하여 PCR 증폭을 진행하며, 사용하는 프라이머 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다.
pcfF CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATG
pcfR TTACCGTGCTTGGCATTATCCCTCGCTGAACATGTCCCGCTTT
CmrF CTACTGTTCAAACCAATGTGAAACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCAC
CmrR CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGG
증폭 산물은 1% 아가로스 겔 전기영동으로 검출하였으며, 600bp, 1200bp, 1600bp가량에서 특이성 띠가 나타났고, 그 결과는 도 2 (a), (b), (c)와 같다. 성공적으로 pcf-Cm r 재조합 세그먼트를 획득하였다.
BamHI를 이용하여 재조합 세그먼트 pcf-Cm r에 대하여 단일 절단을 진행한 후 정제를 수행하며, 전기천공법을 이용하여 재조합 세그먼트를 spoⅡQ 유전자 결실균에 형질 전환하고, 37℃, 180rpm 조건에서 1시간 동안 소생시키며, 클로람페니콜 내성 플레이트에 도포하여 양성 재조합균을 스크리닝하고, 마지막으로 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf, 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1Δpcf 재조합균을 성공적으로 구축한다.
실시예 3 출발균 및 재조합균(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ의 아포 형성률과 효소 활성의 측정
백금이로 글리세린관에서 출발균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1과 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ 균액을 LB 플레이트에 획선으로 도말하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 플레이트 상의 단일 콜로니를 액체 LB 배지 50mL에 접종하고, 37℃, 200rpm 조건에서 20시간 2회 계대 배양한다. 2대 배양에서 활성화된 균액을 2% 접종량으로 취하여 출발 균주와 재조합균을 100mL 액체 LB 배지로 옮기고, 37℃, 200rpm 조건으로 36시간 동안 진탕 플라스크에서 배양하며, 출발균 및 재조합균 균액을 각각 2mL 취하여 80℃ 수조에서 15분 동안 열처리하고, 구배 희석 후 LB 고체 배지에 도포하여 37℃에서 20시간 배양한다. 플레이트 콜로니 계수는 공식 아포 생성률=아포 양/총 균의 양×100%에 따라 출발균 및 재조합균 아포 생성률을 계산한다. 결과는 도 3에서 도시하는 바와 같이, 출발균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1 아포 수는 4.62×108CFU/mL이고, 균체 총 수는 5.79×108CFU/mL이고, 아포 생성률은 약 79.82%이고, 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoII 아포 수는 0.51×106CFU/mL이고, 균체 총 수는 3.19×108CFU/mL이며, 아포 생성률은 약 0.16%이다.
spoⅡQ 유전자 녹아웃으로 아포 결실 균주를 수득할 수 있으나, 아포 결실 공학적 균의 균체가 자가 용해되기 쉬워 생물량이 출발 균주보다 적다. 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ를 기반으로 재조합 균주 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf를 구축하여 아포 결실균의 균체 자가 용해를 줄였다.
출발균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1과 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ를 각각 60시간과 48시간 동안 발효시키며 최대 효소 활성은 각각 391U/mL, 340U/mL이다. 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ는 출발균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1에 비해 α-아밀라아제 발효 활성이 감소되었다.
실시예 4 진탕 플라스크 배양에서 출발균과 재조합균의 성장주기 측정
출발균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1과 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ, 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1Δpcf, 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf를 실시예 1의 방법에 따라 활성화시키고, 활성화된 균액 2mL를 100mL LBPG 액체 배지에 접종하고 37℃, 200rpm 조건으로 진탕 플라스크 배양하며, 그 동안 4시간 내지 6시간마다 샘플을 채취하여 균체 농도OD600를 측정하였다. 성장 그래프 곡선은 도 4에서 도시하는 바와 같다. 상기에서 설명한 배지의 성분은 하기와 같다.
LB 배지: 트립톤 1%, 효모 추출물 분말 0.5%, NaCl 1 %(모두 질량분율) pH 7.0.
LBPG 배지: 트립톤 1%, 효모 추출물 분말 0.5%, NaCl 1%, 포도당 0.1%(모두 질량분율) 글리세린 2.5%(부피분율) pH 7.0.
