CN109385391B

CN109385391B - 菌株及其构建方法，以及其用于发酵生产耐高温黄原胶的应用

Info

Publication number: CN109385391B
Application number: CN201811359138.5A
Authority: CN
Inventors: 胡炎华; 马挺; 戴晓慧; 常利斌; 于宏艳
Original assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Current assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority date: 2018-11-15
Filing date: 2018-11-15
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2038-11-15
Also published as: CN109385391A

Abstract

本发明涉及微生物基因工程领域，特别涉及菌株及其构建方法，以及其用于发酵生产耐高温黄原胶的应用。本发明利用基因工程技术改变野油菜黄单胞菌基因组序列，构建耐高温黄原胶工程菌株，其合成的黄原胶不需要任何发酵后处理就可以耐高温，可大大减少生产成本。

Description

菌株及其构建方法，以及其用于发酵生产耐高温黄原胶的应用

技术领域

本发明涉及微生物基因工程领域，特别涉及菌株及其构建方法，以及其用于发酵生产耐高温黄原胶的应用。

背景技术

黄原胶(Xanthan)是由黄单胞菌属(Xanthomonas)产生的一种水溶性多糖高聚物，是国际上集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体，性能最优越的生物胶，已被广泛应用于食品、石油、地矿、医药、环境保护、轻纺、陶瓷、搪玻璃、油漆、印染、化妆品等二十多个行业几百种用途。

我国是黄原胶的主要产区，近几年全球对黄原胶的需求逐年上涨，我国黄原胶产量也一直呈现增长趋势。黄原胶的的全球销量从2011年的8.4万吨，上升到2015年的18.2万吨。食品加工和石油钻井、开采仍然会是国内外最主要的黄原胶消费领域。耐高温、耐盐和抗剪切性是考察一个聚合物是否具有油田开发应用前景的三个基本性能。单一的黄原胶溶液耐温性较差，而我国多高温高盐油藏，黄原胶在高温下易发生水解、氧化降解和微生物降解等，而生产耐高温黄原胶需要在成品黄原胶中添加交联剂、抗氧化剂等物质。由于生产成本和油藏条件等因素制约，我国石油行业的黄原胶用量比较少。因此利用基因工程的技术改造黄原胶生产菌株的基因组序列，从基因水平上修饰黄原胶的一级结构，提高黄原胶耐高温的特性，是目前高效生产耐高温型黄原胶的一种直接有效快速的技术手段。

现有技术解决黄原胶耐高温的主要方法是：生产菌株诱变(申请号：03178336.8，CN 101906390)；发酵后处理加交联剂(CN 104130336)等。诱变菌株虽能得为经济的突变体，但筛选工作量大，负向突变比例较高，也大大增加了研究成本；加交联剂虽然能够在一定程度上提高黄原胶的耐高温性能，但是处理步骤繁琐，交联剂也需要一定的成本，后期投入高，对于大规模生产来说，大大增加了黄原胶的生产成本。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种菌株及其构建方法，以及其用于发酵生产耐高温黄原胶的应用。本发明利用基因工程技术改变野油菜黄单胞菌基因组序列，构建耐高温黄原胶工程菌株，其合成的黄原胶不需要任何发酵后处理就可以耐高温，可大大减少生产成本。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了野油菜黄单胞菌，敲除了丙酮酰基转移酶基因gumL基因，所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

Ⅰ、具有SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列；

Ⅱ、具有SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

III、与SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

IV、如Ⅰ、Ⅱ或III所示序列的互补序列。

在此基础上，本发明还提供了野油菜黄单胞菌的构建方法，包括如下步骤：

步骤1：扩增获得gumL上下游同源臂基因，通过overlap PCR将gumL基因的上下游同源臂连接，以自杀质粒pLO3为骨架，向质粒上的多克隆位点插入gumL基因的上下游同源臂片段，构建获得丙酮酰基转移酶基因gumL的敲除质pLO3-ΔgumL；

步骤2：将敲除质粒pLO3-ΔgumL转化至E.coliS17菌株，获得转化子，得到重组菌株E.coliS17/pLO3-ΔgumL；

步骤3：将所述重组菌株E.coliS17/pLO3-ΔgumL接合转移至野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris WT(菌种编号NRRL B-1459)，Cm^r、tet^r双抗平板筛选单交换菌株，蔗糖致死筛选获得缺失gumL基因的双交换菌株△gumL。

本发明还提供了野油菜黄单胞菌，在所述的野油菜黄单胞菌或所述的构建方法获得的野油菜黄单胞菌中添加乙酰基转移酶基因gumF和/或gumG基因，所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

Ⅰ、具有SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列；

Ⅱ、具有SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

III、与SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

IV、如Ⅰ、Ⅱ或III所示序列的互补序列。

步骤1：扩增获得gumFG基因，以表达质粒pBBRMCS为骨架，向所述表达质粒pBBRMCS上的多克隆位点插入gumFG基因，构建乙酰基转移酶基因gumF、gumG的表达质粒pBBR-gumFG；

步骤2：将重组质粒pBBR-gumFG转化至E.coli-1 S17菌株，筛选正确的转化子，得到重组菌株E.coli-1 S17/pBBR-gumFG；

步骤3：将重组菌株E.coli-1 S17/pBBR-gumFG接合转移至如权利要求2构建的菌株，Cm^r、Kan^r双抗平板筛选重组菌株，获得gumL基因敲除及添加gumFG基因的△gumL::gumFG菌株。

本发明还提供了野油菜黄单胞菌，在所述的野油菜黄单胞菌或所述的构建方法获得的野油菜黄单胞菌中添加黄原胶聚合输出相关基因gumB和/或gumC基因，所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

Ⅰ、具有SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列；

Ⅱ、具有SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

III、与SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

IV、如Ⅰ、Ⅱ或III所示序列的互补序列。

步骤1：扩增获得gumBC基因，以表达表达质粒pMMB67eH为骨架，向质粒上的多克隆位点插入gumBC基因，构建乙酰基转移酶基因gumB、gumC的表达质粒pMM-gumBC；

步骤2：将重组质粒pMM-gumBC转化至E.coli-1 S17菌株，筛选正确的转化子，得到重组菌株E.coli-1 S17/pMM-gumBC；

步骤3：将重组菌株E.coli-1 S17/pMM-gumBC接合转移至如权利要求4获得菌株中，Cm^r、Amp^r双抗平板筛选重组菌株，获得gumL基因敲除、添加gumFG基因和添加gumBC基因的△gumL::gumFG::gumBC菌株。