실시예 5 출발균과 재조합균의 진탕 플라스크 발효 균체 발효 효소 생산의 측정
출발 균주 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1, 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ, 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1Δpcf 및 재조합 균주 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf를 고체 배지에 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 배양하며, 플레이트에서 요오드 용액을 점적하고 투명한 원의 크기를 관찰하였다. 그 결과는 도 5의 (a), (b), (c), (d)와 같으며, 전분 가수 분해 투명 고리 직경은 각각 2.7cm, 2.2cm, 3.1cm 및 3.4cm이며, 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1Δpcf와 재조합 균주 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf는 발효에 의한 α-아밀라아제 생산 능력이 출발균보다 높게 1차적으로 확인되었다. 출발 균주와 재조합 균주를 각각 2% 접종량으로 100mL의 액체 발효 배지에 접종하고 37℃, 200rpm 조건에서 배양하였으며, 이 기간 동안 12시간마다 샘플을 채취하여 중국 표준 GB/T24401-2009 방법에 따라 α-아밀라아제의 효소 활성을 측정하였으며, 그 결과는 도 6에서 도시하는 바와 같다. 출발균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1, 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1Δpcf 및 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf 모두 발효 60시간에서 최대 효소 활성에 도달하였으며, 이는 각각 391U/mL, 407U/mL 및 434U/mL이다. 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ는 발효 후 48시간에 최대 효소 활성이 340U/mL에 도달하였고, 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf는 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1보다 효소 활성이 10.9% 향상되었다. 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf는 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1Δpcf보다 효소 활성이 6.6% 향상되었다. 또한 구축된 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf는 α-아밀라아제의 발효 활성을 효과적으로 개선할 수 있음을 더 확인하였다.
α-아밀라아제 활성 정의: 1ml 액체 효소가 70℃, pH6.0 조건에서 1분 동안 1mg의 가용성 전분을 액화하는 것으로, 1개 효소 활성 단위는 U/mL로 표시한다.
상기 발효 배지의 성분은 하기와 같다.
가용성 전분 2%, 트립톤 1%, 효모 추출물 분말 0.5%, 염화나트륨 1%, 포도당 0.1%, 글리세린 2.5%(모두 질량분율), pH 7.0.
실시예 6 5L 발효기에서 출발균과 재조합균의 균체 발효 성능의 측정
실시예 1의 방법에 따라 출발균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1, 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1Δpcf 및 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf를 활성화시키고, 5%로 5L 발효기에 접종시키며 발효액 초기 총량은 3L이고, pH7.5, 37℃, 350rpm 조건에서 발효를 진행하며, 발효 주기는 84시간이다. 이 기간 동안 6시간 내지 8시간마다 샘플을 취하여 균체 농도OD600를 측정하고, 12시간마다 샘플을 취하여 α-아밀라아제 효소 활성을 측정하였으며 균체 성장 그래프는 도 7과 같다. 진탕 플라스크 발효에 비해 5L 발효기 발효 시 균체 농도가 더욱 높았으며 균체 성장이 더욱 안정적이었다. α-아밀라아제 효소 활성 측정 결과는 도 8에서 도시하는 바와 같으며, 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1Δpcf, 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf의 효소 활성은 1397U/mL, 1488U/mL에 도달하였는데, 이는 출발균 α-아밀라아제 효소 활성보다 각각 12.1%, 19.3% 높았다.
SEQUENCE LISTING
<110> QILU UNVERSITY OF TECHNOLOGY
<120> Method and application for knocking out spo??Q and pcf genes to improve fermentation, enzyme production of Bacillus licheniformis
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 696
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 1
atgaaagagg aagaaaagaa tcgtacttcc aaaatcacaa agctgcaaca attttttcgt 60
aaacgctggg tatttccggc catctatttg acaagtgccg tcgttgtatt aaccgccgtt 120
ctatggtatc aatcggcttc taacaacgat gtaaaagacc agcttgcaga cgatggcaag 180
aaatcagcct atgataaccg ggatgatgcg gtagaagtag gcaaaccagt cgaaaatgtc 240
gcaatgccgg ttgctgattc tgaaaatgtt tccgtcgtta aaaagttttt tgaaactgac 300
gcaactaaag aagagaaaga agcagcactt gtaaactata ataacacgta cagcatgagc 360
aaaggtatcg acttggctga gaaagacgga aaaacatttg atgtttccgc atctctaagc 420
ggtacggtca tcaaagctgc aaaagaccct gtactgggct acgttgttga agttgaacat 480
gaagatggtt tatcaactgt gtatcagtct ctttctgaag taagcgtcaa acaaggtgac 540
aagattgaac aaaatcaagt catcggaaaa gcaggcaaaa acctttacaa tgaagaaggc 600
ggaaaccatg tgcattttga aatccgcaaa gacggtgttg cgctaaaccc gctgaacttc 660
atggacaagc cggtctccag cattgaaaaa gcgtaa 696
<210> 2
<211> 504
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 2
atggaagatt tgcttttcga atataaaaga gcgctgaaaa acacgaaaaa attgtataag 60
ccctatcaag atgaacaagg gctgacggct gaacagctga atgataaaaa actgatcaga 120
aacatgatga ccgatttgga atatgtgatc gactggcttg aaaacggaag agaacctgga 180
atcagacggg cgattgacag gcgcgactct tataagcgga tgctcctgaa agatccgcgg 240
atcatcgaca cgttttcaga acagagtgca tttgaaccgg ctcaggaagt gtcagcatac 300
gataaagccc ggattgaatc agcgctgtct gcccttacgg cacgcgaaaa agaaatcttc 360
attttacata aggtcgaaca gttttcctat gagcggattg ccgccatgct cggcatcaaa 420
aagtctactg ttcaaaccaa tgtgaaacgg gcgcagctga aaatcgcgaa acagatcgaa 480
aagcctctcg attgtatggc ataa 504
Claims (9)
- α-아밀라아제 고생산성 재조합균에 있어서,
α-아밀라아제 생산 미생물 중의 유전자 spoⅡQ와 유전자 pcf를 녹아웃하여 수득하며, 상기 유전자 spoⅡQ 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.1과 같고, 유전자 pcf 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.2와 같고;
상기 α-아밀라아제 생산 미생물은 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1이고, ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였으며, 균주 일련번호는 ATCC NO. 27811인 재조합균. - (1) α-아밀라아제 생산 미생물의 아포 형성 유전자 spoⅡQ를 녹아웃하여 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ를 획득하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 제조된 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ 중 균체 자가 용해 유전자 pcf를 녹아웃하여, 재조합균 바실러스 리케니포르미스 DL-1ΔspoⅡQΔpcf를 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항의 α-아밀라아제 고생산성 재조합균의 제조 방법. - 상기 단계 (1)에서, α-아밀라아제 생산 미생물의 아포 형성 유전자 spoⅡQ를 녹아웃시키는 구체적인 단계는,
단계 1: 바실러스 리케니포르미스의 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하여 상류 및 하류 상동성 아암(arm) 프라이머 spoⅡQF1, spoⅡQR1 및 spoⅡQF2, spoⅡQR2를 설계하고 PCR 증폭을 수행하여, spoⅡQ 상류 및 하류 상동성 아암 세그먼트를 획득한 다음, PCR 중첩을 통해 상동성 아암을 연결하여 융합 세그먼트 spoⅡQF-spoⅡQR를 획득하는 단계;
여기에서, 상기 상류 및 하류 상동성 아암 프라이머 spoⅡQF1, spoⅡQR1 및 spoⅡQF2, spoⅡQR2의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같으며,