本发明还提供了所述的野油菜黄单胞菌或所述的构建方法获得的野油菜黄单胞菌，其保藏编号为CGMCC No.16101。

本发明还提供了所述的野油菜黄单胞菌或所述的构建方法获得的野油菜黄单胞菌在生产耐高温黄原胶中的应用。

在此基础上，本发明还提供了一种生产耐高温黄原胶的方法，将所述的野油菜黄单胞菌或如所述的构建方法获得的野油菜黄单胞菌接种于培养基中发酵培养，收集发酵液。

在本发明的一些具体实施方案中，生产耐高温黄原胶的方法包括如下步骤：

步骤1：挑取所述的野油菜黄单胞菌或如所述的构建方法获得的野油菜黄单胞菌的单菌落接种到种子培养基，于200rpm、30℃培养20h，获得一级种子培养液；

步骤2：将所述一级种子培养液以1％(v/v)的接种量接种到种子培养基中，于200rpm、30℃培养20h，获得二级种子培养液；

步骤3：将所述二级种子培养液以10％(v/v)的接种量接种到种子培养基中，于230rpm、28℃培养72h，收集发酵液。

本发明利用基因工程技术改变野油菜黄单胞菌基因组序列，构建耐高温黄原胶工程菌株，其合成的黄原胶不需要任何发酵后处理就可以耐高温，可大大减少生产成本。

生物保藏说明

生物材料：MHZ-20002-3；分类命名：野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonascampestris)；于2018年07月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.16101。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示WT、MHZ-20002-1、MHZ-20002-2和MHZ-20002-3所产黄原胶耐温性能比较；

图2示黄原胶合成基因簇；

图3示gumL基因敲除原理图；

图4示gumL上下游同源臂overlap PCR扩增产物电泳图；

图5示MHZ-20002-3的重组子验证图；

图6示qPCR验证WT、MHZ-20002-1、MHZ-20002-2和MHZ-20002-3中gumF、gumG、gumB、gumC、gumL基因的表达量；

图7示HPLC测定黄原胶的丙酮酰基基含量；其中，图7a示WT；图7b示MHZ-20002-1，丙酮酰基：9.2s；内标：18.1s；

图8示HPLC测定黄原胶的乙酰基含量；其中，图8a示WT；图8b示MHZ-20002-1；图8c示MHZ-20002-2；图8d示MHZ-20002-3；乙酰基：15.2s；内标：18.1s；

图9示黄原胶流变性能对比。

具体实施方式

本发明公开了一种菌株及其构建方法，以及其用于发酵生产耐高温黄原胶的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明以Xanthomonas campestris WT(菌种编号NRRL B-1459)为出发菌株，利用基因工程技术敲除了黄原胶合成途径中丙酮酰基转移酶基因的gumL，并过表达了两个乙酰基转移酶基因gumF、gumG和与黄原胶的聚合输出有关的基因gumB、gumC，构建了一株耐高温黄原胶工程菌株，能够产生耐高温黄原胶，具有广泛的工业应用价值。该菌株已委托中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC No.16101。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种耐高温黄原胶基因工程生产菌的构建方法。

耐高温黄原胶基因工程生产菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)从XANTHOMONAS CAMPESTRIS WT(菌种编号NRRL B-1459)基因组上扩增gumL上下游同源臂基因，通过overlap PCR将gumL基因的上下游同源臂连接，以自杀质粒pLO3为骨架，向质粒上的多克隆位点插入gumL基因的上下游同源臂片段，构建丙酮酰基转移酶基因gumL的敲除质粒pLO3-ΔgumL；

(2)将重组质粒pLO3-ΔgumL转化至E.coli-1S17菌株，筛选正确的转化子，得到重组菌株E.coli-1 S17/pLO3-ΔgumL；

(3)将重组菌株E.coli-1 S17/pLO3-ΔgumL接合转移至XANTHOMONAS CAMPESTRISWT(菌种编号NRRL B-1459)，Cm^r、Tet^r双抗平板筛选单交换菌株，蔗糖致死筛选缺失gumL基因的双交换菌株，命名为MHZ-20002-1；

(4)实时荧光定量PCR(qPCR)测定gumL基因的转录水平，图6、表7的结果显示gumL基因没有转录；高效液相色谱(HPLC)测定ΔgumL产生黄原胶的丙酮酰基含量，图7结果显示其黄原胶丙酮酰基含量为0。证明gumL基因已完全失活。

(5)从XANTHOMONAS CAMPESTRIS WT(菌种编号NRRL B-1459)基因组上扩增gumFG基因，以表达质粒pBBRMCS为骨架，向质粒上的多克隆位点插入gumFG基因，构建乙酰基转移酶基因gumF、gumG的表达质粒pBBR-gumFG；

(6)将重组质粒pBBR-gumFG转化至E.coli-1 S17菌株，筛选正确的转化子，得到重组菌株E.coli-1 S17/pBBR-gumFG；

(7)将重组菌株E.coli-1 S17/pBBR-gumFG接合转移至MHZ-20002-1，Cm^r、Kan^r双抗平板筛选重组菌株，命名为MHZ-20002-2；

(8)qPCR测定gumF、gumG基因的转录水平，图6、表7的结果显示gumF、gumG基因转录水平较XANTHOMONAS CAMPESTRIS WT(菌种编号NRRL B-1459)和MHZ-20002-1都有明显的提高；高效液相色谱(HPLC)测定ΔgumL::gumFG产生黄原胶的乙酰基含量，图8结果显示其黄原胶乙酰基含量提高了1倍。

(9)从XANTHOMONAS CAMPESTRIS WT(菌种编号NRRL B-1459)基因组上扩增gumBC基因，以表达表达质粒pMMB67eH为骨架，向质粒上的多克隆位点插入gumBC基因，构建黄原胶聚合输出相关基因gumB、gumC的表达质粒pMM-gumBC；

(10)将重组质粒pMM-gumBC转化至E.coli-1 S17菌株，筛选正确的转化子，得到重组菌株E.coli-1 S17/pMM-gumBC；

(11)将重组菌株E.coli-1 S17/pMM-gumBC接合转移至MHZ-20002-2中，Cm^r、Amp^r双抗平板筛选重组菌株，命名为MH-20002-3；

(12)qPCR测定gumB、gumC基因的转录水平，图6、表7的结果显示MH-20002-3的gumB、gumC转录水平较MHZ-20002-2有明显提高，证明导入的质粒pMM-gumBC有生物活性。

(13)将XANTHOMONAS CAMPESTRIS WT(菌种编号NRRL B-1459)、MHZ-20002-1、MHZ-20002-2和MHZ-20002-3在相同条件下发酵。