spoⅡQF1：CATCGCCAGTCACTAGGATCCACGCCGAGGACGTAGCCT;
spoⅡQR1: TTACCGTGCTTGGCATTATCCCTCGCTGAACATGTCCCGCTTT;
spoⅡQF2: AAAGCGGGACATGTTCAGCGAGGGATAATGCCAAGCACGGTAA;
spoⅡQR2: CAGTATTGACTGCAGGCGGCCGCAAGCTTGAACGGCTGCCTATT;
단계 2: BamHⅠ과 NotⅠ을 이용하여 녹아웃된 pTOPO-Cmr에 대하여 이중 절단(double digestion), 정제, 심리스 클로닝(Seamless Cloning) 기술을 수행하여 단계 1에서 획득한 융합 세그먼트를 벡터와 연결하여 재조합 벡터 pTOPO-Cmr-spoⅡQ를 수득하는 단계;
단계 3: 바실러스 리케니포르미스의 수용성 세포를 제조하며, 단계 2에서 획득한 재조합 벡터를 바실러스 리케니포르미스 균체에 전기천공법으로 도입하고, 클로람페니콜(chloramphenicol)을 함유하는 LB 고체 배지 상에 도포하여 1차 스크리닝을 진행하고, 1차 스크리닝 균주는 5% 자일로스(xylose)를 함유한 LB 액체 배지로 옮겨 2차 스크리닝을 진행하여, 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ를 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제2항의 α-아밀라아제 고생산성 재조합균의 제조 방법. - 상기 단계 (2)에서 재조합균 ΔspoⅡQ에서 균체 자가 용해 유전자 pcf를 녹아웃시키는 구체적인 단계는,
단계 I: 바실러스 리케니포르미스 게놈 DNA 및 pHT01 플라스미드를 템플릿으로 사용하여 상하류 프라이머 pcfF, pcfR 및 Cm rF, Cm rR을 설계하고, PCR 증폭으로 pcf 유전자 세그먼트 및 클로람페니콜 내성 Cm r 유전자 세그먼트를 획득하며, PCR 중첩을 통해 pcf 및 Cm r 유전자 세그먼트를 연결하여 융합 세그먼트 pcf-Cm r을 획득하는 단계;
상기 프라이머 pcfF, pcfR 및 Cm rF, Cm rR 뉴클레오티드 서열은 하기와 같고,
pcfF CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATG
pcfR TTACCGTGCTTGGCATTATCCCTCGCTGAACATGTCCCGCTTT
CmrF CTACTGTTCAAACCAATGTGAAACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCAC
CmrR CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGG
단계 II: 단계 I에서 수득된 pcf-Cm r에 대하여 BamHI를 이용해 단일 절단, 정제를 진행한 후 전기천공법으로 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ 균체에 도입하는 단계;
단계 III: 단계 II에서 수득된 형질 전환된 균을 클로람페니콜이 함유된 LB 고체 배지 상에 도포하고, 클로람페니콜 내성이 있는 양성 유전자 결실 재조합균을 스크리닝하여 재조합균 바실러스 리케니포르미스(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf를 획득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제2항의 α-아밀라아제 고생산성 재조합균의 제조 방법. - (i) α-아밀라아제 고생산성 재조합균을 활성화시켜 활성화 균체를 제조하는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 제조된 활성화 균체를 확대 배양하여 발효 균체를 제조하는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 제조된 발효 균체를 발효 배지에 접종하고, 37℃, 300rpm 조건에서 84시간 동안 발효하며, 고액 분리를 거쳐 액체를 취하고 정제하여 α-아밀라아제를 제조하는 단계를 포함하고;
상기 발효 배지의 성분은,
트립톤(tryptone) 10g/L, 효모 추출물 분말 5g/L, 가용성 전분 20g/L, 염화나트륨 10g/L, 포도당 1g/L, 글리세린 2.5%(부피분율), pH 7.0인 것을 특징으로 하는 제1항의 α-아밀라아제 고생산성 재조합균을 이용하여 α-아밀라아제를 제조하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 단계 (i)에서, 글리세린관에서 균액을 취하여 LB 플레이트에 획선으로 도말하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하며, 단일 콜로니를 선택하여 50mL의 액체 LB 배지로 옮기고 37℃, 200rpm 조건에서 20시간 동안 2회 계대 배양하여 활성화 균체를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 단계 (ii)에 있어서, 단계 (i)에서 수득된 활성화 균체를 2% 접종량으로 100mL LBPG 배지에 옮겨 37℃, 200rpm 조건으로 확대 배양하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 LBPG 배지의 성분이,
트립톤 10g/L, 효모 추출물 분말 5g/L, 염화나트륨 10g/L, 포도당 1g/L, 글리세린 2.5%(부피분율), pH 7.0인 것을 특징으로 하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 단계 (iii)에서, 고속 냉동 원심분리기를 이용하여 발효액을 4℃, 12000rpm 조건에서 10분 동안 원심 분리를 진행하여 조효소액을 수득하며, 이는 후속 효소 활성 측정에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
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