(14)测定以上四株菌所产黄原胶的产量、发酵液黏度、分子量、乙酰基含量、丙酮酰基含量、流变特性及耐高温特性。

本发明的第二个目的，根据如上所述的方法构建获得一株耐高温黄原胶基因工程生产菌MHZ-20002-3。

本发明的第三个目的，通过发酵如上所述耐高温黄原胶基因工程菌，提供一种耐高温黄原胶生产方法。

使用的引物序列信息如表1所示：

表1、引物序列信息

相关基因序列：

△GumL基因序列(如SEQ ID No.29所示)：

ATGGCCAACGCTTTACTGCAGAAATGGGTGGAACGGGCGGAACGTCGCGCATTGTTCTGGTGGCAGCCCAAAAACGGTGGCGTGAACATGGGGGATCACCTGTCGAAGGTGATCGTGTCGTGCGTGTTGGCGTTGCAGGACAAGACACTTCTGGAAAAACGCGATTTGCGCCAGAAGCTGATCGCAACCGGGTCGGTGCTGCATTTCGCCAAAGATGGCGACACCGTGTGGGGAAGCGGTATCAACGGCAAGATTCCGGCCGAGCGCAATACGTTCAGCACGCTGGACGTACGCGCGGTACGCGGTCCCAAGACCCGCGCATTTTTGCTGGAACGTGGCATCGCAGTGCCTGAGGTCTACGGAGACCCGGGATTGCTGACCCCGATGTTTTTCCCCGCCGACGCCCTCGGCCCGGTCACCAAGCGCCCGTTCGCGATCGTGCCGCACTTCAACGAGCCGGTTGAGAAGTACAGCGCCTACGCCGAGCATCTGGTGTTTCCCAACGTCAAGCCGGCCACCTTCATGAGTGCGCTGCTGGGTGCGGAATTTGTCATCAGCAGTTCGCTGCATGGCCTGATCCTGGCCGAAGCCTATGGCATCCCGGCGGTGTATCTGGACTGGGGCAACGGCGAAGACCGTTTCAAGTACGACGACTACTACCACGGCACCGGGCGCATGCAATGGCATGCCGGCCACAGCGTGGAAGAATGCATGGAACTGGGCGGCAACGGCAGTTTCGATCTTGAACGCTTGCAGGCAGGATTGCTGGCTGCGTTCCCTTACGATTTGTGGTGA。

GumB、gumC基因序列(如SEQ ID No.30所示)：

ATGTCGCTGGGCGCTTGCAGCACCGGCCCGGAGATGGCGTCTTCGCTGCCGCATCCGGACCCGCTGGCAATGTCCACGGTGCAGCCCGAATACCGTCTTGCGCCGGGCGATCTGTTGCTGGTGAAGGTGTTTCAGATCGACGATCTGGAGCGGCAGGTCCGCATCGACCAGAACGGTCACATCTCACTGCCGTTGATTGGCGACGTCAAGGCCGCCGGTCTGGGCGTTGGCGAACTGGAAAAGCTGGTCGCCGATCGGTATCGCGCAGGCTACCTGCAGCAGCCGCAGATTTCGGTATTCGTGCAGGAGTCCAACGGGCGTCGCGTCACGGTCACTGGTGCGGTAGACGAGCCGGGCATCTACCCGGTGATCGGCGCCAACCTCACCTTGCAGCAGGCGATCGCGCAGGCCAAGGGTGTCAGCACGGTGGCAAGCCGCGGCAACGTGATCGTGTTCCGCATGGTCAACGGGCAAAAAATGATTGCGCGGTTCGACCTGACCGAGATCGAGAAGGGGGCCAATCCGGATCCTGAGATTTATGGCGGCGACATTGTCGTGGTGTATCGCTCGGATGCGCGCGTGTGGTTGCGCACCATGCTGGAACTGACCCCCTTGGTGATGGTGTGGCGCGCTTACCGATGAGTATGAATTCAGACAATCGTTCCTCTTCGTCGCAGCGGTCATGGTCATCTGGAACTGGCAGATGTCGACTTGATGGACTACTGGCGCGCCCTGGTCTCGCAGCTCTGGCTGATCATCCTGATCGCCGTCGGCGCGCTGTTGCTGGCATTCGGCATCACGATGTTGATGCCCGAGAAGTACCGCGCCACCAGCACCCTGCAGATCGAACGTGACTCGCTCAATGTGGTGAACGTCGACAACCTGATGCCGGTGGAATCGCCGCAGGATCGCGATTTCTACCAGACCCAGTACCAGTTGCTGCAGAGCCGTTCGCTGGCGCGTGCGGTGATCCGGGAAGCCAAGCTCGATCAGGAGCCGGCGTTCAAGGAGCAGGTGGAGGAGGCGCTGGCCAAAGCCGCCGAAAAGAATCCCGAGGCGGGTAAGTCGCTCGATTCGCGGCAGGCGATCGTCGAGCGCAGCCTCACCGATACGTTGCTCGCCGGGCTGGTGGTCGAGCCGATCCTCAACTCGCGCCTGGTGTACGTCAATTACGATTCGCCAGACCCGGTGCTGGCCGCCAAGATCGCCAATACGTACCCGAAGGTGTTCATCGTCAGCACCCAGGAACGCCGCATGAAGGCGTCTTCGTTTGCGACACAGTTTCTGGCTGAGCGCCTGAAGCAGTTGCGCGAGAAGGTCGAAGACTCTGAAAAGGATCTGGTCTCGTATTCGACCGAAGAGCAGATCGTGTCGGTTGGCGATGACAAGCCCTCGCTGCCTGCGCAGAATCTGACCGATCTCAATGCGTTGCTGGCATCCGCACAGGACGCCCGGATCAAGGCCGAGTCAGCTTGGCGGCAGGCTTCCAGTGGCGATGGCATGTCATTGCCGCAGGTGTTGAGCAGCCCGCTGATTCAAAGCCTGCGCAGCGAGCAGGTGCGTCTGACCAGCGAGTACCAGCAGAAACTGTCGACCTTCAAGCCGGATTACCCGGAGATGCAGCGCCTCAAGGCGCAGATCGAAGAGTCGCGTCGTCAGATCAATGGCGAAGTCATCAATATCCGTCAGTCGCTGAAGGCGACCTACGACGCCTCCGTGCATCAGGAGCAGCTGCTCAACGACCGCATCGCCGGTCTGCGGTCCAACGAGCTGGATCTGCAGAGCCGCAGCATCCGCTACAACATGCTCAAGCGCGACGTCGACACCAACCGCCAGCTCTACGATGCGCTCCTGCAGCGCTACAAGGAAATCGGCGTGGCGAGCAACGTGGGCGCCAACAACGTGACCATCGTCGATACCGCAGACGTGCCTACGTCTAAGACTTCGCCGAAACTCAAATTGAACCTCGCGTTGGGCCTGATCTTTGGCGTATTCCTGGGCGTGGCTGTGGCTCTGGTTCGCTACTTCCTGCGTGGGCCTTCTCCGAGGTCGCGGTTGAACTGA。

GumF、gumG基因序列(如SEQ ID No.31所示)：

GTGAATACGGTGACAGGGGCATCGGGGACGTCGGCGCCTGTGCAGGCTGCCGGCGCGCGTGCCTTCGCGAGCGGCCGTAGCCGCGATCCACGTATCGATGCGACCAAGGCGATCGCGATATTGCTGGTGGTGTTCTGCCACGCAAAAGGCGTGCCGCACGGAATGACCCTGTTTGCCTACAGCTTTCACGTTCCGCTTTTCTTCCTCGTGTCGGGTTGGCTGGCTGCCGGTTATGCCTCGCGCACAACCAGCCTGCTGCAGACAATCACCAAGCAGGCACGTGGTCTGTTGCTGCCCTATGTCGTGTTCTATCTGCTTGGATATGTGTATTGGCTGTTGACGCGCAACATCGGCGAGAAAGCTGCACGTTGGGGGAGCCACCCGTGGTGGGAGCCGATCGTGTCGATGTTTACCGGCGTCGGCCCGGATCTGTATGTGCAGCCGCCGCTGTGGTTCCTGCCGGTGATGCTGGTCACCGTGATTGGCTACGTTCTGTTGCGGCGCTGGATGCCGCCACTGGTCATTGCGGCTGTCGCAGTTGTTCTCGCCTGGTTCTGGATGAACTGGTTTCCGCTCCAGCACATGCGATTGTTCTGGGGCCTGGATGTGCTACCGGTGTCGCTGTGCTTCTACGCACTGGGCGCGCTGCTGATCCACGTGTCGCCGTATCTTCCAACCTCCTTGCCTGGTAGCGCGTTGGTCACCGTAGTGCTGGCAGCATTGGTTGCCTGGCTGGCCGGGGTCAACGGCCGCATCGATGTCAACATGCTGGAATTCGGAAGGCAGCATGCCGTATTCCTGTTGAGTGCAGTGGCGGGTTCGTTGATGGTGATCTGCGCGGCGCGCATGGTGCAGGAATGGACATGGCTGCAGTGGATCGGGCGCAACACCTTGCTGATCCTGTGCACGCACATGCTGGTCTTCTTTGTACTGTCTGGTGTTGCGGCCTTGGCGGGTGGGTTTGGTGGGGCGCGCCCAGGCCTTGGTTGGGCCATCTTCGTGACGCTCTTTGCGCTGGTCGCCAGCGTTCCGCTGCGCTGGTTTCTGATGCGTTTTGCCCCCTGGACCTTGGGTGCACGTCCGGTGTCGGCATGACGACGGCTGCGATCACTGCCGGTCGCGTCGACACAATCGCCTCAACTGTCGCGGAGCGCGACTGGCAGATCGACGTGGCCAAGGCTCTTGCGATCATTCTGGTCGCGCTGGGGCACGCCAGTGGCATGCCGCCTGCCTACAAGCTGTTTGCCTACAGCTTCCATGTGCCTCTGTTTTTCGTTCTTTCCGGCTGGGTCGGTGAACGCTTCGGGCGTCGTGCATTTGGCCGGAAGACGGTGGGAAAGCTTGCGCGCACGCTGCTGATTCCCTACGTCAGCTTTTTTCTGGTGGCTTACGGCTACTGGATACTGAGCGCAGTGCTCAACGGCACATCCCAGTCCTGGGCTGGCCACCCCTGGTGGCATCCGTTTGTTGGATTGCTGTGGGCCAATGGATCCAGCTTGTATGTGCTCCCGGCCTTGTGGTTTCTCCCCGCACTGTTTGTCGCCACCGTTGTCTACCTGGCACTGCGCGAAGACCTGAGCGCCGCAGTGCTCGCGGTCTGCAGTTTGCTGGTTGTGTGGGCGTGGACGCGTTGGTTCCCAGGGCTGCGGCTGCGCCTTCCGTTTGCACTGGATGTGCTGCCGGTCGCGCTGTTCTTCATTGCAGTCGGCGCATGGCTGTCACGCTTCGCAGAGAGAGTGCGCGCGCTTCCTGCGGTCGTTTGGGTCGTCGCGTTCCCGGTCCTGGCATTCGCCTGGGGGGGCGTTGCAGCCATGAACGGGCAGGTGGATGTCAATAATCTTCAGTTCGGAAAATCGTCGCTCCTGTTCCTGATCGCAAGCCTGCTGGGTACAGCAATGACGTTGTGCATTGCCTACTTCATGCAAGGGTGGCGCTGGCTGCGTTGGATCGGCGCCAATACGCTGCTGATCCTTGGCACGCACACGTTGGTGTTTCTGGTCGTGACCAGTGTCGTGGTGCGAACCGGGGTGATCGATCGCAAACTCATCGGTACACCTGTCTGGGCGCTGGCTCTCTGCGCCTTTGCCATCGCTGCCTGCATTCCCATGCGTGCCGTGCTGGTGCGCCGCGCCCTGGATGTTGGGATTGAAACGCAAGTGAGACATTTTCAGAATCATCAGTCGATGTGGCGTGTTCGTGTGAGTCACCGGCAAAGGAGATCGGCGCAATGA。

术语解释：

本发明中涉及的基因名称解释如下：

gumB：与多糖聚合输出有关；

gumC：与多糖聚合输出有关；

gumF：乙酰基转移酶(内侧甘露糖)；

gumG：乙酰基转移酶(外侧甘露糖)；

gumL：丙酮酰基转移酶。

本发明提供的菌株及其构建方法，以及其用于发酵生产耐高温黄原胶的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：敲除质粒pLO3-gumL的构建：

使用提取试剂盒提取XANTHOMONAS CAMPESTRIS WT(菌种编号NRRL B-1459)的基因组，gumL的上下游同源臂以XANTHOMONAS CAMPESTRIS WT(菌种编号NRRL B-1459)基因组为模板，分别使用引物gumL-SF/gumL-SR和gumL-XF/gumL-XR及PrimeSTAR DNA聚合酶(Takara Bio,Tokyo,Japan)扩增。通过overlap PCR将上下游DNA片段连接，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得重组片段。将重组片段及pLO3质粒同时使用限制性酶SacI和XbaI进行酶切，37℃，90min，将酶切后的片段使用试剂盒进行PCR纯化回收，将两者的回收产物用T4 DNA连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒pLO3-gumL，并将重组质粒转入E.coli S17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。

实施例2：表达质粒pBBR-gumFG的构建：

使用提取试剂盒提取XANTHOMONAS CAMPESTRIS WT(菌种编号NRRL B-1459)的基因组，以XC基因组为模板，使用引物gumFG-F/gumFG-R及PrimeSTAR DNA聚合酶扩增gumF和gumG基因，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的基因gumFG。将目的片段及pBBRMCS质粒同时使用限制性酶KpnI和Sma1进行酶切，37℃，90min，将酶切后的片段使用试剂盒进行PCR纯化回收，将两者的回收产物用T4 DNA连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒pBBR-gumFG，并将重组质粒转入E.coli S17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。

实施例3：表达质粒pMM-gumBC的构建：

使用提取试剂盒提取XANTHOMONAS CAMPESTRIS WT(菌种编号NRRL B-1459)的基因组，以XC基因组为模板，使用引物gumBC-F/gumBC-R及PrimeSTAR DNA聚合酶扩增gumB和gumC基因，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的基因gumB、gumC。将目的片段及pMMB67eH质粒同时使用限制性酶KpnI和XbaI进行酶切，37℃，90min，将酶切后的片段使用试剂盒进行PCR纯化回收，将两者的回收产物用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒pMM-gumBC，并将重组质粒转入E.coli S17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。

实施例4：耐高温黄原胶基因工程菌株的构建：

在平板培养基挑XC(XANTHOMONAS CAMPESTRIS WT(菌种编号NRRL B-1459)，后续内容简称WT)单菌落接种至含Cm^r的5ml种子培养基，30℃恒温摇床中200rpm培养14h，挑取E.coli S17/pLO3-gumL的单菌落至含有tet^r的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床中200rpm培养8h，两株菌各取5ml 6000rpm离心5min收集菌体，用10mmol/L的MgSO₄溶液洗涤两次，离心，再用200ul的MgSO₄溶液重悬菌体，将XC和E.coli-1 s17/pLO3-gumL按照2:1的比例混匀后抽滤至孔径0.22um的微孔滤膜上，将菌体朝上的滤膜置于无抗性平板上，于30℃恒温培养箱中培养12h进行接合转移。用200ul MgSO₄溶液洗涤滤膜上的菌体，梯度稀释后涂布于含有Cm^r和tet^r的双抗平板上，于30℃恒温培养箱中培养72h。pLO3为自杀载体，在XC中无法复制，当pLO3-gumL接合转移至XC后，其会通过上游同源臂或下游同源臂交换整合入基因组。在双抗平板上挑取单菌落至5ml含双抗的种子液体培养基中，30℃恒温摇床中200rpm培养16h。使用引物为Lop1/Lop2进行菌落PCR验证单交换重组子，PCR产物琼脂糖凝胶电泳，观察是否具有目的条带。

双交换重组子的筛选：将单交换重组子接种于无抗性的5ml种子培养基中，30℃恒温摇床中200rpm培养16h，传代两次，然后将其涂布至10％蔗糖平板上于30℃恒温培养箱中培养72h。挑取单菌落至5ml试管中，30℃，200rpm培养16h，使用引物gumL1/gumL2进行菌落PCR验证，确定正确的双交换重组子，命名为ΔgumL，即MHZ-20002-1。

平板培养基挑MHZ-20002-1单菌落接种至含Cm^r的5ml种子培养基，30℃恒温摇床中200rpm培养14h，挑取E.coli S17/pBBR-gumFG的单菌落至含有Kan^r的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床中200rpm培养8h，两株菌各取5ml 6000rpm离心5min收集菌体，用10mmol/L的MgSO₄溶液洗涤两次，离心，再用200ul的MgSO₄溶液重悬菌体，将MHZ-20002-1和E.coliS17/pBBR-gumFG按照2:1的比例混匀后抽滤至孔径0.22um的微孔滤膜上，将菌体朝上的滤膜置于无抗性平板上，于30℃恒温培养箱中培养12h进行接合转移。用200ul MgSO₄溶液洗涤滤膜上的菌体，梯度稀释后涂布于含有Cm^r和Kan^r的双抗平板上，于30℃恒温培养箱中培养72h。挑取单菌落至5ml试管中，30℃，200rpm培养16h，使用引物BBR1/BBR2进行PCR验证，确定正确的重组子，命名为MHZ-20002-2，即ΔgumL::gumFG。

平板培养基挑MHZ-20002-2单菌落接种至含Cm^r、Kan^r的5ml种子培养基，30℃恒温摇床中200rpm培养14h，挑取E.coli S17/pMM-gumBC的单菌落至含有Amp^r的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床中200rpm培养8h，两株菌各取5ml 6000rpm离心5min收集菌体，用10mmol/L的MgSO₄溶液洗涤两次，离心，再用200ul的MgSO₄溶液重悬菌体，将MHZ-20002-2和E.coli S17-1/pMM-gumBC按照2:1的比例混匀后抽滤至孔径放置在0.22um的滤膜上，将菌体朝上的滤膜置于无抗性平板上，于30℃恒温培养箱中培养12h进行接合转移。用200ulMgSO₄溶液洗涤滤膜上的菌体，梯度稀释后涂布于含有Cm^r、Kan^r和Amp^r的三抗平板上，于30℃恒温培养箱中培养72h。挑取单菌落至5ml试管中，30℃，200rpm培养16h，使用引物mm1/mm2进行PCR验证，确定正确的重组子，命名为MHZ-20002-3，即ΔgumL::gumFG::gumBC。

实施例5.反转录：

平板培养基挑单菌落接种至的5ml种子培养基，30℃恒温摇床中200rpm培养14h，取2mL用于总RNA的提取，使用RNAprep Pure Cell\Bacteria Kit试剂盒提取总RNA，将提取的RNA在BioDrop微量核酸蛋白检测仪测其浓度，当做反转录的模板。反转录使用天根FastQuant RT Kit(with gDNase)试剂盒，配置体系1，如表2所示；

表2

组分	体积
		5×gDNA Buffer	2μL
Total RNA	50ng-2ug
		RNase free ddH<sub>2</sub>O	补足10ul

将上述体系42℃保温3min，再于冰上放置；配置体系2，如表3所示；

表3

将体系2加到体系1，混匀；42℃保温15min，然后95℃保温3min，得到cDNA放置到-20℃冰箱待用。

实施例6：实时荧光定量PCR(qPCR):

将cDNA稀释10倍当做qPCR的模板，使用定量引物(gumL使用引物gumLdl1/gumLdl2，gumF基因使用引物gumFdl1/GumFdl2,gumG基因使用引物gumGdl1/GumGdl2,gumB基因使用引物gumBdl1/gumBdl2,gumC基因使用引物gumCdl1/gumCdl2)及

SybGreen Qpcr Mastermix(DBI Bioscience)进行定量检测，每个样品做三个重复，该检测为相对定量，在检测基因表达的同时，要对该菌的16srDNA进行定量检测，作为内参。定量结束后，取合适的threshold值对结果进行分析。

实施例7：HPLC测定乙酰基、丙酮酰基含量：

乙酰基测定的样品处理方法：将黄原胶样品以5mg/ml的浓度溶于水中，在室温下搅拌过夜，然后在90℃下搅拌1h。超声破碎，工作5s，间隙10s，24个循环。向处理后的黄原胶溶液(1ml)中加入氢氧化钾溶液(0.2M，1ml)。样品用氮气冲洗，密封，并在45℃下保持6h。用磷酸使溶液呈酸性，用水稀释至总体积3ml，过滤，上样。

丙酮酰基测定的样品处理方法：将黄原胶样品以5mg/ml的浓度溶于水中，在室温下搅拌过夜，然后在90℃下搅拌1h。超声破碎，工作5s，间隙10s，24个循环。向处理后的黄原胶溶液(1ml)中加入磷酸(0.1M，1ml)。将样品密封，在90℃下加热90min，用水定量至3ml，过滤，上样。使用Agilent1100高效液相色谱，Aminex HPX-87H lon Exclusion Column(300mm*7.8mm)色谱柱，流动相为0.005M硫酸，流速0.6ml/min，检测波长210nm。

实施例8.黄原胶发酵：

挑所需菌种的单菌落接种到5ml种子培养基，200rpm、30℃培养20h，然后以1％的接种量接种到100ml的种子培养基中，在200rpm、30℃培养20h，然后以10％的接种量接种到100/500ml摇瓶中，28℃、230rpm条件下培养72h。种子培养基(g/L)：蔗糖，20g；蛋白胨，3g；酵母粉，1g；牛肉膏，5g；pH 7.0±0.02。发酵培养基(g/L)：蔗糖，40g；大豆水解粉，6g；酵母粉，0.5g；磷酸氢二钾，1g；碳酸钙，30g。在制备MHZ-2002-2种子液的过程中要在培养液中加入1/1000的Kan^r，在制备MHZ-20002-3种子液的过程中要在培养液中加入1/1000的Kan^r和1/1000的Amp^r。

实施例9.黄原胶产量的测定：

向发酵液中加入三倍体积的乙醇(v/v)，将黄原胶沉淀，过滤，将沉淀放入烘箱90℃干燥6h，精密天平称重，产量计算按照每100g发酵液产生的黄原胶质量。

实施例10.发酵产品黏度的测定：

取发酵产品，按1％浓度溶解在1％氯化钾溶液中，在25℃下使用布氏粘度计LV-DV_II+测定，使用63号转子，转速为60rpm，每次测定重复三次。

实施例11.黄原胶分子量的测量：

黄原胶的分子量测定使用凝胶渗透色谱(GPC)进行测定，流动相为超纯水，流速为0.3ml/min，柱温为50℃。将黄原胶溶于超纯水中(1mg/ml)，用0.22mm的滤器过滤，进样。

实施例12.黄原胶流变特性的评估：

黄原胶的流变特性通过TA流变仪进行测定，将黄原胶溶于超纯水中(10mg/ml)，检测条件为25℃，剪切速率范围为0.001s^-1-1000s^-1。

实施例13：耐温性的测定：

使用pH9～11的饱和食盐水，溶解终浓度0.5％的黄原胶溶液，在25℃水浴中放置30min至恒温，然后用FAN35A粘度计检测，读取600、300、200、100、6和3rpm读数，精确到0.5个单位。记录检测温度。将检测完毕的溶液放置在有内衬套的陈化釜内，上紧螺帽。将陈化釜放入滚子加热炉内，121℃热滚24小时，加热停止后将陈化釜冷却到25℃，将溶液倒出，按照上述方法检测粘度并计算热滚后溶液的动切力YP＝(2×300读数-600读数)，YP值越大耐温性能越高；同时，按上述体系，并进行138℃热滚16h。

表4.WT、MHZ-20002-1、MHZ-20002-2和MHZ-20002-3产量及发酵液黏度的比较

注：*示与野生型WT相比，具有显著差异(P＜0.05)；

**示与野生型WT相比，具有极显著差异(P＜0.01)。

表5.WT、MHZ-20002-1、MHZ-20002-2和MHZ-20002-3所产黄原胶的分子量

注：*示与野生型WT相比，具有显著差异(P＜0.05)；

**示与野生型WT相比，具有极显著差异(P＜0.01)。

表6.WT、MHZ-20002-1、MHZ-20002-2和MHZ-20002-3所产黄原胶耐温性能比较

注：*示与野生型WT相比，具有显著差异(P＜0.05)；

**示与野生型WT相比，具有极显著差异(P＜0.01)。

由表4知四株菌所合成黄原胶的产量基本相同，但发酵液黏度和分子量，MHZ-20002-3明显高于其他三株菌(表4，表5)；工业生产中使用YP值衡量黄原胶的耐温性能，121℃时MHZ-20002-2比出发菌株提高了6倍，而MHZ-20002-3的YP值比出发菌株提高了7倍，138℃时，野生型菌株产品的YP值为0，而两个工程菌株MHZ-20002-2和MHZ-20002-3均仍具有粘度，YP值相比出发菌株有很大提高(图1、表6)。因此，本方法构建的工程菌株可耐高温，将该菌株应用于工业生产，可大大降低因后期交联而造成的耐高温黄原胶生产成本。综上所述，本发明所构建的耐高温黄原胶工程菌MHZ-20002-3，能够实现耐高温黄原胶的生产，菌株具有广泛的工业应用前景。

表7.qPCR验证WT、MHZ-20002-1、MHZ-20002-2和MHZ-20002-3中gumF、gumG、gumB、gumC、gumL基因的表达量

实时荧光定量PCR(qPCR)测定gumL基因的转录水平，图6、表7的结果显示gumL基因没有转录；高效液相色谱(HPLC)测定ΔgumL产生黄原胶的丙酮酰基含量，图7结果显示其黄原胶丙酮酰基含量为0。证明gumL基因已完全失活。

qPCR测定gumF、gumG基因的转录水平，图6、表7的结果显示gumF、gumG基因转录水平较WT和MHZ-20002-1都有明显的提高；高效液相色谱(HPLC)测定ΔgumL::gumFG产生黄原胶的乙酰基含量，图8结果显示其黄原胶乙酰基含量提高了1倍。

qPCR测定gumB、gumC基因的转录水平，图6、表7的结果显示MH-20002-3的gumB、gumC转录水平较MHZ-20002-2有明显提高，证明导入的质粒pMM-gumBC有生物活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司

<120> 菌株及其构建方法，以及其用于发酵生产耐高温黄原胶的应用

<130> MP1822417

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gagtatagag ctcgctggat gacaccgcaa ata 33

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ttcaagatcg aaactgccgt gggctgccac cagaacaat 39

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

attgttctgg tggcagccca acggcagttt cgatcttgaa 40

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gagtctctct agagcacaac aggaagcgga tg 32

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ggggtacctg aatacggtga caggggcat 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

tcccccgggt ttcattgcgc cgatctcct 29

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ggggtaccat gtcgctgggc gcttgca 27

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

tgctctagat ccacgctgaa tcagttgtca ct 32

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ggaagcaccg cgtgtacgtt 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

cagcgttccg gtcaaggtc 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

cttgtttcgg cgtgggtat 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

cagctcaggc gacaaccat 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

aacgcgcttt gagattccca 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

gttgcgtacc cccctttttt a 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

cgccgactac tgggatgctg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

gcgggcctga tatacacgtc 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

gccctctgtc cctaccattg t 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

cttgtcctta gttgccagca c 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

atcgcagtgc ctgaggtcta c 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

gtacttctca accggctcgt t 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

gtcggcccgg atctgtatgt 20

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

tcatccagaa ccaggcgaga ac 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

tctggtggct tacggctact gg 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

caaggccggg agcacataca ag 22

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

gtctgggcgt tggcgaact 19

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

accgcaccag tgaccgtga 19

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

gccgccaaga tcgccaatac 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

ctcagccaga aactgtgtcg c 21

<210> 29

<211> 795

<212> DNA

<213> GumL

<400> 29

atggccaacg ctttactgca gaaatgggtg gaacgggcgg aacgtcgcgc attgttctgg 60

tggcagccca aaaacggtgg cgtgaacatg ggggatcacc tgtcgaaggt gatcgtgtcg 120

tgcgtgttgg cgttgcagga caagacactt ctggaaaaac gcgatttgcg ccagaagctg 180

atcgcaaccg ggtcggtgct gcatttcgcc aaagatggcg acaccgtgtg gggaagcggt 240

atcaacggca agattccggc cgagcgcaat acgttcagca cgctggacgt acgcgcggta 300

cgcggtccca agacccgcgc atttttgctg gaacgtggca tcgcagtgcc tgaggtctac 360

ggagacccgg gattgctgac cccgatgttt ttccccgccg acgccctcgg cccggtcacc 420

aagcgcccgt tcgcgatcgt gccgcacttc aacgagccgg ttgagaagta cagcgcctac 480

gccgagcatc tggtgtttcc caacgtcaag ccggccacct tcatgagtgc gctgctgggt 540

gcggaatttg tcatcagcag ttcgctgcat ggcctgatcc tggccgaagc ctatggcatc 600

ccggcggtgt atctggactg gggcaacggc gaagaccgtt tcaagtacga cgactactac 660

cacggcaccg ggcgcatgca atggcatgcc ggccacagcg tggaagaatg catggaactg 720

ggcggcaacg gcagtttcga tcttgaacgc ttgcaggcag gattgctggc tgcgttccct 780

tacgatttgt ggtga 795

<210> 30

<211> 2064

<212> DNA

<213> GumB、gumC

<400> 30

atgtcgctgg gcgcttgcag caccggcccg gagatggcgt cttcgctgcc gcatccggac 60

ccgctggcaa tgtccacggt gcagcccgaa taccgtcttg cgccgggcga tctgttgctg 120

gtgaaggtgt ttcagatcga cgatctggag cggcaggtcc gcatcgacca gaacggtcac 180

atctcactgc cgttgattgg cgacgtcaag gccgccggtc tgggcgttgg cgaactggaa 240

aagctggtcg ccgatcggta tcgcgcaggc tacctgcagc agccgcagat ttcggtattc 300

gtgcaggagt ccaacgggcg tcgcgtcacg gtcactggtg cggtagacga gccgggcatc 360

tacccggtga tcggcgccaa cctcaccttg cagcaggcga tcgcgcaggc caagggtgtc 420

agcacggtgg caagccgcgg caacgtgatc gtgttccgca tggtcaacgg gcaaaaaatg 480

attgcgcggt tcgacctgac cgagatcgag aagggggcca atccggatcc tgagatttat 540

ggcggcgaca ttgtcgtggt gtatcgctcg gatgcgcgcg tgtggttgcg caccatgctg 600

gaactgaccc ccttggtgat ggtgtggcgc gcttaccgat gagtatgaat tcagacaatc 660

gttcctcttc gtcgcagcgg tcatggtcat ctggaactgg cagatgtcga cttgatggac 720

tactggcgcg ccctggtctc gcagctctgg ctgatcatcc tgatcgccgt cggcgcgctg 780

ttgctggcat tcggcatcac gatgttgatg cccgagaagt accgcgccac cagcaccctg 840

cagatcgaac gtgactcgct caatgtggtg aacgtcgaca acctgatgcc ggtggaatcg 900

ccgcaggatc gcgatttcta ccagacccag taccagttgc tgcagagccg ttcgctggcg 960

cgtgcggtga tccgggaagc caagctcgat caggagccgg cgttcaagga gcaggtggag 1020

gaggcgctgg ccaaagccgc cgaaaagaat cccgaggcgg gtaagtcgct cgattcgcgg 1080

caggcgatcg tcgagcgcag cctcaccgat acgttgctcg ccgggctggt ggtcgagccg 1140

atcctcaact cgcgcctggt gtacgtcaat tacgattcgc cagacccggt gctggccgcc 1200

aagatcgcca atacgtaccc gaaggtgttc atcgtcagca cccaggaacg ccgcatgaag 1260

gcgtcttcgt ttgcgacaca gtttctggct gagcgcctga agcagttgcg cgagaaggtc 1320

gaagactctg aaaaggatct ggtctcgtat tcgaccgaag agcagatcgt gtcggttggc 1380

gatgacaagc cctcgctgcc tgcgcagaat ctgaccgatc tcaatgcgtt gctggcatcc 1440

gcacaggacg cccggatcaa ggccgagtca gcttggcggc aggcttccag tggcgatggc 1500

atgtcattgc cgcaggtgtt gagcagcccg ctgattcaaa gcctgcgcag cgagcaggtg 1560

cgtctgacca gcgagtacca gcagaaactg tcgaccttca agccggatta cccggagatg 1620

cagcgcctca aggcgcagat cgaagagtcg cgtcgtcaga tcaatggcga agtcatcaat 1680

atccgtcagt cgctgaaggc gacctacgac gcctccgtgc atcaggagca gctgctcaac 1740

gaccgcatcg ccggtctgcg gtccaacgag ctggatctgc agagccgcag catccgctac 1800

aacatgctca agcgcgacgt cgacaccaac cgccagctct acgatgcgct cctgcagcgc 1860

tacaaggaaa tcggcgtggc gagcaacgtg ggcgccaaca acgtgaccat cgtcgatacc 1920

gcagacgtgc ctacgtctaa gacttcgccg aaactcaaat tgaacctcgc gttgggcctg 1980

atctttggcg tattcctggg cgtggctgtg gctctggttc gctacttcct gcgtgggcct 2040

tctccgaggt cgcggttgaa ctga 2064

<210> 31

<211> 2231

<212> DNA

<213> GumF、gumG

<400> 31

gtgaatacgg tgacaggggc atcggggacg tcggcgcctg tgcaggctgc cggcgcgcgt 60

gccttcgcga gcggccgtag ccgcgatcca cgtatcgatg cgaccaaggc gatcgcgata 120

ttgctggtgg tgttctgcca cgcaaaaggc gtgccgcacg gaatgaccct gtttgcctac 180

agctttcacg ttccgctttt cttcctcgtg tcgggttggc tggctgccgg ttatgcctcg 240

cgcacaacca gcctgctgca gacaatcacc aagcaggcac gtggtctgtt gctgccctat 300

gtcgtgttct atctgcttgg atatgtgtat tggctgttga cgcgcaacat cggcgagaaa 360

gctgcacgtt gggggagcca cccgtggtgg gagccgatcg tgtcgatgtt taccggcgtc 420

ggcccggatc tgtatgtgca gccgccgctg tggttcctgc cggtgatgct ggtcaccgtg 480

attggctacg ttctgttgcg gcgctggatg ccgccactgg tcattgcggc tgtcgcagtt 540

gttctcgcct ggttctggat gaactggttt ccgctccagc acatgcgatt gttctggggc 600

ctggatgtgc taccggtgtc gctgtgcttc tacgcactgg gcgcgctgct gatccacgtg 660

tcgccgtatc ttccaacctc cttgcctggt agcgcgttgg tcaccgtagt gctggcagca 720

ttggttgcct ggctggccgg ggtcaacggc cgcatcgatg tcaacatgct ggaattcgga 780

aggcagcatg ccgtattcct gttgagtgca gtggcgggtt cgttgatggt gatctgcgcg 840

gcgcgcatgg tgcaggaatg gacatggctg cagtggatcg ggcgcaacac cttgctgatc 900

ctgtgcacgc acatgctggt cttctttgta ctgtctggtg ttgcggcctt ggcgggtggg 960

tttggtgggg cgcgcccagg ccttggttgg gccatcttcg tgacgctctt tgcgctggtc 1020

gccagcgttc cgctgcgctg gtttctgatg cgttttgccc cctggacctt gggtgcacgt 1080

ccggtgtcgg catgacgacg gctgcgatca ctgccggtcg cgtcgacaca atcgcctcaa 1140

ctgtcgcgga gcgcgactgg cagatcgacg tggccaaggc tcttgcgatc attctggtcg 1200

cgctggggca cgccagtggc atgccgcctg cctacaagct gtttgcctac agcttccatg 1260

tgcctctgtt tttcgttctt tccggctggg tcggtgaacg cttcgggcgt cgtgcatttg 1320

gccggaagac ggtgggaaag cttgcgcgca cgctgctgat tccctacgtc agcttttttc 1380

tggtggctta cggctactgg atactgagcg cagtgctcaa cggcacatcc cagtcctggg 1440

ctggccaccc ctggtggcat ccgtttgttg gattgctgtg ggccaatgga tccagcttgt 1500

atgtgctccc ggccttgtgg tttctccccg cactgtttgt cgccaccgtt gtctacctgg 1560

cactgcgcga agacctgagc gccgcagtgc tcgcggtctg cagtttgctg gttgtgtggg 1620

cgtggacgcg ttggttccca gggctgcggc tgcgccttcc gtttgcactg gatgtgctgc 1680

cggtcgcgct gttcttcatt gcagtcggcg catggctgtc acgcttcgca gagagagtgc 1740

gcgcgcttcc tgcggtcgtt tgggtcgtcg cgttcccggt cctggcattc gcctgggggg 1800

gcgttgcagc catgaacggg caggtggatg tcaataatct tcagttcgga aaatcgtcgc 1860

tcctgttcct gatcgcaagc ctgctgggta cagcaatgac gttgtgcatt gcctacttca 1920

tgcaagggtg gcgctggctg cgttggatcg gcgccaatac gctgctgatc cttggcacgc 1980

acacgttggt gtttctggtc gtgaccagtg tcgtggtgcg aaccggggtg atcgatcgca 2040

aactcatcgg tacacctgtc tgggcgctgg ctctctgcgc ctttgccatc gctgcctgca 2100

ttcccatgcg tgccgtgctg gtgcgccgcg ccctggatgt tgggattgaa acgcaagtga 2160

gacattttca gaatcatcag tcgatgtggc gtgttcgtgt gagtcaccgg caaaggagat 2220

cggcgcaatg a 2231

Claims

1.野油菜黄单胞菌，其特征在于，在敲除了丙酮酰基转移酶基因gumL基因的野油菜黄单胞菌中添加乙酰基转移酶基因gumFG基因，

所述丙酮酰基转移酶基因gumL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；

所述gumFG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。

2.如权利要求1所述的野油菜黄单胞菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：扩增获得gumFG基因，以表达质粒pBBRMCS为骨架，向所述表达质粒pBBRMCS上的多克隆位点插入gumFG基因，构建乙酰基转移酶基因gumF、gumG的表达质粒pBBR-gumFG；

步骤2：将重组质粒pBBR-gumFG转化至E. coli-1 S17菌株，筛选正确的转化子，得到重组菌株E. coli-1 S17/pBBR-gumFG；

步骤3：将重组菌株E. coli-1 S17/pBBR-gumFG接合转移至△gumL菌株，Cm^r、Kan^r双抗平板筛选重组菌株，获得gumL基因敲除及添加gumFG基因的△gumL::gumFG菌株；

所述gumL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；

所述gumFG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；

所述△gumL菌株的构建方法包括如下步骤：

步骤1：扩增获得gumL上下游同源臂基因，通过overlap PCR将gumL基因的上下游同源臂连接，以自杀质粒pLO3为骨架，向质粒上的多克隆位点插入gumL基因的上下游同源臂片段，构建获得丙酮酰基转移酶基因gumL的敲除质粒pLO3-ΔgumL；

步骤2：将敲除质粒pLO3-ΔgumL转化至E. coliS17菌株，获得转化子，得到重组菌株E.coliS17/pLO3-ΔgumL；

步骤3：将所述重组菌株E. coliS17/pLO3-ΔgumL接合转移至野油菜黄单胞菌NRRL B-1459，Cm^r、tet^r双抗平板筛选单交换菌株，蔗糖致死筛选获得缺失gumL基因的双交换菌株△gumL。

3.野油菜黄单胞菌，其特征在于，在如权利要求1所述的野油菜黄单胞菌中添加黄原胶聚合输出蛋白表达基因gumBC基因，所述gumBC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示。

4.如权利要求3所述的野油菜黄单胞菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：扩增获得gumBC基因，以表达质粒pMMB67eH为骨架，向质粒上的多克隆位点插入gumBC基因，构建乙酰基转移酶基因gumB、gumC的表达质粒pMM-gumBC；

步骤2：将重组质粒pMM-gumBC转化至E. coli-1 S17菌株，筛选正确的转化子，得到重组菌株E. coli-1 S17/pMM-gumBC；

步骤3：将重组菌株E. coli-1 S17/pMM-gumBC接合转移至如权利要求1获得菌株中，Cm^r、Amp^r双抗平板筛选重组菌株，获得gumL基因敲除、添加gumFG基因和添加gumBC基因的△gumL::gumFG::gumBC菌株；

所述gumL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；

所述gumFG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；

所述gumBC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示。

5.根据权利要求3所述的野油菜黄单胞菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.16101。

6.根据权利要求1或3所述的野油菜黄单胞菌在生产耐高温黄原胶中的应用。

7.根据权利要求5所述的野油菜黄单胞菌在生产耐高温黄原胶中的应用。

8.一种生产耐高温黄原胶的方法，其特征在于，将如权利要求1或3所述的野油菜黄单胞菌接种于培养基中发酵培养，收集发酵液。

9.一种生产耐高温黄原胶的方法，其特征在于，将如权利要求5所述的野油菜黄单胞菌接种于培养基中发酵培养，收集发酵液。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：挑取如权利要求1或3所述的野油菜黄单胞菌的单菌落接种到种子培养基，于200rpm、30℃培养20h，获得一级种子培养液；

步骤2：将所述一级种子培养液以1%（v/v）的接种量接种到种子培养基中，于200rpm、30℃培养20h，获得二级种子培养液；

步骤3：将所述二级种子培养液以10%（v/v）的接种量接种到种子培养基中，于230rpm、28℃培养72h，收集发酵液。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：挑取如权利要求5所述的野油菜黄单胞菌的单菌落接种到种子培养基，于200rpm、30℃培养20h，获得一级种子培养液；